Summary
Qui presentiamo un protocollo CLIP-seq modificato chiamato FbioCLIP-seq con purificazione tandem FLAG-biotina per determinare gli obiettivi di RNA delle proteine leganti l'RNA (RRP) nelle cellule dei mammiferi.
Abstract
Le proteine leganti RNA e RNA (RRP) controllano molteplici processi biologici. La disposizione spaziale e temporale degli RRN e degli RRP è alla base della delicata regolazione di questi processi. È stata sviluppata una strategia chiamata CLIP-seq (cross-linking e immunoprecipitation) per catturare le interazioni proteina-RNA endogena con il cross-linking UV seguito dall'immunoprecipitazione. Nonostante l'ampio uso del metodo CLIP-seq convenzionale nello studio RBP, il metodo CLIP è limitato dalla disponibilità di anticorpi di alta qualità, potenziali contaminanti dagli RRP copurificati, requisito di manipolazione degli isotopi e potenziale perdita di informazioni durante una noiosa procedura sperimentale. Qui descriviamo un metodo CLIP-seq modificato chiamato FbioCLIP-seq utilizzando la purificazione tandem tag FLAG-biotina. Attraverso la purificazione tandem e le rigorose condizioni di lavaggio, quasi tutte le proteine interagenti leganti l'RNA vengono rimosse. Pertanto, anche gli RNA che interagiscono indirettamente mediati da questi RMP copurificati sono ridotti. Il nostro metodo FBIoCLIP-seq consente un rilevamento efficiente di RNA dirette legate alle proteine senza SDS-PAGE e procedure di trasferimento di membrana in modo privo di isotopi e specifico per proteine.
Introduction
Gli RNA e le proteine leganti l'RNA (RRP) controllano diversi processi cellulari tra cui splicing, traduzione, biogenesi ribosoma, regolazione epigenetica e transizione del destinocellulare 1,2,3,4,5,6. I delicati meccanismi di questi processi dipendono dalla disposizione spaziale e temporale unica di RTA e RRP. Pertanto, un passo importante verso la comprensione della regolazione dell'RNA a livello molecolare è quello di rivelare le informazioni posizionali sui siti vincolanti degli RRP.
È stata sviluppata una strategia denominata cross-linking e immunoprecipitazione (CLIP-seq) per catturare le interazioni proteina-RNA con il cross-linking UV seguito dall'immunoprecipitazione della proteina di interesse7. La caratteristica chiave della metodologia è l'induzione di collegamenti incrociati covalenti tra una proteina legante l'RNA e le sue molecole di RNA direttamente legate (entro ~1 Å) dall'irradiazione UV8. Le impronte RBP possono essere determinate dal clustering di tag CLIP e dalle chiamate di picco, che di solito hanno una risoluzione di 30−60 nt. In alternativa, la fase di trascrizione inversa di CLIP può portare a indeli (inserimenti o deduzioni) o sostituzioni ai siti di collegamento incrociato, che consente l'identificazione di siti di legame proteico sugli RNA con una risoluzione mono nucleotidica. Condotte come Novoalign e CIMS sono state sviluppate per l'analisi dei risultati di sequenziamento ad alta produttività di CLIP-seq8. Sono stati proposti anche diversi metodi CLIP-seq modificati, tra cui il cross-linking e l'immunoprecipitazione della risoluzione del nucleotide individuale (iCLIP), CLIP avanzato (eCLIP), irCLIP e cross-linking e immunoprecipitazione fotoattivibili ribonucleoside (PAR-CLIP)9,10,11,12.
Nonostante l'ampio uso dei metodi CLIP-seq tradizionali nello studio degli RRP, i metodi CLIP presentano diversi inconvenienti. In primo luogo, la noiosa elettroforesi del gel denaturato e la procedura di trasferimento a membrana possono portare alla perdita di informazioni e causare una complessità della sequenza limitata. In secondo luogo, il metodo CLIP specifico della proteina basato su anticorpi può abbattere un complesso proteico anziché una singola proteina bersaglio, il che può portare a false interazioni proteina-RNA positive dagli RRP copurificati. In terzo luogo, la strategia basata su anticorpi richiede una grande quantità di anticorpi di alta qualità, il che rende l'applicazione di questi metodi inadeguata per lo studio degli RRB senza anticorpi di alta qualità disponibili. In quarto luogo, il metodo TRADIZIONALE CLIP richiede ATP radioetichettato per etichettare gli RNA legati alle proteine.
