Summary
Vi beskriver en immunofluorescens og kvantitativ PCR-metode for lokalisering og kvantifisering av begomovirus i insektvev. Immunofluorescensprotokollen kan brukes til å samlokalisere virale og vektorproteiner. Den kvantitative PCR-protokollen kan utvides til å kvantifisere virus i hele whitefly-legemer og virusinfiserte planter.
Abstract
Begomovirus (slekten Begomovirus, familie Geminiviridae) overføres av hvite fluer i Bemisia tabaci-komplekset på en vedvarende, sirkulasjonsmåte. Tatt i betraktning den omfattende skaden forårsaket av begomovirus for å beskjære produksjonen over hele verden, er det viktig å forstå samspillet mellom begomovirus og deres whitefly vektor. For å gjøre dette, lokalisering og kvantifisering av viruset i vektorvev er avgjørende. Her, ved hjelp av tomat gul blad curl virus (TYLCV) som et eksempel, beskriver vi en detaljert protokoll for å lokalisere begomovirus i whitefly midguts, primære spyttkjertler, og eggstokkene ved immunofluorescens. Metoden er basert på bruk av spesifikke antistoffer mot et viruspelsprotein, dye-merket sekundære antistoffer og et konfokal mikroskop. Protokollen kan også brukes til å kolokalisere begomovirale og whitefly proteiner. Vi beskriver videre en protokoll for kvantifisering av TYLCV i whitefly midguts, primære spyttkjertler, hemolymph, og eggstokkene av kvantitative PCR (qPCR). Ved hjelp av primere som er spesielt utviklet for TYLCV, tillater protokollene for kvantifisering sammenligning av mengden TYLCV i forskjellige vev av whitefly. Den beskrevne protokollen er potensielt nyttig for kvantifisering av begomovirus i kroppen til en whitefly og en virusinfisert plante. Disse protokollene kan brukes til å analysere sirkulasjonsveien til begomovirus i whitefly eller som et supplement til andre metoder for å studere whitefly-begomovirus interaksjoner.
Introduction
I de siste tiårene har begomovirus (slektbegomovirus, familie Geminiviridae) forårsaket alvorlig skade på produksjonen av mange grønnsaker, fiber og dekorative avlinger over hele verden1. Begomovirus overføres på en vedvarende måte av whitefly Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae), som er en kompleks art som inneholder over 35 kryptiske arter2,3. Begomovirus kan direkte eller indirekte påvirke whitefly fysiologi og atferd, for eksempel fecundity4, lang levetid4,og vert preferanse5,6. Videre varierer overføringseffektiviteten til en gitt begomovirusart /stamme for forskjellige whitefly kryptiske arter selv under de samme eksperimentelle forholdene7,8,9,10, noe som indikerer at det er en kompleks interaksjon mellom begomovirus og whiteflies. For bedre å forstå mekanismene underliggende whitefly-begomovirus interaksjoner, lokalisering og kvantifisering av viruset i whitefly vev er avgjørende.
Tomat gul blad curl virus (TYLCV) er et begomovirus som først ble rapportert i Israel, men i dag forårsaker alvorlig skade på tomatproduksjon over hele verden11,12. På grunn av sin økonomiske betydning, er det en av de best studerte begomovirus13. Som andre monopartite begomovirus er TYLCV et sirkulært DNA-virus med én tråd med en genomstørrelse på ca. 2800 nukleotider14. Mens fortsatt under debatt, flere linjer med bevis støtte replikering av TYLCV i whiteflies15,16,17. Videre har samspillet mellom TYLCV-partikler og whitefly proteiner blitt rapportert6,18,19,20. For virusoverføring får whiteflies TYLCV ved å mate på virusinfiserte planter, virions passerer langs matkanalen for å nå spiserøret, trenge inn i midgutveggen for å nå hemolymfen, og deretter translocate inn i de primære spyttkjertlene (PSGs). Til slutt er virions egested med spytt langs spyttkanalen i plantephloem21. Videre viser flere studier at TYLCV er i stand til å overføres transovarialt fra kvinnelige hvitefluer til deres avkom22,23. Med andre ord, for å oppnå produktiv overføring, må viruset overvinne cellulære barrierer i whitefly for å translocate fra ett vev til et annet. Under kryssingen av disse barrierene vil interaksjoner mellom whitefly og virusproteiner sannsynligvis forekomme, noe som sannsynligvis bestemmer effektiviteten som virusene overføres med.
