Summary
Vi beskriver en immunfluorescens og kvantitativ PCR-metode til lokalisering og kvantificering af begomovirus i insektvæv. Immunofluorescensprotokollen kan bruges til at colocalize virale og vektorproteiner. Den kvantitative PCR-protokol kan udvides til at kvantificere virus i hele whitefly organer og virus-inficerede planter.
Abstract
Begomovirus (slægten Begomovirus, familie Geminiviridae)overføres af whiteflies af Bemisia tabaci kompleks i en vedvarende, cirkulerende måde. I betragtning af de omfattende skader forårsaget af begomovirus til afgrødeproduktion på verdensplan, er det bydende nødvendigt at forstå samspillet mellem begomovirus og deres whitefly vektor. For at gøre dette, lokalisering og kvantificering af virus i vektorvæv er afgørende. Her, ved hjælp af tomat gul blad krølle virus (TYLCV) som et eksempel, beskriver vi en detaljeret protokol til at lokalisere begomovirus i whitefly midguts, primære spytkirtler, og æggestokke ved immunfluorescens. Metoden er baseret på brugen af specifikke antistoffer mod et viruscoatprotein, farvemærkede sekundære antistoffer og et konfokalmikroskop. Protokollen kan også bruges til at colocalize begomovirale og whitefly proteiner. Vi beskriver endvidere en protokol for kvantificering af TYLCV i whitefly midguts, primære spytkirtler, hæmolymfe og æggestokke efter kvantitativ PCR (qPCR). Ved hjælp af primere specielt designet til TYLCV, protokollerne til kvantificering tillader sammenligning af mængden af TYLCV i forskellige væv af whitefly. Den beskrevne protokol er potentielt nyttig til kvantificering af begomovirus i kroppen af en whitefly og en virus-inficeret plante. Disse protokoller kan bruges til at analysere cirkulation stil en begomovirus i whitefly eller som et supplement til andre metoder til at studere whitefly-begomovirus interaktioner.
Introduction
I de sidste årtier, begomovirus (slægten Begomovirus, familie Geminiviridae)har forårsaget alvorlige skader på produktionen af mange vegetabilske, fiber, og prydafgrøder på verdensplan1. Begomovirus overføres på en vedvarende måde af whitefly Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae), som er en kompleks art, der indeholder over 35 kryptiske arter2,3. Begomovirus kan direkte eller indirekte påvirke whitefly fysiologi og adfærd, såsom frugtbarhed4,levetid4,og vært præference5,6. Desuden varierer transmissionseffektiviteten af en given begomovirusart/stamme for forskellige hvidflyvekryptiske arter, selv under de samme forsøgsbetingelser7,8,9,10, hvilket indikerer, at der er et komplekst samspil mellem begomovirus og hvidfluer. For bedre at forstå de mekanismer, der ligger til grund for whitefly-begomovirus interaktioner, lokalisering og kvantificering af virus i whitefly væv er afgørende.
Tomat gul blad krølle virus (TYLCV) er en begomovirus, der først blev rapporteret i Israel, men i dag forårsager alvorlige skader på tomat produktion på verdensplan11,12. På grund af sin økonomiske betydning, det er en af de bedst undersøgte begomovirus13. Ligesom andre monopartit begomovirus er TYLCV en cirkulær DNA-virus med en enkeltstrengs cirkulær DNA-virus med en genomstørrelse på ca. 2.800 nukleotider14. Mens der stadig er under debat, flere linjer af beviser understøtter replikering af TYLCV i whiteflies15,16,17. Desuden er samspillet mellem TYLCV-partikler og whiteflyproteiner rapporteret6,18,19,20. For virus transmission, whiteflies erhverve TYLCV ved fodring på virus-inficerede planter, virioner passere langs fødevarekanalen for at nå spiserøret, trænge ind i midgut væggen for at nå hæmolymfen, og derefter flytte ind i den primære spytkirtler (PSGs). Endelig er virioner egested med spyt langs spytkanalen i plantphloem21. Endvidere viser flere undersøgelser, at TYLCV er i stand til at overføres fra kvindelige hvidefluer til deres afkom22,23. Med andre ord, for at opnå produktiv transmission, virus har til at overvinde cellulære barrierer i whitefly at flytte fra et væv til et andet. Under passagen af disse barrierer, interaktioner mellem whitefly og virus proteiner vil sandsynligvis forekomme, sandsynligvis bestemme den effektivitet, hvormed virus overføres.