L'alta affinità della streptavidina con le proteine biotinilate lo rende un approccio molto potente per purificare specifiche proteine o complessi proteici. L'efficiente biotinylazione delle proteine che trasportano una sequenza peptidica artificiale mediante la biotina ligasi bira etopica nelle cellule di mammifero lo rende una strategia efficiente per eseguire la purificazione della biotina in vivo13. Abbiamo sviluppato un metodo CLIP-seq modificato chiamato FbioCLIP-seq(FLAG-Biotin-mediated Cross-linking e Immunoprecipitation seguito da sequenziamento ad alta produttività) utilizzando la purificazione tandem flag-biotinatag 14 (Figura 1). Attraverso la purificazione tandem e le rigorose condizioni di lavaggio, quasi tutti gli RRB interagenti vengono rimossi (Figura 2). Le rigorose condizioni di lavaggio consentono anche di aggirare l'SDS-PAGE e il trasferimento a membrana, che è ad alta intensità di manodopera e tecnicamente impegnativo. E simile a eCLIP e irCLIP, il metodo FbioCLIP-seq è privo di isotopi. Saltare il gel in esecuzione e trasferire i passaggi evita la perdita di informazioni, mantiene intatte le autentiche interazioni proteina-RNA e aumenta la complessità della libreria. Inoltre, l'elevata efficienza del sistema di etichettatura lo rende una buona scelta per gli RMP senza anticorpi di alta qualità disponibili.
Qui forniamo una descrizione dettagliata del protocollo FBIoCLIP-seq per le cellule di mammifero. In breve, le cellule sono reticate da UV a 254 nm, seguite da lisi cellulare e immunoprecipitazione FLAG (FLAG-IP). Successivamente, i complessi proteina-RNA vengono ulteriormente purificati dalla cattura dell'affinità della biotina e gli RNA sono frammentati dalla digestione parziale con la MNasi. Quindi, l'RNA legato alla proteina viene defosforilato e legato con un linker 3 '. Un linker 5' di RNA viene aggiunto dopo che l'RNA è fosforilato con PNK ed eluitato dalla digestione della proteinasi K. Dopo la trascrizione inversa, i segnali di RNA legati alle proteine vengono amplificati dalla PCR e purificati dalla purificazione del gel di agarosio. Due RMP sono stati scelti per esemplificare il risultato di FbioCLIP-seq. LIN28 è una proteina legante l'RNA ben caratterizzata coinvolta nella maturazione dei microRNA, nella traduzione delle proteine e nella riprogrammazionecellulare 15,16,17. WDR43 è una proteina wd40 contenente il dominio che si pensa coordini la biogenesi ribosoma, la trascrizione eucariotica e il controllo della pluripotenza delle cellule staminali embrionali14,18. Coerentemente con i risultati precedentemente riportati per LIN28 con CLIP-seq, FbioCLIP-seq rivela siti di legame di LIN28 su motivi "GGAG" nel microRNA mir-let7g emRNAAs 16,19 ( Figura3). WDR43 FbioCLIP-seq ha anche identificato la preferenza di associazione di WDR43 con distanziale trascritto esterno da 5' (5'-ETS) di pre-rRNA20 (Figura 4). Questi risultati convalidano l'affidabilità del metodo FBIoCLIP-seq.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Costruzione della linea cellulare
- Clonare il gene di interesse in un piggyBac vettore pPiggyBac-FLAG-bio-[cDNA di interesse]-(resistente alla igromicina) plasmide che porta un epitopo FLAG-biotina13,21 per esprimere un tag FLAG-biotina fusa RBP(FBRBP).
- Cotrasfetto il vettore di espressione FBRBP con il vettore pBase in una linea cellulare che esprime l'enzima BirA22.
NOTA: In questo studio, il gene FBRBP è stato trasfetto in cellule staminali embrionali di topo (mESC) che trasportano un vettore di espressione BirAintegrato 21. In alternativa, il vettore diespressione FB RBP può essere cotrasfetto in celle con pBase e pPiggyBac-BirA-V5 insieme. - Far crescere le cellule in mESC su piatti gelatinizzati e mantenerle in mezzo di coltura mES(Tavola dei Materiali)in CO2 al 5% a 37 °C. Selezionare le cellule trasfette con igromicina b (100 μg/mL) per 1 settimana.
- Dopo la selezione del farmaco, raccogliere le cellule mediante tampone di carico SDS (Tabella 1) e utilizzare una macchiaoccidentale 23 per confermare l'etichettatura e l'espressione del gene rispettivamente con un anticorpo FLAG e una streptavidina-HRP.
2. Cross-linking
- Piastra ~3 x 106 mES cellule in una piastra di 10 cm 1 giorno prima dell'esperimento in modo che le cellule crescano fino al 70−90% di confluenza quando raccolte (~5−10 milioni di cellule per campione).
- Rimuovere il mezzo con un vuoto. Trattare le cellule con 2 mL dello 0,25% di tripsiderina-EDTA per 2 minuti a temperatura ambiente (RT) e temprare la triptina di 4 mL di mezzo mESC fresco. Trasferire le celle in un tubo di centrifuga da 15 ml. Far girare le cellule centrifugando a 300 x g per 3 min a 4 °C e rimuovere il supernatante.
- Sospendere le celle con 4 mL di PBS freddo e placcare le celle alla piastra di 10 cm per il cross-linking. Collegare le cellule tramite radiazioni con luce UV a 254 nm (impostare il cross-linker UV con un parametro di 400 mJ/cm2).
NOTA: Per i monostrati cellulari, le cellule possono essere collegate con la luce UV direttamente sulla piastra prima del trattamento con tripina. - Trasferire le celle collegate a croce in un tubo da 15 ml. Spin down per centrifugazione a 300 x g per 3 min a 4 °C e rimuovere il supernatante.
