Summary
Burada, memeli hücrelerinde RNA bağlayıcı proteinlerin (RRB) RNA hedeflerini belirlemek için FLAG-biotin tandem saflaştırma ile FbioCLIP-seq adı verilen değiştirilmiş bir CLIP-seq protokolü salıyoruz.
Abstract
RNA ve RNA bağlayıcı proteinler (RRB' ler) birden fazla biyolojik işlemi kontrol eder. RNA'ların ve RRB'lerin mekansal ve zamansal düzenlemesi bu süreçlerin hassas bir şekilde düzenlenmesinin temelini oluşturur. ENdojen protein-RNA etkileşimlerini UV çapraz bağlanması ve ardından immünoprepitasyon ile yakalamak için CLIP-seq (çapraz bağlama ve immünopredimasyon) adı verilen bir strateji geliştirilmiştir. RBP çalışmasında konvansiyonel CLIP-seq yönteminin yaygın kullanımına rağmen, CLIP yöntemi yüksek kaliteli antikorların bulunabilirliği, saflaştırılmış RP'lerden potansiyel kirleticimaddeler, izotop manipülasyongereksinimi ve sıkıcı bir deneysel işlem sırasında potansiyel bilgi kaybı ile sınırlıdır. Burada FLAG-biotin etiketi tandem arınma kullanarak FbioCLIP-seq adlı değiştirilmiş bir CLIP-seq yöntemi ni tanımlıyoruz. Tandem arınma ve sıkı yıkama koşulları sayesinde, hemen hemen tüm etkileşen RNA bağlayıcı proteinler kaldırılır. Böylece, dolaylı olarak bu copurified RbPs aracılık rna'lar da azalır. FbioCLIP-seq metodumuz, sds-PAGE ve membran transfer prosedürleri olmadan doğrudan proteine bağlı RNA'ların izotopsuz ve proteine özgü antikorsuz bir şekilde etkin bir şekilde algılanmasını sağlar.
Introduction
RNA ve RNA bağlayıcı proteinler (RRB' ler) birleştirme, çeviri, ribozom biyogenez, epigenetik regülasyon ve hücre kaderi geçişi1,2,3,4,5,6gibi çeşitli hücresel süreçleri kontrol eder. Bu süreçlerin hassas mekanizmaları RNA'ların ve RRB'lerin eşsiz mekansal ve zamansal düzenlemesine bağlıdır. Bu nedenle, rna regülasyonunu moleküler düzeyde anlama yolunda önemli bir adım, RP'lerin bağlayıcı bölgeleri hakkındaki konumsal bilgileri ortaya çıkarmaktır.
Bir strateji çapraz bağlama ve immünoprepitasyon olarak anılacaktır (CLIP-seq)uvçapraz bağlantı ile protein-RNA etkileşimleri yakalamak için geliştirilmiştir ilgi protein immünopreside ani 7. Metodolojinin en önemli özelliği, Bir RNA bağlayıcı protein ve doğrudan bağlı RNA molekülleri arasında kovalent çapraz bağlantıların indüksiyonudur (~ 1 şiçinde) UV ışınlama8. RBP ayak izleri, genellikle 30−60 nt çözünürlüğe sahip CLIP etiket kümeleme ve tepe arama ile belirlenebilir. Alternatif olarak, CLIP'in ters transkripsiyon adımı, tek nükleotid çözünürlükte RNA'larda protein bağlama sitelerinin tanımlanmasına olanak tanıyan çapraz bağlama sitelerine indels (eklemeler veya silmeler) veya ikamelere yol açabilir. Novoalign ve CIMS gibi boru hatları CLIP-seq8yüksek iş bölümü sekanslama sonuçlarının analizi için geliştirilmiştir. Çeşitli modifiye CLIP-seq yöntemleri de önerilmiştir, bireysel nükleotit çözünürlük çapraz bağlama ve immünoprepitasyon dahil (iCLIP), gelişmiş CLIP (eCLIP), irCLIP, ve fotoaktipabl ribonükleoside gelişmiş çapraz bağlama ve immünopredi (PAR-CLIP)9,10,11,12.
RRB'lerin çalışmasında geleneksel CLIP-seq yöntemlerinin yaygın kullanımına rağmen, CLIP yöntemlerinin çeşitli dezavantajları vardır. İlk olarak, sıkıcı denatüre jel elektroforez ve membran transferi prosedürü bilgi kaybına yol açabilir, ve sınırlı dizi karmaşıklığına neden. İkinci olarak, proteine özgü antikor bazlı CLIP yöntemi tek bir hedef protein yerine bir protein kompleksini aşağı çekebilir, bu da saflaştırılmış RP'lerden yanlış pozitif protein-RNA etkileşimlerine yol açabilir. Dördüncü olarak, geleneksel CLIP yöntemi proteine bağlı RNA'ları etiketlemek için radiolabeled ATP gerektirir.