Immunfluorescens er en almindeligt anvendt teknik til proteinfordelingsanalyse. Specificiteten af antistoffer, der er bindende for deres antigen, danner grundlag for immunfluorescens. På grund af den økonomiske betydning af TYLCV, monoklonale antistoffer mod TYLCV pels protein er blevet udviklet, tilbyder en meget følsom måde at lokalisere virus24. Kvantitativ PCR (qPCR) muliggør følsom og specifik kvantificering af nukleinsyrer. Denne teknik er oftest baseret på anvendelse af hydrolysesonde (f.eks. TaqMan) eller fluorescerende farvestof (f.eks. For hydrolyse sonde-baserede qPCR, er der behov for specifikke sonder, hvilket derfor øger omkostningerne. Fluorescerende farvestof-baserede qPCR er enklere og mere omkostningseffektiv, fordi mærket amplicon-specifikke hybridisering sonder ikke er påkrævet25. Hidtil, flere undersøgelser har brugt immunfluorescens og qPCR sammen med andre metoder til at undersøge de komplekse begomovirus-whitefly interaktioner. For eksempel udførte Pan et al. qPCR og immunfluorescensanalyse af virus i whiteflyvæv og fandt, at forskellen i evnen til at overføre tobak krøllet skyde virus (TbCSV) mellem whitefly arter AsiaII 1 og Mellemøsten Asien Minor 1 (MEAM1) skyldtes virus er i stand til effektivt at krydse midgut væggen i AsiaII1, men ikke MEAM18. Tilsvarende, mens Middelhavet (MED) whiteflies let kan overføre TYLCV, de undlader at overføre tomat gul blad krølle Kina virus (TYLCCNV). Selektiv overførsel blev undersøgt ved hjælp af immunfluorescenspåvisning af virus i PSG'erne, som viste, at TYLCCNV ikke let krydser PSG'erne i MED whiteflies26. Immunfluorescens colokalisering af TYLCV CP og autofagi markør protein ATG8-II i whitefly midguts viser, at autofagi spiller en afgørende rolle i at undertrykke infektionen af TYLCV i whitefly27.
Her, ved hjælp af TYLCV som et eksempel, beskriver vi en protokol for lokalisering af begomovirus i whitefly midguts, PSGs, og æggestokke ved en immunfluorescens teknik. Teknikken omfatter dissektion, fiksering og inkubation med primære og farvemærkemærkede sekundære antistoffer. Fluorescenssignaler, der viser placeringen af virale proteiner i whitefly-vævene, kan derefter påvises under et konfokalmikroskop. Endnu vigtigere, denne protokol kan bruges til at colocalize begomovirale og whitefly proteiner. Vi beskriver endvidere en protokol for kvantificering af TYLCV ved hjælp af SYBR Green-baserede qPCR i whitefly midguts, PSGs, hæmolymfe og æggestokke, der kan bruges til at sammenligne mængden af virus i forskellige whitefly vævsprøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Whitefly, Virus, Planter, og erhvervelse af virus
- Bageste hvidfluer (MEAM1) på bomuld(Gossypium hirsutum cv. Zhemian 1793) i insektsikre bure i et drivhus ved 26 ± 1 °C med en 14:10 lys:mørk cyklus og 60 ± 10% relativ luftfugtighed.
- Udfør konventionelle PCR baseret på whitefly mitokondriel cytokrom oxidase jeg gen til at bestemme renheden af whitefly befolkning.
- Saml 20 voksne hvidfluer og overfør dem individuelt til et PCR-rør, der indeholder 30 μL lysisbuffer (10 mM Tris, pH = 8,4, 50 mM KCl, 0,45% [wt/vol] Tween-20, 0,2% [wt/vol] gelatine, 0,45% [vol/vol] Nonidet P 40, 60 g/mLLas Proteineas Kas).
