Summary
אנו מתארים שיטת ה-PCR הכמותית וכמותית ללוקליזציה וכימות של וירוסים ברקמות החרקים. ניתן להשתמש בפרוטוקול האימונוללונציה כדי להתאים חלבונים וקטוריים ומוקטורים. הפרוטוקול PCR כמותי ניתן להאריך כדי לכמת וירוסים בגופים שלמים כנימה וצמחים נגועים בווירוס.
Abstract
וירוסים (סוג של וירוס, משפחה גמביתיים) משודרים על ידי ויטאווניים של מתחם הטבק הבומיסיה באופן מתמשך, circulative. בהתחשב בנזק הנרחב שנגרם על-ידי וירוסים לחיתוך הייצור ברחבי העולם, זה הכרחי להבין את האינטראקציה בין וירוסים באגאוטיות לבין וקטור כנימה שלהם. לשם כך, לוקליזציה וקוונפיקציה של הנגיף ברקמות וקטורי הוא קריטי. כאן, באמצעות עגבניה צהוב עלה וירוס תלתל (TYLCV) כדוגמה, אנו מתארים פרוטוקול מפורט כדי להתאים וירוסים בתוך מידות בינוני, בלוטות הרוק הראשי, והשחלות על ידי immunofluorescence. השיטה מבוססת על שימוש בנוגדנים ספציפיים נגד חלבון מעיל וירוס, נוגדנים משניים המסומנים בצבע, ו מיקרוסקופ קונפוקלית וקד. הפרוטוקול יכול לשמש גם כדי להתאים את החלבונים באמצעות ויראלי להלבין. אנו מתארים עוד פרוטוקול עבור כימות של TYLCV ב midefly מידות, בלוטות הרוק הראשי, המוליקמ, והשחלות על ידי ה-PCR כמותי (qPCR). באמצעות התחל שתוכנן במיוחד עבור TYLCV, הפרוטוקולים עבור כימות לאפשר השוואה של כמות TYLCV ברקמות שונות של הלבנה. הפרוטוקול המתואר הוא שימושי פוטנציאל לכמת של וירוסים בתוך הגוף של להלבין ומפעל נגוע בווירוס. פרוטוקולים אלה ניתן להשתמש כדי לנתח את מסלול המחזור של וירוסים בהאגאוטיות ב כנימה או כהשלמה לשיטות אחרות כדי ללמוד אינטראקציות וירוס להלבין.
Introduction
בעשורים האחרונים, וירוסים (סוג של וירוסבימודוללי, משפחה גמניריתיים) גרמו נזק חמור לייצור של ירקות רבים, סיבים, וגידולים דקורטיביים ברחבי העולם1. וירוסים משודרים באופן מתמשך על ידי המיסיה הבוטטיות של הטבק , שהוא מינים מורכבים המכילים מעל 35 מינים מסתורית2,3. וירוסים יכול להשפיע ישירות או בעקיפין על פיזיולוגיה והתנהגות של כנימה, כגון פוריות4, אריכות ימים4, והעדפה מארחים5,6. יתר על כן, את היעילות השידור של מינים וירוסים מסוג מסוים/זן משתנה עבור מינים שונים הנסתר להלבין גם תחת אותם תנאים ניסיוני7,8,9,10, המציין כי יש אינטראקציה מורכבת בין וירוסים באגאוטיות ו כנימה. כדי להבין טוב יותר את המנגנונים שבבסיס האינטראקציות להלבין וירוס, לוקליזציה וכימות הווירוס ברקמות כנימה חיוניים.
עגבניות העלה צהוב וירוס תלתל (TYLCV) הוא וירוס באגאומודוללי שדווחו לראשונה בישראל אך כיום גורם נזק חמור לייצור עגבניות ברחבי העולם11,12. בשל חשיבותו הכלכלית, הוא אחד הווירוסים הטובים ביותר שנחקרו13. כמו אחרים וירוסים באגאופית אחרים, TYLCV הוא וירוס בודד ומעגלי DNA עם גודל הגנום של כ 2,800 נוקלאוטידים14. תוך כדי דיון, כמה שורות של ראיות תומכות השכפול של TYLCV ב whiteflies15,16,17. יתר על כן, האינטראקציה של חלקיקים TYLCV וחלבונים כנימה דווחו6,18,19,20. עבור העברת וירוסים, whiteflies לרכוש TYLCV על ידי האכלה על צמחים נגועים וירוס, הרימונים לעבור לאורך תעלת המזון כדי להגיע הוושט, לחדור את הקיר באמצע המעיים כדי להגיע המוליקמ, ולאחר מכן העברת לתוך בלוטות הרוק הראשי (PSGs). לבסוף, הריטונים מואגרים עם רוק לאורך תעלת הרוק לתוך הצמח שיפה21. יתרה מזאת, מספר מחקרים מראים כי TYLCV מסוגל להיות transovarially ששודרו נקבה whiteflies לצאצאיהם22,23. במילים אחרות, כדי להשיג שידור פרודוקטיבי, הווירוס יש להתגבר על מחסומים סלולריים בתוך הלבנה כדי לאתר מרקמה אחת לאחרת. במהלך המעבר של מחסומים אלה, האינטראקציות בין חלבונים להלבין ווירוסים צפויים להתרחש, כנראה קביעת היעילות שבה הווירוסים משודרים.