Immunofluorescens er en vanlig teknikk for proteinfordelingsanalyse. Spesifisiteten av antistoffer som binder seg til antigenet danner grunnlaget for immunofluorescens. På grunn av den økonomiske betydningen av TYLCV, monoklonale antistoffer mot TYLCV pels protein er utviklet, og tilbyr en svært følsom måte å lokalisere viruset24. Kvantitativ PCR (qPCR) tillater følsom og spesifikk kvantifisering av nukleinsyrer. Denne teknikken er oftest basert på bruk av hydrolysesonde (f.eks. TaqMan) eller fluorescerende dye (f.eks. SYBR Green) deteksjon. For hydrolyserprobebasert qPCR er det nødvendig med spesifikke sonder, noe som øker kostnadene. Fluorescerende fargebasert qPCR er enklere og mer kostnadseffektiv, fordi merket amplicon-spesifikke hybridiseringsprober ikke er nødvendig25. Så langt har flere studier brukt immunfluorescens og qPCR sammen med andre metoder for å undersøke de komplekse begomovirus-whitefly interaksjoner. For eksempel, Pan et al. utført qPCR og immunofluorescens analyse av viruset i whitefly vev og fant at forskjellen i evne til å overføre tobakk krøllete skyte virus (TbCSV) mellom whitefly arter AsiaII 1 og Midtøsten Asia Minor 1 (MEAM1) var på grunn av viruset å effektivt krysse midgut veggen av AsiaII1, men ikke MEAM18. På samme måte, mens middelhavshvitfluer (MED) lett kan overføre TYLCV, klarer de ikke å overføre tomatgul bladkrøll Kina-virus (TYLCCNV). Selektiv overføring ble undersøkt ved hjelp av immunofluorescens deteksjon av virus i PSGs, som viste at TYLCCNV ikke lett krysser PSGs av MED whiteflies26. Immunofluorescence kolokalisering av TYLCV CP og autofagi markør protein ATG8-II i whitefly midguts viser at autofagi spiller en kritisk rolle i å undertrykke infeksjonen av TYLCV i whitefly27.
Her, ved hjelp av TYLCV som et eksempel, beskriver vi en protokoll for lokalisering av begomovirus i whitefly midguts, PSGs og eggstokkene ved en immunofluorescensteknikk. Teknikken inkluderer disseksjon, fiksering og inkubasjon med primære og farsmerkede sekundære antistoffer. Fluorescenssignaler som viser plasseringen av virusproteiner i whitefly-vevet kan deretter oppdages under et konfokalmikroskop. Enda viktigere, denne protokollen kan brukes til å kolocalisere begomovirale og whitefly proteiner. Vi beskriver videre en protokoll for kvantifisering av TYLCV ved hjelp av SYBR Green-baserte qPCR i whitefly midguts, PSGs, hemolymph og eggstokkene, som kan brukes til å sammenligne mengden virus i forskjellige whitefly vevsprøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Whitefly, Virus, Planter, og Oppkjøp av viruset
- Bakre whiteflies (MEAM1) på bomull (Gossypium hirsutum cv. Zhemian 1793) i insektsikre bur i et drivhus ved 26 ± 1 °C med en 14:10 lys:mørk syklus og 60 ± 10% relativ fuktighet.
- Utfør konvensjonell PCR basert på whitefly mitokondriecytokromoksidase I genet for å bestemme renheten til whitefly befolkningen.
- Samle 20 voksne whiteflies og overfør dem individuelt til et PCR-rør som inneholder 30 μL lysisbuffer (10 mM Tris, pH = 8,4, 50 mM KCl, 0,45% [wt/vol] Tween-20, 0,2% [wt/vol] gelatin, 0,45% [vol/vol] Nonidet P 40, 60 g/mL Proteinase Kase).
