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Immunology and Infection

प्रतिरक्षण और मात्रात्मक पीसीआर द्वारा व्हाइटफ्लाई ऊतकों में बेगोमोवायरस का स्थानीयकरण और परिमाणीकरण

Published: February 8, 2020 doi: 10.3791/60731
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Ministry of Agriculture Key Laboratory of Molecular Biology of Crop Pathogen and Insects, Institute of Insect Sciences, Zhejiang University

Summary

हम कीट ऊतकों में बेगोमोवायरस के स्थानीयकरण और मात्राकरण के लिए एक प्रतिरक्षण और मात्रात्मक पीसीआर विधि का वर्णन करते हैं। इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल का उपयोग वायरल और वेक्टर प्रोटीन को सहस्थानीय बनाने के लिए किया जा सकता है। मात्रात्मक पीसीआर प्रोटोकॉल को पूरे व्हाइटफ्लाई निकायों और वायरस से संक्रमित पौधों में वायरस की मात्रा निर्धारित करने के लिए बढ़ाया जा सकता है।

Abstract

बेगोमोवायरस (जीनस बेगोमोवायरस,परिवार जेमिनीविरीडी)लगातार, संचारित तरीके से बेमिसिया तबसी परिसर के सफेद मक्खियों द्वारा प्रेषित किए जाते हैं। दुनिया भर में फसल उत्पादन के लिए begomoviruses की वजह से व्यापक नुकसान को ध्यान में रखते हुए, यह begomoviruses और उनके whitefly वेक्टर के बीच बातचीत को समझने के लिए जरूरी है । ऐसा करने के लिए, वेक्टर ऊतकों में वायरस का स्थानीयकरण और मात्राकरण महत्वपूर्ण है। यहां, एक उदाहरण के रूप में टमाटर पीले पत्ते कर्ल वायरस (TYLCV) का उपयोग करके, हम प्रतिकार द्वारा व्हाइटफ्लाई मिडगुट, प्राथमिक लार ग्रंथियों और अंडाशय में बेगोमोवायरस को स्थानीयकृत करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। विधि एक वायरस कोट प्रोटीन, रंगलेबल माध्यमिक एंटीबॉडी, और एक confocal माइक्रोस्कोप के खिलाफ विशिष्ट एंटीबॉडी के उपयोग पर आधारित है । प्रोटोकॉल का उपयोग बेगोमोवायरल और व्हाइटफ्लाई प्रोटीन को सहस्थानीय बनाने के लिए भी किया जा सकता है। हम आगे व्हाइटफ्लाई मिडगुट, प्राथमिक लार ग्रंथियों, हीमोलिमीलफ, और मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) द्वारा अंडाशय में TYLCV के परिमाणीकरण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं । विशेष रूप से TYLCV के लिए डिज़ाइन किए गए प्राइमर का उपयोग करके, क्वांटिफिकेशन के लिए प्रोटोकॉल व्हाइटफ्लाई के विभिन्न ऊतकों में टायलसीवी की मात्रा की तुलना की अनुमति देते हैं। वर्णित प्रोटोकॉल एक व्हाइटफ्लाई और वायरस संक्रमित पौधे के शरीर में बेगोमोवायरस के परिमाणीकरण के लिए संभावित रूप से उपयोगी है। इन प्रोटोकॉलका उपयोग व्हाइटफ्लाई में बेगोमोवायरस के परिसंचरण मार्ग का विश्लेषण करने या व्हाइटफ्लाई-बेगोमोवायरस इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए अन्य तरीकों के पूरक के रूप में किया जा सकता है।

Introduction

पिछले दशकों में, बेगोमोवायरस (जीनस बेगोमोवायरस,परिवार जेमिनीविरीडी)नेदुनियाभर में कई सब्जी, फाइबर और सजावटी फसलों के उत्पादन को गंभीर नुकसान पहुंचाया है। बेगोमोवायरस व्हाइटफ्लाई बेमिसिया तबसी (हेमिप्टेरा: एलेरोडिडी) द्वारा लगातार तरीके से फैलते हैं, जो एक जटिल प्रजाति है जिसमें 35 गुप्त प्रजातियां2,3से अधिक होती हैं। बेगोमोवायरस प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष रूप से व्हाइटफ्लाई फिजियोलॉजी और व्यवहार को प्रभावित कर सकते हैं, जैसे कि फेकंडिटी4,दीर्घायु4,और मेजबान वरीयता5,6। इसके अलावा, एक दिए गए बेगोमोवायरस प्रजातियों/तनाव की संचरण दक्षता विभिन्न सफेद मक्खी गुप्त प्रजातियों के लिए भी एक ही प्रयोगात्मक परिस्थितियोंमें 7,8,9,10,यह दर्शाता है कि वहां begomoviruss और whiteflies के बीच एक जटिल बातचीत है बदलता है । व्हाइटफ्लाई-बेगोमोवायरस इंटरैक्शन अंतर्निहित तंत्रको बेहतर ढंग से समझने के लिए, व्हाइटफ्लाई ऊतकों में वायरस का स्थानीयकरण और मात्राकरण आवश्यक है।