NOTA: Il pellet di cella collegato incrociato può essere conservato a -80 °C fino all'uso.
3. Preparazione del llysato cellulare
- Lire le cellule con 500 μL di tampone di lavaggio A(tabella 1)appena integrate con 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 1/500 cocktail inibitore della proteasi e 400 U/mL RNasi inibitore. Trasferire le celle in un tubo RNasi-free da 1,5 ml. Incubare le cellule per 30−60 minuti su un rotore con una rotazione delicata a 4 °C.
- Trattare il lisato con 30 μL di DNasi I a 37 °C per 10 min. Interrompere la reazione aggiungendo 4 μL di 0,5 M EDTA. Far girare il pellet insolubile di 12.000 x g per 20 min a 4 °C e trasferire il supernatante su un nuovo tubo prechilled da 1,5 ml.
NOTA: Per un uso immediato, tenere sul ghiaccio. Se il supernatante non verrà utilizzato immediatamente, conservarlo a -80 °C fino all'uso.
4. Preparazione delle perle FLAG
- Aggiungere 40 μL di perline FLAG per campione a un tubo fresco da 1,5 ml.
- Lavare rapidamente le perline con 0,5 mL di tampone di lavaggio ghiacciato A e girare verso il basso di 3.000 x g per 2 min a 4 °C.
- Ripetere il passaggio 4.2 una volta. Spin giù le perline con 3.000 x g per 2 min a 4 °C. Rimuovere con cura il tampone con una punta di pipetta a estremità stretta. Evitare di rimuovere le perline.
5. Immunoprecipitazione
- Trasferire il lysate della cella dal passaggio 3.2 alle perle FLAG pre-equilibrate. Ruotare delicatamente tutti i campioni su uno shaker a rulli a 4 °C. Incubare le perle FLAG con lisato per 2−4 ore o durante la notte.
- Centrifugare le perline per 2 minuti a 3.000 x g e rimuovere il supernatante.
- Lavare le perline con 0,5 mL di tampone di lavaggio prechilled A per incubazione per 5 minuti in un rotatore a 4 °C, far girare giù le perline con 3.000 x g per 2 min e rimuovere il supernatante. Ripetere il lavaggio 1x.
- Ripetere il lavaggio 2x come descritto al passaggio 5.3 con 0,5 mL di tampone di lavaggio prechilled B (Tabella 1).
6. Eluizione con peptide FLAG 3x
- Preparare 3x soluzione di eluizione FLAG sciogliendo 1 mg di peptide FLAG 3x con 5 mL di tampone di lavaggio A ad una concentrazione finale di 200 ng/mL.
- Spin down le perline FLAG dal passaggio 5.4 con 3.000 x g per 2 min. Rimuovere attentamente il supernatante. Assicurarsi che la maggior parte del supernatante venga rimossa utilizzando una punta di pipetta finale stretta.
- Aggiungere 200 μL di soluzione di eluizione FLAG 3x a ciascun campione. Incubare i campioni con rotazione delicata per 30 min a 4 °C. Spin down le perline FLAG per 2 min a 3.000 x g. Trasferire i supernatanti in tubi freschi.
- Ripetere l'eluizione 2x come descritto nei passaggi 6.2 e 6.3 e mettere in comune gli eluenti. Risparmia il 5% degli eluenti per l'analisi western delle macchie o la colorazione dell'argento per verificare l'efficienza di FLAG-IP.
7. Preparazione delle perline di streptavidina
- Preparare 50 μL di un liquame di perline di streptavidina per ciascun campione. Raccogliere le perline con un supporto magnetico per 30 s e rimuovere il supernatante con una punta di pipetta.
- Lavare rapidamente le perline con 0,5 mL di tampone di lavaggio ghiacciato A e raccogliere le perline con un supporto magnetico per 30 s.
- Ripetere il lavaggio 1x. Rimuovere il supernatante dopo il lavaggio.
8. Purificazione dell'affinità della biotina
- Trasferire gli eluenti raggruppati dal passaggio 6.4 alle perline di streptavidina dal passo 7.3 e ruotare delicatamente i campioni a 4 °C per 1−3 h o durante la notte.
- Raccogliere le perline con un supporto magnetico per 30 s e rimuovere il supernatante. Lavare le perline 2x con 500 μL di tampone di lavaggio C (Tabella 1) con rotazione delicata a RT per 5 min.
- Raccogliere le perline con il supporto magnetico e rimuovere il supernatante. Lavare le perline 2x con 500 μL di tampone di lavaggio D (Tabella 1) ruotando a RT per 5 min.
- Raccogliere le perline con il supporto magnetico e rimuovere il supernatante. Lavare rapidamente le perline 2 volte con 500 μL di tampone PNK ghiacciato(tabella 1).