- Tilsæt 5-7 keramiske perler (2 mm i diameter) i hvert PCR-rør og male prøverne til at udføre væv lysis.
- Alle prøver ved 65 °C i 1 time efterfulgt af 10 min ved 100 °C og centrifugeres derefter kortvarigt. Brug denne supernatant som skabelon til PCR forstærkning.
BEMÆRK: Inkubationstiden ved 65 °C kan om nødvendigt øges. - PcR-reaktionen forberedes således: 1 U af TAQ DNA-polymerase, 2 μL 10x buffer (med Mg2+), 1,6 μL dNTP-blanding (2,5 mM), 0,5 μL af hver primer (10 μM hver), 2 μL hvidtfluevæv lysatsupernatant og dobbelt destilleret vand til et samlet volumen på 20 μL pr. reaktion. Den forreste primer sekvens er 5'-TTGATTTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3', og den omvendte primer sekvens er 5'-TAATATGGCAGATTAGTGCATTGGA-3'.
BEMÆRK: En negativ kontrol, hvor DNA'et erstattes med nukleasefrit vand og en positiv kontrol med tidligere verificeret MEAM1 whitefly DNA bør medtages. - PcR udføres ved hjælp af følgende cykelparametre: indledende denaturering ved 95 °C i 3 min. efterfulgt af 35 afnatureringscyklusser ved 95 °C i 30 s, glødning ved 50-55 °C i 30 s og udvidelse ved 72 °C i 1 min efterfulgt af 72 °C i 10 min.
- Det forstærkede produkt fordøjes med restriktionsenzymet Taq I. For at gøre dette skal fordøjelsesblandingen forberedes med 0,1 μL (1 U) enzym,1 μL 10x Taq I Buffer, 1 μL BSA, 5 μL forstærket produkt og dobbelt destilleret vand til et samlet volumen på 10 μL. Inkuber ved 65 °C i 1 time i en termocycler.
- Udfør agarose gel elektroforese af prøverne ved at indlæse 5-7 μL af hvert fordøjet produkt og en DNA-stige (100-2.000 bp) i brøndene på en 1% agarose gel. Derefter observere DNA-bånd størrelser ved gel-rød farvning i en gel dokumentation maskine ved hjælp af UV-lys. Sammenlign båndet størrelser af de fordøjede produkter til den positive kontrol for at bestemme renheden af whitefly befolkning.
- Agro-inoculate den smitsomme klon af TYLCV (GenBank tiltrædelsesnummer AM282874.1) (pBINPLUS-SH2-1.4A) i 3-4 sande blad fase tomatplanter(Solanum lycopersicum L. cv. Hezuo 903).
- Vaccinere 10 ml Luria-Bertani (LB) medium indeholdende kanamycin (50 μg/ml) og rifampicin (50 μg/ml) med en enkelt koloni. Inkuberved 28 °C med omrystning ved 200 omdrejninger i minuttet, indtil OD600 når ~1,5.
- Høst agrobakterier ved centrifugering ved 4.000 x g i 10 min. Kassér supernatanten.
- Resuspendering pellets i 10 ml infiltrationbuffer, bestående af 200 μM acetosyringon, 10 mM 2-(N-morpholino) ethansulfonsyre (MES) og 10 mM MgCl2. Inkuberved stuetemperatur (RT) i 1-2 timer.
- Infiltrere 2-3 planteblade ved hjælp af blandingen fra trin 1.3.3 med en 1 ml nåleløs sprøjte. Vedligehold planter i et drivhus ved 26 ± 1 °C.
- Omkring 1 måned senere, udføre en visuel inspektion og vælge planter, der viser gule krølle blade og stunt symptomer.
- Overfør ikke-viruliferous whitefly voksne på TYLCV-inficerede tomatplanter i 48 timer for virus erhvervelse.
2. Dissektion og samling af Midguts, Primær Spytkirtler (PSG), æggestokke, og hæmolymfe af kvindelige whiteflies
- Indsamle whiteflies ved hjælp af aspiration, og derefter placere dem på is til at sætte dem i koma. Tilføj 1x PBS (fosfat-buffered saltvand) buffer på et mikroskop dias, og derefter placere whiteflies i 1x PBS buffer til dissektion under et stereomikroskop.
