Summary
We beschrijven een immunofluorescentie en kwantitatieve PCR-methode voor de lokalisatie en kwantificering van begomovirussen in insectenweefsels. Het immunofluorescentieprotocol kan worden gebruikt om virale en vectoreiwitten samen te lokaliseren. Het kwantitatieve PCR-protocol kan worden uitgebreid om virussen in hele wittevlieglichamen en met virussen geïnfecteerde planten te kwantificeren.
Abstract
Begomovirussen (geslacht Begomovirus, familie Geminiviridae) worden overgedragen door witte vliegen van de Bemisia tabaci complex in een aanhoudende, circulerende manier. Gezien de grote schade veroorzaakt door begomovirussen aan de productie van gewassen wereldwijd, is het noodzakelijk om de interactie tussen begomovirussen en hun wittevliegvector te begrijpen. Om dit te doen, lokalisatie en kwantificering van het virus in de vectorweefsels is van cruciaal belang. Hier, met behulp van tomaat geel blad krul virus (TYLCV) als voorbeeld, beschrijven we een gedetailleerd protocol om begomovirussen lokaliseren in wittevlieg midguts, primaire speekselklieren, en eierstokken door immunofluorescentie. De methode is gebaseerd op het gebruik van specifieke antilichamen tegen een viruscoat eiwit, kleurstof-gelabeldsecundaire antilichamen, en een confocale microscoop. Het protocol kan ook worden gebruikt om begomovirale en wittevliegeiwitten te colocaliseren. We beschrijven verder een protocol voor de kwantificering van TYLCV in wittevliegmiddeningewanden, primaire speekselklieren, hemolymph en eierstokken door kwantitatieve PCR (qPCR). Met behulp van primers speciaal ontworpen voor TYLCV, de protocollen voor kwantificering maken de vergelijking van de hoeveelheid TYLCV in verschillende weefsels van de wittevlieg. Het beschreven protocol is potentieel nuttig voor de kwantificering van begomovirussen in het lichaam van een wittevlieg en een met virussen geïnfecteerde plant. Deze protocollen kunnen worden gebruikt om de circulatieroute van begomovirussen in de wittevlieg te analyseren of als aanvulling op andere methoden om wittevlieg-begomovirus interacties te bestuderen.
Introduction
In de afgelopen decennia hebben begomovirussen (geslacht Begomovirus, familie Geminiviridae)ernstige schade toegebracht aan de productie van vele plantaardige, vezel- en siergewassen wereldwijd1. Begomovirussen worden op een hardnekkige manier overgedragen door de witte vlieg Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae), een complexe soort met meer dan 35 cryptische soorten2,3. Begomovirussen kunnen direct of indirect invloed hebben op de fysiologie en het gedrag van witte vlieg, zoals vruchtbaarheid4,levensduur4en gastheervoorkeur5,6. Bovendien varieert de transmissie-efficiëntie van een bepaalde begomovirussoort/-soort voor verschillende wittevliegcryptische soorten, zelfs onder dezelfde experimentele omstandigheden7,8,9,10, wat aangeeft dat er een complexe interactie is tussen begomovirussen en witte vliegen. Om de mechanismen die ten grondslag liggen aan wittevlieg-begomovirus interacties beter te begrijpen, lokalisatie en kwantificering van het virus in wittevliegweefsels zijn essentieel.
Tomaat geel blad krul virus (TYLCV) is een begomovirus dat voor het eerst werd gemeld in Israël, maar tegenwoordig veroorzaakt ernstige schade aan de tomatenproductie wereldwijd11,12. Vanwege het economische belang is het een van de best bestudeerde begomovirussen13. Net als andere monopartite begomovirussen, TYLCV is een single-streng cirkel-DNA-virus met een genoom grootte van ongeveer 2.800 nucleotiden14. Hoewel nog steeds in debat, verschillende lijnen van bewijs ondersteunen de replicatie van TYLCV in whiteflies15,16,17. Bovendien is de interactie van TYLCV-deeltjes en wittevliegeiwitten gerapporteerd6,18,19,20. Voor virusoverdracht verwerven witte vliegen TYLCV door zich te voeden met virusgeïnfecteerde planten, passeren virions langs het voedselkanaal om de slokdarm te bereiken, dringen ze de midgutwand binnen om de hemolymph te bereiken en vervolgens over te plaatsen in de primaire speekselklieren (PSG's). Ten slotte worden virions met speeksel langs het speekselkanaal in plantenphloem21ingenomen. Bovendien tonen verschillende studies aan dat TYLCV transovarially kan worden overgedragen van vrouwelijke wittevliegen naar hun nakomelingen22,23. Met andere woorden, om productieve transmissie te bereiken, moet het virus cellulaire barrières binnen de witte vlieg overwinnen om van het ene weefsel naar het andere te translokaliseren. Tijdens het oversteken van deze barrières zullen interacties tussen wittevlieg- en viruseiwitten waarschijnlijk optreden, waarschijnlijk het bepalen van de efficiëntie waarmee de virussen worden overgedragen.