אימונואופלובורנציה היא טכניקה נפוצה לניתוח הפצת חלבונים. הספציפיות של כריכת נוגדנים לאנטיגן שלהם מהווים את הבסיס לאימונולובורנציה. בשל המשמעות הכלכלית של TYLCV, נוגדנים חד שבטיים נגד חלבון הפרווה TYLCV פותחו, המציע דרך רגישה מאוד כדי להתאים את הווירוס24. ה-PCR הכמותי (qPCR) מאפשר כימות רגישות וספציפיות של חומצות גרעין. טכניקה זו מבוססת בתדירות גבוהה על השימוש במחקר הידרוליזה (למשל, TaqMan) או צבע פלורסנט (למשל, SYBR גרין) זיהוי. עבור הידרוליזה בדיקה qPCR מבוססי, הבדיקות הספציפיות הם נחוצים, אשר כתוצאה מכך להגדיל את העלות. פלורסנט מבוססי לצבוע qPCR הוא פשוט יותר וחסכוני יותר, כי התווית בדיקה היברידיתים ספציפיים של הכלאה אינם נדרשים25. עד כה, מספר מחקרים השתמשו immunofluorescence ו qPCR יחד עם שיטות אחרות כדי לחקור את הקשר המורכב וירוס מורכב ולהלבין. לדוגמה, פאן et al ביצע qpcr ניתוח אימונוoforסנס של הנגיף ברקמות כנימה ומצא כי ההבדל ביכולת לשדר טבק מתולתל לירות וירוס (tbcsv) בין מינים כנימה asiaii 1 ואת המזרח התיכון אסיה מינור 1 (MEAM1) היה בשל הווירוס להיות מסוגל ביעילות לחצות אתהקיר פיתול של באופן דומה, בעוד הים התיכון (MED) להלבין יכול בקלות להעביר TYLCV, הם נכשלים לשדר עגבניות עלה צהוב תלתל וירוס בסין (TYLCCNV). שידור סלקטיבי נחקר באמצעות זיהוי immunofluorescence של וירוס ב-PSGs, אשר הראה כי TYLCCNV לא בקלות לחצות את PSGs של MED להלבין26. Immunofluorescence לוקליזציה של TYLCV CP ואת החלבון האוטומטי סמן הסימון ATG8-II ב-midefly המעיים מראה כי באופן אוטומטי משחק תפקיד קריטי ב לדכא את הזיהום של TYLCV ב-27whitly.
כאן, באמצעות TYLCV כדוגמה, אנו מתארים פרוטוקול עבור הלוקליזציה של וירוסים באגאוטיות ב מידולי מידות, PSGs, והשחלות על ידי טכניקה immunofluorescence. הטכניקה כוללת ניתוח, קיבוע ודגירה עם נוגדנים משניים בעלי התווית הראשית והצבע. אותות פלואורסצנטית מראה את המיקום של חלבונים ויראלי ברקמות להלבין ניתן לזהות במיקרוסקופ קונפוקלית וקד. חשוב מכך, פרוטוקול זה ניתן להשתמש כדי להתאים את החלבונים באמצעות ויראלי להלבין. אנחנו עוד לתאר את הפרוטוקול עבור כימות TYLCV באמצעות מבוססי sybr הירוק qpcr ב-midefly מידות, psgs, המוליקמ, והשחלות, כי ניתן להשתמש כדי להשוות את כמות הווירוס בדגימות שונות רקמת כנימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. whitefly, וירוס, צמחים, ורכישת הווירוס
- להלבין האחורי (MEAM1) על כותנה (Gossypium שעירות קורות חיים. zhemian 1793) בכלובים הוכחה חרקים בחממה ב 26 ± 1 ° צ' עם אור 14:10: מחזור כהה 60 ± 10% לחות יחסית.
- לבצע ה-PCR המקובלת על בסיס אוקסידאז מיטוכונדריאלי כרום הגנים כדי לקבוע את טוהר האוכלוסיה הלבנה.