- For midgut dissektion, bryde maven af whitefly og trække ud midgut ved hjælp af en fin akupunktur nål (0,25 mm i diameter). Overfør midgut til ren, 1x PBS.
- For PSG dissektion, bryde kroppen af whitefly i brystkassen nær hovedet fra dorsal side. Dernæst indsætte en nål i brystkassen til at fastsætte whitefly, og bruge en anden nål til at ryste whitefly indtil de to spytkirtler er adskilt fra kroppen. Derefter overføres PSGs til ren, 1x PBS.
- For æggestokkene dissektion, helt bryde maven af whitefly, og bruge en nål til at adskille æggestokkene fra andre væv. Fjern derefter overskydende væv ved at pipettere.
- Til hæmolymfesamlingen tilsættes 10 μL 1x PBS-buffer på et mikroskopdias og derefter placere en whitefly i bufferen. For at opnå hæmolymfen, forsigtigt rive et hul i maven ved hjælp af en fin akupunktur nål, og lidt trykke maven for at frigive hæmolymfe ud i bufferen. 8 μL af væsken opsamles som hæmolymfeprøven.
3. Lokalisering af TYLCV i Whitefly Midgut, Primær Spytkirtler, og æggestokke af Immunofluorescens
BEMÆRK: Proceduren for lokalisering af TYLCV i midguts præsenteres som et eksempel. Metoden kan bruges til psgs og æggestokke.
- Dissekere midguts i TBS buffer (10 mM Tris-HCl, 150 mM natriumchlorid, pH = 7,5) som beskrevet i trin 2.2.1. Saml 15-20 whitefly midguts, overføre dem til et glas Petri skål (3,5 cm i diameter), og derefter fjerne overskydende TBS buffer.
- Tilføj 1 ml 4% paraformaldehyd til at fastsætte midguts for 2 timer ved stuetemperatur, og derefter fjerne den fiksative løsning. Pipette langsomt at vaske midguts 3x i TBS i 2 min hver.
- Inkuber midtvoldene i 1 ml 0,5% Triton X-100 i 30 minutter for at permeabilize. Fjern derefter permeabiliseringsopløsningen, og skyl midguts 3x med TBST (1x TBS med 0,05% Tween 20) som beskrevet i trin 3.2.
- Tilføj 1 ml 1% BSA (kvægserumalbumin udarbejdet i TBST) for at blokere midguts. Udfør blokeringstrinnet ved RT i 2 timer, og fjern derefter blokeringsopløsningen, og skyl midguts 3x i TBST.
- Fortynd de primære antistoffer (MAb 1C4 mod TYLCV-pelsprotein) ved 1:400 med TBST24, og opløsningen tilsættes petriskålen for at nedsænke midguts. Inkuber ved 4 °C natten over i mørke. Den primære antistofopløsning kasseres, og 3x vaskes i TBST.
- Fortynd de sekundære antistoffer (anti-mus) ved 1:400 med TBST og tilsæt opløsningen i petriskålen for at nedsænke midguts. Inkuber skålen i 2 timer på RT i mørke. Midguts 3x i TBST kasseres, og midguts en vaskes.
- Overfør midguts til et klart mikroskop dias. Aspirate så meget TBST fra diaset som muligt. Tilføj 1 dråbe DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochlorid) for at plette kernen, og derefter placere coverslip og forsegle med neglelak. Undersøg under et konfokalmikroskop.
4. Kvantificering af TYLCV i Whitefly Midgut, Primær Spytkirtler, Hæmolymfe og æggestokke med qPCR
- Dissekere whitefly midguts, PSGs, hæmolymfe, og æggestokke i 1x PBS som beskrevet ovenfor.
- Uddrag DNA af midguts, PSGs, hæmolymfe, og æggestokke.
- Efter dissektion vaskes midguts, PSGs og æggestokkene i ren, 1x PBS buffer 2-3x.