Streptavidin biyotinylated proteinlere yüksek yakınlık belirli proteinler veya protein kompleksleri arındırmak için çok güçlü bir yaklaşım yapar. Memeli hücrelerinde ektonik olarak ifade edilen bakteriyel BirA biotin ligaz ile yapay peptit dizilimini taşıyan proteinlerin verimli biyotinylation vivo biotin arıtma gerçekleştirmek için etkili bir strateji yapar13. Biz modifiye CLIP-seq yöntemi FbioCLIP-seq (FLAG-Biotin aracılı Cross-lmürekkep ve benmmuno p recipitation yüksek iş itme takip) FLAG-biotin etiket tandem arıtma14 kullanarak geliştirdi (Şekil 1). Tandem arınma ve sıkı yıkama koşulları sayesinde, hemen hemen tüm etkileşen RRB'ler çıkarılır (Şekil 2). Sıkı yıkama koşulları, emek yoğun ve teknik açıdan zorlu olan SDS-PAGE ve membran transferinin de atlatılmasına olanak sağlar. Ve eCLIP ve irCLIP benzer, FbioCLIP-seq yöntemi izotop-free. Jel çalışan ve transfer adımları atlayarak bilgi kaybını önler, otantik protein-RNA etkileşimleri bozulmadan tutar ve kütüphane karmaşıklığını artırır. Ayrıca, etiketleme sisteminin yüksek verimlilik yüksek kaliteli antikorlar mevcut olmadan RbPs için iyi bir seçim yapar.
Burada memeli hücreleri için FbioCLIP-seq protokolü adım adım açıklamasını salıyoruz. Kısaca, hücreler çapraz bağlı 254 nm UV, hücre lysis ve FLAG immünopresipitasyon takip (FLAG-IP). Daha sonra, protein-RNA kompleksleri biotin afinite yakalama ile daha da saflaştırılır ve RNA'lar MNase ile kısmi sindirim ile parçalanır. Daha sonra proteine bağlı RNA fosforilasyona ve 3' linker ile bağlanır. RNA PNK ile fosforlandırıldıktan ve proteinaz K sindirimi ile eluted sonra 5' RNA bağlayıcı eklenir. Ters transkripsiyondan sonra, proteine bağlı RNA sinyalleri PCR ile yükseltilir ve agarose jel saflaştırma ile saflaştırılır. Fbio CLIP-seq sonucunu örneklemek için iki RRB seçildi. LIN28 mikroRNA olgunlaşma, protein çevirisi ve hücre yeniden programlama15,16,17dahil iyi karakterize RNA bağlayıcı proteindir. WDR43 ribozom biyogenez, ökaryotik transkripsiyon ve embriyonik kök hücre pluripotency kontrol koordine etmek için düşünülen bir WD40 etki alanı içeren protein14,18. CLIP-seq ile LIN28 için daha önce bildirilen sonuçlarla tutarlı olarak, FbioCLIP-seq mikroRNA mir-let7g ve mRNA'larda "GGAG" motifleri üzerinde LIN28'in bağlayıcı alanlarını ortaya çıkarır16,19 (Şekil 3). WDR43 FbioCLIP-seq ayrıca WDR43'ün bağlayıcı tercihini 5' harici transkripsiyonlu spacers (5'-ETS) öncesi rRNA'lar20 (Şekil 4)ile belirlemİştir. Bu sonuçlar FbioCLIP-seq yönteminin güvenilirliğini doğrular.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hücre hattı yapımı
- Bir PiggyBac vektör pPiggyBac-FLAG-bio-[cDNA ilgi]-(Hygromycin-dirençli) plazmid içine ilgi gen klon bir FLAG-biotin epitop13taşıyan,21 bir FLAG-biotin etiketi rbp erimiş ifade etmek(FBRBP).
- BirA enzimini ifade eden bir hücre hattına pBase vektörü ile vektörü ifade eden FBRBP'yi Cotransfect22.
NOT: Bu çalışmada, FBRBP geni entegre bir BirA ekspresyon vektörü21taşıyan fare embriyonik kök hücrelerine (mESCs) geçirilmiştir. Alternatif olarak, FBRBP ifade vektörü pBase ve pPiggyBac-BirA-V5 ile birlikte hücrelere cotransfected olabilir. - MESC'deki hücreleri jelatinize yemeklerde büyütün ve 37 °C'de %5 CO2'de mES kültür ortamında(Malzeme Tablosu)koruyun. Higromisin b (100 μg/mL) ile transfected hücreleri seçin 1 hafta.
- İlaç seçiminden sonra, SDS yükleme tamponu(Tablo 1)ile hasat hücreleri ve sırasıyla flag antikor ve streptavidin-HRP ile genin etiketlenmesi ve ekspresyonu onaylamak için Batı leke23 kullanın.
2. Çapraz bağlama
- Plaka ~3 x 106 mES hücreleri 10 cm plaka 1 gün önce böylece hücreler hasat edildiğinde % 70−90 biraraya büyür (~ 5−10 milyon hücre örnek başına).
- Ortamı vakumla çıkarın. Hücreleri oda sıcaklığında 2 dakika (RT) için %0,25 tripsin-EDTA ile tedavi edin ve trypsini 4 mL taze mESC ortamı ile söndürün. Hücreleri 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. 4 °C'de 3 dk 3 00 x g'da hücreleri santrifüj le aşağı çevirin ve süpernatantı çıkarın.
- 4 mL soğuk PBS ile hücreleri askıya alın ve çapraz bağlama için hücreleri 10 cm plakaya geri plakalayın. Hücreleri 254 nm UV ışığı ile radyasyonla birbirine bağla (UV çapraz bağlantıcihazını 400 mJ/cm2parametreye göre ayarlayın).
NOT: Hücre monolayers için, hücreler trypsin tedavisinden önce doğrudan plaka üzerinde UV ışığı ile çapraz bağlantılı olabilir. - Çapraz bağlı hücreleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın. 4 °C'de 3 dk 3 00 x g'da santrifüj ile aşağı doğru çevirin ve süpernatantı çıkarın.