- לאסוף 20 מבוגרים whiteflies ולהעביר אותם בנפרד לצינור PCR המכיל 30 μl של מאגר לפירוק (10 מ"מ, pH = 8.4, 50 mm kcl, 0.45% [wt/vol] יצירת רצף-20, 0.2% [wt/vol] הג, 0.45% [vol/vol] nonidet P 40, 60 g/mL פרוט
- להוסיף 5 – 7 חרוזי קרמיקה (2 מ ' קוטר) לתוך כל צינור PCR ולטחון את הדגימות כדי לבצע את הליזה רקמות.
- מודקון את כל הדגימות ב 65 ° c עבור 1 h ואחריו 10 דקות ב 100 ° c, ולאחר מכן צנטריפוגה בקצרה. השתמש ב-supernatant כתבנית עבור הגברה של PCR.
הערה: ניתן להגדיל את זמן הדגירה ב-65 ° c במידת הצורך. - הכינו את תגובת ה-PCR כדלקמן: 1 U של Taq ה-DNA פולימראז, 2 μL של מאגר 10x (עם Mg2 +), 1.6 μl של התערובת dntp (2.5 מ"מ), 0.5 μl של כל פריימר (10 μm כל אחד), 2 μl של רקמת הרקמה הלבנה של 20 μl לכל תגובה. הרצף הקדמי של הסדרה הוא 5 '-TTGATTTT-3 ' והרצף האחורי של ההילוך ההפוך הוא 5 '-היפוך כמוסות-3 '.
הערה: שליטה שלילית שבה ה-dna הוא החליף עם nuclease-מים חינם שליטה חיובית עם DNA MEAM1 כנימה בעבר יש לכלול. - בצע PCR באמצעות פרמטרי האופניים הבאים: דנטורציה ראשונית ב 95 ° c עבור 3 דקות, ואחריו 35 מחזורים של הדנטורציה ב 95 ° c עבור 30, ריפוי ב-50-55 ° c, והרחבה בשעה 72 ° c עבור 1 דקות, ואחריו 72 ° c עבור 10 דקות.
- לעכל את המוצר מוגבר עם אנזים הגבלה Taq I. כדי לעשות זאת, להכין את תערובת העיכול עם 0.1 μL (1 U) של אנזים, 1 μL של מאגר 10 x Taq I, 1 μL של BSA, 5 μL של מוצר מוגבר, וכפול מים מזוקקים לנפח הכולל של 10 μL. מודטה ב 65 ° c עבור 1 h ב התרמוטרטרנר.
- ביצוע agarose ג'ל אלקטרופורזה של דגימות על ידי טעינת 5 – 7 μL של כל מוצר מתעכל וסולם DNA (100-2000 bp) לתוך הבארות של 1% agarose ג'ל. לאחר מכן, בדוק את מידות ה-DNA באמצעות מכתים ג'ל אדום במכונת התיעוד ג'ל באמצעות אור UV. השווה את גדלי הלהקה של המוצרים העוכלים לפקד החיובי כדי לקבוע את טוהר האוכלוסיה הלבנה.
- אגרו-איחסן שיבוט מדבק של TYLCV (GenBank מספר ההצטרפות AM 282874.1) (pBINPLUS-SH2-1.4 A) לתוך 3 – 4 בשלב האמיתי עלים עגבניות צמחים (Solanum lycopersicum L. Cv. Hezuo 903).
- איחסן 10 מ ל לוריא-ברגלי (LB) בינוני המכיל קאנאמיצין (50 μg/mL) ו גריסופלובין (50 μg/mL) עם מושבה אחת. מודטה ב -28 ° צ' עם טלטול ב 200 סל ד עד OD600 מגיע ~ 1.5.
- הקציר האגרוריה על ידי צנטריפוגה ב 4,000 x g עבור 10 דקות. לבטל את הסופרנטאנט.
- השעיה מחדש של כדורי 10 מ ל של מאגר הסתננות, המורכב של 200 μM acetosyringone, 10 מ"מ 2-(N-גוגוולסטינו) חומצה sulfonic (MES), ו 10 מ"מ MgCl2. דגירה בטמפרטורת החדר (RT) עבור 1 – 2 h.
- לחדור 2 – 3 הצמח העלים באמצעות התערובת מ1.3.3 שלב עם מזרק 1 mL. לשמור על צמחים בחממה ב -26 ± 1 ° c.
- כעבור 1 כחודש, לבצע בדיקה חזותית ולבחור צמחים מראה צהוב תלתל עלה וסימפטומים פעלולים.
- העברת מבוגרים שאינם והיסטוליטיות בוגרים על הTYLCV-הנגועים בצמחי עגבניות עבור 48 h עבור רכישת וירוסים.