- Tilsett 5–7 keramiske perler (2 mm i diameter) i hvert PCR-rør og slip prøvene for å utføre vevslysen.
- Inkuber alle prøver ved 65 °C i 1 t etterfulgt av 10 min ved 100 °C, og deretter sentrifuge kort. Bruk denne supernatanten som mal for PCR-forsterkning.
MERK: Inkubasjonstiden ved 65 °C kan økes om nødvendig. - Forbered PCR-reaksjonen på følgende måte: 1 U av Taq DNA polymerase, 2 μL 10x buffer (med Mg2+), 1,6 μL dNTP-blandingen (2,5 ml), 0,5 μL av hver primer (10 μM hver), 2 μL whiteflyvev lysatsupernatant, og dobbelt destillert vann til et totalt volum på 20 μL per reaksjon. Den fremre primersekvensen er 5'-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3' og den omvendte primersekvensen er 5'-TAATATGGCAGATTAGTGCATTGGA-3'.
MERK: En negativ kontroll der DNA erstattes med kjernefritt vann og en positiv kontroll med tidligere verifisert MEAM1 whitefly DNA bør inkluderes. - Utfør PCR ved hjelp av følgende sykkelparametere: innledende denaturering ved 95 °C i 3 min, etterfulgt av 35 sykluser med denaturering ved 95 °C i 30 °C i 30 °C i 10 min.
- Fordøye det forsterkede produktet med restriksjonsenzymet Taq I. For å gjøre dette, forberede fordøyelsesblandingen med 0,1 μL (1 U) av enzym,1 μL av 10x Taq I Buffer, 1 μL BSA, 5 μL forsterket produkt og dobbelt destillert vann til et totalt volum på 10 μL. Inkuber ved 65 °C i 1 timer i en termocycler.
- Utfør agarose gel elektroforese av prøvene ved å laste 5-7 μL av hvert fordøyd produkt og en DNA-stige (100-2000 bp) inn i brønnene til en 1% agarose gel. Deretter må du observere DNA-båndstørrelsene ved å gelrøde flekker i en geldokumentasjonsmaskin ved hjelp av UV-lys. Sammenlign båndstørrelsene til de fordøyde produktene med den positive kontrollen for å bestemme renheten til whitefly-populasjonen.
- Agro-inokulere den smittsomme klonen av TYLCV (GenBank tiltredelsenummer AM282874.1) (pBINPLUS-SH2-1.4A) i 3-4 ekte blad stadium tomatplanter (Solanum lycopersicum L. cv. Hezuo 903).
- Inokuler 10 ml Luria–Bertani (LB) medium som inneholder kanamycin (50 μg/ml) og rifampicin (50 μg/ml) med en enkelt koloni. Inkuber ved 28 °C med risting ved 200 o/min til OD600 når ~ 1,5.
- Høst agrobakterier ved sentrifugering på 4000 x g i 10 min. Kast supernatanten.
- Resuspender pellets i 10 ml infiltrasjonsbuffer, bestående av 200 μM acetosyringone, 10 mM 2-(N-morpholino) etan sulfonsyre (MES) og 10 mM MgCl2. Inkuber ved romtemperatur (RT) i 1–2 timer.
- Infiltrere 2-3 planteblader ved hjelp av blandingen fra trinn 1.3.3 med en 1 ml kanyleløs sprøyte. Vedlikehold planter i et drivhus ved 26 ± 1 °C.
- Omtrent 1 måned senere, utføre en visuell inspeksjon og velge planter som viser gul curl blad og stunt symptomer.
- Overfør ikke-viruliferous whitefly voksne på TYLCV-infiserte tomatplanter for 48 timer for virusoppkjøp.
2. Disseksjon og samling av midguts, primære spyttkjertler (PSG), eggstokkene, og Hemolymph av kvinnelige hvitefluer
- Samle hvitefluer ved hjelp av aspirasjon, og legg dem deretter på is for å sette dem i koma. Tilsett 1x PBS (fosfatbufret saltvann) buffer på et mikroskoplysbilde, og plasser deretter hvitefluer i 1x PBS-bufferen for disseksjon under et stereomikroskop.