Immunofluorescentie is een veelgebruikte techniek voor eiwitdistributieanalyse. De specificiteit van antilichamen die aan hun antigeen zijn gebonden, vormt de basis van immunofluorescentie. Vanwege de economische betekenis van TYLCV zijn monoklonale antilichamen tegen het TYLCV-vachteiwit ontwikkeld, die een zeer gevoelige manier bieden om het virus te lokaliseren24. Kwantitatieve PCR (qPCR) maakt gevoelige en specifieke kwantificering van nucleïnezuren mogelijk. Deze techniek is het vaakst gebaseerd op het gebruik van hydrolyse sonde (bijvoorbeeld TaqMan) of fluorescerende kleurstof (bijvoorbeeld SYBR Green) detectie. Voor qPCR op basis van hydrolysesonis zijn specifieke sondes nodig, waardoor de kosten stijgen. Fluorescerende kleurstof gebaseerde qPCR is eenvoudiger en kosteneffectiever, omdat gelabeld amplicon-specifieke hybridisatie sondes zijn niet vereist25. Tot nu toe hebben verschillende studies immunofluorescentie en qPCR gebruikt, samen met andere methoden om de complexe interacties tussen begomovirus-whitefly te onderzoeken. Pan et al. voerde bijvoorbeeld qPCR- en immunofluorescentieanalyse van het virus in wittevliegweefsels uit en constateerde dat het verschil in vermogen om tabakskrullend scheutvirus (TbCSV) tussen wittevliegsoorten AsiaII 1 en Minor 1 in Het Midden-Oosten (MEAM1) over te brengen, te wijten was aan het feit dat het virus efficiënt de midgutwall van AsiaII1 maar meam18kon oversteken. Op dezelfde manier, terwijl mediterrane (MED) witte vliegen gemakkelijk Kan verzenden TYLCV, ze niet aan tomaat gele blad krul China virus (TYLCCNV) overbrengen. Selectieve overdracht werd onderzocht aan de hand van immunofluorescentiedetectie van het virus in de PSG's, waaruit bleek dat TYLCCNV niet gemakkelijk de PSGs van MED-witvliegen kruist26. Immunofluorescentie colokalisatie van TYLCV CP en de autofagie marker eiwit ATG8-II in wittevlieg midguts blijkt dat autofagie speelt een cruciale rol bij het onderdrukken van de infectie van TYLCV in de wittevlieg27.
Hier beschrijven we met Behulp van TYLCV als voorbeeld een protocol voor de lokalisatie van begomovirussen in wittevliegdwergen, PSGs en eierstokken door middel van een immunofluorescentietechniek. De techniek omvat dissectie, fixatie, en incubatie met primaire en kleurstof-gelabeldsecundaire antilichamen. Fluorescentiesignalen die de locatie van virale eiwitten in de wittevliegweefsels laten zien, kunnen vervolgens worden gedetecteerd onder een confocale microscoop. Wat nog belangrijker is, kan dit protocol worden gebruikt om begomovirale en wittevliegproteïnen colocaliseren. We beschrijven verder een protocol voor de kwantificering van TYLCV met behulp van SYBR Green-based qPCR in whitefly midguts, PSGs, hemolymph, en eierstokken, die kunnen worden gebruikt om de hoeveelheid virus te vergelijken in verschillende wittevliegweefsel monsters.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Whitefly, Virus, Plants, en De verwerving van het Virus
- Achterwitte vliegen (MEAM1) op katoen (Gossypium hirsutum cv. Zhemian 1793) in insectenbestendige kooien in een kas bij 26 ± 1 °C met een licht-donkere cyclus van 14:10 uur en 60 ± 10% relatieve vochtigheid.
- Voer conventionele PCR uit op basis van wittevliegmitochondrial cytochroomoxidase I-gen om de zuiverheid van de wittevliegpopulatie te bepalen.