2. חיתוך ואיסוף של מידות, בלוטות הרוק הראשי (PSG), השחלות, ואת המוליש של הנשי ויטאפליס
- לאסוף whiteflies באמצעות שאיפה, ואז למקם אותם על הקרח כדי לשים אותם בתרדמת. הוסף מאגר של 1x PBS (פוספט לאגירה) לתוך שקופית מיקרוסקופ, ולאחר מכן הצב להלבין במאגר 1x PBS לחיתוך תחת מיקרוסקופ סטריאו.
- עבור ניתוח ביניים, לשבור את הבטן של הלבנה ולהוציא את המעיים באמצעות מחט אקופונקטורה קנס (0.25 מ"מ קוטר). . העבירו את הקרביים לניקוי, 1x PBS
- לקבלת ניתוח PSG, לשבור את הגוף של הלבנה בתוך החזה ליד הראש מהצד הלבן. לאחר מכן, הכנס מחט לתוך בית החזה כדי לתקן את הלבן, ולהשתמש במחט אחרת כדי לנער את להלבין עד שתי בלוטות הרוק מופרדים מן הגוף. ואז, להעביר את ה-PSGs כדי לנקות, 1x PBS.
- עבור ניתוח השחלה, לשבור לחלוטין את הבטן של הלבנה, ולהשתמש במחט כדי להפריד את השחלות מרקמות אחרות. לאחר מכן, הסירו את הרקמות העודפות באמצעות ליטוף.
- עבור אוסף המוליקמ, להוסיף 10 μL של מאגר PBS 1x אל שקופית מיקרוסקופ, ולאחר מכן למקם להלבין במאגר. כדי להשיג את המוליקמ, לקרוע בעדינות חור בבטן באמצעות מחט דיקור משובח, ולחץ מעט על הבטן כדי לשחרר את המוליש לתוך המאגר. לאסוף 8 μL של הנוזל כמו לדוגמה המוליקמ.
3. לוקליזציה של TYLCV ב Whitefly מידות, בלוטות הרוק הראשי, והשחלות על ידי Immunofluorescence
הערה: ההליך לוקליזציה של TYLCV באמצע המעיים מוצג כדוגמה. ניתן להשתמש בשיטה עבור PSGs והשחלות.
- נתח את המעיים במאגר TBS (10 מ"מ טריס-HCl, 150 מ"מ נתרן כלוריד, pH = 7.5) כמתואר בשלב 2.2.1. לאסוף 15 – 20 מידות המעיים להלבין, להעביר אותם צלחת פטרי זכוכית (3.5 ס מ קוטר), ולאחר מכן להסיר מאגר TBS עודף.
- הוסף 1 mL של 4% פאראמפורמלדהיד כדי לתקן את המעיים עבור 2 h בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להסיר את הפתרון הקבע. פיפטה לאט כדי לשטוף את המעיים 3x ב TBS עבור 2 דקות כל אחד.
- מודטת המעיים ב 1 מ ל של 0.5% טריטון X-100 עבור 30 דקות כדי לחדור. לאחר מכן להסיר את הפתרון החדירות ולשטוף את מידות 3x עם TBST (1x TBS עם 0.05% יצירת רצף 20) כמתואר בשלב 3.2.
- הוסף 1 מ ל של 1% BSA (סרום שור הוכן בשנת TBST) כדי לחסום את מידת המעיים. בצע את שלב החסימה ב-RT עבור 2 h, ולאחר מכן להסיר את הפתרון חסימה ולשטוף את המעיים 3x ב TBST.
- לדלל את הנוגדנים העיקריים (MAb 1C4 נגד חלבון TYLCV מעיל) ב 1:400 עם TBST24 ולהוסיף את הפתרון לתוך צלחת פטרי כדי לטבול את מידת המעיים. מודטה ב -4 ° c לילה בחשכה. להיפטר פתרון הנוגדן העיקרי ולשטוף 3x ב TBST.
- דלל את הנוגדנים המשניים (אנטי-עכבר) ב-1:400 עם TBST והוסף את הפתרון לצלחת פטרי כדי לטבול את המעיים. מודחת הצלחת 2 h ב RT בחושך. להיפטר הפתרון נוגדן משני ולשטוף את המעיים 3x ב TBST.
- להעביר את המעיים. לשקופית מיקרוסקופ ברורה ומכה את החלק האפשרי. של TBST להוסיף 1 טיפה של DAPI (4 ', 6-diamidino-2-פניינילידול, דיהידרוטסטוסטרון) כדי להכתים את הגרעין, ולאחר מכן למקם את הכיסויים ואת החותם עם לק. . לבחון תחת מיקרוסקופ ממוקד
4. קוונפיקציה של TYLCV ב Whitefly מידות, בלוטות הרוק הראשי, המוליקמ, והשחלות עם qPCR
- לנתח את מידות האמצע הלבנה, PSGs, המוליקמ, ושחלות ב-1x PBS כפי שמתואר לעיל.
