Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

توطين والقياس الكمي لفيروسات البيجومو في أنسجة الذبابة البيضاء عن طريق الفلورة المناعية وPCR الكمي

Published: February 8, 2020 doi: 10.3791/60731
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Ministry of Agriculture Key Laboratory of Molecular Biology of Crop Pathogen and Insects, Institute of Insect Sciences, Zhejiang University

Summary

نحن نصف الفلور المناعي وطريقة PCR الكمية لتوطين والقياس الكمي لفيروسات البجومو في أنسجة الحشرات. يمكن استخدام بروتوكول الفلورسينس المناعي لتوطين البروتينات الفيروسية والنواقل. ويمكن توسيع نطاق بروتوكول PCR الكمي لتحديد الفيروسات في أجسام الذبابة البيضاء الكاملة والنباتات المصابة بالفيروس.

Abstract

تنتقل فيروسات البيجومو (جنس Begomovirus، Geminiviridaeالأسرة) عن طريق الذباب الأبيض من مجمع بيميسيا tabaci بطريقة مستمرة وتعميمية. وبالنظر إلى الضرر الواسع النطاق الذي تسببه فيروسات البجومو لإنتاج المحاصيل في جميع أنحاء العالم، لا بد من فهم التفاعل بين فيروسات البجومو وناقل الذبابة البيضاء. وللقيام بذلك، فإن توطين الفيروس والقياس الكمي له في أنسجة النواقل أمر بالغ الأهمية. هنا، باستخدام الطماطم الصفراء ورقة حليقة فيروس (TYLCV) كمثال، ونحن نصف بروتوكول مفصل لتوطين فيروسات البجومو في وسط الذبابة البيضاء، والغدد اللعابية الأولية، والمبايض عن طريق الفلور المناعي. وتستند هذه الطريقة على استخدام أجسام مضادة محددة ضد بروتين معطف الفيروس، والأجسام المضادة الثانوية المسماة بالصبغة، والمجهر البؤري. ويمكن أيضا أن تستخدم البروتوكول لcolocalize بروتينات البيجوموفيروسات والذبابة البيضاء. كما وصفنا بروتوكولًا للقياس الكمي لـ TYLCV في وسط الذبابة البيضاء والغدد اللعابية الأولية والهيموليمف والمبيضين بواسطة PCR الكمي (qPCR). باستخدام المبادئ التمهيدية المصممة خصيصًا لـ TYLCV ، تسمح بروتوكولات القياس الكمي بمقارنة كمية TYLCV في أنسجة الذبابة البيضاء المختلفة. ومن المحتمل أن يكون البروتوكول الموصوف مفيداً للقياس الكمي لفيروسات البجومو في جسم الذبابة البيضاء والنبات المصاب بالفيروس. ويمكن استخدام هذه البروتوكولات لتحليل مسار الدورة الدموية لفيروسات البجومو في الذبابة البيضاء أو كمكمل لطرق أخرى لدراسة التفاعلات بين الذبابة البيضاء والفيروسات.

Introduction

في العقود الأخيرة ، تسببت فيروسات البجومو (جنس Begomovirus، Geminiviridaeالأسرة) في أضرار جسيمة لإنتاج العديد من محاصيل الخضروات والألياف والزينة في جميع أنحاء العالم1. تنتقل فيروسات البجومو بطريقة مستمرة عن طريق ذبابة البياض البيضاء (Hemiptera: Aleyrodidae) ، وهي نوع معقد يحتوي على أكثر من 35 نوعًا خفيًا2،3. قد تؤثر فيروسات Begomo بشكل مباشر أو غير مباشر على فسيولوجيا الذبابة البيضاء وسلوكها ، مثل البراز4، وطول العمر4، وتفضيل المضيف5،6. وعلاوة على ذلك، فإن كفاءة انتقال أنواع/سلالة فيروس بيغومو تختلف عن الأنواع المختلفة خفي الذبابة البيضاء حتى في ظل نفس الظروف التجريبية7،8،9،10، مما يدل على أن هناك تفاعل معقد بين فيروسات البجومو والذباب الأبيض. من أجل فهم أفضل للآليات الكامنة وراء تفاعلات الذبابة البيضاء والفايروس، فإن توطين الفيروس والقياس الكمي له في أنسجة الذبابة البيضاء أمر ضروري.