- For midgut disseksjon, bryte magen på whitefly og trekke ut midgut ved hjelp av en fin akupunktur nål (0,25 mm i diameter). Overfør midgut en ren, 1x PBS.
- For PSG disseksjon, bryte kroppen av whitefly i thorax nær hodet fra dorsal side. Deretter setter du en nål inn i thoraxen for å fikse whitefly, og bruk en annen nål til å riste whitefly til de to spyttkjertlene er skilt fra kroppen. Deretter overfører du PSGs til ren, 1x PBS.
- For eggstokkdisseksjonen, bryte helt magen på whitefly, og bruk en nål for å skille eggstokkene fra andre vev. Fjern deretter overflødig vev ved pipettering.
- For hemolymph samlingen, legg til 10 μL 1x PBS buffer på et mikroskop lysbilde, og plasser deretter en whitefly i bufferen. For å oppnå hemolymfen, riv forsiktig et hull i magen ved hjelp av en fin akupunkturnål, og trykk litt på magen for å frigjøre hemolymph ut i bufferen. Samle 8 μL av væsken som hemolymfprøve.
3. Lokalisering av TYLCV i Whitefly Midgut, primær spyttkjertler og eggstokkene ved immunofluorescens
MERK: Fremgangsmåten for lokalisering av TYLCV i mellomguts presenteres som et eksempel. Metoden kan brukes til PSGs og eggstokkene.
- Disseker midguts i TBS buffer (10 mM Tris-HCl, 150 mM natriumklorid, pH = 7,5) som beskrevet i trinn 2.2.1. Samle 15-20 whitefly midguts, overfør dem til et glass Petri parabolen (3,5 cm i diameter), og fjern deretter overflødig TBS buffer.
- Tilsett 1 ml 4% paraformaldehyd for å fikse midguts i 2 timer ved romtemperatur, og fjern deretter den fikserende løsningen. Pipette sakte å vaske midguts 3x i TBS i 2 min hver.
- Inkuber midguts i 1 ml 0,5% Triton X-100 i 30 min for å permeabilize. Fjern deretter permeabiliseringsløsningen og vask midguts 3x med TBST (1x TBS med 0,05% Tween 20) som beskrevet i trinn 3.2.
- Tilsett 1 ml 1% BSA (storfe serum albumin forberedt i TBST) for å blokkere midguts. Utfør blokkeringstrinnet på RT i 2 timer, og fjern deretter blokkeringsoppløsningen og vask midguts 3x i TBST.
- Fortynn de primære antistoffene (MAb 1C4 mot TYLCV-pelsprotein) ved 1:400 med TBST24 og tilsett oppløsningen i Petri-fatet for å senke midguts. Inkuber ved 4 °C over natten i mørket. Kast den primære antistoffoppløsningen og vask 3x i TBST.
- Fortynn de sekundære antistoffene (anti-mus) på 1:400 med TBST og legg til løsningen i Petri-fatet for å senke midguts. Inkuber parabolen i 2 timer på RT i mørket. Kast den sekundære antistoffoppløsningen og vask midguts 3x i TBST.
- Overfør midguts til et klart mikroskop lysbilde. Aspirer så mye TBST av lysbildet som mulig. Tilsett 1 dråpe DAPI (4', 6-diamidino-2-fenylindzol, dihydroklorid) for å beise kjernen, og plasser deretter dekkslip og forsegling med neglelakk. Under søk under et konfokalmikroskop.
4. Kvantifisering av TYLCV i Whitefly Midgut, Primær spyttkjertler, Hemolymph, og eggstokkene med qPCR
- Dissekere whitefly midguts, PSGs, hemolymph, og eggstokkene i 1x PBS som beskrevet ovenfor.
- Trekk ut DNA-et til midguts, PSGs, hemolymph og eggstokkene.
- Etter disseksjon, vask midguts, PSGs og eggstokkene i ren, 1x PBS buffer 2-3x.