- לחלץ את ה-DNA של מידות, PSGs, המוליקמ, והשחלות.
- לאחר הניתוח, לשטוף את המעיים, PSGs, והשחלות נקי, 1x מאגר PBS 2 – 3x.
- לאסוף 20 מידות או 20 PSGs ב 5 μL של 1x PBS ולהעביר אותם לתוך 25 μL פתרון הליזה. להעביר כל שחלה ב 5 μL של 1x PBS ולאחר מכן להעביר לתוך 25 μL פתרון לפירוק בנפרד.
- לטחון מידות, PSGs, ודגימות השחלות כפי שמתואר בשלב 1.2.2.
- לאסוף 8 μL של המוליקמ עם 1x PBS לתוך צינור PCR, ולאחר מכן להוסיף 10 μL של פתרון לפירוק. מערבבים ביסודיות.
- לחלץ דנ א מכל הדגימות כפי שמתואר ב1.2.3.
- הכן שני תערובות מאסטר qPCR נפרד (18 μL כל אחד) עבור TYLCV ואת השליטה הפנימית (β-actin גן) כדלקמן: 10 μl של מיקס ירוק sybr, 0.8 μl של כל פריימר (10 μm כל אחד), ו 6.4 μl של מים כפולים מזוקקים לכל התגובה. עבור TYLCV, רצף תחל הקדמי הוא 5 ′-GAAGCGACCAGGCGATATAA-3 ′ ואת הרצף פריימר הפוכה הוא 5 ′-GGAACATגנול-3 ′. עבור β-actin, הרצף הקדמי פריימר הוא 5 ′-TCTTCCAGCCATCCTTCTTG-3 ′ ואת הרצף פריימר הפוכה הוא 5 ′-CGGTGATTTCCTTCTGCATT-3 ′.
- לחלק 18 μL של תערובת הורים לתוך מבחנות של צינורות הסטריפ qPCR או צלחת הטוב 96. לאחר מכן, להוסיף 2 μL של דגימות ה-DNA לתוך כל בקבוקון. בצע את כל התגובות עם לפחות שלושה משכפל טכני ושלושה משכפל ביולוגי.
הערה: שלב 4.5 צריך להתבצע על קרח. - סגרו את הצינורות qPCR או לאטום את הצלחות 96 עם לוחית דבק חותם.
- צנטריפוגה לאסוף את הנוזל בתחתית צינורות qPCR או 96 צלחת היטב.
- למקם את הצינורות או הצלחת לתוך הציקלer תרמית בזמן אמת לבצע qPCR.
- לבצע את qPCR באמצעות הפרמטרים הבאים אופניים: 95 ° c עבור 30 s, ואחריו 40 מחזורים של 95 ° צ' עבור 5 s ו60 ° צ' עבור 34 s עבור פריימר התארכות, 1 מחזור ב 95 ° c עבור 15 s, המסתיים בצעד עקומת ההיתוך של 60 ° c עד 95 ° c עם תוספת של 0.5 ° c לכל 15 ס.
- בחר SYBR כמו צבע fluorophore ולא ידוע כסוג לדוגמה.
- לייצא את הנתונים כמותיים לפורמט גיליון אלקטרוני ולנתח את הכמות היחסית של ה-DNA נגיפי על ידי 2-ΔΔCT שיטה28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MEAM1 להלבין את מורכבות B. עש ו TYLCV שימשו לדוגמה כאן כדי לתאר את ההליכים. הסקירה של התהליכים האימונולואוליים והליכי הקוונפיקציה המתוארים בכתב יד זה מוצגים באיור 1. איור 2 מציג את התוצאות הייצוגיות של זיהוי immunofluorescence של TYLCV ו dapi הצביעת ב psgs, מידות המעיים, והשחלות, המציין כי TYLCV שהצטברו יותר ב-psgs ו-midguts, ופחות בשחלות. איור 3 מראה את הכמות היחסית של וירוס בשנת psgs להלבין, מידות, המוליקמ, ושחלות לאחר כנימה ניזון על TYLCV-נגוע עגבניות 24, 48, ו 72 h, המציין כי כמות הווירוס גדל ברקמות שונות להלבין שונים עם הגידול של תקופת הגישה לרכוש.