- Verzamel 20 volwassen witvliegen en breng ze individueel over naar een PCR-buis met 30 μL lysisbuffer (10 mM Tris, pH = 8,4, 50 mM KCl, 0,45% [wt/vol] Tween-20, 0,2% [wt/vol] gelatine, 0,45% [vol/vol] Nonidet P 40, 60 g/mL Protein Kase).
- Voeg 5-7 keramische kralen (2 mm in diameter) toe aan elke PCR-buis en maal de monsters om de weefsellyse uit te voeren.
- Bebroed alle monsters bij 65 °C gedurende 1 uur, gevolgd door 10 min bij 100 °C, en centrifugeer kort. Gebruik deze supernatant als sjabloon voor PCR-versterking.
LET OP: De incubatietijd bij 65 °C kan indien nodig worden verhoogd. - Bereid de PCR-reactie als volgt voor: 1 U van Taq DNA polymerase, 2 μL van 10x buffer (met Mg2+),1,6 μL dNTP-mengsel (2,5 mM), 0,5 μL van elke primer (elk 10 μM), 2 μL witvliegweefsel lysate supernatant en dubbel gedestilleerd water tot een totaal volume van 20 μL per reactie. De voorwaartse primersequentie is 5'-TTGATTTTTTGtGTCATCCAGAAGT-3' en de omgekeerde primerreeks is 5'-TAATATGGCAGATTAGTGCATTGGA-3'.
OPMERKING: Een negatieve controle waarbij het DNA wordt vervangen door nuclease-vrij water en een positieve controle met eerder geverifieerd MEAM1 whitefly DNA moet worden opgenomen. - Pcr uitvoeren met behulp van de volgende fietsparameters: initiële denaturatie bij 95 °C gedurende 3 min, gevolgd door 35 cycli van denaturatie bij 95 °C voor 30 s, annealing bij 50-55 °C voor 30 s en verlenging bij 72 °C gedurende 1 min, gevolgd door 72 °C gedurende 10 min.
- Verteer het versterkte product met restrictieenzym Taq I. Bereid hiervoor het spijsverteringsmengsel voor met 0,1 μL (1 U) enzym,1 μL van 10x Taq I Buffer, 1 μL BSA, 5 μL versterkt product en dubbel gedestilleerd water tot een totaal volume van 10 μL. Incubeer bij 65 °C gedurende 1 uur in een thermocycler.
- Voer agarose gel elektroforese van de monsters uit door 5-7 μL van elk verteerd product en een DNA-ladder (100-2.000 bp) in de putten van een 1% agarosegel te laden. Observeer vervolgens de DNA-bandmaten door gelrode vlekken in een geldocumentatiemachine met UV-licht. Vergelijk de bandgroottes van de verteerde producten met de positieve controle om de zuiverheid van de wittevliegpopulatie te bepalen.
- Agro-inoculeren de besmettelijke kloon van TYLCV (GenBank toetredingsnummer AM282874.1) (pBINPLUS-SH2-1.4A) in 3-4 echte bladfase tomatenplanten(Solanum lycopersicum L. cv. Hezuo 903).
- Inenting 10 mL luria-Bertani (LB) medium met kanamycine (50 μg/mL) en rifampicin (50 μg/mL) met een enkele kolonie. Incubeer bij 28 °C met schudden bij 200 tpm tot de OD600 ~1,5 bereikt.
- Oogst agrobacteriën door centrifugeren op 4.000 x g voor 10 min. Gooi de supernatant weg.
- Pellets opnieuw opschorten in 10 mL infiltratiebuffer, bestaande uit 200 μM acetosyringone, 10 mM 2-(N-morpholino) ethaansulfoonzuur (MES) en 10 mM MgCl2. Incubeer bij kamertemperatuur (RT) voor 1-2 uur.
- Infiltreren 2-3 plantenbladeren met behulp van het mengsel van stap 1.3.3 met een 1 mL naaldloze spuit. Houd planten in een kas op 26 ± 1 °C.
- Ongeveer 1 maand later, het uitvoeren van een visuele inspectie en kies planten met gele krul blad en stunt symptomen.
- Breng niet-virulifere wittevlieg volwassenen over op TYLCV-geïnfecteerde tomatenplanten voor 48 uur voor het verkrijgen van virussen.