NOT: Çapraz bağlı hücre peleti kullanıma kadar -80 °C'de saklanabilir.
3. Hücre lisat hazırlığı
- 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 1/500 proteaz inhibitörü kokteyli ve 400 U/mL RNase inhibitörü ile taze olarak desteklenen 500 μL yıkama tamponu A(Tablo 1)içeren hücreleri lyse. Hücreleri 1,5 mL'lik bir RNase içermeyen tüpe aktarın. Hücreleri 30−60 dk boyunca bir rotor üzerinde 4 °C'de hafif bir dönüşle kuluçkaya yatırın.
- 10 dakika boyunca 37 °C'de 30 μL DNase I ile lysate'yi tedavi edin. 0,5 M EDTA 4 μL ekleyerek reaksiyonu durdurun. Çözünmez peleti 4 °C'de 20 dakika boyunca 12.000 x g aşağı doğru çevirin ve supernatant'ı 1,5 mL'lik yeni bir önceden soğutulmuş tüpe aktarın.
NOT: Hemen kullanım için, buz üzerinde tutun. Süpernatant hemen kullanılmayacaksa, kullanıma kadar -80 °C'de saklayın.
4. BAYRAK boncuk hazırlama
- Taze 1,5 mL'lik bir tüpe numune başına 40 μL bulamaç FLAG boncukekleyin.
- Boncukları 0,5 mL buz gibi yıkama tamponu A ile hızlıca yıkayın ve 4 °C'de 2 dakika boyunca 3.000 x g aşağı doğru döndürün.
- Adım 4.2'yi bir kez tekrarlayın. 4 °C'de 2 dk için 3.000 x g ile boncukaşağı çevirin. Arabelleği dar uçlu pipet ucuyla dikkatlice çıkarın. Boncukları çıkarmaktan kaçının.
5. İmmünyağış
- Hücre lisatını 3.2.adımdan önceden dengelendirilmiş BAYRAK boncuklarına aktarın. Tüm numuneleri 4 °C'de bir silindir çalkalayıcıüzerinde hafifçe döndürün. BAYRAK boncuklarını 2−4 saat veya bir gecede lysate ile kuluçkaya yatırın.
- 3.000 x g 2 dakika boncuk santrifüj ve supernatant kaldırın.
- Boncukları 0,5 mL önceden soğutulmuş yıkama tamponu A'yı 4 °C'de bir rotatörde 5 dakika kuluçka ya da 2 dk için 3.000 x g ile çevirin ve süpernatantı çıkarın. Yıkama 1x tekrarlayın.
- Adım 5.3'te açıklandığı gibi 2x yıkamayı önceden soğutulmuş yıkama tamponu B 0,5 mL ile tekrarlayın(Tablo 1).
6. 3x BAYRAK peptid ile elüsyon
- 1 mg 3x FLAG peptidini 5 mL yıkama tamponu A ile 200 ng/mL'lik son konsantrasyona eriterek 3x FLAG elüsyonu çözeltisini hazırlayın.
- 2 dk için 3.000 x g ile adım 5.4 bayrak boncuk aşağı spin. Supernatant dikkatle çıkarın. Supernatant çoğu dar bir uç pipet ucu kullanılarak kaldırılır emin olun.
- Her numuneye 200 μL 3x FLAG elüsasyon çözeltisi ekleyin. Numuneleri 4 °C'de 30 dk hafif bir dönüşle kuluçkaya yatırın. 3.000 x g2 dakika için BAYRAK boncuk aşağı spin . Supernatants'ı taze tüplere aktarın.
- 6.2 ve 6.3 adımlarında açıklandığı gibi elütion 2x'i tekrarlayın ve eluentleri bir araya getirin. FLAG-IP'nin verimliliğini kontrol etmek için batı leke analizi veya gümüş boyama için elüentlerin %5'inden tasarruf edin.
7. Streptavidin boncuk hazırlama
- Her numune için 50 μL streptavidin boncuk bulamacı hazırlayın. 30 s için bir manyetik stand ile boncuk toplamak ve bir pipet ucu ile supernatant kaldırın.
- Boncukları 0,5 mL buz gibi yıkama tamponu A ile hızlıbir şekilde yıkayın ve 30 s'lik manyetik standla boncukları toplayın.
- Yıkama 1x tekrarlayın. Yıkamadan sonra supernatant çıkarın.
8. Biotin afinite arınma
- Havuzlu eluentleri adım 6.4'ten streptavidin boncuklarına 7.3 adımdan aktarın ve numuneleri 4 °C'de 1−3 saat veya bir gece boyunca hafifçe döndürün.
- 30 s için bir manyetik stand ile boncuk toplamak ve supernatant kaldırın. Boncukları 5 dakika boyunca RT'de hafif çetreleyerek 500 μL yıkama tamponc(Tablo 1)ile yıkayın.
- Manyetik standı ile boncuk toplamak ve supernatant kaldırın. 5 dakika BOYUNCA RT'de dönerek boncukları 500 μL yıkama tamponu D(Tablo 1)ile yıkayın.
- Manyetik standı ile boncuk toplamak ve supernatant kaldırın. Boncukları 500 μL buz gibi PNK tamponuyla hızlıca yıkayın (Tablo 1).