איור 1: מבט כולל על הפרוטוקולים המוצגים במאמר זה. (א) הליכים ניסיוניים לחיסולי הזדקנות באמצע המעיים, psgs והשחלות. רקמות נאספו מ-TYLCV מבוגרים נקבה whiteflies, ואחריו סדרה של קיבעון, החדירות, חסימת, incubations עם נוגדנים הראשי הכרוך בחלבון מעיל TYLCV, ו fluorochrome-מעלה מעלה נוגדנים משני כי לאגד את הנוגדנים העיקריים. בסופו של דבר, הדגימות נותחו תחת מיקרוסקופ קונ, המאפשר רכישת תמונות. (ב) הליך ניסיוני לקוונפיקציה של וירוס באמצע המעיים להלבין, psgs, השחלות, ו המוליקמ. רקמות נאספו מ-TYLCV מבוגרים נקבה להלבין נשים, ולאחר מכן החילוץ DNA בוצע. qPCR התבצע על מכשיר PCR בזמן אמת, המאפשר רכישת נתונים שניתן לנתח לאחר מכן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הגילוי החיסוני של TYLCV ב בלוטות הרוק הראשי, midguts, והשחלות של למבוגרים נקבה whiteflies לאחר הזמן הגישה לרכישת וירוס 48 h. Whiteflies הורשו לאכול על TYLCV-מזוהם צמחים עגבניות עבור 48 h, ולאחר מכן 20 PSGs, 20 מידות, ו 20 שחלות היו גזור ונאסף. לאחר מכן, דגימות תוקנו 4% פורמלדהיד, החדיר ב 0.5% טריטון X-100, נחסם ב-1% BSA, ולאחר מכן הדגירה עם נוגדנים נגד העכבר נגד TYLCV (MAb 1C4 נגד חלבון מעיל TYLCV)24 ו עז אנטי עכבר משני נוגדנים מצוירים לצבע פלורסנט אדום (כלומר, dylight 549). גרעינים היו מוכתמים DAPI (כחול). אותות אימונוoforסנס נבדקו תחת מיקרוסקופ קונפוקלית וקד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: קוונפיקציה של TYLCV DNA באמצע המעיים, המוליקמ, בלוטות הרוק הראשי, והשחלות ב MEAM1 whiteflies. מבוגר האכיל על צמחים עגבניות נגוע TYLCV עבור 24, 48, ו 72 h, ולאחר מכן את המעיים להלבין מידות, המוליקמ, PSGs, והשחלות היו גזור ונאסף. לאחר מכן, הוצאת ה-DNA ו-qPCR בוצעו עבור המעיים (A), המוליקמ (ב), psgs (C), ושחלות (ד). הנתונים היו מנורמלות תחילה ל-DNA כנימה β-actin , ולאחר מכן את הכמות היחסית של וירוס שהתקבל היה מנורמל שוב זה ב 24 h. NV: לא מעשית. נתונים מוצגים כמו הממוצע ± SEM של כמות יחסית של וירוס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו מתארים פרוטוקול עבור לוקליזציה וכימות של וירוס באגאוטיות ברקמות של וקטור להלבין שלה על ידי immunofluorescence סנס ו-qPCR. חיתוך מייצג את הצעד הראשון לוקליזציה ולכמת את הנגיף ברקמות להלבין. הגוף הלבן הוא כ 1 מ"מ באורך, כלומר הרקמות קטנות מאוד, וקשה לנתח אותם. חוץ מזה, יש קשרים. חזקים בין הרקמות לדוגמה, השחלות קשורות היטב לקטקטציטים, מה שמקשה על בידוד. כאן, בהתחשב המאפיינים והמיקומים של הרקמות השונות, אנו מתארים גישות שונות לניתוח. עם זאת, הרבה תרגול נדרש כדי לנתח במהירות ובדייקנות הרקמות האלה. בנוסף, מוטב להשתמש בויטאפליס טריים, משום שחרקים מתים יגבירו את הקושי של הניתוח. יתרה מזאת, יש לנקות את הרקמות כדי למנוע זיהום.