- Samle 20 midguts eller 20 PSGs i 5 μL av 1x PBS og overfør dem til 25 μL lysis oppløsning. Overfør hver eggstokk i 5 μL av 1x PBS og overfør deretter til 25 μL lyseoppløsning individuelt.
- Grind midguts, PSGs, og eggstokkene prøver som beskrevet i trinn 1.2.2.
- Samle 8 μL hemolymph med 1x PBS i et PCR-rør, og tilsett deretter 10 μL lyseoppløsning. Bland grundig.
- Trekk ut DNA fra alle prøver som beskrevet i 1.2.3.
- Forbered to separate qPCR-masterblandinger (18 μL hver) for TYLCV og internkontrollen(β-actin-genet) som følger: 10 μL SYBR Grønn blanding, 0,8 μL av hver primer (10 μM hver) og 6,4 μL dobbeltdestillert vann per reaksjon. For TYLCV, fremover primer sekvensen er 5′-GAAGCGACCAGGCGATATAA-3', og omvendt primer sekvens er 5′-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3′. For β-actin, fremover primer sekvensen er 5′-TCTTCCAGCCATCCTTCTTG-3', og omvendt primer sekvens er 5′-CGGTGATTTCCTTCTGCATT-3′.
- Dispenser 18 μL av masterblandingen i hetteglass med qPCR-striperør eller en 96 brønnplate. Deretter legger du til 2 μL dna-prøver i hvert hetteglass. Utfør alle reaksjoner med minst tre tekniske replikater og tre biologiske replikaer.
MERK: Trinn 4.5 skal utføres på is. - Lukk qPCR-rørene eller forsegle de 96 brønnplatene med klebemiddelplateforsegling.
- Sentrifuge å samle væsken på bunnen av qPCR rør eller 96 brønnplate.
- Plasser rørene eller platen i sanntids termisk syklusr og utfør qPCR.
- Utfør qPCR ved hjelp av følgende sykkelparametere: 95 °C for 30 s, etterfulgt av 40 sykluser på 95 °C for 5 s og 60 °C for 34 s for primerannealing og forlengelse, 1 syklus ved 95 °C i 15 s, og slutter med et smeltekurvetrinn på 60 °C til 95 °C med en økning på 0,5 °C per 15 s.
- Velg SYBR som fluorophoredye og ukjent som prøvetype.
- Eksporter kvantitative data til et regnearkformat og analyser den relative mengden viral DNA ved 2−ΔΔCT-metoden 28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MEAM1-whiteflies av B. tabaci kompleks og TYLCV ble brukt som et eksempel her for å beskrive prosedyrene. Oversikten over immunfluorescens og viralkvantifiseringsprosedyrer som er beskrevet i dette manuskriptet, er vist i figur 1. Figur 2 viser representative resultater av immunfluorescensdeteksjon av TYLCV og DAPI-farging i PSGs, midguts og eggstokkene, noe som indikerer at TYLCV samlet seg mer i PSGs og midguts, og mindre i eggstokkene. Figur 3 viser den relative mengden virus i whitefly PSGs, midguts, hemolymph, og eggstokkene etter whiteflies matet på TYLCV-infisert tomat for 24, 48 og 72 h, noe som indikerer at mengden virus økt i forskjellige whitefly vev med økningen av oppkjøpet tilgangsperioden.