الطماطم الصفراء ورقة حليقة فيروس (TYLCV) هو فيروس begomo التي تم الإبلاغ عنها لأول مرة في إسرائيل ولكن في الوقت الحاضر يسبب أضرارا جسيمة لإنتاج الطماطم في جميع أنحاء العالم11،12. نظرا لأهميتها الاقتصادية، وهي واحدة من أفضل درس begomoviruses13. مثل غيرها من فيروسات البجومو أحادية الجانب ، TYLCV هو فيروس الحمض النووي الدائري أحادي ة حبلا بحجم جينوم يبلغ حوالي 2800 نيوكليوتيدات14. في حين لا تزال قيد المناقشة، عدة خطوط من الأدلة تدعم تكرار TYLCV في الذباب الأبيض15،16،17. وعلاوة على ذلك، تم الإبلاغ عن تفاعل جزيئات TYLCV وبروتينات الذبابة البيضاء6،18،19،20. لانتقال الفيروس، الذباب الأبيض الحصول على TYLCV عن طريق التغذية على النباتات المصابة بالفيروس، وتمر الفيريونات على طول قناة الغذاء للوصول إلى المريء، واختراق جدار منتصف الأمعاء للوصول إلى الهيموليمف، ومن ثم نقل هاوية إلى الغدد اللعابية الأولية (PSGs). وأخيرا، يتم على غرار virions مع اللعاب على طول القناة اللعابية في phloem النبات21. وعلاوة على ذلك، تظهر العديد من الدراسات أن TYLCV قادرة على أن تنتقل عبر ية من الذباب الأبيض الإناث إلى ذريتها22،23. وبعبارة أخرى، من أجل تحقيق انتقال منتج، يتعين على الفيروس التغلب على الحواجز الخلوية داخل الذبابة البيضاء للانتقال من نسيج إلى آخر. أثناء عبور هذه الحواجز، من المرجح أن تحدث تفاعلات بين بروتينات الذبابة البيضاء والفيروسات، وربما تحديد الكفاءة التي تنتقل بها الفيروسات.

الفلور المناعي هو تقنية شائعة الاستخدام لتحليل توزيع البروتين. خصوصية الأجسام المضادة الملزمة للمستضد تشكل أساس الفلور المناعي. نظرًا للأهمية الاقتصادية لـ TYLCV ، تم تطوير الأجسام المضادة أحادية النسيلة ضد بروتين معطف TYLCV ، مما يوفر طريقة حساسة للغاية لتوطين الفيروس24. يسمح PCR الكمي (qPCR) بالقياس الكمي الحساس والمحدد للأحماض النووية. وتستند هذه التقنية في أغلب الأحيان إلى استخدام مسبار التحلل المائي (على سبيل المثال، TaqMan) أو صبغة الفلورسنت (على سبيل المثال، SYBR Green) للكشف. وبالنسبة لـ qPCR القائم على مسبار التحلل المائي، هناك حاجة إلى مسابر محددة، مما يزيد بالتالي من التكلفة. الفلورسنت المستندة إلى صبغ qPCR هو أبسط وأكثر فعالية من حيث التكلفة، وذلك لأن المسمى تحقيقات التهجين amplicon محددة ليست مطلوبة25. حتى الآن، استخدمت العديد من الدراسات الفلورة المناعية وqPCR جنبا إلى جنب مع طرق أخرى للتحقيق في التفاعلات المعقدة بين فيروس بيجومو والذبابة البيضاء. على سبيل المثال، أجرى بان وآخرون تحليل qPCR ومثبط اتّصال المناعة للفيروس في أنسجة الذبابة البيضاء، ووجدوا أن الفرق في القدرة على نقل فيروس التبغ المجعد (TbCSV) بين أنواع الذبابة البيضاء AsiaII 1 والشرق الأوسط آسيا الصغرى 1 (MEAM1) كان بسبب قدرة الفيروس على عبور جدار منتصف الأمعاء في آسيا1 ولكن ليس MEAM18. وبالمثل، في حين أن الذباب الأبيض المتوسط (MED) يمكن أن ينقل بسهولة TYLCV، فإنها تفشل في نقل الطماطم الصفراء ورقة حليقة الصين فيروس (TYLCCNV). تم التحقيق في انتقال انتقائي باستخدام الكشف عن الفلورالمناعي للفيروس في PSGs ، والتي أظهرت أن TYLCCNV لا تعبر بسهولة PSGs من الذباب الأبيض MED26. الفلورة المناعية colocalizationمن TYLCV CP وعلامة autophagy البروتين ATG8-II في الذبابة البيضاء midguts يظهر أن autophagy يلعب دورا حاسما في قمع عدوى TYLCV في الذبابة البيضاء27.

هنا ، باستخدام TYLCV كمثال ، نصف بروتوكولًا لتوطين فيروسات البجومو في الأحشاء البيضاء ، PSGs ، والمبايض بواسطة تقنية الفلورسة المناعية. وتشمل هذه التقنية تشريح، والتثبيت، والحضانة مع الأجسام المضادة الثانوية الأولية والصبغية. يمكن بعد ذلك الكشف عن إشارات الفلورسينس التي تظهر موقع البروتينات الفيروسية في أنسجة الذبابة البيضاء تحت المجهر البؤري. والأهم من ذلك، يمكن استخدام هذا البروتوكول لتوطين بروتينات البيجوموفيروسات والذبابة البيضاء. كما وصفنا بروتوكولًا للقياس الكمي لـ TYLCV باستخدام QPCR المستند إلى SYBR الأخضر في وسط الذبابة البيضاء ، PSGs ، الهيموليمف ، والمبيضين ، التي يمكن استخدامها لمقارنة كمية الفيروس في عينات أنسجة الذبابة البيضاء المختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الذبابة البيضاء ، والفيروسات ، والنباتات ، واكتساب الفيروس