הטכניקה החיסונית מבוססת. על שימוש בנוגדנים ספציפיים ריכוז עבודה מתאים לכל נוגדן חשוב מאוד בהדמיה, משום שריכוז גבוה של נוגדנים מפחית את היחס בין האות לרקע וריכוז נמוך עלול שלא לספק אות מספקת. כאן, השתמשנו בדילול של 1:400. בשביל נוגדנים ונוגדנים שניים יש לחלק נוגדנים אלה כדי למנוע הקפאה חוזרת והפשרה של 20 ° c. מדלל נוגדנים צריך להיות מוכן בדיוק לפני השימוש. כאשר הפרוטוקול המתואר כאן משמש לוקליזציה חלבונים ויראלי להלבין, חשוב כי הנוגדנים העיקריים נגד חלבונים ויראלי ולהלבין מיוצרים בעלי חיים של מינים שונים. בנוסף, את fluorophores של נוגדנים משנית יש לבחור בקפידה כדי למנוע דימום-דרך בין הערוצים. יתר על כן, לאור הגודל הקטן של רקמות להלבין, הם צריכים תמיד להיות שטף תחת המיקרוסקופ כדי למנוע אובדן. למרות immunofluorescence הוא רגיש מאוד, הוא יחסית יותר זמן רב ויקר בהשוואה לשיטות אחרות במיקום וירוס כגון הזריחה באתרו ימינליות (דג). בנוסף, לא ניתן לרכוש נוגדנים נגד וירוסי באגאומודולל.
המפתח ליישום מוצלח של qpcr לקוונפיקציה של הנגיף ברקמות כנימה שוכנת בעיצוב של התחל המתאים ומבחר של גנים התייחסות אנדוגניים. רופגס ואח ' תיאר את הקריטריונים לעיצוב התחל של qPCR בפירוט25, אשר חל גם על עיצוב התחל וירוס. במחקר זה, β-actin נבחר גן התייחסות לקוונפיקציה וירוס ברקמות כנימה. עם זאת, במקרים מסוימים (למשל, גנים RNA), גנים אנדוגני אחרים צריך לשמש כגנים התייחסות אם הם מתאימים לעיצוב ניסיוני29. כמו כן, כדי לקבל תוצאות יציבות ומדויקות, להלבין של אותו שלב התפתחותי יש להשתמש, כי whiteflies של שלבים התפתחותיים שונים בעלי יכולות דיפרנציאליות לרכוש ולשדר וירוסים22. יתר על כן, בעוד השתמשנו 20 PSGs או מידות כמו דוגמה אחת, השתמשנו המוליע מייל שנאסף מאחד להלבין כמדגם אחד עבור ניתוח qPCR. זאת בשל העובדה כי האוסף של המוליקמ הוא זמן רב ואת ה-DNA של דגימות המוליקמ פגיע להשפלה אם לא מעובד בזמן. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לכמת את כמות הווירוס בגוף כולו להלבין וצמחים נגועים בווירוס.
לסיכום, אנו מתארים פרוטוקול יעיל ורגיש כדי לוקליזציה ומכמת וירוסים מאוקטיטיות ברקמות להלבין על ידי immunofluorescence סנס ו qPCR, בהתאמה. פרוטוקול זה יכול גם להיות מותאם עבור לוקליזציה וכימות של וירוסים באגאומודולונים אחרים. יתרה מזאת, ניתן להשתמש בפרוטוקול האימונוללואוורנציה כדי להתאים חלבונים ויראליות להלבין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי תוכנית המחקר ופיתוח המפתח הלאומי (מספר גרנט: 2017YFD0200600), הקרן מיועד למחקר החקלאות סין מערכת (מספר מענק: מכוניות 23-D07) ואת ביל & מלינדה גייטס קרן (מזהה השקעה OPP1149777 ). אנו מודים לפרופסור ג'יאן-שיאנג וו למתן נוגדנים TYLCV CP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Paraformaldehyde | MultiSciences | F0001 | |
| 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) | Abcam | ab104139 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MultiSciences | A3828 | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio-RAD | 185-5201 | |
| Confocal microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Dylight 549-goat anti-mouse | Earthox | E032310-02 | Secondary antibody |
| Monoclonal antibody (MAb 1C4) | Primary antibody | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548119-0500 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| TB green premix Ex Taq (Tli RNase H Plus) | TaKaRa | RR820A | qPCR master mix |
| Thermocycler | Thermofisher | A41182 | |
| Tissuelyzer | Shaghai jingxin | Tissuelyser-48 | |
| Triton-X-100 | BBI life sciences | 9002-93-1 | |
| Tween 20 | BBI life sciences | 9005-64-5 |
References
- Rojas, M. R., et al. World management of geminiviruses. Annual Review of Phytopathology. 56, 637-677 (2018).
- De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).
- Navas-Castillo, J., Fiallo-Olive, E., Sanchez-Campos, S. Emerging virus diseases transmitted by whiteflies. Annual Review of Phytopathology. 49, 219-248 (2011).
- Liu, J., et al. Viral infection of tobacco plants improves performance of Bemisia tabaci but more so for an invasive than for an indigenous biotype of the whitefly. Journal of Zhejiang University-Science B. 11 (1), 30-40 (2010).
- Legarrea, S., Barman, A., Marchant, W., Diffie, S., Srinivasan, R. Temporal effects of a begomovirus infection and host plant resistance on the preference and development of an insect vector, Bemisia tabaci, and implications for epidemics. PLoS One. 10 (11), 0142114 (2015).