- Der indsamles 20 midguts eller 20 PSG'er i 5 μL 1x PBS og overfør dem til 25 μL lysisopløsning. Hver æggestok overføres i 5 μL 1x PBS og overføres derefter til 25 μL lysisopløsning individuelt.
- Grind midguts, PSGs, og æggestokke prøver som beskrevet i trin 1.2.2.
- Opsaml 8 μL hæmolymfe med 1x PBS i et PCR-rør, og tilsæt derefter 10 μL lysisopløsning. Bland grundigt.
- Udtrække DNA fra alle prøver som beskrevet i 1.2.3.
- Der fremstilles to separate qPCR-masterblandinger (18 μL hver) til TYLCV og den interne kontrol (β-actin-gen) som følger: 10 μL SYBR Grøn blanding, 0,8 μL af hver primer (hver 10 μM) og 6,4 μL dobbelt destilleret vand pr. reaktion. For TYLCV, den forreste primer sekvens er 5′-GAAGCGACCAGGCGATATAA-3 'og den omvendte primer sekvens er 5′-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3′. For β-actin, den forreste primer sekvens er 5′-TCTTCCAGCCATCCTCTTG-3 'og den omvendte primer sekvens er 5′-CGGTGATTTCCTTCTGCATT-3′.
- Udber 18 μL af masteren blandes i hætteglas med qPCR striprør eller en 96 brøndplade. Derefter tilsættes 2 μL af DNA-prøverne i hvert hætteglas. Udfør alle reaktioner med mindst tre tekniske replikater og tre biologiske replikater.
BEMÆRK: Trin 4.5 skal udføres på is. - Luk qPCR-rørene, eller luk de 96 brøndplader med klæbepladetætning.
- Centrifuge at indsamle væsken i bunden af qPCR rør eller 96 godt plade.
- Placer rørene eller pladen i den termiske cyklus cyklusr i realtid og udfør qPCR.
- QPCR udføres ved hjælp af følgende cykelparametre: 95 °C i 30 s efterfulgt af 40 cyklusser på 95 °C for 5 s og 60 °C for 34 s til primerannealing og forlængelse, 1 cyklus ved 95 °C i 15 s, der slutter med et smeltekurvetrin på 60 °C til 95 °C med en forøgelse på 0,5 °C pr. 15 s.
- Vælg SYBR som fluorophore farvestof og ukendt som prøvetype.
- Eksporter de kvantitative data til et regnearksformat, og analysér den relative mængde viralt DNA ved hjælp af metoden 2−ΔΔCT 28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MEAM1 whiteflies af B. tabaci kompleks og TYLCV blev brugt som et eksempel her til at beskrive procedurerne. Oversigten over de immunfluorescens- og virale kvantificeringsprocedurer , der er beskrevet i dette manuskript , er vist i figur 1. Figur 2 viser repræsentative resultater af immunfluorescenspåvisning af TYLCV og DAPI farvning i PSGs, midguts og æggestokke, hvilket indikerer, at TYLCV akkumuleret mere i PSGs og midguts, og mindre i æggestokkene. Figur 3 viser den relative mængde virus i whitefly PSGs, midguts, hæmolymfe og æggestokke efter whiteflies fodret med TYLCV-inficeret tomat til 24, 48 og 72 timer, hvilket indikerer, at mængden af virus steg i forskellige whitefly væv med stigningen i erhvervelse naccess periode.