2. Dissectie en Verzameling van Midguts, Primaire Speekselklieren (PSG), Eierstokken, en Hemolymph van Vrouwelijke Wittevliegen
- Verzamel witte vliegen met behulp van aspiratie, en plaats ze dan op ijs om ze in een coma te brengen. Voeg 1x PBS (fosfaat-gebufferde zoutoplossing) buffer op een microscoop dia, en plaats witvliegen in de 1x PBS buffer voor dissectie onder een stereomicroscoop.
- Voor de midgut dissectie, breek de buik van de wittevlieg en trek de midgut met behulp van een fijne acupunctuurnaald (0,25 mm in diameter). Breng de midgut schoon, 1x PBS.
- Voor PSG dissectie, breek het lichaam van de wittevlieg in de thorax in de buurt van het hoofd van de rugzijde kant. Steek vervolgens een naald in de thorax om de witte vlieg te repareren en gebruik een andere naald om de wittevlieg te schudden totdat de twee speekselklieren van het lichaam zijn gescheiden. Breng vervolgens de PSG's over naar clean, 1x PBS.
- Voor de eierstok dissectie, volledig breken de buik van de wittevlieg, en gebruik een naald om de eierstokken te scheiden van andere weefsels. Verwijder vervolgens overtollige weefsels door te beknikelen.
- Voor de hemolymph collectie, voeg 10 μL van 1x PBS buffer op een microscoop dia, en plaats vervolgens een wittevlieg in de buffer. Om de hemolymph te verkrijgen, scheur voorzichtig een gat in de buik met behulp van een fijne acupunctuurnaald en druk je de buik lichtjes om de hemolymph in de buffer los te laten. Verzamel 8 μL van de vloeistof als het hemolymfemonster.
3. Lokalisatie van TYLCV in Whitefly Midgut, Primaire speekselklieren en eierstokken door immunofluorescentie
OPMERKING: De procedure voor de lokalisatie van TYLCV in de midguts wordt gepresenteerd als een voorbeeld. De methode kan worden gebruikt voor PSGs en eierstokken.
- Ontleed de midguts in tbs-buffer (10 mM Tris-HCl, 150 mM natriumchloride, pH = 7.5) zoals beschreven in stap 2.2.1. Verzamel 15-20 wittevlieg midguts, breng ze in een glazen petrischaal (3,5 cm in diameter), en verwijder dan overtollige TBS-buffer.
- Voeg 1 mL van 4% paraformaldehyde toe om midguts 2 uur bij kamertemperatuur te fixeren en verwijder vervolgens de fixatieve oplossing. Pipette langzaam aan de midguts 3x in TBS wassen voor 2 min elk.
- Incubeer de midguts in 1 mL van 0,5% Triton X-100 voor 30 min om te permeabilize. Verwijder vervolgens de permeabilisatieoplossing en was de midguts 3x met TBST (1x TBS met 0,05% Tween 20) zoals beschreven in stap 3.2.
- Voeg 1 mL van 1% BSA (runderserum albumine bereid in TBST) toe om de midguts te blokkeren. Voer de blokkeringsstap bij RT uit voor 2 uur en verwijder vervolgens de blokkeringsoplossing en was de midguts 3x in TBST.
- Verdun de primaire antilichamen (MAb 1C4 tegen TYLCV-vachteiwit) op 1:400 met TBST24 en voeg de oplossing toe aan de petrischaal om de midguts onder te dompelen. Incubeer bij 4 °C 's nachts in het donker. Gooi de primaire antilichaamoplossing weg en was 3x in TBST.
- Verdun de secundaire antilichamen (anti-muis) om 1:400 met TBST en voeg de oplossing toe aan de petrischaal om de midguts onder te dompelen. Incubeer het gerecht voor 2 uur bij RT in het donker. Gooi de secundaire antilichaamoplossing weg en was de midguts 3x in TBST.
- Breng de midguts naar een heldere microscoopdia. Zo veel mogelijk tbsT van de glijbaan halen. Voeg 1 druppel DAPI (4', 6-diamidino-2-fenylindole, dihydrochloride) toe om de kern te bevlekken en leg vervolgens de coverslip en afdichting met nagellak. Onderzoek onder een confocale microscoop.
4. Kwantificering van TYLCV in Whitefly Midgut, Primaire speekselklieren, Hemolymph en Eierstokken met qPCR
- Ontleed de wittevlieg middeningewanden, PSGs, hemolymph, en eierstokken in 1x PBS zoals hierboven beschreven.