9. Kısmi RNA sindirimi
- MNase reaksiyon arabelleği ile MNase 105kat seyreltme olun (Tablo 1). Her numuneye 100 μL MNase çözeltisi ekleyin. 10 dakika boyunca 1.200 rpm (5 s run, 30 s stop) olarak ayarlanmış bir termal karıştırıcı ile 37 °C'deki boncukları girdaplayın, 30 s'lik manyetik standla boncukları toplayın ve süpernatantı çıkarın.
NOT: MNase konsantrasyonu farklı RNA bağlayıcı proteinler için optimize edilmelidir. RNA'ları 30−50 nt parçalara sığdırabilen (son kitaplığın ekleme boyutuna göre belirlenir) MNase konsantrasyonu en uygun uymaktadır. - Boncukları 2x'i 500 μL buz gibi PNK+EGTA tamponuile hızlıca yıkayın (Tablo 1). Bir manyetik stand ile boncuk toplamak ve her yıkama adımı arasında supernatant kaldırın.
- Boncukları 2x 500 μL yıkama tamponcuğu C ile 5 dakika boyunca RT'de hafif çetren olarak yıkayın. Daha sonra boncukları 500 μL buz gibi PNK tamponuyla hızlıca yıkayın.
10. RNA'nın fosforilasyonunun bozulması
- Bir buzağı bağırsağı fosfataz (CIP) reaksiyon karışımı ile 8 μL 10x CIP tampon(Tablo Malzemeler), 3 μL CIP enzimve 69 ° L su yapın. Reaksiyon başına toplam hacim 80 μL'dir.
- Bir manyetik stand ile boncuk toplamak ve tampon kaldırın. Boncuklara CIP reaksiyon karışımını ekleyin. 10 dk için 1.200 rpm (5 s run, 30 s stop) ayarlanmış bir termal karıştırıcı ile 37 °C'de boncuk girdap.
- Boncukları 500 μL buz gibi PNK+EGTA tamponuyla hızlıca yıkayın. Boncukları 500 μL buz gibi PNK tamponuyla hızlıca yıkayın.
11. 3' bağlayıcı ligasyonu
- 4 μL 20 μM 3' linker, 4 μL 10x T4 RNA ligaz tamponu, 4 μL %50 PEG8000, 2 μL T4 RNA ligase 2 (kesilmiş) ve 26 μL su ile 3' linker karışımı yapın. Reaksiyon başına toplam hacim 40 μL'dir.
- Bir manyetik stand ile adım 10.3 boncuk toplamak ve tampon kaldırın. Boncuklara 3' linker ligation karışımından 40 μL ekleyin. 16 °C'de 16 °C'de 1.200 rpm (5 s run, 30 s stop) olarak ayarlanmış bir termal mikser ile 3 saat veya bir gecede boncukları girdap.
- Boncukları 500 μL buz gibi PNK+EGTA tamponuyla hızlıca yıkayın. Boncukları 500 μL buz gibi PNK tamponuyla hızlıca yıkayın.
12. PNK tedavisi
- 4 μL 10x PNK tamponu, 2 μL T4 PNK enzimi, 1 0 mM ATP ve 33 μL su ile PNK karışımı yapın. Reaksiyon başına toplam hacim 40 μL'dir.
- Bir manyetik stand ile boncuk toplamak ve tampon kaldırın. Boncuklara 40 μL PNK karışımı ekleyin. 10 dk için 1.200 rpm (5 s run, 30 s stop) ayarlanmış bir termal karıştırıcı ile 37 °C'de boncukları yavaşça girdap.
- Boncukları 500 μL buz gibi PNK+EGTA tamponu ile hızlıca yıkayın.
- Boncukları 500 μL buz gibi PNK tamponu yla hızlıca yıkayın. İmmünoenjin verimliliğini doğrulamak için boncukların %5'ini Batı veya gümüş boyama analizine ayırın.
13. RNA yalıtımı
- Bir manyetik stand ile adım 12.4 boncuk toplamak ve tampon kaldırın. Proteinaz K sindirim tampon200 μL ekleyin (Tablo 1). 37 °C'de 30 dk boncukları 1.200 rpm (5 s run, 30 s stop) olarak ayarlanmış bir termal mikser ile girdap. Manyetik boncukları izole edin ve deney için süpernatant'ı alın.
- Adım 13.1'den itibaren supernatant'a 400 μL RNA izolasyon reaktifi(Malzeme Tablosu)ekleyin, iyice karıştırın ve 5 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Kloroform 80 μL ekleyin ve iyice karıştırın ve sonra 5 dakika buz üzerinde kuluçka. 10 dk 4 °C için 12.000 x g ile aşağı doğru çevirin.
NOT: Bu adım kimyasal bir başlık içinde yapılmalıdır. - Supernatant alın (~ 500 μL) ve izopropanol iki cilt ekleyin:etanol karışımı (1:1), 3 M sodyum asetat 1/10 hacmi (pH = 5.5), ve glikojen 1 μL. -20 °C'de 2 saat dondurun. 20 dk için 12.000 x g ile 4 °C'de santrifüj.
- Pelet 2x buz gibi% 70 etanol ile yıkayın. 5 dk için 12.000 x g ile 4 °C'de pelet aşağı çevirin. Supernatant çıkarın ve pelet kuru. RNA'ları 5 μL'lik RNase içermeyen H2O'da çözün.