9. Digestione parziale dell'RNA
- Effettuare una diluizionedi 10 5volte della MNasi con tampone di reazione di MNasi(tabella 1). Aggiungere 100 μL di soluzione di MNasi a ciascun campione. Vortice le perline a 37 °C con un miscelatore termico impostato a 1.200 giri/min (corsa 5 s, 30 s stop) per 10 min, raccogliere le perline con un supporto magnetico per 30 s e rimuovere il supernatante.
NOTA: La concentrazione di MNasi deve essere ottimizzata per diverse proteine leganti l'RNA. La concentrazione di MNasi che può digerire gli RNA in frammenti di 30−50 nt (determinata dalla dimensione dell'inserto della libreria finale) è ottimale. - Lavare rapidamente le perline 2x con 500 μL di tampone PNK+EGTA ghiacciato(tabella 1). Raccogliere le perline con un supporto magnetico e rimuovere il supernatante tra ogni fase di lavaggio.
- Lavare le perline 2x con 500 μL di tampone di lavaggio C a rotazione delicata per 5 minuti a RT. Quindi lavare rapidamente le perline 2x con 500 μL di tampone PNK ghiacciato.
10. Defosforilazione dell'RNA
- Fare una miscela di reazione fosfatasi dell'intestino di vitello (CIP) con 8 μL di tampone CIP 10x(tabella dei materiali),3 μL di enzima CIP e 69 μL di acqua. Il volume totale è di 80 μL per reazione.
- Raccogliere le perline con un supporto magnetico e rimuovere il tampone. Aggiungere la miscela di reazione CIP alle perline. Vortice le perline a 37 °C con un miscelatore termico impostato a 1.200 giri/min (corsa 5 s, fermata 30 s) per 10 min.
- Lavare rapidamente le perline 2x con 500 μL di tampone PNK+EGTA ghiacciato. Lavare rapidamente le perline 2x con 500 μL di tampone PNK ghiacciato.
11. 3' legatura linker
- Fare una miscela di linker 3' con 4 μL di 20 μM 3' linker, 4 μL di 10x T4 RNA ligasi buffer, 4 μL di 50% PEG8000, 2 μL di T4 RNA ligasi 2 (troncata) e 26 μL di acqua. Il volume totale è di 40 μL per reazione.
- Raccogliere le perline dal passaggio 10.3 con un supporto magnetico e rimuovere il buffer. Aggiungere 40 μL del mix di ligation del linker 3' alle perline. Vortice le perline a 16 °C con un miscelatore termico impostato a 1.200 giri/min (corsa 5 s, fermata 30 s) per 3 ore o durante la notte.
- Lavare rapidamente le perline 2x con 500 μL di tampone PNK+EGTA ghiacciato. Lavare rapidamente le perline 2x con 500 μL di tampone PNK ghiacciato.
12. Trattamento PNK
- Fare una miscela PNK con 4 μL di tampone PNK 10x, 2 μL di enzima T4 PNK, 1 μL di 10 mM ATP e 33 μL di acqua. Il volume totale è di 40 μL per reazione.
- Raccogliere le perline con un supporto magnetico e rimuovere il tampone. Aggiungere 40 μL di miscela PNK alle perline. Vortice delicatamente le perline a 37 °C con un miscelatore termico impostato a 1.200 giri/min (corsa 5 s, fermata 30 s) per 10 min.
- Lavare rapidamente le perline con 500 μL di tampone PNK+EGTA ghiacciato.
- Lavare rapidamente le perline con 500 μL di tampone PNK ghiacciato. Risparmia il 5% delle perline per l'analisi della colorazione occidentale o argentata per confermare l'efficienza dell'immunoprecipitazione.
13. Isolamento dell'RNA
- Raccogliere le perline dal passaggio 12.4 con un supporto magnetico e rimuovere il buffer. Aggiungere 200 μL di proteinasi K tampone di digestione(tabella 1). Vortice le perline per 30 min a 37 °C con un miscelatore termico impostato a 1.200 giri/min (corsa 5 s, fermata 30 s). Isolare magneticamente le perline e prendere il supernatante per l'esperimento.
- Aggiungere 400 μL di reagente di isolamento dell'RNA(Table of Materials)al supernatante del passaggio 13.1, mescolare accuratamente e incubare sul ghiaccio per 5 minuti. Aggiungere 80 μL di cloroformio e mescolare accuratamente e quindi incubare sul ghiaccio per 5 minuti. Spin down con 12.000 x g per 10 min 4 °C.
NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito in una cappa chimica. - Prendere il supernatante (~500 μL) e aggiungere due volumi di mix isopropanolo:etanolo (1:1), 1/10 volume di 3 M acetato di sodio (pH = 5,5) e 1 μL di glicogeno. Congelare a -20 °C per 2 h. Centrifuga a 4 °C con 12.000 x g per 20 min.
- Lavare il pellet 2 volte con ghiaccio freddo 70% di etanolo. Far girare il pellet a 4 °C con 12.000 x g per 5 minuti. Rimuovere il supernatante e asciugare il pellet. Sciogliere gli RNA in 5 μL di H2O privo di RNasi.