- Extract van het DNA van de midguts, PSGs, hemolymph, en eierstokken.
- Na dissectie, was de midguts, PSGs, en eierstokken in schone, 1x PBS buffer 2-3x.
- Verzamel 20 midguts of 20 PSGs in 5 μL van 1x PBS en breng ze over in een lysis-oplossing van 25 μL. Breng elke eierstok over in 5 μL van 1x PBS en breng vervolgens individueel over naar 25 μL lysis-oplossing.
- Grind midguts, PSGs, en eierstokken monsters zoals beschreven in stap 1.2.2.
- Verzamel 8 μL hemolymfe met 1x PBS in een PCR-buis en voeg vervolgens 10 μL lysis-oplossing toe. Meng.
- Haal DNA uit alle monsters zoals beschreven in punt 1.2.3.
- Bereid twee afzonderlijke qPCR-hoofdmixen (elk 18 μL) voor TYLCV en de interne controle(β-actingen) als volgt: 10 μL SYBR Green mix, 0,8 μL van elke primer (elk 10 μM) en 6,4 μL dubbel gedestilleerd water per reactie. Voor TYLCV, de forward primer sequentie is 5′-GAAGCGACCAGGCGATATAA-3′en de omgekeerde primer sequentie is 5'-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3′. Voor β-actin,de forward primer sequentie is 5′-TCTTCCAGCCCTTCTTG-3′ en de omgekeerde primer sequentie is 5'-CGGTGATTTCCTTCTGCATT-3′.
- Giet 18 μL van de master mix in flesjes qPCR stripbuizen of een 96 putplaat. Voeg vervolgens 2 μL van de DNA-monsters toe aan elke flacon. Voer alle reacties uit met ten minste drie technische replicaties en drie biologische replicaties.
LET OP: Stap 4.5 moet op ijs worden uitgevoerd. - Sluit de qPCR buizen of sluit de 96 putplaten af met kleefplaatafdichting.
- Centrifuge om de vloeistof aan de onderkant van de qPCR buizen of 96 putplaat te verzamelen.
- Plaats de buizen of plaat in de real-time thermische cycler en voer qPCR uit.
- Voer de qPCR uit met behulp van de volgende fietsparameters: 95 °C voor 30 s, gevolgd door 40 cycli van 95 °C voor 5 s en 60 °C voor 34 s voor primerannealing en verlenging, 1 cyclus bij 95 °C voor 15 s, eindigend met een smeltende curvestap van 60 °C tot 95 °C met een toename van 0,5 °C per 15 s.
- Kies SYBR als fluorophore kleurstof en onbekend als monster type.
- Exporteer de kwantitatieve gegevens naar een spreadsheetformaat en analyseer de relatieve hoeveelheid viraal DNA met de 2−ΔΔCT-methode 28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De MEAM1 whiteflies van het B. tabaci complex en TYLCV werden hier als voorbeeld gebruikt om de procedures te beschrijven. Het overzicht van de immunofluorescentie- en virale kwantificeringsprocedures die in dit manuscript worden beschreven, is weergegeven in figuur 1. Figuur 2 toont representatieve resultaten van immunofluorescentiedetectie van TYLCV- en DAPI-vlekken in PSG's, midguts en eierstokken, wat aangeeft dat TYLCV meer heeft opgehoopt in de PSG's en midlef, en minder in de eierstokken. Figuur 3 toont de relatieve hoeveelheid virus in de wittevlieg PSGs, midguts, hemolymph en eierstokken na witte vliegen gevoed met TYLCV-geïnfecteerde tomaat voor 24, 48 en 72 uur, wat aangeeft dat de hoeveelheid virus toegenomen in verschillende wittevliegweefsels met de toename van de overname toegangsperiode.