14. 5' RNA bağlayıcı ligasyonu
- 1 μL 10x T4 RNA ligaz tamponu, 0,5 μL BSA (1 μg/μL), 1 00 mM ATP, 1 μL RNa sinhibitör ve 0,5 μL T4 RNA ligaz ile 5'l'lik RNA ligasyon karışımı yapın. Reaksiyon başına toplam hacim 4 μL'dir.
- RNA'ya 1μL 5' 20 μM RNA bağlantı sını 13.4 adımdan ekleyin, 70 °C'de 2 dakika ısıtarak RNA'yı dennature yapın ve hemen buz üzerinde soğuyun.
- Adım 14.2'den Itibaren RNA'ya 5' RNA ligasyon karışımını ekleyin. Bir gecede 16 °C'de kuluçkaya yatırın.
15. Ters transkripsiyon
- Bölüm 13'te açıklandığı gibi RNA'ları arındırın ve RNA'yı 11,5 μL RNase içermeyen su ile eritin.
- Saflaştırılmış RNA'ya 1 μL 10 μM ters transkripsiyon astarı, 70 °C'de 2 dk ısı ekleyin ve hemen buz üzerinde soğuyun.
- 4 μL 5x ters transkripsiyon tamponu, 1 0 mM dNTPs 1 μL, 0,1 M DTT 1L, RNase inhibitörü 1 μL ve 0,5 μL ters transkripsiyon(Malzeme Tablosu)ile ters transkripsiyon karışımı yapın. Reaksiyon başına toplam hacim 7.5 μL'dir.
- RNA'ya 7,5 μL ters transkripsiyon karışımı ekleyin, 50 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın ve 10 dk boyunca 70 °C'de kuluçka ya da reaksiyonu durdurun. 4 °C'de bırakın.
16. PCR amplifikasyon
- 15 μL 2x PCR ana karışımı(Malzeme Tablosu),15.4 adımdan 5 μL cDNA, 10 μM ileri astar 1(Tablo 2), 0,6 μL 10 μM ters astar 1 (Tablo 2) ve 8.8 μL H2O ile PCR amplifikasyon karışımı yapın. Toplam hacim 30 μL'dir.
- CDNA'yı aşağıdaki ayarlarla yükseltin: 98 °C 30 s, 98 °C 10 s, 60 °C 30 s, 72 °C 30 s (15−20 devir için 2−4 tekrar adımları), 72 °C 2 dk ve 4 °C'de tutun. PCR ürününü %2−3 agarose jel üzerinde çalıştırın. ~100−150 bp'nin DNA'sını kesin, jel ekstraksiyon kiti(Malzeme Tablosu)ile DNA ayıklayın ve 20 μL su ile DNA'yı eleyin.
- Saflaştırılmış PCR ürününün 3 μL'sini alın, ileri astar 2(Tablo 2) ve ters astar 2 (indeks astarı) ile yükseltin; Tablo 2) dizin dizilerini tanıtmak için beş döngü için adım 16.2'de açıklandığı gibi. 16.2 adımda açıklandığı gibi PCR ürün arındırın.
- Kitaplığı yüksek iş dizisi sıralama platformuyla sırala.
17. Biyoinformatik analizi
- Daha önce açıklandığı gibi ticari programları kullanarak veri analizi gerçekleştirin8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FbioCLIP-seq prosedürünün şematik gösterimi Şekil 1'degösterilmiştir. FLAG aracılı veya streptavidin aracılı tek adımlı arınma ile karşılaştırıldığında, FLAG-biotin tandem saflaştırma, dolaylı protein-RNA etkileşimlerinin kontaminasyonunu önleyerek hemen hemen tüm saflaştırılmış proteinleri ortadan kaldırmış(Şekil 2). LIN28 ve WDR43 için FbioCLIP-seq için temsili sonuçlar Şekil 3 ve Şekil 4'tegösterilmiştir. Biz MM'ler ile LIN28 veya WDR43 FbioCLIP-seq gerçekleştirdi. Şekil 3A ön let-7g LIN28 ve WDR43 FbioCLIP-seq parça görünümünü gösterir. Pre-let-7g'de bildirilen GGAG motifi ve FbioCLIP-seq tarafından tanımlanan çapraz bağlantılı siteler Şekil 3B'degösterilmiştir. CIMS algoritması tarafından çağrılan mutasyon bölgelerinin sınıflandırılması LIN28'in G nükleotitine bağlanmayı ve çapraz bağlantıyı tercih ettiğini göstermiştir(Şekil 3C). LIN28 FbioCLIP-seq bağlama alanlarındaki zenginleştirilmiş RNA motifleri Şekil 3D'degösterilmiştir. Lin28 ve HNRNPU'da FbioCLIP-seq'nin daha fazla temsili izi Şekil 3E'degösterilmiştir. WDR43 ve LIN28 FbioCLIP-seq karşılaştırması Rn45 pre-rRNA locus(Şekil 4)farklı bağlama desenleri gösterdi. Şekil 5, hücre hattı yapımından sonra FLAG ve biotin etiket doğrulamasının temsili sonuçlarını gösterir. Şekil 6 verimli (Şekil 6A)veya başarısız (Şekil 6B) FLAG-IP ve FLAG-biotin tandem arınma temsil sonuçlarını gösterir.