  1. الذباب الأبيض الخلفي (MEAM1) على القطن(Gossypium hirsutum cv. Zhemian 1793) في أقفاص مقاومة للحشرات في دفيئة عند 26 ± 1 درجة مئوية مع 14:10 ضوء: دورة داكنة و60 ± 10٪ رطوبة نسبية.
  2. إجراء PCR التقليدية على أساس الخلايا الميتوكوندريا البيضاء أوكسيديز الأول الجين لتحديد نقاء السكان الذبابة البيضاء.
    1. جمع 20 الذباب الأبيض الكبار ونقلها بشكل فردي إلى أنبوب PCR تحتوي على 30 ميكرولتر من العازلة الليسيه (10 mM تريس, درجة الحموضة = 8.4, 50 mM KCl, 0.45% [wt/vol] Tween-20, 0.2% [wt/vol] الجيلاتين, 0.45% [vol/vol] Nonidet P 40, 60 g/m L Proteinase).
    2. أضف 5-7 حبات خزفية (قطرها 2 مم) إلى كل أنبوب PCR واطحن العينات لإجراء تحليل الأنسجة.
    3. احتضان جميع العينات عند 65 درجة مئوية لساعة واحدة تليها 10 دقيقة عند 100 درجة مئوية، ثم الطرد المركزي لفترة وجيزة. استخدم هذا السوبرناستانك كقالب لتضخيم PCR.
      ملاحظة: يمكن زيادة وقت الحضانة عند 65 درجة مئوية إذا لزم الأمر.
    4. إعداد تفاعل PCR على النحو التالي: 1 U من تق الحمض النووي البوليميراز، 2 ميكرولتر من 10x العازلة (مع ملغ2 +)،1.6 ميكرولتر من خليط dNTP (2.5 mM)، 0.5 μL من كل التمهيدي (10 ميكرومتر لكل منهما)، 2 μL من الأنسجة الذبابة البيضاء تحلل supernatant، والمياه المقطرة مزدوجة إلى حجم إجمالي قدره 20 ميكرولتر لكل رد فعل. تسلسل التمهيدي إلى الأمام هو 5'-TTGATTTTTGgTCATAGAAGT-3' وتسلسل التمهيدي العكسي هو 5'TAATGGCAGATTAGTAGGTATGGA-3'.
      ملاحظة: يجب تضمين عنصر تحكم سلبي حيث يتم استبدال الحمض النووي بالماء الخالي من nuclease وعنصر تحكم إيجابي مع الحمض النووي الذبابة البيضاء MEAM1 التي تم التحقق منها مسبقًا.
    5. قم بإجراء PCR باستخدام معلمات ركوب الدراجات التالية: التهيئة الأولية عند 95 درجة مئوية لمدة 3 سنوات، تليها 35 دورة من التهيئة عند 95 درجة مئوية لمدة 30 ث، والصلب عند 50-55 درجة مئوية لمدة 30 ث، والتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، تليها 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
    6. هضم المنتج المضخم مع تقييد انزيم طق I. للقيام بذلك، قم بإعداد خليط الهضم مع 0.1 ميكرولتر (1 U) من الإنزيم، 1 ميكرولتر من 10x Taq I Buffer، 1 μL من BSA، 5 ميكرولتر من المنتج المضخم، والمياه المقطرة المزدوجة إلى حجم إجمالي قدره 10 ميكرولتر. احتضان في 65 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في cycler الحرارية.
    7. قم بإجراء الكهربية هلام أغاروز من العينات عن طريق تحميل 5-7 ميكرولتر من كل منتج مهضوم وسلم الحمض النووي (100-2000 نقطة بالثانية) في آبار هلام أغروس 1٪. ثم، لاحظ أحجام الفرقة الحمض النووي عن طريق تلطيخ هلام أحمر في آلة وثائق هلام باستخدام الأشعة فوق البنفسجية. قارن أحجام الفرقة من المنتجات المهضومة إلى السيطرة الإيجابية لتحديد نقاء السكان الذبابة البيضاء.
  3. الزراعية inoculate استنساخ المعدية من TYLCV (جينبنك الانضمام رقم AM282874.1) (pBINPLUS-SH2-1.4A) في 3-4 صحيح ورقة مرحلة نباتات الطماطم(Solanum lycopersicum L. cv. Hezuo 903).
    1. Inoculate 10 مل من لوريا بيرتاني (LB) المتوسطة التي تحتوي على kanamycin (50 ميكروغرام / مل) وريفامبيسين (50 ميكروغرام / مل) مع مستعمرة واحدة. احتضان في 28 درجة مئوية مع اهتزاز في 200 دورة في الدقيقة حتى OD600 تصل إلى ~ 1.5.
    2. حصاد البكتيريا الزراعية عن طريق الطرد المركزي في 4000 × ز لمدة 10 دقيقة. تجاهل supernatant.
    3. إعادة تعليق الكريات في 10 مل من العازلة التسلل، وتتكون من 200 ميكرومتر أسيتوسيلينرينجون، 10 ممتر 2-(N-morpholino) حمض السلفوين الإيثان (MES)، و 10 mM MgCl2. احتضان في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 1-2 ساعة.
    4. التسلل 2-3 أوراق النبات باستخدام الخليط من الخطوة 1.3.3 مع حقنة 1 مل بدون إبرة. الحفاظ على النباتات في الدفيئة في 26 ± 1 درجة مئوية.
  4. حوالي 1 شهر في وقت لاحق، وإجراء الفحص البصري واختيار النباتات تظهر ورقة حليقة الصفراء وأعراض حيلة.
  5. نقل البالغين الذبابة البيضاء غير viruliferous على نباتات الطماطم المصابة TYLCV ل48 ساعة للحصول على الفيروس.