Figuur 1: Overzicht van de protocollen in deze paper. (A) Experimentele procedures voor immunofluorescentie in wittevliegmiddeningewanden, PSGs en eierstokken. Weefsels werden verzameld van TYLCV-geïnfecteerde volwassen vrouwelijke wittevliegen, gevolgd door een reeks fixatie, permeabilisatie, blokkeren, incubatie met primaire antilichamen die zich binden aan een TYLCV-vachteiwit, en fluorchroom-geconjugeerde secundaire antilichamen die zich binden aan de primaire antilichamen. Ten slotte werden monsters geanalyseerd onder een confocale microscoop, waardoor de verwerving van beelden mogelijk werd. (B) Experimentele procedure voor de kwantificering van het virus in de wittevliegmiddeningewanden, PSGs, eierstokken en hemolymfe. Weefsels werden verzameld van TYLCV-geïnfecteerde volwassen vrouwelijke wittevliegen, en vervolgens DNA-extractie werd uitgevoerd. qPCR werd uitgevoerd op een real-time PCR-instrument, waardoor de verwerving van gegevens die vervolgens kunnen worden geanalyseerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Immunofluorescentiedetectie van TYLCV in de primaire speekselklieren, midguts en eierstokken van vrouwelijke volwassen wittevliegen na een toegangsperiode van 48 uur virusverwerving. Witte vliegen mochten zich voeden met met TYLCV-geïnfecteerde tomatenplanten voor 48 uur, en vervolgens 20 PSGs, 20 midguts, en 20 eierstokken werden ontleed en verzameld. Vervolgens werden monsters vastgesteld in 4% formaldehyde, permeabilized in 0,5% Triton X-100, geblokkeerd in 1% BSA, en vervolgens geïncubeerd met muis anti-TYLCV monoklonale antilichamen (MAb 1C4 tegen TYLCV-vachteiwit)24 en geit anti-muis secundaire antilichamen vervoegd tot een rode fluorescerende kleurstof (d.w.z., Dylight 549). Kernen werden gekleurd met DAPI (blauw). Immunofluorescentiesignalen werden onderzocht onder een confocale microscoop. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Kwantificering van TYLCV DNA in de midguts, hemolymph, primaire speekselklieren en eierstokken in MEAM1-witvliegen. Volwassen gevoed met TYLCV-geïnfecteerde tomatenplanten voor 24, 48 en 72 uur, en vervolgens de wittevlieg midguts, hemolymph, PSGs, en eierstokken werden ontleed en verzameld. Vervolgens werden de extractie van DNA en qPCR uitgevoerd voor de midguts (A), hemolymph (B), PSGs (C), en eierstokken (D). De gegevens werden eerst genormaliseerd aan whitefly β-actin DNA, en toen werd de relatieve hoeveelheid verkregen virus opnieuw genormaliseerd aan dat bij 24 h. NV: Niet-viruliferous. Gegevens worden gepresenteerd als het gemiddelde ± SEM van relatieve hoeveelheid virus. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we een protocol voor de lokalisatie en kwantificering van een begomovirus in de weefsels van zijn wittevliegvector door immunofluorescentie en qPCR. Dissectie is de eerste stap om het virus in wittevliegweefsels te lokaliseren en te kwantificeren. De wittevlieg lichaam is ongeveer 1 mm lang, wat betekent dat de weefsels zijn zeer klein, en het is moeilijk om ze te ontleden. Bovendien zijn er sterke verbindingen tussen de weefsels. De eierstokken zijn bijvoorbeeld nauw verbonden met de bacteriocyten, waardoor ze moeilijk te isoleren zijn. Hier beschrijven we, gezien de kenmerken en locaties van de verschillende weefsels, verschillende benaderingen voor dissectie. Er is echter veel oefening nodig om deze weefsels snel en nauwkeurig te ontleden. Bovendien is het het beste om verse witte vliegen te gebruiken, omdat dode insecten de moeilijkheid van dissectie zouden verhogen. Bovendien moeten nadeleding weefsels worden gereinigd om besmetting te voorkomen.
De immunofluorescentietechniek is gebaseerd op het gebruik van specifieke antilichamen. Een geschikte werkconcentratie voor elk antilichaam is zeer belangrijk bij beeldvorming, omdat een hoge concentratie antilichamen de signaal-achtergrondverhouding vermindert en een lage concentratie mogelijk niet voldoende signaal biedt. Hier gebruikten we een verdunning van 1:400 voor zowel primaire antilichamen als tweede antilichamen. Deze antilichamen moeten worden onderverdeeld in kleine aliquots en op -20 °C worden gehouden om herhaalde bevriezing en ontdooiing te voorkomen. De antilichaamverdunningen moeten vlak voor gebruik worden bereid. Wanneer het hier beschreven protocol wordt gebruikt om virale en wittevliegeiwitten samen te brengen, is het belangrijk dat de primaire antilichamen tegen virale en wittevliegeiwitten worden geproduceerd bij dieren van verschillende soorten. Daarnaast moeten de fluorophores van de secundaire antilichamen zorgvuldig worden gekozen om bloedingen tussen kanalen te voorkomen. Bovendien, gezien de kleine omvang van wittevliegweefsels, moeten ze altijd onder de microscoop worden gewassen om verlies te voorkomen. Hoewel immunofluorescentie zeer gevoelig is, is het relatief tijdrovender en kostbaarder in vergelijking met andere viruslocatiemethoden zoals fluorescentie in situ Hybridisaties (FISH). Bovendien zijn antilichamen tegen begomovirussen mogelijk niet te koop.