Şekil 1: FbioCLIP şematik gösterimi. UV-çapraz bağlı hücreler (adım 1) lysis tampon (adım 2) lysed vardır. FBRBP-RNA kompleksi anti-FLAG recine (adım 3−4) kullanılarak immünoppresipitated edilir. Eluted protein-RNA kompleksi streptavidin boncukları ile daha da saflaştırılır ve protein-protein etkileşimlerini ortadan kaldırmak için sıkı yıkama koşulları kullanılır (adım 5−6). RNA'lar kısmen MNase tarafından sindirilir ve proteine bağlı olmayan RNA parçaları daha fazla yıkanarak çıkarılır (adım 7−8). RNA'lar daha sonra fosforlu olarak tanımlanır ve 3' linker ile bağlanır (adım 9). Daha sonra RNA'lar fosforilasyona ve proteinaz K tedavisi ile eluted (adım 10). Saflaştırılmış RNA'lar 6 nt rastgele barkod içeren 5'rNA bağlayıcısı ile bağlanır (adım 11). Ters transkripsiyondan (adım 12) sonra, cDNA kitaplığı PCR ile yükseltilir ve yüksek işlem li sıralama yapılır (adım 13−15). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: FLAG-biotin tandem arınma kopurified proteinleri kaldırır. FBWDR43'ün gümüş boyama, FLAG veya biotin aracılı tek adımlı arınmada sunulan hemen hemen tüm etkileşim proteinlerin, tandem saflaştırmada sıkı yıkama dan sonra ortadan kaldırıldığını göstermiştir. BAYRAK: BAYRAK aracılı yakınlık arınma, SA: streptavidin aracılı biotin arınma, tandem: FLAG-biotin tandem arınma. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: LIN28 FbioCLIP-seq temsilci sonuçları. (A) LIN28 FbioCLIP-seq etiketleri ve mutasyon izleme görünümü öncesi-let-7g RNA CIMS tarafından çağrılan okur. Gösterilen etiketler FbioCLIP-seq benzersiz okur. Toplamda, LIN28 FbioCLIP-seq için ~ 7.7 milyon benzersiz okuma ve WDR43 FbioCLIP-seq için ~ 2.2 000.000 benzersiz okuma gereksiz okumalar çıkardıktan sonra alındı. (B) LIN28 FbioCLIP-seq tarafından pre-let7-g RNA GGAG motifi üzerinde Çapraz bağlantılı siteler. Oklar çapraz bağlantılı siteleri gösterir. (C) Mutasyona uğramış nükleotitlerin farklı mutasyon türlerindeki yüzdesi. G en sık çapraz bağlı ve mutasyona uğramış nükleotittir. Rastgele: dört nükleotitin rastgele dağılımı. (D) Homer algoritması ile FbioCLIP-seq tarafından LIN28 bağlama motiflerini tahmin edilmiştir. (E) LIN28 ve HNRNPU mRNA'larda LIN28 FbioCLIP-seq'nin görüntülerini izleyin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Rn45S locus wdr43 ve LIN28 FbioCLIP-seq temsilcisi sonuçları. Rn45S locus wdr43 ve LIN28 FbioCLIP-seq parça görünümü. WDR43 ve LIN28 pre-rRNA üzerinde farklı bağlama desenleri gösterdi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: FLAG ve biotin etiket doğrulamasının temsili sonuçları. FLAG veya biotin Western leke hücre hatlarının etiketleme doğrular. Klonlar #1, #2, ve #4 etiketli proteinin kötü ifade sini gösterirken, #3 etiketlenmiş proteinin zayıf ekspresyonu gösterdi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: FLAG immünopresipitasyonu ve tandem saflaştırma verimlilik doğrulamasının temsili sonuçları. (A) Bayrak ve biotin afinite saflaştırma ile etiketli proteinin etkin saflaştırılması örneği. (B) Etiketli proteinin BAYRAK ve biyotin afinite saflaştırma sıyrıklılığı ile verimsiz saflaştırma örneği. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Arabellek | Kompozisyon |
| SDS yükleme arabelleği | 50 mM Tris pH 6.8, %2 SDS, %0.1 bromofenolblue, %10 gliserol, 100 mM DTT |
| Yıkama tamponu A | 1x PBS, %0.5 NP-40, %0.5 sodyum deoksikolat, %0.1 SDS |
| Yıkama tamponu B | 5x PBS, %0.5 NP-40, %0.5 sodyum deoksikolat, %0.1 SDS |
| Yıkama tamponC | 50 mM Tris pH 7.4, %2 SDS |
| Yıkama tamponu D | 5x PBS, %0.5 NP-40, %0.5 SDS, 1 M üre |
| PNK arabelleği | 50 mM Tris pH 7.4, %0.5 NP-40, 10 mM MgCl2 |
| MNase reaksiyon arabelleği | 10 mM Tris pH 8.0, 1 mM CaCl2 |
| PNK+EGTA arabelleği | 50 mM Tris pH 7.4, %0.5 NP-40, 10 mM EGTA |
| Proteinaz K sindirim tamponu | 50 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 50 mM NaCl, %0.5 SDS, 20 g proteinaz K |
Tablo 1: Bu çalışmada kullanılan arabelleklerin bileşimi.