2. تشريح وجمع من الأحشاء الوسطى، الغدد اللعابية الأولية (PSG)، المبيضين، والهيموليمف من الذباب الأبيض الإناث

  1. جمع الذباب الأبيض باستخدام الطموح، ومن ثم وضعها على الجليد لوضعها في غيبوبة. إضافة 1x PBS (الفوسفات العازلة المالحة) عازلة على شريحة المجهر، ومن ثم وضع الذباب الأبيض في المخزن المؤقت 1x PBS للتشريح تحت المجهر ستيريو.
    1. لتشريح منتصف الأمعاء، كسر البطن من الذبابة البيضاء وسحب منتصف gut باستخدام إبرة الوخز بالإبر غرامة (0.25 ملم في القطر). نقل منتصف غوت لتنظيف، 1x PBS.
    2. لتشريح PSG، كسر الجسم من الذبابة البيضاء في الصدر بالقرب من الرأس من الجانب الظهري. بعد ذلك، أدخل إبرة في الصدر لإصلاح الذبابة البيضاء، واستخدم إبرة أخرى لهز الذبابة البيضاء حتى يتم فصل الغدد اللعابية اثنين من الجسم. ثم، نقل PSGs لتنظيف، 1x PBS.
    3. لتشريح المبيض، كسر تماما بطن الذبابة البيضاء، واستخدام إبرة لفصل المبيضين من الأنسجة الأخرى. ثم، وإزالة الأنسجة الزائدة عن طريق الأنابيب.
    4. لجمع الهيموليمفية، إضافة 10 ميكرولتر من 1x PBS العازلة على شريحة المجهر، ومن ثم وضع الذبابة البيضاء في المخزن المؤقت. للحصول على الهيموليمف، ومزق بلطف ثقب في البطن باستخدام إبرة الوخز بالإبر غرامة، واضغط قليلا على البطن للافراج عن الهيموليمفية في العازلة. جمع 8 ميكرولتر من السائل كعينة الهيموليمف.

3. توطين TYLCV في وايتفلاي ميدغوت، الغدد اللعابية الأولية، والمبايض عن طريق الفلور المناعي

ملاحظة: يتم تقديم الإجراء لتوطين TYLCV في وسط الأحشاء كمثال. ويمكن استخدام هذه الطريقة لPSGs والمبايض.

  1. تشريح الأحشاء الوسطى في العازلة TBS (10 MM Tris-HCl، 150 mM كلوريد الصوديوم، درجة الحموضة = 7.5) كما هو موضح في الخطوة 2.2.1. اجمع 15-20 من وسط الذبابة البيضاء، ونقلها إلى طبق بيتري زجاجي (قطره 3.5 سم)، ثم قم بإزالة العازلة TBS الزائدة.
  2. أضف 1 مل من 4% بارافورمالديهايد لإصلاح الأحشاء لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة، ثم قم بإزالة المحلول المثبت. ماسيت ببطء لغسل midguts 3x في TBS لمدة 2 دقيقة لكل منهما.
  3. احتضان وسط الأحشاء في 1 مل من 0.5٪ تريتون X-100 لمدة 30 دقيقة لpermeabilize. ثم إزالة محلول permeabilization وغسل midguts 3x مع TBST (1x TBS مع 0.05٪ Tween 20) كما هو موضح في الخطوة 3.2.
  4. إضافة 1 مل من 1٪ BSA (بوملين مصل البقر أعدت في TBST) لمنع وسط الأحشاء. قم بتنفيذ خطوة الحجب في RT لمدة 2 ساعة ، ثم قم بإزالة محلول الحجب واغسل الأحشاء الوسطى 3x في TBST.
  5. تمييع الأجسام المضادة الأولية (MAb 1C4 ضد بروتين معطف TYLCV) في الساعة 1:400 مع TBST24 وإضافة المحلول إلى طبق بيتري لغمر الأحشاء الوسطى. احتضان في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها في الظلام. تجاهل محلول الأجسام المضادة الأساسي وغسل 3x في TBST.
  6. تمييع الأجسام المضادة الثانوية (المضادة للفأرة) في الساعة 1:400 مع TBST وإضافة المحلول إلى طبق بيتري لغمر الأحشاء الوسطى. احتضان الطبق لمدة 2 ساعة في RT في الظلام. تجاهل محلول الأجسام المضادة الثانوية وغسل midguts 3x في TBST.
  7. نقل وسط الأحشاء إلى شريحة مجهر واضحة. اسشق أكبر قدر TBST قبالة الشريحة قدر الإمكان. إضافة 1 قطرة من DAPI (4'، 6-diamidino-2-phenylindole، ديهيدروكلوريد) لوصمة عار النواة، ومن ثم وضع غطاء وختم مع طلاء الأظافر. فحص تحت المجهر البؤري.