Figur 1: Oversikt over protokollene som presenteres i dette papiret. (A) Eksperimentelle prosedyrer for immunfluorescens i whitefly midguts, PSGs og eggstokkene. Vev ble samlet inn fra TYLCV-infiserte voksne kvinnelige hvitefluer, etterfulgt av en rekke fikserings-, permeabilisering, blokkering, inkubasjoner med primære antistoffer som binder seg til et TYLCV-pelsprotein og fluorokromkonjugerte sekundære antistoffer som binder seg til de primære antistoffene. Til slutt ble prøver analysert under et konfokalmikroskop, slik at oppkjøpet av bilder. (B) Eksperimentell prosedyre for kvantifisering av virus i whitefly midguts, PSGs, eggstokkene, og hemolymph. Vev ble samlet inn fra TYLCV-infiserte voksne kvinnelige hvitefluer, og deretter ble DNA-ekstraksjon utført. qPCR ble utført på et PCR-instrument i sanntid, slik at innsamling av data som senere kan analyseres. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Immunfluorescenspåvisning av TYLCV i de primære spyttkjertlene, midguts og eggstokkene av kvinnelige voksne hvitefluer etter en 48 h virusoppkjøpstilgangsperiode. Whiteflies fikk lov til å mate på TYLCV-infiserte tomatplanter i 48 timer, og deretter 20 PSGs, 20 midguts og 20 eggstokkene ble dissekert og samlet. Deretter ble prøvene løst i 4% formaldehyd, permeabilized i 0,5% Triton X-100, blokkert i 1% BSA, og deretter inkubert med mus anti-TYLCV monoklonale antistoffer (MAb 1C4 mot TYLCV pelsprotein)24 og geit anti-mus sekundære antistoffer konjugert til en rød fluorescerende farge (dvs. Dylight 594). Nuclei ble farget med DAPI (blå). Immunfluorescenssignaler ble undersøkt under et konfokalmikroskop. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Kvantifisering av TYLCV DNA i midguts, hemolymph, primære spyttkjertler, og eggstokkene i MEAM1 whiteflies. Voksen matet på TYLCV-infiserte tomatplanter i 24, 48 og 72 timer, og deretter ble whitefly midguts, hemolymph, PSGs og eggstokkene dissekert og samlet. Deretter ble det utført ekstraksjon av DNA og qPCR for midguts (A), hemolymph (B), PSGs (C) og eggstokkene (D). Data ble først normalisert til whitefly β-actin DNA, og deretter ble den relative mengden virus oppnådd igjen normalisert til det ved 24 h. NV: Non-viruliferous. Data presenteres som gjennomsnittlig ± SEM av relativ mengde virus. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en protokoll for lokalisering og kvantifisering av et begomovirus i vevet på whitefly-vektoren ved immunofluorescens og qPCR. Disseksjon representerer det første trinnet for å lokalisere og kvantifisere viruset i whitefly vev. Whitefly kroppen er ca 1 mm i lengde, noe som betyr at vevet er ekstremt små, og det er vanskelig å dissekere dem. Dessuten er det sterke forbindelser mellom vevet. For eksempel er eggstokkene tett forbundet med bakteriocytter, noe som gjør dem vanskelige å isolere. Her, med tanke på egenskapene og plasseringene til de forskjellige vevene, beskriver vi ulike tilnærminger for disseksjon. Imidlertid er mye praksis nødvendig for å raskt og nøyaktig dissekere disse vevene. I tillegg er det best å bruke friske hvitefluer, fordi døde insekter vil øke vanskeligheten med disseksjon. Videre må postdisseksjon rengjøres for å unngå forurensning.
Immunfluorescensteknikken er basert på bruk av spesifikke antistoffer. En egnet arbeidskonsentrasjon for hvert antistoff er svært viktig i bildebehandling, fordi en høy konsentrasjon av antistoffer reduserer signal-til-bakgrunn-forholdet og en lav konsentrasjon kan ikke gi tilstrekkelig signal. Her brukte vi en fortynning på 1:400 for både primære antistoffer og andre antistoffer. Disse antistoffene bør deles inn i små aliquots og holdes ved -20 °C for å unngå gjentatt frysing og tining. Antistofffortynningene skal tilberedes rett før bruk. Når protokollen som er beskrevet her brukes til å samlokalisere virale og whitefly proteiner, er det viktig at de primære antistoffene mot virale og whitefly proteiner produseres hos dyr av forskjellige arter. I tillegg bør fluoropforene til de sekundære antistoffene velges nøye for å forhindre utfallende mellom kanaler. Videre, i lys av den lille størrelsen på whitefly vev, bør de alltid vaskes under mikroskopet for å unngå tap. Selv om immunfluorescens er svært følsom, er det relativt mer tidkrevende og kostbart sammenlignet med andre virusplasseringsmetoder som Fluorescence in situ Hybridizations (FISH). I tillegg kan antistoffer mot begomovirus ikke være tilgjengelig for kjøp.