De sleutel tot de succesvolle toepassing van qPCR voor de kwantificering van het virus in wittevliegweefsels ligt in het ontwerpen van geschikte primers en selectie van endogene referentiegenen. Rodríguez et al. beschreven de criteria voor het ontwerpen van qPCR primers in detail25, die ook van toepassing is bij het ontwerp van virusprimers. In deze studie werd β-actine geselecteerd als referentiegen voor viruskwantificering in wittevliegweefsels. In sommige gevallen (bijvoorbeeld RNA-genen) moeten echter andere endogene genen als referentiegenen worden gebruikt als ze geschikt zijn voor het experimentele ontwerp29. Ook, om stabiele en nauwkeurige resultaten te verkrijgen, moeten witte vliegen van zelfde ontwikkelingsstadium worden gebruikt, omdat de witte vliegen van verschillende ontwikkelingsstadia differentiële capaciteiten bezitten om virussen te verwerven en over te brengen22. Bovendien, terwijl we gebruikt 20 PSGs of midguts als een monster, gebruikten we een hemolymph verzameld van een wittevlieg als een monster voor qPCR analyse. Dit is te wijten aan het feit dat de verzameling van de hemolymph tijdrovend is en het DNA van de hemolymph monsters kwetsbaar is voor afbraak als het niet tijdig wordt verwerkt. Dit protocol kan ook worden gebruikt om de hoeveelheid virus in wittevlieg hele lichaam en virus geïnfecteerde planten te kwantificeren.
Samengevat beschrijven we een efficiënt en gevoelig protocol om begomovirussen in wittevliegweefsels te lokaliseren en te kwantificeren door respectievelijk immunofluorescentie en qPCR. Dit protocol kan ook worden aangepast voor de lokalisatie en kwantificering van andere begomovirussen. Bovendien kan het protocol van immunofluorescentie worden gebruikt om virale en wittevliegeiwitten samen te lokaliseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door National Key Research and Development Program (Grant number: 2017YFD0200600), het geoormerkte fonds voor China Agriculture Research System (subsidienummer: CARS-23-D07) en de Bill & Melinda Gates Foundation (Investment ID OPP11497777 ). Wij danken Prof. Jian-Xiang Wu voor het verstrekken van TYLCV CP antilichamen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Paraformaldehyde | MultiSciences | F0001 | |
| 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) | Abcam | ab104139 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MultiSciences | A3828 | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio-RAD | 185-5201 | |
| Confocal microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Dylight 549-goat anti-mouse | Earthox | E032310-02 | Secondary antibody |
| Monoclonal antibody (MAb 1C4) | Primary antibody | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548119-0500 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| TB green premix Ex Taq (Tli RNase H Plus) | TaKaRa | RR820A | qPCR master mix |
| Thermocycler | Thermofisher | A41182 | |
| Tissuelyzer | Shaghai jingxin | Tissuelyser-48 | |
| Triton-X-100 | BBI life sciences | 9002-93-1 | |
| Tween 20 | BBI life sciences | 9005-64-5 |
References
- Rojas, M. R., et al. World management of geminiviruses. Annual Review of Phytopathology. 56, 637-677 (2018).
- De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).
- Navas-Castillo, J., Fiallo-Olive, E., Sanchez-Campos, S. Emerging virus diseases transmitted by whiteflies. Annual Review of Phytopathology. 49, 219-248 (2011).
- Liu, J., et al. Viral infection of tobacco plants improves performance of Bemisia tabaci but more so for an invasive than for an indigenous biotype of the whitefly. Journal of Zhejiang University-Science B. 11 (1), 30-40 (2010).
- Legarrea, S., Barman, A., Marchant, W., Diffie, S., Srinivasan, R. Temporal effects of a begomovirus infection and host plant resistance on the preference and development of an insect vector, Bemisia tabaci, and implications for epidemics. PLoS One. 10 (11), 0142114 (2015).
- Fang, Y., et al. Tomato yellow leaf curl virus alters the host preferences of its vector Bemisia tabaci. Scientific Reports. 3, 2876 (2013).