Figur 1: Oversigt over de protokoller, der præsenteres i dette dokument. (A) Eksperimentelle procedurer for immunfluorescens i whitefly midguts, PSGs og æggestokke. Væv blev indsamlet fra TYLCV-inficerede voksne kvindelige hvidefluer, efterfulgt af en række fiksering, permeabilisering, blokering, inkubationer med primære antistoffer, der binder sig til en TYLCV pels protein, og fluorokonom-konjugerede sekundære antistoffer, der binder sig til de primære antistoffer. Endelig blev prøver analyseret under et konfokalmikroskop, hvilket gjorde det muligt at købe billeder. (B) Eksperimentel procedure for kvantificering af virus i whitefly midguts, PSGs, æggestokke, og hæmolymfe. Væv blev indsamlet fra TYLCV-inficerede voksne kvindelige hvidefluer, og derefter DNA-ekstraktion blev udført. qPCR blev udført på et PCR-instrument i realtid, hvilket gjorde det muligt at købe data, der efterfølgende kan analyseres. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Immunofluorescenspåvisning af TYLCV i de primære spytkirtler, midguts og æggestokke af kvindelige voksne hvidfluer efter en adgangsperiode på 48 timer ved erhvervelse af virus. Whiteflies fik lov til at fodre på TYLCV-inficerede tomatplanter i 48 timer, og derefter 20 PSGs, 20 midguts, og 20 æggestokke blev dissekeret og indsamlet. Dernæst blev prøverne fastsat i 4% formaldehyd, permeabiliseret i 0,5% Triton X-100, blokeret i 1% BSA, og derefter inkuberet med mus anti-TYLCV monoklonale antistoffer (MAb 1C4 mod TYLCV pels protein)24 og ged anti-mus sekundære antistoffer konjugeret til en rød fluorescerende farvestof (dvs. Dylight 549). Nuclei blev plettet med DAPI (blå). Immunfluorescenssignaler blev undersøgt under et konfokalmikroskop. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Kvantificering af TYLCV DNA i midguts, hæmolymfe, primære spytkirtler og æggestokke i MEAM1 whiteflies. Voksen fodret med TYLCV-inficerede tomatplanter i 24, 48 og 72 timer, og derefter whitefly midguts, hæmolymfe, PSGs, og æggestokke blev dissekeret og indsamlet. Dernæst blev ekstraktion af DNA og qPCR udført for midguts(A),hæmolymph (B), PSGs (C), og æggestokke (D). Dataene blev først normaliseret til whitefly β-actin DNA, og derefter blev den relative mængde virus, der blev opnået, igen normaliseret til den ved 24 h. NV: Ikke-viruliferous. Data præsenteres som den gennemsnitlige ± SEM af relativ virusmængde. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en protokol for lokalisering og kvantificering af en begomovirus i væv af sin whitefly vektor ved immunfluorescens og qPCR. Dissektion repræsenterer det første skridt til at lokalisere og kvantificere virus i whitefly væv. Den whitefly krop er omkring 1 mm i længden, hvilket betyder, at væv er ekstremt små, og det er svært at dissekere dem. Desuden er der stærke forbindelser mellem væv. For eksempel er æggestokkene tæt forbundet med bakteriokytter, hvilket gør dem vanskelige at isolere. Her beskriver vi forskellige tilgange til dissektion i betragtning af de forskellige vævs karakteristika og placering. Men en masse praksis er nødvendig for hurtigt og præcist at dissekere disse væv. Desuden er det bedst at bruge friske hvidefluer, fordi døde insekter ville øge vanskeligheden ved dissektion. Desuden skal postdissection, væv rengøres for at undgå forurening.
Immunfluorescensteknikken er baseret på anvendelse af specifikke antistoffer. En passende arbejdskoncentration for hvert antistof er meget vigtig i billeddannelse, fordi en høj koncentration af antistoffer reducerer signal-til-baggrundsforholdet, og en lav koncentration kan ikke give tilstrækkeligt signal. Her brugte vi en fortynding på 1:400 for både primære antistoffer og andet antistoffer. Disse antistoffer skal opdeles i små aliquoter og opbevares ved -20 °C for at undgå gentagen frysning og optøning. Antistoffortyndinger skal forberedes lige før brug. Når den protokol, der er beskrevet her, bruges til at colocalize virale og whitefly proteiner, er det vigtigt, at de primære antistoffer mod virale og whitefly proteiner er produceret i dyr af forskellige arter. Desuden bør fluorophorerne af de sekundære antistoffer vælges omhyggeligt for at forhindre udblødning mellem kanalerne. I betragtning af hvidflyvevævs ringe størrelse bør de desuden altid vaskes under mikroskopet for at undgå tab. Selv om immunfluorescens er meget følsom, er det relativt mere tidskrævende og dyrt sammenlignet med andre virus lokaliseringsmetoder såsom Fluorescens in situ Hybridiseringer (FISH). Desuden kan antistoffer mod begomovirus muligvis ikke købes.