Nøkkelen til vellykket anvendelse av qPCR for kvantifisering av viruset i whitefly vev ligger i utformingen av egnede primere og valg av endogene referansegener. Rodríguez et al. beskrev kriteriene for å designe qPCR-primere i detalj25, som også gjelder i utformingen av virusprimere. I denne studien ble β-actin valgt som referansegen for viruskvantifisering i whitefly vev. Men i noen tilfeller (f.eks. RNA-gener), bør andre endogene gener brukes som referansegener hvis de er egnet for eksperimentell design29. Også for å oppnå stabile og nøyaktige resultater, bør whiteflies av samme utviklingsstadium brukes, fordi whiteflies av forskjellige utviklingsstadier har differensialiske evner til å skaffe og overføre virus22. Videre, mens vi brukte 20 PSGs eller midguts som en prøve, brukte vi en hemolymph samlet fra en whitefly som en prøve for qPCR analyse. Dette skyldes det faktum at samlingen av hemolymfen er tidkrevende og DNA-et til hemolymfprøvene er sårbare for nedbrytning hvis de ikke behandles i tide. Denne protokollen kan også brukes til å kvantifisere mengden virus i whitefly hele kroppen og virusinfiserte planter.
Oppsummert beskriver vi en effektiv og sensitiv protokoll for å lokalisere og kvantifisere begomovirus i henholdsvis whiteflyvev ved immunfluorescens og qPCR. Denne protokollen kan også tilpasses for lokalisering og kvantifisering av andre begomovirus. Videre kan protokollen for immunofluorescens brukes til å samlokalisere virale og whitefly proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Key Research and Development Program (Grant number: 2017YFD0200600), det øremerkede fondet for China Agriculture Research System (stipendnummer: CARS-23-D07) og Bill & Melinda Gates Foundation (Investment ID OPP1149777 ). Vi takker prof. Jian-Xiang Wu for å gi TYLCV CP antistoffer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Paraformaldehyde | MultiSciences | F0001 | |
| 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) | Abcam | ab104139 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MultiSciences | A3828 | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio-RAD | 185-5201 | |
| Confocal microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Dylight 549-goat anti-mouse | Earthox | E032310-02 | Secondary antibody |
| Monoclonal antibody (MAb 1C4) | Primary antibody | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548119-0500 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| TB green premix Ex Taq (Tli RNase H Plus) | TaKaRa | RR820A | qPCR master mix |
| Thermocycler | Thermofisher | A41182 | |
| Tissuelyzer | Shaghai jingxin | Tissuelyser-48 | |
| Triton-X-100 | BBI life sciences | 9002-93-1 | |
| Tween 20 | BBI life sciences | 9005-64-5 |
References
- Rojas, M. R., et al. World management of geminiviruses. Annual Review of Phytopathology. 56, 637-677 (2018).
- De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).
- Navas-Castillo, J., Fiallo-Olive, E., Sanchez-Campos, S. Emerging virus diseases transmitted by whiteflies. Annual Review of Phytopathology. 49, 219-248 (2011).
- Liu, J., et al. Viral infection of tobacco plants improves performance of Bemisia tabaci but more so for an invasive than for an indigenous biotype of the whitefly. Journal of Zhejiang University-Science B. 11 (1), 30-40 (2010).
- Legarrea, S., Barman, A., Marchant, W., Diffie, S., Srinivasan, R. Temporal effects of a begomovirus infection and host plant resistance on the preference and development of an insect vector, Bemisia tabaci, and implications for epidemics. PLoS One. 10 (11), 0142114 (2015).
- Fang, Y., et al. Tomato yellow leaf curl virus alters the host preferences of its vector Bemisia tabaci. Scientific Reports. 3, 2876 (2013).
- Guo, T., et al. Comparison of transmission of papaya leaf curl China virus among four cryptic species of the whitefly Bemisia tabaci complex. Scientific Reports. 5, 15432 (2015).