- Guo, T., et al. Comparison of transmission of papaya leaf curl China virus among four cryptic species of the whitefly Bemisia tabaci complex. Scientific Reports. 5, 15432 (2015).
- Pan, L. L., et al. Differential efficiency of a begomovirus to cross the midgut of different species of whiteflies results in variation of virus transmission by the vectors. Science China-Life Sciences. 61 (10), 1254-1265 (2018).
- Pan, L. L., Cui, X. Y., Chen, Q. F., Wang, X. W., Liu, S. S. Cotton leaf curl disease: which whitefly is the vector. Phytopathology. 108 (10), 1172-1183 (2018).
- Fiallo-Olive, E., Pan, L. L., Liu, S. S., Navas-Castillo, J. Transmission of begomoviruses and other whitefly-borne viruses: dependence on the vector species. Phytopathology. , (2019).
- Cohen, S., Nitzany, F. E. Transmission and host range of the tomato yellow leaf curl virus. Phytopathology. 56, 1127-1131 (1966).
- Moriones, E., Navas-Castillo, J. Tomato yellow leaf curl virus, an emerging virus complex causing epidemics worldwide. Virus Research. 71 (1-2), 123-134 (2000).
- Ghanim, M. A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector. Virus Research. 186, 47-54 (2014).
- Navot, N., Pichersky, E., Zeidan, M., Zamir, D., Czosnek, H. Tomato yellow leaf curl virus - a whitefly-transmitted geminivirus with a single genomic component. Virology. 185 (1), 151-161 (1991).
- Sanchez-Campos, S., et al. Tomato yellow leaf curl virus: No evidence for replication in the insect vector Bemisia tabaci. Scientific Reports. 6, 30942 (2016).
- Pakkianathan, B. C., et al. Replication of tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector, Bemisia tabaci. Journal of Virology. 89 (19), 9791-9803 (2015).
- Rodriguez-Negrete, E. A., et al. A sensitive method for the quantification of virion-sense and complementary-sense DNA strands of circular single-stranded DNA viruses. Scientific Reports. 4, 6438 (2014).
- Gotz, M., et al. Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions. Journal of Virology. 86 (24), 13241-13252 (2012).
- Zhao, J., Chi, Y., Zhang, X. J., Wang, X. W., Liu, S. S. Implication of whitefly vesicle associated membrane protein-associated protein B in the transmission of Tomato yellow leaf curl virus. Virology. 535, 210-217 (2019).
- Maluta, N. K., Garzo, E., Moreno, A., Lopes, J. R., Fereres, A. Tomato yellow leaf curl virus benefits population growth of the Q biotype of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae). Neotropical Entomology. 43 (4), 385-392 (2014).
- Czosnek, H., Hariton-Shalev, A., Sobol, I., Gorovits, R., Ghanim, M. The incredible journey of begomoviruses in their whitefly vector. Viruses. 9 (10), 273 (2017).
- Wei, J., et al. Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).
- Ghanim, M., Morin, S., Zeidan, M., Czosnek, H. Evidence for transovarial transmission of tomato yellow leaf curl virus by its vector, the whitefly Bemisia tabaci. Virology. 240 (2), 295-303 (1998).
- Xie, Y., et al. Highly sensitive serological methods for detecting tomato yellow leaf curl virus in tomato plants and whiteflies. Virology Journal. 10, 142 (2013).
- Arya, M., et al. Basic principles of real-time quantitative PCR. Expert Review of Molecular Diagnostics. 5 (2), 209-219 (2005).
- Wei, J., et al. Specific cells in the primary salivary glands of the whitefly Bemisia tabaci control retention and transmission of begomoviruses. Journal of Virology. 88 (22), 13460-13468 (2014).
- Wang, L. L., et al. The autophagy pathway participates in resistance to tomato yellow leaf curl virus infection in whiteflies. Autophagy. 12 (9), 1560-1574 (2016).
- Arocho, A., Chen, B. Y., Ladanyi, M., Pan, Q. L. Validation of the 2(-Delta Delta Ct) calculation as an alternate method of data analysis for quantitative PCR of BCR-ABL P210 transcripts. Diagnostic Molecular Pathology. 15 (1), 56-61 (2006).
- Li, R., et al. Reference gene selection for qRT-PCR analysis in the sweetpotato whitefly, Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae). PLoS One. 8 (1), 53006 (2013).