Nøglen til en vellykket anvendelse af qPCR til kvantificering af virus i whitefly væv ligger i udformningen af egnede primere og udvælgelse af endogene reference gener. Rodríguez et al. beskrev kriterierne for at designe qPCR primere i detaljer25, som også gælder i udformningen af virus primere. I denne undersøgelse blev β-actin valgt som referencegen for viruskvantificering i whiteflyvæv. I nogle tilfælde (f.eks. RNA-gener) bør andre endogene gener dog anvendes som referencegener, hvis de er egnede til forsøgsdesignet29. Også, for at opnå stabile og præcise resultater, whiteflies af samme udviklingsmæssige fase bør anvendes, fordi whiteflies af forskellige udviklingsmæssige faser besidder forskellige kapaciteter til at erhverve og overføre virus22. Desuden, mens vi brugte 20 PSGs eller midguts som en prøve, vi brugte en hæmolymfe indsamlet fra en whitefly som en prøve for qPCR analyse. Dette skyldes det faktum, at indsamlingen af hæmolymfen er tidskrævende og DNA af hæmolymfe prøverne er sårbar over for nedbrydning, hvis de ikke behandles i tide. Denne protokol kan også bruges til at kvantificere mængden af virus i whitefly hele kroppen og virus-inficerede planter.
Sammenfattende beskriver vi en effektiv og følsom protokol til at lokalisere og kvantificere begomovirus i whitefly væv ved immunfluorescens og qPCR, henholdsvis. Denne protokol kan også tilpasses til lokalisering og kvantificering af andre begomovirus. Endvidere kan protokollen om immunfluorescens bruges til at colocalize virale og whitefly proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Key Research and Development Program (Grant number: 2017YFD0200600), den øremærkede fond for China Agriculture Research System (tilskudsnummer: CARS-23-D07) og Bill & Melinda Gates Foundation (Investment ID OPP1149777 ). Vi takker prof. Jian-Xiang Wu for at give TYLCV CP antistoffer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Paraformaldehyde | MultiSciences | F0001 | |
| 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) | Abcam | ab104139 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MultiSciences | A3828 | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio-RAD | 185-5201 | |
| Confocal microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Dylight 549-goat anti-mouse | Earthox | E032310-02 | Secondary antibody |
| Monoclonal antibody (MAb 1C4) | Primary antibody | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548119-0500 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| TB green premix Ex Taq (Tli RNase H Plus) | TaKaRa | RR820A | qPCR master mix |
| Thermocycler | Thermofisher | A41182 | |
| Tissuelyzer | Shaghai jingxin | Tissuelyser-48 | |
| Triton-X-100 | BBI life sciences | 9002-93-1 | |
| Tween 20 | BBI life sciences | 9005-64-5 |
References
- Rojas, M. R., et al. World management of geminiviruses. Annual Review of Phytopathology. 56, 637-677 (2018).
- De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).
- Navas-Castillo, J., Fiallo-Olive, E., Sanchez-Campos, S. Emerging virus diseases transmitted by whiteflies. Annual Review of Phytopathology. 49, 219-248 (2011).
- Liu, J., et al. Viral infection of tobacco plants improves performance of Bemisia tabaci but more so for an invasive than for an indigenous biotype of the whitefly. Journal of Zhejiang University-Science B. 11 (1), 30-40 (2010).
- Legarrea, S., Barman, A., Marchant, W., Diffie, S., Srinivasan, R. Temporal effects of a begomovirus infection and host plant resistance on the preference and development of an insect vector, Bemisia tabaci, and implications for epidemics. PLoS One. 10 (11), 0142114 (2015).
- Fang, Y., et al. Tomato yellow leaf curl virus alters the host preferences of its vector Bemisia tabaci. Scientific Reports. 3, 2876 (2013).
- Guo, T., et al. Comparison of transmission of papaya leaf curl China virus among four cryptic species of the whitefly Bemisia tabaci complex. Scientific Reports. 5, 15432 (2015).