| Oligo adı | Sıra | Notlar | ||||
| 3' bağlayıcı | rAppAGATCGGAAGAGCACACGTCT-NH2 | |||||
| 5' RNA bağlantı | GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGUCNNNNN | |||||
| RT astar | AGACGTGTGCTCtTCCGATCT | |||||
| İleri astar 1 | GTTCAGAGTTCTACACACCGACGATC | |||||
| Ters astar 1 | AGACGTGTGCTCtTCCGATCT | |||||
| İleri astar 2 | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAC | |||||
| Ters astar 2 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTTTCCGATC-s-T | Kırmızı ve altı çizili diziler Illumina dizisini temsil eder. | ||||
Tablo 2: Bu çalışmada kullanılan oligonükleotidler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, protein-RNA komplekslerinin tandem arınmasını gerçekleştirmek için FLAG-biotin çift etiketleme sisteminden yararlanarak FbioCLIP-seq adı verilen değiştirilmiş bir CLIP-seq yöntemini tanıtıyoruz. FLAG-biotin çift etiketleme sistemi protein-protein ve protein-DNA etkileşimleri13,21belirlenmesinde güçlü olduğu gösterilmiştir. Burada, bu sistemin proteinlerle etkileşime girerken RNA'ları tanımlamada yüksek özgüllüğünü ve rahatlığını gösteriyoruz. Tandem arınma ve sıkı yıkama koşulları sayesinde, daha fazla protein-RNA etkileşimi korunmuş ve aynı komplekste RRB'ler tarafından aracılık edilen kontamine RNA sinyallerini önlemek için zorlu SDS-PAGE ve membran transfer adımını atladık. Ayrıca, bu adımların bypass radyoetiketli ATP ile RNA etiketleme önler. Bu yordamı çok daha kolay hale getirir. Yayınımızın hazırlanması sırasında uvCLAP adı verilen benzer bir yöntemin de24önerildiğini unutmayın.
Protokolün başarısı için birkaç adım önemlidir. İlk olarak, etiketli proteinin biyotinylasyonunun etkinliği deneyden önce Batı lekeleri ile teyit edilmelidir(Şekil 5). İkinci olarak, Arınmış proteinin 3 x FLAG peptid tarafından verimli bir şekilde elüsülasyonu, RNA sinyallerinin başarılı bir şekilde amplifikasyonu için gereklidir. 12.4. basamaktaki boncuklar, iyi miktarda hedef protein indiğini garanti altına almak için Batı lekeveya gümüş boyama ile analiz edilmelidir(Şekil 6). Verimliliği artırmak için, ya adım 6 500 ng / mL 3 x FLAG peptid konsantrasyonu artırmak ya da daha iyi üretim elde etmek için elüsyon adımı birden çok kez tekrarlayın. Üçüncü olarak, ilk denemede her protein için MNase konsantrasyonu titre etmek en uygunudur. Aşırı hazımsızlık veya yetersiz tedavi uygun olmayan boyutlarda RNA parçalarına yol açabilir. Son olarak, protokol yakınlık arınma ve son derece sıkı yıkama iki tur içerir. Sadece az miktarda saflaştırılmış RNA alınır. Reaktif RNase içermez ve MNase tedavi adımından sonra RNA bozulmasını önlemelidir.
Bu yöntemin kolaylığına rağmen, hala geliştirilebilir bazı yönleri vardır. Örneğin, RNA'ya 5' adaptörün bağlanması sinyallerin geri kazanımını sınırlayabilir, çünkü ters transkripsiyonun önemli bir kısmı çapraz bağlı peptidler tarafından sonlandırılacaktır. Mevcut çalışmamız esas olarak etiketli proteinlerin ektopik ekspresyonuna dayanmaktadır, bu da protein aşırı ekspresyonuna bağlı bazı eserlere yol açabilir. Bu endojen çekirge içine etiketi tanıtarak yöntemi geliştirmeye değer. CRISPR/Cas9 sistemi hücre hattı yapımını çok daha kolay ve uygulanabilir hale getirir. Bazı çalışmalarda fare dokularına eCLIP-seq deneyi uygulanmıştır25. Çift etiketli knock-in farelerin türevi de fbioCLIP-seq yönteminin geliştirilmesi ve uygulanmasında potansiyel ve umut verici bir yöndür. Ayrıca, ektonik bakteriyel BirA ligaz ifade vivo beklenmedik biyotinylation olaylara yol açabilir. Proteinin etiketlettürülme de biyolojik fonksiyonlarını etkileyebilir.