14. 5' Legatura linker RNA
- Fare una miscela di legatura 5' RNA con 1 μL di 10x T4 RNA ligasi tampone, 0,5 μL di BSA (1 μg/μL), 1 μL di 10 mM ATP, 1 μL di inibitore della RNasi e 0,5 μL di T4 RNA ligasi. Il volume totale è di 4 μL per reazione.
- Aggiungere 1 μL di 5' 20 μM RNA linker all'RNA dal passo 13.4, denaturare l'RNA riscaldando a 70 °C per 2 min e raffreddare immediatamente sul ghiaccio.
- Aggiungere il mix di legatura dell'RNA 5' all'RNA dal passaggio 14.2. Incubare a 16 °C durante la notte.
15. Trascrizione inversa
- Purificare gli RNA come descritto nella sezione 13 e sciogliere l'RNA con 11,5 μL di acqua priva di RNasi.
- Aggiungere 1 μL di primer di trascrizione inversa da 10 μM all'RNA purificato, riscaldare a 70 °C per 2 minuti e raffreddare immediatamente sul ghiaccio.
- Fare una miscela di trascrizione inversa con 4 μL di 5x buffer di trascrizione inversa, 1 μL di 10 mM dNTPs, 1 μL di 0,1 M DTT, 1 μL di inibitore della RNasi e 0,5 μL di trascrittasi inversa(Tabella dei materiali). Il volume totale è di 7,5 μL per reazione.
- Aggiungere 7,5 μL di miscela di trascrizione inversa all'RNA, incubare a 50 °C per 30 minuti e interrompere la reazione per incubazione a 70 °C per 10 minuti. Lasciare a 4 °C.
16. Amplificazione PCR
- Creare una miscela di amplificazione PCR con 15 μL di 2x PCR master mix(Table of Materials),5 μL di cDNA dal passo 15.4, 0,6 μL di primer avanti 10 μM(tabella 2),0,6 μL di primer inverso 10 μM(tabella 2)e 8,8 μL di H2O. Il volume totale è di 30 μL.
- Amplificare il cDNA con le seguenti impostazioni: 98 °C 30 s, 98 °C 10 s, 60 °C 30 s, 72 °C 30 s (ripetere i passaggi 2−4 per 15−20 cicli), 72 °C 2 min e tenere a 4 °C. Eseguire il prodotto PCR su un gel di agarosio 2−3%. Tagliare il DNA di ~100−150 bp, estrarre il DNA con kit di estrazione del gel(Table of Materials)ed elutare il DNA con 20 μL di acqua.
- Prendere 3 μL del prodotto PCR purificato, amplificare con primer avanti 2 (Tabella 2) e primer inverso 2 (primer indice; Tabella 2) La commissione per i dati come descritto nel passaggio 16.2 per cinque cicli per introdurre sequenze di indici. Purificare il prodotto PCR come descritto al passaggio 16.2.
- Sequenziare la libreria con una piattaforma di sequenziamento ad alta velocità effettiva.
17. Analisi bioinformatica
- Eseguire l'analisi dei dati utilizzando programmi commerciali come descritto inprecedenza 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La rappresentazione schematica della procedura FBIOCLIP-seq è illustrata nella figura 1. Rispetto alla purificazione dell'affinità in un solo passaggio mediata da FLAG o streptavidina, la purificazione tandem FLAG-biotina ha rimosso quasi tutte le proteine copurificate, evitando la contaminazione delle interazioni indirette proteina-RNA (Figura 2). I risultati rappresentativi per FbioCLIP-seq per LIN28 e WDR43 sono illustrati nella figura 3 e nella figura 4. Abbiamo eseguito LIN28 o WDR43 FbioCLIP-seq con mESC. La figura 3A mostra la vista traccia di LIN28 e WDR43 FbioCLIP-seq in pre-let-7g. Il motivo GGAG riportato in pre-let-7g e i siti cross-linked identificati da FbioCLIP-seq sono mostrati nella Figura 3B. La classificazione dei siti di mutazione chiamati dall'algoritmo CIMS ha mostrato che LIN28 preferisce legarsi e cross-link al nucleotide G (Figura 3C). I motivi RNA arricchiti nei siti di associazione LIN28 FbioCLIP-seq sono mostrati nella Figura 3D. Tracce più rappresentative di FbioCLIP-seq su LIN28 e HNRNPU sono mostrate nella figura 3E. Il confronto tra WDR43 e LIN28 FbioCLIP-seq ha mostrato i loro diversi modelli di legame nel locus Rn45 pre-rRNA (Figura 4). La figura 5 mostra i risultati rappresentativi della convalida dei tag FLAG e biotina dopo la costruzione della linea cellulare. La figura 6 mostra i risultati rappresentativi di unapurificazionein tandem FLAG-IP e FLAG-biotina efficiente ( figura 6A ) o non riuscita ( figura6B).