- Pan, L. L., et al. Differential efficiency of a begomovirus to cross the midgut of different species of whiteflies results in variation of virus transmission by the vectors. Science China-Life Sciences. 61 (10), 1254-1265 (2018).
- Pan, L. L., Cui, X. Y., Chen, Q. F., Wang, X. W., Liu, S. S. Cotton leaf curl disease: which whitefly is the vector. Phytopathology. 108 (10), 1172-1183 (2018).
- Fiallo-Olive, E., Pan, L. L., Liu, S. S., Navas-Castillo, J. Transmission of begomoviruses and other whitefly-borne viruses: dependence on the vector species. Phytopathology. , (2019).
- Cohen, S., Nitzany, F. E. Transmission and host range of the tomato yellow leaf curl virus. Phytopathology. 56, 1127-1131 (1966).
- Moriones, E., Navas-Castillo, J. Tomato yellow leaf curl virus, an emerging virus complex causing epidemics worldwide. Virus Research. 71 (1-2), 123-134 (2000).
- Ghanim, M. A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector. Virus Research. 186, 47-54 (2014).
- Navot, N., Pichersky, E., Zeidan, M., Zamir, D., Czosnek, H. Tomato yellow leaf curl virus - a whitefly-transmitted geminivirus with a single genomic component. Virology. 185 (1), 151-161 (1991).
- Sanchez-Campos, S., et al. Tomato yellow leaf curl virus: No evidence for replication in the insect vector Bemisia tabaci. Scientific Reports. 6, 30942 (2016).
- Pakkianathan, B. C., et al. Replication of tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector, Bemisia tabaci. Journal of Virology. 89 (19), 9791-9803 (2015).
- Rodriguez-Negrete, E. A., et al. A sensitive method for the quantification of virion-sense and complementary-sense DNA strands of circular single-stranded DNA viruses. Scientific Reports. 4, 6438 (2014).
- Gotz, M., et al. Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions. Journal of Virology. 86 (24), 13241-13252 (2012).
- Zhao, J., Chi, Y., Zhang, X. J., Wang, X. W., Liu, S. S. Implication of whitefly vesicle associated membrane protein-associated protein B in the transmission of Tomato yellow leaf curl virus. Virology. 535, 210-217 (2019).
- Maluta, N. K., Garzo, E., Moreno, A., Lopes, J. R., Fereres, A. Tomato yellow leaf curl virus benefits population growth of the Q biotype of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae). Neotropical Entomology. 43 (4), 385-392 (2014).
- Czosnek, H., Hariton-Shalev, A., Sobol, I., Gorovits, R., Ghanim, M. The incredible journey of begomoviruses in their whitefly vector. Viruses. 9 (10), 273 (2017).
- Wei, J., et al. Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).
- Ghanim, M., Morin, S., Zeidan, M., Czosnek, H. Evidence for transovarial transmission of tomato yellow leaf curl virus by its vector, the whitefly Bemisia tabaci. Virology. 240 (2), 295-303 (1998).
- Xie, Y., et al. Highly sensitive serological methods for detecting tomato yellow leaf curl virus in tomato plants and whiteflies. Virology Journal. 10, 142 (2013).
- Arya, M., et al. Basic principles of real-time quantitative PCR. Expert Review of Molecular Diagnostics. 5 (2), 209-219 (2005).
- Wei, J., et al. Specific cells in the primary salivary glands of the whitefly Bemisia tabaci control retention and transmission of begomoviruses. Journal of Virology. 88 (22), 13460-13468 (2014).
- Wang, L. L., et al. The autophagy pathway participates in resistance to tomato yellow leaf curl virus infection in whiteflies. Autophagy. 12 (9), 1560-1574 (2016).
- Arocho, A., Chen, B. Y., Ladanyi, M., Pan, Q. L. Validation of the 2(-Delta Delta Ct) calculation as an alternate method of data analysis for quantitative PCR of BCR-ABL P210 transcripts. Diagnostic Molecular Pathology. 15 (1), 56-61 (2006).
- Li, R., et al. Reference gene selection for qRT-PCR analysis in the sweetpotato whitefly, Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae). PLoS One. 8 (1), 53006 (2013).