Çok sayıda çalışma, hücrelerin gen ekspresyonunun ve epigenomunun tamamen homojen değil heterojen olduğunu göstermiş ve etkileşim ağını tek hücreli düzeyde incelemenin değerli olduğunu göstermektedir. Tek hücrelerin transkripsiyonu ve epigenomunu incelemek için çeşitli stratejiler geliştirilmiştir. Ancak protein-RNA etkileşimini tek hücredüzeyinde analiz etmek için herhangi bir strateji bildirilmemiştir. Denatüre jel çalışan ve membran transfer adımları olmadan, FbioCLIP-seq tek hücreli düzeyde protein-RNA etkileşimleri çalışma için potansiyel bir strateji yapar daha fazla sinyalleri koruyabilirsiniz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Hibe desteği Çin Ulusal Temel Araştırma Programı (2017YFA0504204, 2018YFA0107604), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31630095) ve Tsinghua Üniversitesi Yaşam Bilimleri Merkezi'nden destek almaktadır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| UV crosslinker | UVP | HL-2000 HybrilLinker | |
| Affinity Purification Beads | |||
| ANTI-FLAG beads | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| Streptavidin beads | Invitrogen | 112.06D | |
| Reagents | |||
| 10x PBS | Gibco | 70013032 | |
| 3 M NaOAc | Ambion | AM9740 | |
| 3 x FLAG peptide | Sigma-Aldrich | F4799 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| CIP | NEB | M0290S | CIP buffer is in the same package. |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Gel purification kit | QIAGEN | 28704 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 449172 | |
| MNase | NEB | M0247S | |
| NP-40 | Amresco | M158-500ML | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 10837091001 | |
| Porteinase K | TAKARA | 9033 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | NEB | 0492S | |
| reverse trancriptase (SupperScriptIII) | Invitrogen | 18080093 | |
| RNA isolation reagent (Trizol) | Invitrogen | 15596018 | |
| RNase Inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
| RQ1 Dnase | Promega | M6101 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | PNK buffer is in the same package. |
| T4 RNA ligaes | ThermoFisher | EL0021 | T4 RNA ligase buffer and BSA are in the same package. |
| T4 RNA ligase2, truncated | NEB | M0242S | T4 RNA ligase buffer and 50% PEG are in the same package. |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200072 | |
| Urea | Sigma-Aldrich | 208884 | |
| mESC culture medium | |||
| DMEM (80%) | Gibco | 11965126 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| FCS (15%) | Hyclone | ||
| Glutamax (1%) | Gibco | 35050061 | |
| LIF | purified recombinant protein; 10,000 fold dilution | ||
| NEAA (1%) | Gibco | 11140050 | |
| Nucleoside mix (1%) | Millipore | ES-008-D | |
| Penicillin-Streptomycin (1%) | Gibco | 15140122 | |
| Kit | |||
| DNA gel extraction kit | QIAGEN | 28704 |
References
- Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates. Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).
- Guallar, D., et al. RNA-dependent chromatin targeting of TET2 for endogenous retrovirus control in pluripotent stem cells. Nature Genetics. 50 (3), 443-451 (2018).
- Holmqvist, E., Li, L., Bischler, T., Barquist, L., Vogel, J. Global Maps of ProQ Binding In Vivo Reveal Target Recognition via RNA Structure and Stability Control at mRNA 3' Ends. Molecular Cell. 70 (5), 971-982 (2018).
- Wei, C., et al. RBFox2 Binds Nascent RNA to Globally Regulate Polycomb Complex 2 Targeting in Mammalian Genomes. Molecular Cell. 62 (6), 875-889 (2016).
- Kim, D. S., et al. Activation of PARP-1 by snoRNAs Controls Ribosome Biogenesis and Cell Growth via the RNA Helicase DDX21. Molecular Cell. 75 (6), 1270-1285 (2019).
- Yao, R. W., et al. Nascent Pre-rRNA Sorting via Phase Separation Drives the Assembly of Dense Fibrillar Components in the Human Nucleolus. Molecular Cell. 76 (5), 767-783 (2019).
- Licatalosi, D. D., et al. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).
- Moore, M. J., et al. Mapping Argonaute and conventional RNA-binding protein interactions with RNA at single-nucleotide resolution using HITS-CLIP and CIMS analysis. Nature Protocols. 9 (2), 263-293 (2014).
- Konig, J., et al. iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments. (50), e2638 (2011).
- Zarnegar, B. J., et al. irCLIP platform for efficient characterization of protein-RNA interactions. Nature Methods. 13 (6), 489-492 (2016).
- Van Nostrand, E. L., et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).
- Hafner, M., et al. PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins. Journal of Visualized Experiments. (41), e2034 (2010).
- de Boer, E., et al. Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7480-7485 (2003).
- Bi, X., et al. RNA Targets Ribogenesis Factor WDR43 to Chromatin for Transcription and Pluripotency Control. Molecular Cell. 75 (1), 102-116 (2019).
- Heo, I., et al. TUT4 in concert with Lin28 suppresses microRNA biogenesis through pre-microRNA uridylation. Cell. 138 (4), 696-708 (2009).
- Cho, J., et al. LIN28A Is a Suppressor of ER-Associated Translation in Embryonic Stem Cells. Cell. 151 (4), 765-777 (2012).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Zhao, C., et al. Tissue specific roles for the ribosome biogenesis factor Wdr43 in zebrafish development. PLoS Genetics. 10 (1), 1004074 (2014).
- Wilbert, M. L., et al. LIN28 binds messenger RNAs at GGAGA motifs and regulates splicing factor abundance. Molecular Cell. 48 (2), 195-206 (2012).
- Hunziker, M., et al. UtpA and UtpB chaperone nascent pre-ribosomal RNA and U3 snoRNA to initiate eukaryotic ribosome assembly. Nature Communications. 7, 12090 (2016).
- Kim, J., Cantor, A. B., Orkin, S. H., Wang, J. L. Use of in vivo biotinylation to study protein-protein and protein-DNA interactions in mouse embryonic stem cells. Nature Protocols. 4 (4), 506-517 (2009).
- Li, Z., Michael, I. P., Zhou, D., Nagy, A., Rini, J. M. Simple piggyBac transposon-based mammalian cell expression system for inducible protein production. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 5004-5009 (2013).
- Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).
- Aktas, T., et al. DHX9 suppresses RNA processing defects originating from the Alu invasion of the human genome. Nature. 544 (7648), 115-119 (2017).
- Xu, Q., et al. Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis. Journal of Visualized Experiments. (147), e59681 (2019).