4. القياس الكمي للTYLCV في وايتفلاي ميدغوت، الغدد اللعابية الأولية، هيموليمف، والمبايض مع qPCR

  1. تشريح منتصف الذبابة البيضاء، PSGs، الهيموليمف، والمبايض في 1x PBS كما هو موضح أعلاه.
  2. استخراج الحمض النووي من منتصف الأحشاء، PSGs، الهيموليمف، والمبيضين.
    1. بعد تشريح، وغسل وسط الأحشاء، PSGs، والمبايض في نظيفة، 1x PBS العازلة 2-3x.
    2. جمع 20 midguts أو 20 PSGs في 5 ميكرولتر من 1x PBS ونقلها إلى محلول الانحلال 25 μL. نقل كل مبيض في 5 ميكرولتر من 1x PBS ومن ثم نقل إلى محلول الانحلال 25 ميكرولتر بشكل فردي.
    3. طحن الأحشاء الوسطى، PSGs، وعينات المبيضين كما هو موضح في الخطوة 1.2.2.
    4. جمع 8 ميكرولتر من الهيموليمفية مع 1x PBS في أنبوب PCR، ثم إضافة 10 ميكرولتر من محلول الانحلال. تخلط جيدا.
  3. استخراج الحمض النووي من جميع العينات كما هو موضح في 1.2.3.
  4. إعداد اثنين من الخلطات الرئيسية qPCR منفصلة (18 ميكرولتر لكل منهما) لTYLCV والرقابة الداخلية(α-actin الجينات) على النحو التالي: 10 ميكرولتر من مزيج SYBR الأخضر، 0.8 μL من كل التمهيدي (10 ميكرومتر لكل منهما)، و 6.4 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج لكل رد فعل. لTYLCV، تسلسل التمهيدي إلى الأمام هو 5′-GAAGCGCCAGGATATAA-3' وتسلسل التمهيدي العكسي هو 5′-GGAACATGGGGCTTCجاتا-3′. لα-actin,تسلسل التمهيدي إلى الأمام هو 5′-TCTTCCAGCCATCCTCTTG-3′ وتسلسل التمهيدي العكسي هو 5′-CGGTGattTCCTCTCTATT-3′.
  5. الاستغناء 18 ميكرولتر من المزيج الرئيسي في قوارير من أنابيب قطاع qPCR أو لوحة بئر 96. ثم أضف 2 ميكرولتر من عينات الحمض النووي في كل قارورة. تنفيذ جميع ردود الفعل مع ما لا يقل عن ثلاثة يكرر التقنية وثلاثة يكرر البيولوجية.
    ملاحظة: الخطوة 4.5 يجب أن يتم تنفيذها على الجليد.
  6. إغلاق أنابيب qPCR أو ختم لوحات بئر 96 مع ختم لوحة لاصقة.
  7. جهاز طرد مركزي لجمع السائل في الجزء السفلي من أنابيب qPCR أو لوحة بئر 96.
  8. ضع الأنابيب أو اللوحة في الدراجة الحرارية في الوقت الحقيقي وانفذ qPCR.
    1. قم بإجراء qPCR باستخدام معلمات ركوب الدراجات التالية: 95 درجة مئوية لمدة 30 ث، تليها 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 5 ث و 60 درجة مئوية لمدة 34 ث للصلب وإطالة، 1 دورة عند 95 درجة مئوية لمدة 15 ث، وتنتهي بخطوة منحنى ذوبان من 60 درجة مئوية إلى 95 درجة مئوية مع زيادة قدرها 0.5 درجة مئوية لكل 15 s.
    2. اختيار SYBR كصبغة الفلوروفور وغير معروف كنوع العينة.
  9. تصدير البيانات الكمية إلى شكل جدول البيانات وتحليل الكمية النسبية من الحمض النووي الفيروسي من خلال طريقة 2−ΟΟCT 28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم استخدام الذباب الأبيض MEAM1 لمجمع B. tabaci وTYLCV كمثال هنا لوصف الإجراءات. تظهر النظرة العامة لإجراءات الفلور المناعي والقياس الكمي الفيروسي الموصوفة في هذه المخطوطة في الشكل 1. يوضح الشكل 2 النتائج التمثيلية للكشف عن الفلور المناعي لتلطيخ TYLCV وDAPI في PSGs وmidguts والمبيضين ، مما يشير إلى أن TYLCV تراكمت أكثر في PSGs وmidguts ، وأقل في المبيضين. ويبين الشكل 3 الكمية النسبية للفيروس في الـ PSGs الذبابة البيضاء، ومنتصف الأحشاء، والهيموليمفية، والمبيضين بعد أن يتغذى الذباب الأبيض على الطماطم المصابة بـ TYLCV لمدة 24 و48 و72 ساعة، مما يشير إلى أن كمية الفيروس زادت في أنسجة الذبابة البيضاء المختلفة مع زيادة فترة الحصول على الطماطم.