- Fang, Y., et al. Tomato yellow leaf curl virus alters the host preferences of its vector Bemisia tabaci. Scientific Reports. 3, 2876 (2013).
- Guo, T., et al. Comparison of transmission of papaya leaf curl China virus among four cryptic species of the whitefly Bemisia tabaci complex. Scientific Reports. 5, 15432 (2015).
- Pan, L. L., et al. Differential efficiency of a begomovirus to cross the midgut of different species of whiteflies results in variation of virus transmission by the vectors. Science China-Life Sciences. 61 (10), 1254-1265 (2018).
- Pan, L. L., Cui, X. Y., Chen, Q. F., Wang, X. W., Liu, S. S. Cotton leaf curl disease: which whitefly is the vector. Phytopathology. 108 (10), 1172-1183 (2018).
- Fiallo-Olive, E., Pan, L. L., Liu, S. S., Navas-Castillo, J. Transmission of begomoviruses and other whitefly-borne viruses: dependence on the vector species. Phytopathology. , (2019).
- Cohen, S., Nitzany, F. E. Transmission and host range of the tomato yellow leaf curl virus. Phytopathology. 56, 1127-1131 (1966).
- Moriones, E., Navas-Castillo, J. Tomato yellow leaf curl virus, an emerging virus complex causing epidemics worldwide. Virus Research. 71 (1-2), 123-134 (2000).
- Ghanim, M. A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector. Virus Research. 186, 47-54 (2014).
- Navot, N., Pichersky, E., Zeidan, M., Zamir, D., Czosnek, H. Tomato yellow leaf curl virus - a whitefly-transmitted geminivirus with a single genomic component. Virology. 185 (1), 151-161 (1991).
- Sanchez-Campos, S., et al. Tomato yellow leaf curl virus: No evidence for replication in the insect vector Bemisia tabaci. Scientific Reports. 6, 30942 (2016).
- Pakkianathan, B. C., et al. Replication of tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector, Bemisia tabaci. Journal of Virology. 89 (19), 9791-9803 (2015).
- Rodriguez-Negrete, E. A., et al. A sensitive method for the quantification of virion-sense and complementary-sense DNA strands of circular single-stranded DNA viruses. Scientific Reports. 4, 6438 (2014).
- Gotz, M., et al. Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions. Journal of Virology. 86 (24), 13241-13252 (2012).
- Zhao, J., Chi, Y., Zhang, X. J., Wang, X. W., Liu, S. S. Implication of whitefly vesicle associated membrane protein-associated protein B in the transmission of Tomato yellow leaf curl virus. Virology. 535, 210-217 (2019).
- Maluta, N. K., Garzo, E., Moreno, A., Lopes, J. R., Fereres, A. Tomato yellow leaf curl virus benefits population growth of the Q biotype of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae). Neotropical Entomology. 43 (4), 385-392 (2014).
- Czosnek, H., Hariton-Shalev, A., Sobol, I., Gorovits, R., Ghanim, M. The incredible journey of begomoviruses in their whitefly vector. Viruses. 9 (10), 273 (2017).
- Wei, J., et al. Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).
- Ghanim, M., Morin, S., Zeidan, M., Czosnek, H. Evidence for transovarial transmission of tomato yellow leaf curl virus by its vector, the whitefly Bemisia tabaci. Virology. 240 (2), 295-303 (1998).
- Xie, Y., et al. Highly sensitive serological methods for detecting tomato yellow leaf curl virus in tomato plants and whiteflies. Virology Journal. 10, 142 (2013).
- Arya, M., et al. Basic principles of real-time quantitative PCR. Expert Review of Molecular Diagnostics. 5 (2), 209-219 (2005).
- Wei, J., et al. Specific cells in the primary salivary glands of the whitefly Bemisia tabaci control retention and transmission of begomoviruses. Journal of Virology. 88 (22), 13460-13468 (2014).
- Wang, L. L., et al. The autophagy pathway participates in resistance to tomato yellow leaf curl virus infection in whiteflies. Autophagy. 12 (9), 1560-1574 (2016).
- Arocho, A., Chen, B. Y., Ladanyi, M., Pan, Q. L. Validation of the 2(-Delta Delta Ct) calculation as an alternate method of data analysis for quantitative PCR of BCR-ABL P210 transcripts. Diagnostic Molecular Pathology. 15 (1), 56-61 (2006).
- Li, R., et al. Reference gene selection for qRT-PCR analysis in the sweetpotato whitefly, Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae). PLoS One. 8 (1), 53006 (2013).