टमाटर पीली पत्ती कर्ल वायरस (TYLCV) एक बेगोमोवायरस है जो पहले इसराइल में सूचित किया गया था, लेकिन आजकल11,12दुनिया भर में टमाटर के उत्पादन को गंभीर नुकसान पहुंचाता है । इसके आर्थिक महत्व के कारण, यह सबसे अच्छा अध्ययन begomoviruses13में से एक है । अन्य मोनोपार्टिट बेगोमोवायरस की तरह, टायलसीवी एक एकल-स्ट्रैंड गोलाकार डीएनए वायरस है जिसका जीनोम आकार लगभग 2,800 न्यूक्लियोटाइड्स14है। हालांकि अभी भी बहस चल रही है, सबूतों की कई पंक्तियां व्हाइटफ्लियों15,16,17में टायलसीवी की प्रतिकृति का समर्थन करती हैं । इसके अलावा,6 , 18,19,20के बारे में टीएलसीवी कणों और व्हाइटफ्लाई प्रोटीन की बातचीतकीसूचना दी गई है । वायरस संचरण के लिए, व्हाइटफ्लियों वायरस संक्रमित पौधों पर भोजन करके TYLCV प्राप्त करते हैं, घेघा तक पहुंचने के लिए खाद्य नहर के साथ विरशन गुजरते हैं, हीमोलिम्फ तक पहुंचने के लिए मिडगट दीवार में प्रवेश करते हैं, और फिर प्राथमिक लार ग्रंथियों (पीएसजी) में स्थानांतरित करते हैं। अंत में, विरियन को लार डक्ट के साथ लार के साथ पौधे के फ्लोएम21में रखा जाता है। इसके अलावा, कई अध्ययनों से पता चलता है कि TYLCV महिला व्हाइटफ्लियों से उनकीसंतान2,23तक ट्रांसवाइज रूप से प्रेषित करने में सक्षम है। दूसरे शब्दों में, उत्पादक संचरण प्राप्त करने के लिए, वायरस को एक ऊतक से दूसरे में स्थानांतरित करने के लिए व्हाइटफ्लाई के भीतर सेलुलर बाधाओं को दूर करना पड़ता है। इन बाधाओं के पार करने के दौरान, व्हाइटफ्लाई और वायरस प्रोटीन के बीच बातचीत होने की संभावना है, शायद दक्षता का निर्धारण जिसके साथ वायरस प्रेषित होते हैं।

प्रतिरक्षण प्रोटीन वितरण विश्लेषण के लिए आमतौर पर उपयोग की जाने वाली तकनीक है। उनके एंटीजन के लिए बाध्यकारी एंटीबॉडी की विशिष्टता प्रतिरक्षण का आधार बनाती है। TYLCV के आर्थिक महत्व के कारण, TYLCV कोट प्रोटीन के खिलाफ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी विकसित किया गया है, वायरस24स्थानीयकरण के लिए एक अत्यधिक संवेदनशील तरीका प्रदान करता है । मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर) न्यूक्लिक एसिड के संवेदनशील और विशिष्ट मात्राकरण की अनुमति देता है। यह तकनीक हाइड्रोलाइसिस जांच (जैसे, TaqMan) या फ्लोरोसेंट डाये (जैसे, SYBR ग्रीन) का पता लगाने के उपयोग पर सबसे अधिक बार आधारित है। हाइड्रोलिस जांच आधारित क्यूपीसीआर के लिए विशिष्ट जांच की आवश्यकता होती है, जिसके परिणामस्वरूप लागत में वृद्धि होती है । फ्लोरोसेंट डाया आधारित क्यूपीसीआर सरल और अधिक लागत प्रभावी है, क्योंकि लेबल वाले एम्प्लिस-विशिष्ट संकरण जांच की आवश्यकता नहीं है25। अब तक, कई अध्ययनों ने जटिल बेगोमोवायरस-व्हाइटफ्लाई इंटरैक्शन की जांच करने के लिए अन्य तरीकों के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस और क्यूपीसीआर का उपयोग किया है। उदाहरण के लिए, पैन एट अल ने व्हाइटफ्लाई ऊतकों में वायरस के क्यूपीसीआर और इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण किया और पाया कि व्हाइटफ्लाई प्रजातियों AsiaII 1 और मध्य पूर्व एशिया माइनर 1 (MEAM1) के बीच तंबाकू घुंघराले शूट वायरस (TbCSV) संचारित करने की क्षमता में अंतर वायरस के कारण एशियाII1 की मिडगट दीवार को कुशलतापूर्वक पार करने में सक्षम था लेकिन MEAM18नहीं । इसी तरह, जबकि भूमध्य (मेड) whiteflies आसानी से TYLCV संचारित कर सकते हैं, वे टमाटर पीले पत्ते कर्ल चीन वायरस (TYLCCNV) संचारित करने में विफल । पीएसजी में वायरस का इम्यूनोफ्लोरेसेंस डिटेक्शन का उपयोग करके चयनात्मक संचरण की जांच की गई थी, जिससे पता चला कि TYLCCNV आसानी से मेड व्हाइटफ्लियों26के पीएसजी को पार नहीं करता है । टायलसीवी सीपी के इम्यूनोफ्लोरेसेंस सहस्थानीयकरण और व्हाइटफ्लाई मिडगुट्स में ऑटोफैगी मार्कर प्रोटीन एटीजी 8-II से पता चलता है कि ऑटोफैगी व्हाइटफ्लाई27में टायलसीवी के संक्रमण का दमन करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।

यहां, एक उदाहरण के रूप में TYLCV का उपयोग करते हुए, हम एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस तकनीक द्वारा व्हाइटफ्लाई मिडगुट, पीएसजी और अंडाशय में बेगोमोवायरस के स्थानीयकरण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। तकनीक में प्राथमिक और रंग-लेबल वाले माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ विच्छेदन, निर्धारण और ऊष्मायन शामिल है। व्हाइटफ्लाई ऊतकों में वायरल प्रोटीन के स्थान को दिखाने वाले फ्लोरेसेंस संकेतों को फिर एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत पता लगाया जा सकता है। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग बेगोमोवायरल और व्हाइटफ्लाई प्रोटीन को सहस्थानीय बनाने के लिए किया जा सकता है। हम व्हाइटफ्लाई मिडगुट, पीएसजी, हीमोलिम्फ और अंडाशय में एसआईबीआर ग्रीन-आधारित क्यूपीसीआर का उपयोग करके TYLCV के क्वांटिफिकेशन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जिसका उपयोग विभिन्न व्हाइटफ्लाई ऊतक नमूनों में वायरस की मात्रा की तुलना करने के लिए किया जा सकता है।

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Protocol

1. व्हाइटफ्लाई, वायरस, पौधे, और वायरस का अधिग्रहण

  1. कपास पर रियर व्हाइटफ्लियों (MEAM1)(गोसिपियम हिर्सुटम सीवी. Zhemian 1793) एक ग्रीनहाउस में कीट प्रूफ पिंजरों में 26 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर एक 14:10 प्रकाश: अंधेरे चक्र और 60 ± 10% सापेक्ष आर्द्रता के साथ।
  2. व्हाइटफ्लाई आबादी की शुद्धता निर्धारित करने के लिए व्हाइटफ्लाई माइटोकॉन्ड्रियल साइटोक्रोम ऑक्सीडेस आई जीन के आधार पर पारंपरिक पीसीआर करें।
    1. 20 वयस्क सफेद मक्खियों को इकट्ठा करें और उन्हें व्यक्तिगत रूप से एक पीसीआर ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें लाइसिस बफर (10 एमएम ट्रिस, पीएच = 8.4, 50 एमएम केसीएल, 0.45% [wt/vol] ट्वीन-20, 0.2% [wt/vol] जिलेटिन, 0.45% [vol/vol] नोनिडेट 40, 60 gL
    2. प्रत्येक पीसीआर ट्यूब में 5-7 सिरेमिक मोतियों (व्यास में 2 मिमी) जोड़ें और ऊतक ों को करने के लिए नमूनों को पीस लें।
    3. 1 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर सभी नमूनों को इनक्यूबेट करें और इसके बाद 100 डिग्री सेल्सियस पर 10 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 000 000 000 000 000 000 000 000 000 00000000. पीसीआर प्रवर्धन के लिए टेम्पलेट के रूप में इस अधिनेत का उपयोग करें।
      नोट: यदि आवश्यक हो तो 65 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन समय बढ़ाया जा सकता है।
    4. पीसीआर प्रतिक्रिया इस प्रकार तैयार करें: Taq डीएनए बहुलक के 1 U, 10x बफर के 2 μL (एमजी2 +के साथ), डीएनटीपी मिश्रण के 1.6 माइक्रोन (2.5 मीटर), प्रत्येक प्राइमर के 0.5 माइक्रोन (प्रत्येक माइक्रोन), व्हाइटफ्लाई ऊतक के 2 μL सुपरनेट, और डबल आसुत पानी 20 माइक्रोन प्रति प्रतिक्रिया की कुल मात्रा के लिए। फॉरवर्ड प्राइमर सीक्वेंस 5'-TTGATTTTGTGTTCATCCAGAAGT-3' है और रिवर्स प्राइमर सीक्वेंस 5'-TAATGGCAGATTAGTGCATATTGGA-3' है।
      नोट: एक नकारात्मक नियंत्रण जहां डीएनए nuclease मुक्त पानी के साथ प्रतिस्थापित किया जाता है और पहले से सत्यापित MEAM1 whitefly डीएनए के साथ एक सकारात्मक नियंत्रण शामिल किया जाना चाहिए ।
    5. निम्नलिखित साइकिलिंग मापदंडों का उपयोग करपीसीआर प्रदर्शन करें: 3 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर प्रारंभिक निंदा, 30 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर denaturation के 35 चक्र, 30 एस के लिए 50-55 डिग्री सेल्सियस पर एनीलिंग, और 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर विस्तार, 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस के बाद।
    6. प्रतिबंध एंजाइम Taq I के साथ प्रवर्धित उत्पाद को पचाएं। ऐसा करने के लिए, एंजाइम के 0.1 माइक्रोन (1 यू) के साथ पाचन मिश्रण तैयार करें, 10x Taq I बफर का 1 माइक्रोन, बीएसए का 1 माइक्रोन, प्रवर्धित उत्पाद का 5 माइक्रोन, और डबल आसुत पानी 10 माइक्रोन की कुल मात्रा में। थर्मोसाइकिलर में 1 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    7. प्रत्येक पचाए गए उत्पाद के 5-7 माइक्रोन लोड करके नमूनों के अगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस और एक डीएनए सीढ़ी (100-2,000 बीपी) को 1% अगारोज जेल के कुओं में करें। फिर, यूवी लाइट का उपयोग करके जेल-रेड धुंधला मशीन में जेल-लाल धुंधला द्वारा डीएनए बैंड आकार का निरीक्षण करें। व्हाइटफ्लाई आबादी की शुद्धता निर्धारित करने के लिए पचाए गए उत्पादों के बैंड आकार की तुलना सकारात्मक नियंत्रण से करें।
  3. एग्रो-टायलसीवी (जेनबैंक परिग्रहण संख्या AM282874.1) (pBINPLUS-SH2-1.4 A) के संक्रामक क्लोन को 3-4 सच्चे पत्ती चरण टमाटर के पौधों(सोलसुम लाइकोपीर्सिकम एल सीवी हेज़ुओ 903) में टीका लगाते हैं।
    1. लुरिया-बर्टानी (एलबी) माध्यम का 10 मीटर का टीका लगाकर कनकमिन (50 μg/mL) और रिफामपिसिन (50 μg/mL) एक ही कॉलोनी के साथ। 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट 200 आरपीएम पर मिलाते हुए जब तक ओडी600 ~ 1.5 तक पहुंचता है।
    2. 10 मिन के लिए 4,000 x ग्राम पर केंद्रीकरण द्वारा हार्वेस्ट एग्रोबैक्टीरिया। सुपरनेटेंट को छोड़ दें।
    3. घुसपैठ बफर के 10 मीटर में छर्रों को फिर से निलंबित करना, जिसमें 200 माइक्रोएम एसीटोसिरिंगोन, 10 एम एम 2-(एन-मॉर्फोलिनो) एथेन सल्फोनिक एसिड (एमईएस), और 10 एमएम एमजीसीएल2शामिल हैं। 1-2 घंटे के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर इनक्यूबेट।
    4. 1-3.3 चरण से मिश्रण का उपयोग करके 2-3 पौधे के पत्तों में घुसपैठ करें 1 मिलीएल सुईरहित सिरिंज के साथ। 26 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर एक ग्रीनहाउस में पौधों को बनाए रखें।
  4. लगभग 1 महीने बाद, एक दृश्य निरीक्षण करें और पीले कर्ल के पत्ते और स्टंट लक्षण ों को दिखाने वाले पौधों का चयन करें।
  5. वायरस अधिग्रहण के लिए 48 घंटे के लिए TYLCV-संक्रमित टमाटर के पौधों पर गैर-विषाचारसफेद सफेद मक्खी वयस्कों को स्थानांतरित करें।

2. मिडगुट्स, प्राइमरी लार ग्रंथियों (पीएसजी), अंडाशय और महिला व्हाइटफ्लियों के हीमोलिम्फ का विच्छेदन और संग्रह

  1. आकांक्षा का उपयोग करसफेद ी ले लीजिए, और फिर उन्हें कोमा में डालने के लिए बर्फ पर रखें। एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर 1x पीबीएस (फॉस्फेट-बफरलव) बफर जोड़ें, और फिर स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत विच्छेदन के लिए 1x पीबीएस बफर में व्हाइटफ्लियों रखें।
    1. मिडगट विच्छेदन के लिए, व्हाइटफ्लाई के पेट को तोड़ें और ठीक एक्यूपंक्चर सुई (व्यास में 0.25 मिमी) का उपयोग करके मिडगट को बाहर निकालें। मिडगट को साफ करने के लिए स्थानांतरित करें, 1x पीबीएस।
    2. पीएसजी विच्छेदन के लिए, पृष्ठीय पक्ष से सिर के पास छाती में व्हाइटफ्लाई के शरीर को तोड़ें। इसके बाद, व्हाइटफ्लाई को ठीक करने के लिए छाती में एक सुई डालें, और सफेद मक्खी को हिलाने के लिए एक और सुई का उपयोग करें जब तक कि दो लार ग्रंथियां शरीर से अलग न हो जाएं। फिर, पीएसजी को साफ, 1x पीबीएस में स्थानांतरित करें।
    3. अंडाशय विच्छेदन के लिए, व्हाइटफ्लाई के पेट को पूरी तरह से तोड़ दें, और अंडाशय को अन्य ऊतकों से अलग करने के लिए सुई का उपयोग करें। फिर, पाइपिंग द्वारा अतिरिक्त ऊतकों को हटा दें।
    4. हीमोलिम्फ संग्रह के लिए, माइक्रोस्कोप स्लाइड पर 1x पीबीएस बफर के 10 माइक्रोन जोड़ें, और फिर बफर में एक व्हाइटफ्लाई रखें। हीमोलिम्फ प्राप्त करने के लिए, धीरे-धीरे एक ठीक एक्यूपंक्चर सुई का उपयोग करके पेट में एक छेद को फाड़ दें, और बफर में हीमोलिम्फ को छोड़ने के लिए पेट को थोड़ा दबाएं। हीमोलिम्फ नमूने के रूप में तरल के 8 माइक्रोन एकत्र करें।

3. व्हाइटफ्लाई मिडगट, प्राइमरी लार ग्रंथियों और अंडाशय में टायलसीवी का स्थानीयकरण प्रतिकार से