Figure 1
الشكل 1: نظرة عامة على البروتوكولات المعروضة في هذه الورقة. (أ)الإجراءات التجريبية للفلورية المناعية في الأحشاء البيضاء، PSGs، والمبايض. تم جمع الأنسجة من الذباب الأبيض الأنثوي البالغ المصاب بـ TYLCV ، تليها سلسلة من التثبيت ، والازدواجية ، والحجب ، والاحتضان مع الأجسام المضادة الأولية التي ترتبط ببروتين معطف TYLCV ، والأجسام المضادة الثانوية المترافقة مع الفلوروكروم التي ترتبط بالأجسام المضادة الأولية. وأخيراً، تم تحليل العينات تحت المجهر البؤري، مما سمح بالحصول على الصور. (ب)إجراء تجريبي للقياس الكمي للفيروس في وسط الذبابة البيضاء ، PSGs ، المبيضين ، والليمفاوية. تم جمع الأنسجة من الذباب الأبيض الأنثوي البالغ المصاب بـ TYLCV ، ثم تم إجراء استخراج الحمض النووي. تم تنفيذ qPCR على أداة PCR في الوقت الحقيقي ، مما يسمح بالحصول على البيانات التي يمكن تحليلها لاحقًا. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: الكشف عن الفلور المناعي من TYLCV في الغدد اللعابية الأولية، وسط الأحشاء، والمبيضين من الذباب الأبيض الإناث البالغين بعد فترة الوصول إلى الفيروس 48 ساعة. وسُمح للذباب الأبيض بالتغذية على نباتات الطماطم المصابة بـ TYLCV لمدة 48 ساعة، ثم تم تشريح وجمع 20 PSGs و20 من منتصف الأحشاء و20 مبايض. بعد ذلك ، تم تثبيت العينات في 4 ٪ الفورمالديهايد ، permeabilized في 0.5 ٪ تريتون X - 100 ، منعت في 1 ٪ BSA ، ثم احتضنت مع الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة للفأر TYLCV (MAb 1C4 ضد بروتين معطف TYLCV)24 والماعز المضادة للفأر الأجسام المضادة الثانوية مترافقة مع صبغة الفلورسنت الحمراء (أي Dylight 549). كانت النوى ملطخة DAPI (الأزرق). تم فحص إشارات الفلورة المناعية تحت المجهر البؤري. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: القياس الكمي للحمض النووي TYLCV في الأحشاء الوسطى، والغدد الهيموفية، والغدد اللعابية الأولية، والمبايض في الذباب الأبيض MEAM1. يتغذى البالغون على نباتات الطماطم المصابة بـ TYLCV لمدة 24 و48 و72 ساعة ، ثم تم تشريح الأحشاء المتوسطة الذبابة البيضاء والهيموليمف وPSGs والمبايض وجمعها. بعد ذلك ، تم إجراء استخراج الحمض النووي وqPCR لمنتصف الأحشاء(A)، hemolymph(B)، PSGs(C)، والمبايض(D). تم تطبيع البيانات أولاً إلى الحمض النووي لذبابة بيضاء، ثم تم تطبيع الكمية النسبية للفيروس الذي تم الحصول عليه مرة أخرى إلى أن في 24 ح. NV: غير viruliferous. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± SEM من الكمية النسبية للفيروس. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا نصف بروتوكول لتوطين والقياس الكمي لفيروس بيغومو في أنسجة ناقل الذبابة البيضاء من قبل الفلور المناعي وqPCR. تشريح يمثل الخطوة الأولى لتوطين والقياس الكمي للفيروس في أنسجة الذبابة البيضاء. يبلغ طول جسم الذبابة البيضاء حوالي 1 مم ، مما يعني أن الأنسجة صغيرة للغاية ، ومن الصعب تشريحها. إلى جانب ذلك، هناك صلات قوية بين الأنسجة. على سبيل المثال ، ترتبط المبايض بإحكام مع البكتيريا ، مما يجعل من الصعب عزلها. هنا ، وبالنظر إلى خصائص ومواقع الأنسجة المختلفة ، ونحن نصف نهج مختلفة للتشريح. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى الكثير من الممارسة لتشريح هذه الأنسجة بسرعة ودقة. بالإضافة إلى ذلك ، من الأفضل استخدام الذباب الأبيض الطازج ، لأن الحشرات الميتة ستزيد من صعوبة التشريح. وعلاوة على ذلك، بعد تشريح، يجب تنظيف الأنسجة لتجنب التلوث.

تعتمد تقنية الفلورة المناعية على استخدام أجسام مضادة محددة. تركيز العمل المناسب لكل جسم مضاد مهم جداً في التصوير، لأن التركيز العالي للأجسام المضادة يقلل من نسبة الإشارة إلى الخلفية وقد لا يوفر التركيز المنخفض إشارة كافية. هنا، استخدمنا تخفيف 1:400 لكل من الأجسام المضادة الأولية والأجسام المضادة الثانية. يجب تقسيم هذه الأجسام المضادة إلى أعليكوت صغيرة والاحتفاظ بها عند -20 درجة مئوية لتجنب التجميد والذوبان المتكررين. وينبغي إعداد تخفيف الأجسام المضادة الحق قبل الاستخدام. عندما يتم استخدام البروتوكول الموصوف هنا لتوطين البروتينات الفيروسية والبيضاء ، من المهم أن يتم إنتاج الأجسام المضادة الأولية ضد البروتينات الفيروسية والبيضاء في الحيوانات من أنواع مختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، يجب اختيار الفلوروفوريات للأجسام المضادة الثانوية بعناية لمنع النزيف بين القنوات. علاوة على ذلك ، نظرًا لصغر حجم أنسجة الذبابة البيضاء ، يجب غسلها دائمًا تحت المجهر لتجنب الخسارة. على الرغم من أن الفلور المناعي حساس للغاية ، إلا أنه أكثر استهلاكًا للوقت ومكلفًا نسبيًا بالمقارنة مع طرق موقع الفيروسات الأخرى مثل التهجين في الموقع (FISH). بالإضافة إلى ذلك، قد لا تكون الأجسام المضادة ضد فيروسات البجومو متاحة للشراء.