Figura 1: Rappresentazione schematica di FbioCLIP. Le cellule uv-cross-linked (fase 1) sono lese in tampone dilisi (fase 2). Il complesso FBRBP-RNA è immunoprecipitato usando resina anti-FLAG (passaggi 3−4). Il complesso proteina-RNA diluito viene ulteriormente purificato con perline di streptavidina e vengono utilizzate rigorose condizioni di lavaggio per rimuovere le interazioni proteina-proteina (passaggi 5−6). Gli RNA sono parzialmente digeriti dalla MNasi e i frammenti di RNA non legati alle proteine vengono rimossi mediante ulteriore lavaggio (passaggi 7−8). Gli RNA vengono quindi defosforati e legati con 3' linker (passo 9). Quindi gli RNA vengono fosforilati ed eluti dal trattamento con proteinasi K (fase 10). Gli RNA purificati sono legati con un linker RNA da 5' contenente un codice a barre casuale da 6 nt (passaggio 11). Dopo la trascrizione inversa (passaggio 12), la libreria cDNA viene amplificata con PCR e viene eseguito il sequenziamento ad alta velocità effettiva (passaggi 13−15). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: La purificazione tandem FLAG-biotina rimuove le proteine copurificate. La colorazione in argento di FBWDR43 ha mostrato che quasi tutte le proteine interagenti presentate nella purificazione in un solo passaggio mediata da FLAG o biotina sono state eliminate dopo un rigoroso lavaggio in purificazione tandem. FLAG: Purificazione dell'affinità mediata dal FLAG, SA: purificazione della biotina mediata dalla streptavidina, tandem: purificazione tandem FLAG-biotina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Risultati rappresentativi di LIN28 FbioCLIP-seq. (A) Traccia la vista dei tag LIN28 FbioCLIP-seq e delle letture delle mutazioni chiamate dal CIMS in RNA pre-let-7g. I tag mostrati sono letture univoce di FbioCLIP-seq. In totale, sono state recuperate ~ 7,7 milioni di letture univocheper LIN28 Fbio CLIP-seq e ~ 2,2 milioni di letture univocheper WDR43 Fbio CLIP-seq dopo aver rimosso le letture ridondanti. (B) Siti cross-linked sul motivo GGAG dell'RNA pre-let7-g di LIN28 FbioCLIP-seq. Le frecce indicano i siti collegati in modo incrociato. (C) Percentuale di nucleotidi mutati in diversi tipi di mutazioni. G è il nucleotide cross-linked e mutato più frequente. Casuale: distribuzione casuale dei quattro nucleotidi. (D) Motivi di legame LIN28 previsti da FbioCLIP-seq con algoritmo HOMER. (E) Tenere traccia delle viste di LIN28 FbioCLIP-seq su mRNA LIN28 e HNRNPU. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Risultati rappresentativi di WDR43 e LIN28 FbioCLIP-seq sul locus Rn45S. Traccia la vista di WDR43 e LIN28 FbioCLIP-seq sul locus Rn45S. WDR43 e LIN28 hanno mostrato diversi modelli di legame su pre-rRNA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Risultati rappresentativi della convalida dei tag FLAG e biotina. FLAG o biotina Western blot convalida l'etichettatura delle linee cellulari. Cloni #1, #2 e #4 hanno mostrato un'espressione efficiente e la biotinylation del tag mentre #3 mostrato scarsa espressione della proteina taggata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Risultati rappresentativi dell'immunoprecipitazione FLAG e della convalida dell'efficienza di purificazione tandem. (A) Esempio di purificazione efficiente delle proteine etichettate mediante FLAG e purificazione dell'affinità della biotina. (B) Esempio di purificazione inefficiente delle proteine etichettate mediante FLAG e purificazione dell'affinità della biotina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Buffer | Composizione |
| Buffer di caricamento SDS | 50 mM Tris pH 6,8, 2% SDS, 0,1% bromofenoloblue, 10% glicerolo, 100 mM DTT |
| Tampone di lavaggio A | 1x PBS, 0,5% NP-40, 0,5% deossicholato di sodio, 0,1% SDS |
| Tampone di lavaggio B | 5x PBS, 0,5% NP-40, 0,5% deossicholato di sodio, 0,1% SDS |
| Tampone di lavaggio C | 50 mM Tris pH 7.4, 2% SDS |
| Tampone di lavaggio D | 5x PBS, 0,5% NP-40, 0,5% SDS, 1 M urea |
| Buffer PNK | 50 mM Tris pH 7.4, 0.5% NP-40, 10 mM MgCl2 |
| Buffer di reazione MNasi | 10 mM Tris pH 8.0, 1 mM CaCl2 |
| Buffer PNK+EGTA | 50 mM Tris pH 7.4, 0.5% NP-40, 10 mM EGTA |
| Tampone di digestione proteinasi K | 50 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0,5% SDS, 20 μg di proteinasi K |
Tabella 1: Composizione dei tamponi utilizzati nel presente studio.