नोट: मिडगुट में टायलसीवी के स्थानीयकरण की प्रक्रिया को एक उदाहरण के रूप में प्रस्तुत किया गया है। विधि पीएसजी और अंडाशय के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

  1. टीबीएस बफर (10 एमएम ट्रिस-एचसीएल, 150 एमएम सोडियम क्लोराइड, पीएच = 7.5) में मिडगुट को विच्छेदन करें जैसा कि चरण 2.2.1 में वर्णित है। 15-20 व्हाइटफ्लाई मिडगुट ्स लीजिए, उन्हें एक ग्लास पेट्री डिश (व्यास में 3.5 सेमी) में स्थानांतरित करें, और फिर अतिरिक्त टीबीएस बफर को हटा दें।
  2. कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए मिडगुट को ठीक करने के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड का 1 एल जोड़ें, और फिर फिक्सिव सॉल्यूशन को हटा दें। पिपेट धीरे-धीरे 2 मिन के लिए टीबीएस में मिडगुट 3x धोने के लिए।
  3. 0.5% ट्राइटन एक्स-100 के 1 mL में 30 मिन के लिए परमीबिलाइज करने के लिए मिडगुटकोइन करें। फिर परमीबिलाइजेशन समाधान को हटा दें और चरण 3.2 में वर्णित टीबीएस (0.05% ट्वीन 20 के साथ 1x टीबीएस) के साथ मिडगुट 3x धोएं।
  4. मिडगुटको ब्लॉक करने के लिए 1% बीएसए (एसटीएसटी में तैयार गोजातीय सीरम एल्बुमिन) का 1 एमएल जोड़ें। 2 घंटे के लिए आरटी पर अवरुद्ध कदम प्रदर्शन करें, और फिर अवरुद्ध समाधान को हटा दें और TBST में मिडगुट 3x धो लें।
  5. TBST24 के साथ 1:400 पर प्राथमिक एंटीबॉडी (TYLCV कोट प्रोटीन के खिलाफ MAb 1C4) पतला और मिडगुट विसर्जित करने के लिए पेट्री डिश में समाधान जोड़ें । अंधेरे में रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान को त्यागें और TBST में 3x धो लें।
  6. TBST के साथ 1:400 पर माध्यमिक एंटीबॉडी (एंटी-माउस) को पतला करें और मिडगुटको विसर्जित करने के लिए पेट्री डिश में समाधान जोड़ें। अंधेरे में आरटी में 2 घंटे के लिए पकवान इनक्यूबेट। सेकेंडरी एंटीबॉडी सॉल्यूशन को डिस्कार्ड करें और TBST में मिडगुट3x धो लें।
  7. मिडगुट्स को एक स्पष्ट माइक्रोस्कोप स्लाइड में स्थानांतरित करें। संभव के रूप में स्लाइड से ज्यादा TBST के रूप में Aspirate । नाभिक को दागदेने के लिए डैपीआई (4', 6-डिमिडिनो-2-फेनिलिंडॉल, डाइहाइड्रोक्लोराइड) की 1 बूंद जोड़ें और फिर कवरस्लिप और सील को नेल पॉलिश के साथ रखें। एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत जांच करें।

4. व्हाइटफ्लाई मिडगट, प्राइमरी लार ग्रंथियों, हीमोलिम्फ और अंडाशय में क्यूटपीसीआर के साथ टायलसीवी का क्वांटिफिकेशन

  1. ऊपर वर्णित 1x पीबीएस में व्हाइटफ्लाई मिडगुट, पीएसजी, हीमोलिम्फ और अंडाशय को विच्छेदन करें।
  2. मिडगुट, पीएसजी, हीमोलिम्ह और अंडाशय का डीएनए निकालें।
    1. विच्छेदन के बाद, मिडगुट, पीएसजी और अंडाशय को साफ, 1x पीबीएस बफर 2-3x में धोलें।
    2. 1x पीबीएस के 5 माइक्रोन में 20 मिडगुट या 20 पीएसजी एकत्र करें और उन्हें 25 माइक्रोन लिसिस समाधान में स्थानांतरित करें। प्रत्येक अंडाशय को 1x पीबीएस के 5 माइक्रोन में स्थानांतरित करें और फिर व्यक्तिगत रूप से 25 माइक्रोन लिसिस समाधान में स्थानांतरित करें।
    3. कदम 1.2.2 में वर्णित मिडगुट, पीएसजी और अंडाशय के नमूनों को पीसें।
    4. 1x पीबीएस के साथ 8 माइक्रोन को पीसीआर ट्यूब में इकट्ठा करें, और फिर लिसिस समाधान के 10 माइक्रोन जोड़ें। अच्छी तरह मिला लें।
  3. 1.2.3 में वर्णित सभी नमूनों से डीएनए निकालें।
  4. TYLCV के लिए दो अलग क्यूपीसीआर मास्टर मिक्स (18 माइक्रोन प्रत्येक) और आंतरिक नियंत्रण(एसीटीन जीन) इस प्रकार तैयार करें: एसवाईबीआर ग्रीन मिक्स के 10 माइक्रोन, प्रत्येक प्राइमर के 0.8 माइक्रोन (प्रत्येक माइक्रोन), और प्रति प्रतिक्रिया डबल आसुत पानी के 6.4 माइक्रोन। TYLCV के लिए, फॉरवर्ड प्राइमर अनुक्रम 5′-GAAGCGACCAGGCGATATAA-3 है' और रिवर्स प्राइमर अनुक्रम 5′-GGAACATCAGGGCTCTGATA-3' है । ए-ऐक्टिनके लिए, फॉरवर्ड प्राइमर अनुक्रम 5′-TCTTCCAGCCATCCATCTTG-3 है' और रिवर्स प्राइमर अनुक्रम 5′-CGGTGATTTCCTTCTGCATT-3'।
  5. क्यूपीसीआर स्ट्रिप ट्यूब या 96 अच्छी प्लेट की शीशियों में मास्टर मिश्रण के 18 माइक्रोन बांटें। इसके बाद प्रत्येक शीशी में डीएनए नमूनों में से 2 माइक्रोन डालें। कम से कम तीन तकनीकी प्रतिकृतियों और तीन जैविक प्रतिकृतियों के साथ सभी प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन करें।
    नोट: चरण 4.5 बर्फ पर किया जाना चाहिए।
  6. क्यूपीसीआर ट्यूब बंद करें या चिपकने वाली प्लेट सील के साथ 96 अच्छी प्लेटों को सील करें।
  7. क्यूपीसीआर ट्यूब या 96 अच्छी प्लेट के नीचे तरल इकट्ठा करने के लिए सेंट्रलाइज।
  8. ट्यूब या प्लेट को वास्तविक समय थर्मल साइकिलर में रखें और क्यूपीसीआर करें।
    1. निम्नलिखित साइकिलिंग मापदंडों का उपयोग करते हुए क्यूपीसीआर का प्रदर्शन करें: 30 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, इसके बाद प्राइमर एनिंग और विस्तार के लिए 34 एस के लिए 5 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 40 चक्र और 60 डिग्री सेल्सियस, 15 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर 1 चक्र, 60 डिग्री सेल्सियस से 95 डिग्री सेल्सियस के पिघलने वाले वक्र चरण के साथ समाप्त होता है। 0.5 डिग्री सेल्सियस प्रति 15 एस की वृद्धि।
    2. नमूना प्रकार के रूप में फ्लोरोफोर डाये और अज्ञात के रूप में SYBR चुनें।
  9. मात्रात्मक डेटा को स्प्रेडशीट प्रारूप में निर्यात करें और 2−−10CT विधि28द्वारा वायरल डीएनए की सापेक्ष मात्रा का विश्लेषण करें।

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Representative Results

बी तबसी कॉम्प्लेक्स और टायलसीवी के एमईएएम1 व्हाइटफ्लियों का उपयोग प्रक्रियाओं का वर्णन करने के लिए यहां एक उदाहरण के रूप में किया गया था। इस पांडुलिपि में वर्णित प्रतिरक्षण और वायरल क्वांटिफिकेशन प्रक्रियाओं का अवलोकन चित्र 1में दिखाया गया है । चित्रा 2 पीएसजी, मिडगुटऔर अंडाशय में TYLCV और डीपीआई धुंधला के इम्यूनोफ्लोरेसेंस डिटेक्शन के प्रतिनिधि परिणामों को दर्शाता है, यह दर्शाता है कि टाइलसीवी पीएसजी और मिडगुट में अधिक जमा हुआ, और अंडाशय में कम। चित्रा 3 व्हाइटफ्लाई पीएसजी, मिडगुट, हीमोलिम्फ और अंडाशय में वायरस की सापेक्ष मात्रा को दिखाता है, क्योंकि 24, 48 और 72 घंटे के लिए टायलसीवी-संक्रमित टमाटर पर खिलाया जाने वाला व्हाइटफ्लियों के बाद वायरस की मात्रा बढ़ गई है, यह दर्शाता है कि अधिग्रहण पहुंच अवधि में वृद्धि के साथ विभिन्न व्हाइटफ्लाई ऊतकों में वायरस की मात्रा बढ़ गई।

Figure 1
चित्रा 1: इस पेपर में प्रस्तुत प्रोटोकॉल का अवलोकन। (A)व्हाइटफ्लाई मिडगुट, पीएसजी और अंडाशय में प्रतिरक्षण के लिए प्रायोगिक प्रक्रियाएं। टिवर्ट्स को टायलसीवी-संक्रमित वयस्क महिला व्हाइटफ्लियों से एकत्र किया गया था, जिसके बाद निर्धारण, परमीबिलाइजेशन, अवरुद्ध, प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन की एक श्रृंखला एकत्र की गई थी जो एक टाइलसीवी कोट प्रोटीन से बांधती है, और फ्लोरोक्रोम-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी जो प्राथमिक एंटीबॉडी से बांधती है। अंत में, नमूनों का विश्लेषण एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत किया गया, जिससे छवियों के अधिग्रहण की अनुमति मिली। (ख)व्हाइटफ्लाई मिडगुट, पीएसजी, अंडाशय और हीमोलिम्फ में वायरस की मात्रा के लिए प्रायोगिक प्रक्रिया । टिश्यू को टायलसीवी-संक्रमित वयस्क महिला व्हाइटफ्लियों से एकत्र किया गया था, और फिर डीएनए निष्कर्षण किया गया था। क्यूपीसीआर को वास्तविक समय पीसीआर उपकरण पर किया गया था, जिससे डेटा के अधिग्रहण की अनुमति मिलती थी जिसका बाद में विश्लेषण किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: प्राथमिक लार ग्रंथियों, मिडगुट, और महिला वयस्क सफेद मक्खियों के अंडाशय में TYLCV का इम्यूनोफ्लोरेसेंस डिटेक्शन 48 एच वायरस अधिग्रहण पहुंच अवधि के बाद। व्हाइटफ्लियों को 48 घंटे के लिए TYLCV-संक्रमित टमाटर के पौधों को खिलाने की अनुमति दी गई थी, और फिर 20 पीएसजी, 20 मिडगुट, और 20 अंडाशय विच्छेदित और एकत्र किए गए थे। इसके बाद, नमूनों को 4% फॉर्मलडिहाइड में तय किया गया, 0.5% ट्राइटन एक्स-100 में पार्मिबिलाइज्ड, 1% बीएसए में अवरुद्ध, और फिर माउस एंटी-टायलसीवी मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (डीएटीसीवी कोट प्रोटीन के खिलाफ एमएबी 1C4)24 और बकरी विरोधी माउस माध्यमिक एंटीबॉडी एक लाल फ्लोरोसेंट डाइट (यानी, ड्लाइट 59) के साथ इनक्यूबेटेड किया गया। नाभिक को DAPI (नीला) से दाग दिया गया था। एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत इम्यूनोफ्लोरेसेंस संकेतों की जांच की गई । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: मिडगुट, हीमोलिमीलह, प्राथमिक लार ग्रंथियों, और MEAM1 whiteflies में अंडाशय में TYLCV डीएनए की मात्रा । 24, 48 और 72 घंटे के लिए TYLCV-संक्रमित टमाटर के पौधों पर खिलाया गया वयस्क, और फिर व्हाइटफ्लाई मिडगुट, हीमोलिमील, पीएसजी और अंडाशय को विच्छेदित और एकत्र किया गया। इसके बाद, डीएनए और क्यूपीसीआर की निकासी मिडगुट(ए),हीमोलिम्फ(बी),पीएसजी(सी),और अंडाशय(डी)के लिए की गई थी। डेटा को सबसे पहले व्हाइटफ्लाई-ऐक्टिन डीएनए में सामान्यीकृत किया गया था, और फिर प्राप्त वायरस की सापेक्ष मात्रा को फिर से 24 घंटे एनवी: गैर-विरूपित में सामान्यीकृत किया गया था। डेटा वायरस की सापेक्ष मात्रा के मतलब ± SEM के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यहां हम प्रतिकार और क्यूपीसीआर द्वारा अपने व्हाइटफ्लाई वेक्टर के ऊतकों में एक बेगोमोवायरस के स्थानीयकरण और मात्राकरण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। विच्छेदन व्हाइटफ्लाई ऊतकों में वायरस को स्थानीयकृत और मात्रा देने के लिए पहले कदम का प्रतिनिधित्व करता है। व्हाइटफ्लाई शरीर लंबाई में लगभग 1 मिमी है, जिसका अर्थ है कि ऊतक बेहद छोटे हैं, और उन्हें विच्छेदन करना मुश्किल है। इसके अलावा, ऊतकों के बीच मजबूत कनेक्शन हैं। उदाहरण के लिए, अंडाशय जीवाणुओं के साथ कसकर जुड़े होते हैं, जिससे उन्हें अलग-थलग करना मुश्किल हो जाता है। यहां, विभिन्न ऊतकों की विशेषताओं और स्थानों को ध्यान में रखते हुए, हम विच्छेदन के लिए विभिन्न दृष्टिकोणों का वर्णन करते हैं। हालांकि, इन ऊतकों को तेजी से और सटीक रूप से विच्छेदन करने के लिए बहुत सारे अभ्यास की आवश्यकता है। इसके अलावा, ताजा सफेद मक्खियों का उपयोग करना सबसे अच्छा है, क्योंकि मृत कीड़े विच्छेदन की कठिनाई को बढ़ादेंगे। इसके अलावा, पोस्टडिसेक्शन, ऊतकों को संदूषण से बचने के लिए साफ किया जाना चाहिए।

इम्यूनोफ्लोरेसेंस तकनीक विशिष्ट एंटीबॉडी के उपयोग पर आधारित है। इमेजिंग में प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए एक उपयुक्त काम करने वाली एकाग्रता बहुत महत्वपूर्ण है, क्योंकि एंटीबॉडी की उच्च एकाग्रता सिग्नल-टू-बैकग्राउंड अनुपात को कम करती है और कम एकाग्रता पर्याप्त संकेत प्रदान नहीं कर सकती है। यहां, हमने प्राथमिक एंटीबॉडी और दूसरे एंटीबॉडी दोनों के लिए 1:400 के कमजोर पड़ने का उपयोग किया। इन एंटीबॉडी को छोटे एलिकोट्स में बांटा जाना चाहिए और बार-बार ठंड और विगलन से बचने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाना चाहिए। एंटीबॉडी कमजोर पड़ने का उपयोग करने से ठीक पहले तैयार किया जाना चाहिए। जब यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग वायरल और व्हाइटफ्लाई प्रोटीन को सहस्थानीय बनाने के लिए किया जाता है, तो यह महत्वपूर्ण है कि वायरल और व्हाइटफ्लाई प्रोटीन के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी विभिन्न प्रजातियों के जानवरों में उत्पादित किए जाते हैं। इसके अतिरिक्त, माध्यमिक एंटीबॉडी के फ्लोरोफोरस को चैनलों के बीच खून को रोकने के लिए सावधानीपूर्वक चुना जाना चाहिए। इसके अलावा, व्हाइटफ्लाई ऊतकों के छोटे आकार को देखते हुए, उन्हें नुकसान से बचने के लिए हमेशा माइक्रोस्कोप के नीचे धोया जाना चाहिए। यद्यपि प्रतिकार अत्यधिक संवेदनशील है, लेकिन सीटू संकरण (मछली) में फ्लोरेसेंस जैसे अन्य वायरस स्थान विधियों की तुलना में यह अपेक्षाकृत अधिक समय लेने वाला और महंगा होता है। इसके अलावा, बेगोमोवायरस के खिलाफ एंटीबॉडी खरीद के लिए उपलब्ध नहीं हो सकते हैं।

व्हाइटफ्लाई ऊतकों में वायरस की मात्रा के लिए क्यूपीसीआर के सफल अनुप्रयोग की कुंजी उपयुक्त प्राइमर के डिजाइन और एंडोजेनस संदर्भ जीन के चयन में निहित है। रोड्रिगेज एट अल ने क्यूपीसीआर प्राइमर को विस्तार से25डिजाइन करने के मापदंड का वर्णन किया, जो वायरस प्राइमर के डिजाइन में भी लागू होता है । इस अध्ययन में, व्हाइटफ्लाई ऊतकों में वायरस क्वांटिफिकेशन के लिए संदर्भ जीन के रूप में एक्टिन का चयन किया गया था। हालांकि, कुछ मामलों में (जैसे, आरएनए जीन), अन्य एंडोजेनस जीन का उपयोग संदर्भ जीन के रूप में किया जाना चाहिए यदि वे प्रायोगिक डिजाइन29के लिए उपयुक्त हैं। इसके अलावा, स्थिर और सटीक परिणाम प्राप्त करने के लिए, एक ही विकासात्मक चरण के सफेद मक्खियों का उपयोग किया जाना चाहिए, क्योंकि विभिन्न विकासात्मक चरणों के सफेद मक्खियों मेंवायरस 22को प्राप्त करने और संचारित करने के लिए अंतर क्षमताएं हैं। इसके अलावा, जब हमने एक नमूने के रूप में 20 पीएसजी या मिडगुट का उपयोग किया, तो हमने क्यूपीसीआर विश्लेषण के लिए एक नमूने के रूप में एक व्हाइटफ्लाई से एकत्र किए गए हीमोलिम्फ का उपयोग किया। यह इस तथ्य के कारण है कि हीमोलिम्फ का संग्रह समय लेने वाला है और हीमोलिम्ह के नमूनों का डीएनए समय पर संसाधित नहीं होने पर गिरावट की चपेट में है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग व्हाइटफ्लाई पूरे शरीर और वायरस संक्रमित पौधों में वायरस की मात्रा की मात्रा निर्धारित करने के लिए भी किया जा सकता है।

संक्षेप में, हम क्रमशः प्रतिरक्षण और क्यूपीसीआर द्वारा व्हाइटफ्लाई ऊतकों में बेगोमोवायरस को स्थानीयकृत और निर्धारित करने के लिए एक कुशल और संवेदनशील प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। इस प्रोटोकॉल को अन्य बेगोमोवायरस के स्थानीयकरण और परिमाणीकरण के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है। इसके अलावा, प्रतिकार के प्रोटोकॉल का उपयोग वायरल और व्हाइटफ्लाई प्रोटीन को सहस्थानीय बनाने के लिए किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (अनुदान संख्या: 2017YFD0200600), चीन कृषि अनुसंधान प्रणाली के लिए निर्धारित निधि (अनुदान संख्या: कारों-23-D07) और बिल & मेलिंडा गेट्स फाउंडेशन (निवेश आईडी OPP1149777द्वारा समर्थित था ). हम TYLCV सीपी एंटीबॉडी प्रदान करने के लिए प्रो जियान-जियांग वू को धन्यवाद देते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% Paraformaldehyde MultiSciences F0001
4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) Abcam ab104139
Bovine Serum Albumin (BSA) MultiSciences A3828
CFX Connect Real-Time PCR Detection System Bio-RAD 185-5201
Confocal microscopy Zeiss LSM800
Dylight 549-goat anti-mouse Earthox E032310-02 Secondary antibody
Monoclonal antibody (MAb 1C4) Primary antibody
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sangon Biotech B548119-0500
Stereo microscope Zeiss Stemi 2000-C
TB green premix Ex Taq (Tli RNase H Plus) TaKaRa RR820A qPCR master mix
Thermocycler Thermofisher A41182
Tissuelyzer Shaghai jingxin Tissuelyser-48
Triton-X-100 BBI life sciences 9002-93-1
Tween 20 BBI life sciences 9005-64-5

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References

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