ويكمن مفتاح التطبيق الناجح لـ qPCR للقياس الكمي للفيروس في أنسجة الذبابة البيضاء في تصميم الكبيات المناسبة واختيار الجينات المرجعية الذاتية. وصف رودريغيز وآخرون معايير تصميم أجهزة إعداد الكبيات qPCR بالتفصيل25، والتي تنطبق أيضًا في تصميم أجهزة تحديد الفيروسات. في هذه الدراسة، تم اختيار α-actin كجين مرجعي للقياس الكمي للفيروسات في أنسجة الذبابة البيضاء. ومع ذلك ، في بعض الحالات (مثل جينات الحمض النووي الريبي) ، يجب استخدام جينات داخلية أخرى كجينات مرجعية إذا كانت مناسبة للتصميم التجريبي29. أيضا ، للحصول على نتائج مستقرة ودقيقة ، يجب استخدام الذباب الأبيض من نفس المرحلة التنموية ، لأن الذباب الأبيض من مختلف المراحل التنموية يمتلك قدرات تفاضلية للحصول على الفيروسات ونقلها22. وعلاوة على ذلك، في حين استخدمنا 20 PSGs أو وسطية كعينة واحدة، استخدمنا الهيموليمف التي تم جمعها من ذبابة بيضاء واحدة كعينة واحدة لتحليل qPCR. ويرجع ذلك إلى حقيقة أن جمع الهيموليمفية تستغرق وقتا طويلا والحمض النووي لعينات الهيموليمفية عرضة للتدهور إذا لم تتم معالجتها في الوقت المناسب. ويمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول لتحديد كمية الفيروس في الجسم الأبيض كله والنباتات المصابة بالفيروس.