| Nome Oligo | Sequenza | Note | ||||
| 3' linker | rAppAGATCGGAAGAGCACGTCT-NH2 | |||||
| Linker 5' RNA | GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGUCNNNNN | |||||
| Primer RT | AGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| Primer in avanti 1 | GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC | |||||
| Primer inverso 1 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| Primer in avanti 2 | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAC | |||||
| Primer inverso 2 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGTGACTGGAGTGTAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T | Le sequenze rosse e sottolineate rappresentano la sequenza dell'indice Illumina. | ||||
Tabella 2: Oligonucleotidi utilizzati in questo studio.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Qui introduciamo un metodo CLIP-seq modificato chiamato FbioCLIP-seq, sfruttando il sistema di doppia etichettatura FLAG-biotina per eseguire la purificazione tandem dei complessi proteina-RNA. Il sistema di doppia etichettatura FLAG-biotina si è dimostrato potente nell'identificare le interazioni proteina-proteina e proteina-DNA13,21. Qui dimostriamo l'alta specificità e convenienza di questo sistema nell'identificare gli RNA che interagiscono con le proteine. Attraverso la purificazione tandem e le rigorose condizioni di lavaggio, abbiamo saltato l'impegnativo SDS-PAGE e la fase di trasferimento della membrana, in modo che siano state preservate più interazioni proteina-RNA ed evitare segnali di RNA contaminati mediati dagli RRP nello stesso complesso. Inoltre, il bypass di questi passaggi evita l'etichettatura dell'RNA con ATP radioetichettato. Ciò rende la procedura molto più semplice. Si noti che durante la preparazione della nostra pubblicazione, è stato proposto anche un metodo simile chiamato uvCLAP24.
Diversi passaggi sono importanti per il successo del protocollo. In primo luogo, l'efficienza della biotinylazione della proteina taggata deve essere confermata dalla macchia occidentale prima dell'esperimento (Figura 5). In secondo luogo, l'eluizione efficiente della proteina purificata da 3 x peptide FLAG è necessaria per il successo dell'amplificazione dei segnali di RNA. Le perline del passaggio 12.4 devono essere analizzate con macchia occidentale o argento per garantire che venga recuperata una discreta quantità di proteine bersaglio (Figura 6). Per aumentare l'efficienza, aumentare la concentrazione di peptidi 3 x FLAG nel passaggio 6 fino a 500 ng/mL o ripetere più volte la fase di eluizione per ottenere una migliore produzione. In terzo luogo, è ottimale titolare la concentrazione di MNasi per ogni proteina al primo studio. La troppo disdigestione o il trattamento insufficiente possono portare a frammenti di RNA di dimensioni inappropriate. Infine, il protocollo contiene due cicli di purificazione dell'affinità e lavaggio altamente rigoroso. Viene recuperata solo una piccola quantità di RNA purificate. Il reagente deve essere privo di RNasi ed evitare la degradazione dell'RNA dopo la fase di trattamento della MNasi.
Nonostante la facilità di questo metodo, ci sono ancora alcuni aspetti che possono essere migliorati. Ad esempio, la legatura di un adattatore 5' all'RNA direttamente può limitare il recupero dei segnali perché una parte significativa della trascrizione inversa sarà terminata da peptidi residui incrociati. Il nostro studio attuale si basa principalmente sull'espressione ectopica di proteine taggate, che può portare ad alcuni artefatti a causa della sovraespressione proteica. Vale la pena migliorare il metodo introducendo il tag nel locus endogeno. Il sistema CRISPR/Cas9 rende la costruzione della linea cellulare molto più semplice e praticabile. Alcuni studi hanno applicato l'esperimento eCLIP-seq ai tessuti del topo25. Derivazione di topi knock-in con il doppio tag è anche una direzione potenziale e promettente nel miglioramento e nell'applicazione del metodo FbioCLIP-seq. Inoltre, la legasi batterica BirA espressa ectopicamente può portare a eventi di biotinilazione imprevisti in vivo. L'etichettatura della proteina può anche influenzare le sue funzioni biologiche.
Un gran numero di studi ha dimostrato che l'espressione genica e l'epigenoma delle cellule sono eterogenei invece che completamente omogenei, suggerendo che è utile studiare la rete di interazione a livello di una singola cellula. Sono state sviluppate diverse strategie per studiare il trascritoma e l'epigenoma delle singole cellule. Tuttavia, non sono state riportate strategie per analizzare l'interactoma proteina-RNA a livello di una singola cellula. Senza il gel denaturato in esecuzione e le fasi di trasferimento della membrana, FbioCLIP-seq può preservare più segnali, il che lo rende una potenziale strategia per studiare le interazioni proteina-RNA a livello di una singola cellula.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Il sostegno alle sovvenzioni proviene dal National Basic Research Program of China (2017YFA0504204, 2018YFA0107604), dalla National Natural Science Foundation of China (31630095) e dal Center for Life Sciences dell'Università di Tsinghua.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| UV crosslinker | UVP | HL-2000 HybrilLinker | |
| Affinity Purification Beads | |||
| ANTI-FLAG beads | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| Streptavidin beads | Invitrogen | 112.06D | |
| Reagents | |||
| 10x PBS | Gibco | 70013032 | |
| 3 M NaOAc | Ambion | AM9740 | |
| 3 x FLAG peptide | Sigma-Aldrich | F4799 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| CIP | NEB | M0290S | CIP buffer is in the same package. |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Gel purification kit | QIAGEN | 28704 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 449172 | |
| MNase | NEB | M0247S | |
| NP-40 | Amresco | M158-500ML | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 10837091001 | |
| Porteinase K | TAKARA | 9033 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | NEB | 0492S | |
| reverse trancriptase (SupperScriptIII) | Invitrogen | 18080093 | |
| RNA isolation reagent (Trizol) | Invitrogen | 15596018 | |
| RNase Inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
| RQ1 Dnase | Promega | M6101 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | PNK buffer is in the same package. |
| T4 RNA ligaes | ThermoFisher | EL0021 | T4 RNA ligase buffer and BSA are in the same package. |
| T4 RNA ligase2, truncated | NEB | M0242S | T4 RNA ligase buffer and 50% PEG are in the same package. |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200072 | |
| Urea | Sigma-Aldrich | 208884 | |
| mESC culture medium | |||
| DMEM (80%) | Gibco | 11965126 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| FCS (15%) | Hyclone | ||
| Glutamax (1%) | Gibco | 35050061 | |
| LIF | purified recombinant protein; 10,000 fold dilution | ||
| NEAA (1%) | Gibco | 11140050 | |
| Nucleoside mix (1%) | Millipore | ES-008-D | |
| Penicillin-Streptomycin (1%) | Gibco | 15140122 | |
| Kit | |||
| DNA gel extraction kit | QIAGEN | 28704 |
References
- Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates. Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).
- Guallar, D., et al. RNA-dependent chromatin targeting of TET2 for endogenous retrovirus control in pluripotent stem cells. Nature Genetics. 50 (3), 443-451 (2018).
- Holmqvist, E., Li, L., Bischler, T., Barquist, L., Vogel, J. Global Maps of ProQ Binding In Vivo Reveal Target Recognition via RNA Structure and Stability Control at mRNA 3' Ends. Molecular Cell. 70 (5), 971-982 (2018).
- Wei, C., et al. RBFox2 Binds Nascent RNA to Globally Regulate Polycomb Complex 2 Targeting in Mammalian Genomes. Molecular Cell. 62 (6), 875-889 (2016).
- Kim, D. S., et al. Activation of PARP-1 by snoRNAs Controls Ribosome Biogenesis and Cell Growth via the RNA Helicase DDX21. Molecular Cell. 75 (6), 1270-1285 (2019).
- Yao, R. W., et al. Nascent Pre-rRNA Sorting via Phase Separation Drives the Assembly of Dense Fibrillar Components in the Human Nucleolus. Molecular Cell. 76 (5), 767-783 (2019).
- Licatalosi, D. D., et al. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).
- Moore, M. J., et al. Mapping Argonaute and conventional RNA-binding protein interactions with RNA at single-nucleotide resolution using HITS-CLIP and CIMS analysis. Nature Protocols. 9 (2), 263-293 (2014).
- Konig, J., et al. iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments. (50), e2638 (2011).
- Zarnegar, B. J., et al. irCLIP platform for efficient characterization of protein-RNA interactions. Nature Methods. 13 (6), 489-492 (2016).
- Van Nostrand, E. L., et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).
- Hafner, M., et al. PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins. Journal of Visualized Experiments. (41), e2034 (2010).
- de Boer, E., et al. Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7480-7485 (2003).
- Bi, X., et al. RNA Targets Ribogenesis Factor WDR43 to Chromatin for Transcription and Pluripotency Control. Molecular Cell. 75 (1), 102-116 (2019).
- Heo, I., et al. TUT4 in concert with Lin28 suppresses microRNA biogenesis through pre-microRNA uridylation. Cell. 138 (4), 696-708 (2009).
- Cho, J., et al. LIN28A Is a Suppressor of ER-Associated Translation in Embryonic Stem Cells. Cell. 151 (4), 765-777 (2012).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Zhao, C., et al. Tissue specific roles for the ribosome biogenesis factor Wdr43 in zebrafish development. PLoS Genetics. 10 (1), 1004074 (2014).
- Wilbert, M. L., et al. LIN28 binds messenger RNAs at GGAGA motifs and regulates splicing factor abundance. Molecular Cell. 48 (2), 195-206 (2012).
- Hunziker, M., et al. UtpA and UtpB chaperone nascent pre-ribosomal RNA and U3 snoRNA to initiate eukaryotic ribosome assembly. Nature Communications. 7, 12090 (2016).
- Kim, J., Cantor, A. B., Orkin, S. H., Wang, J. L. Use of in vivo biotinylation to study protein-protein and protein-DNA interactions in mouse embryonic stem cells. Nature Protocols. 4 (4), 506-517 (2009).
- Li, Z., Michael, I. P., Zhou, D., Nagy, A., Rini, J. M. Simple piggyBac transposon-based mammalian cell expression system for inducible protein production. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 5004-5009 (2013).
- Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).
- Aktas, T., et al. DHX9 suppresses RNA processing defects originating from the Alu invasion of the human genome. Nature. 544 (7648), 115-119 (2017).
- Xu, Q., et al. Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis. Journal of Visualized Experiments. (147), e59681 (2019).