- Pan, L. L., et al. Differential efficiency of a begomovirus to cross the midgut of different species of whiteflies results in variation of virus transmission by the vectors. Science China-Life Sciences. 61 (10), 1254-1265 (2018).
- Pan, L. L., Cui, X. Y., Chen, Q. F., Wang, X. W., Liu, S. S. Cotton leaf curl disease: which whitefly is the vector. Phytopathology. 108 (10), 1172-1183 (2018).
- Fiallo-Olive, E., Pan, L. L., Liu, S. S., Navas-Castillo, J. Transmission of begomoviruses and other whitefly-borne viruses: dependence on the vector species. Phytopathology. , (2019).
- Cohen, S., Nitzany, F. E. Transmission and host range of the tomato yellow leaf curl virus. Phytopathology. 56, 1127-1131 (1966).
- Moriones, E., Navas-Castillo, J. Tomato yellow leaf curl virus, an emerging virus complex causing epidemics worldwide. Virus Research. 71 (1-2), 123-134 (2000).
- Ghanim, M. A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector. Virus Research. 186, 47-54 (2014).
- Navot, N., Pichersky, E., Zeidan, M., Zamir, D., Czosnek, H. Tomato yellow leaf curl virus - a whitefly-transmitted geminivirus with a single genomic component. Virology. 185 (1), 151-161 (1991).
- Sanchez-Campos, S., et al. Tomato yellow leaf curl virus: No evidence for replication in the insect vector Bemisia tabaci. Scientific Reports. 6, 30942 (2016).
- Pakkianathan, B. C., et al. Replication of tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector, Bemisia tabaci. Journal of Virology. 89 (19), 9791-9803 (2015).
- Rodriguez-Negrete, E. A., et al. A sensitive method for the quantification of virion-sense and complementary-sense DNA strands of circular single-stranded DNA viruses. Scientific Reports. 4, 6438 (2014).
- Gotz, M., et al. Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions. Journal of Virology. 86 (24), 13241-13252 (2012).
- Zhao, J., Chi, Y., Zhang, X. J., Wang, X. W., Liu, S. S. Implication of whitefly vesicle associated membrane protein-associated protein B in the transmission of Tomato yellow leaf curl virus. Virology. 535, 210-217 (2019).
- Maluta, N. K., Garzo, E., Moreno, A., Lopes, J. R., Fereres, A. Tomato yellow leaf curl virus benefits population growth of the Q biotype of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae). Neotropical Entomology. 43 (4), 385-392 (2014).
- Czosnek, H., Hariton-Shalev, A., Sobol, I., Gorovits, R., Ghanim, M. The incredible journey of begomoviruses in their whitefly vector. Viruses. 9 (10), 273 (2017).
- Wei, J., et al. Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).
- Ghanim, M., Morin, S., Zeidan, M., Czosnek, H. Evidence for transovarial transmission of tomato yellow leaf curl virus by its vector, the whitefly Bemisia tabaci. Virology. 240 (2), 295-303 (1998).
- Xie, Y., et al. Highly sensitive serological methods for detecting tomato yellow leaf curl virus in tomato plants and whiteflies. Virology Journal. 10, 142 (2013).
- Arya, M., et al. Basic principles of real-time quantitative PCR. Expert Review of Molecular Diagnostics. 5 (2), 209-219 (2005).
- Wei, J., et al. Specific cells in the primary salivary glands of the whitefly Bemisia tabaci control retention and transmission of begomoviruses. Journal of Virology. 88 (22), 13460-13468 (2014).
- Wang, L. L., et al. The autophagy pathway participates in resistance to tomato yellow leaf curl virus infection in whiteflies. Autophagy. 12 (9), 1560-1574 (2016).
- Arocho, A., Chen, B. Y., Ladanyi, M., Pan, Q. L. Validation of the 2(-Delta Delta Ct) calculation as an alternate method of data analysis for quantitative PCR of BCR-ABL P210 transcripts. Diagnostic Molecular Pathology. 15 (1), 56-61 (2006).
- Li, R., et al. Reference gene selection for qRT-PCR analysis in the sweetpotato whitefly, Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae). PLoS One. 8 (1), 53006 (2013).