باختصار، نحن نصف بروتوكول فعال وحساس لتوطين وكمية فيروسات البجومو في أنسجة الذبابة البيضاء عن طريق الفلور المناعي وqPCR، على التوالي. ويمكن أيضا تكييف هذا البروتوكول لتوطين والقياس الكمي لفيروسات البجومو الأخرى. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام بروتوكول الفلورة المناعية لتوطين البروتينات الفيروسية والبيضاء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي (رقم المنحة: 2017YFD0200600)، والصندوق المخصص لنظام البحوث الزراعية الصيني (رقم المنحة: CARS-23-D07) ومؤسسة بيل وميليندا غيتس (INVESTMENT ID OPP1149777 ). نشكر البروفيسور جيان شيانغ وو لتوفير الأجسام المضادة TYLCV CP.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% Paraformaldehyde MultiSciences F0001
4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) Abcam ab104139
Bovine Serum Albumin (BSA) MultiSciences A3828
CFX Connect Real-Time PCR Detection System Bio-RAD 185-5201
Confocal microscopy Zeiss LSM800
Dylight 549-goat anti-mouse Earthox E032310-02 Secondary antibody
Monoclonal antibody (MAb 1C4) Primary antibody
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sangon Biotech B548119-0500
Stereo microscope Zeiss Stemi 2000-C
TB green premix Ex Taq (Tli RNase H Plus) TaKaRa RR820A qPCR master mix
Thermocycler Thermofisher A41182
Tissuelyzer Shaghai jingxin Tissuelyser-48
Triton-X-100 BBI life sciences 9002-93-1
Tween 20 BBI life sciences 9005-64-5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rojas, M. R., et al. World management of geminiviruses. Annual Review of Phytopathology. 56, 637-677 (2018).
  2. De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).
  3. Navas-Castillo, J., Fiallo-Olive, E., Sanchez-Campos, S. Emerging virus diseases transmitted by whiteflies. Annual Review of Phytopathology. 49, 219-248 (2011).
  4. Liu, J., et al. Viral infection of tobacco plants improves performance of Bemisia tabaci but more so for an invasive than for an indigenous biotype of the whitefly. Journal of Zhejiang University-Science B. 11 (1), 30-40 (2010).
  5. Legarrea, S., Barman, A., Marchant, W., Diffie, S., Srinivasan, R. Temporal effects of a begomovirus infection and host plant resistance on the preference and development of an insect vector, Bemisia tabaci, and implications for epidemics. PLoS One. 10 (11), 0142114 (2015).
  6. Fang, Y., et al. Tomato yellow leaf curl virus alters the host preferences of its vector Bemisia tabaci. Scientific Reports. 3, 2876 (2013).
  7. Guo, T., et al. Comparison of transmission of papaya leaf curl China virus among four cryptic species of the whitefly Bemisia tabaci complex. Scientific Reports. 5, 15432 (2015).
  8. Pan, L. L., et al. Differential efficiency of a begomovirus to cross the midgut of different species of whiteflies results in variation of virus transmission by the vectors. Science China-Life Sciences. 61 (10), 1254-1265 (2018).
  9. Pan, L. L., Cui, X. Y., Chen, Q. F., Wang, X. W., Liu, S. S. Cotton leaf curl disease: which whitefly is the vector. Phytopathology. 108 (10), 1172-1183 (2018).
  10. Fiallo-Olive, E., Pan, L. L., Liu, S. S., Navas-Castillo, J. Transmission of begomoviruses and other whitefly-borne viruses: dependence on the vector species. Phytopathology. , (2019).
  11. Cohen, S., Nitzany, F. E. Transmission and host range of the tomato yellow leaf curl virus. Phytopathology. 56, 1127-1131 (1966).
  12. Moriones, E., Navas-Castillo, J. Tomato yellow leaf curl virus, an emerging virus complex causing epidemics worldwide. Virus Research. 71 (1-2), 123-134 (2000).
  13. Ghanim, M. A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector. Virus Research. 186, 47-54 (2014).
  14. Navot, N., Pichersky, E., Zeidan, M., Zamir, D., Czosnek, H. Tomato yellow leaf curl virus - a whitefly-transmitted geminivirus with a single genomic component. Virology. 185 (1), 151-161 (1991).
  15. Sanchez-Campos, S., et al. Tomato yellow leaf curl virus: No evidence for replication in the insect vector Bemisia tabaci. Scientific Reports. 6, 30942 (2016).
  16. Pakkianathan, B. C., et al. Replication of tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector, Bemisia tabaci. Journal of Virology. 89 (19), 9791-9803 (2015).
  17. Rodriguez-Negrete, E. A., et al. A sensitive method for the quantification of virion-sense and complementary-sense DNA strands of circular single-stranded DNA viruses. Scientific Reports. 4, 6438 (2014).
  18. Gotz, M., et al. Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions. Journal of Virology. 86 (24), 13241-13252 (2012).
  19. Zhao, J., Chi, Y., Zhang, X. J., Wang, X. W., Liu, S. S. Implication of whitefly vesicle associated membrane protein-associated protein B in the transmission of Tomato yellow leaf curl virus. Virology. 535, 210-217 (2019).
  20. Maluta, N. K., Garzo, E., Moreno, A., Lopes, J. R., Fereres, A. Tomato yellow leaf curl virus benefits population growth of the Q biotype of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae). Neotropical Entomology. 43 (4), 385-392 (2014).
  21. Czosnek, H., Hariton-Shalev, A., Sobol, I., Gorovits, R., Ghanim, M. The incredible journey of begomoviruses in their whitefly vector. Viruses. 9 (10), 273 (2017).
  22. Wei, J., et al. Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).
  23. Ghanim, M., Morin, S., Zeidan, M., Czosnek, H. Evidence for transovarial transmission of tomato yellow leaf curl virus by its vector, the whitefly Bemisia tabaci. Virology. 240 (2), 295-303 (1998).
  24. Xie, Y., et al. Highly sensitive serological methods for detecting tomato yellow leaf curl virus in tomato plants and whiteflies. Virology Journal. 10, 142 (2013).
  25. Arya, M., et al. Basic principles of real-time quantitative PCR. Expert Review of Molecular Diagnostics. 5 (2), 209-219 (2005).
  26. Wei, J., et al. Specific cells in the primary salivary glands of the whitefly Bemisia tabaci control retention and transmission of begomoviruses. Journal of Virology. 88 (22), 13460-13468 (2014).
  27. Wang, L. L., et al. The autophagy pathway participates in resistance to tomato yellow leaf curl virus infection in whiteflies. Autophagy. 12 (9), 1560-1574 (2016).
  28. Arocho, A., Chen, B. Y., Ladanyi, M., Pan, Q. L. Validation of the 2(-Delta Delta Ct) calculation as an alternate method of data analysis for quantitative PCR of BCR-ABL P210 transcripts. Diagnostic Molecular Pathology. 15 (1), 56-61 (2006).
  29. Li, R., et al. Reference gene selection for qRT-PCR analysis in the sweetpotato whitefly, Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae). PLoS One. 8 (1), 53006 (2013).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 156، الفلورة المناعية، PCR الكمي، بيميسيا تاباتشي، الطماطم الصفراء ورقة حليقة الفيروس،تشريح، الغدة اللعابية الأولية، منتصف الأمعاء
توطين والقياس الكمي لفيروسات البيجومو في أنسجة الذبابة البيضاء عن طريق الفلورة المناعية وPCR الكمي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ban, F. X., Yin, T. Y., Guo, Q.,… More

Ban, F. X., Yin, T. Y., Guo, Q., Pan, L. L., Liu, Y. Q., Wang, X. W. Localization and Quantification of Begomoviruses in Whitefly Tissues by Immunofluorescence and Quantitative PCR. J. Vis. Exp. (156), e60731, doi:10.3791/60731 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter