Summary
Nous décrivons une méthode d’immunofluorescence et quantitative de PCR pour la localisation et la quantification des bégomovirus dans les tissus d’insecte. Le protocole d’immunofluorescence peut être utilisé pour colocaliser les protéines virales et vectorielles. Le protocole pcR quantitatif peut être étendu pour quantifier les virus dans des corps entiers de mouche blanche et des plantes infectées par le virus.
Abstract
Les begomovirus (genre Begomovirus, famille Geminiviridae)sont transmis par les mouches blanches du complexe Bemisia tabaci d’une manière persistante et circulative. Compte tenu des dommages considérables causés par les bégomovirus à la production agricole dans le monde entier, il est impératif de comprendre l’interaction entre les begomovirus et leur vecteur de mouche blanche. Pour ce faire, la localisation et la quantification du virus dans les tissus vectoriels sont cruciales. Ici, en utilisant le virus de boucle jaune de feuille de tomate (TYLCV) comme exemple, nous décrivons un protocole détaillé pour localiser des bégomovirus dans les midguts de mouche blanche, les glandes salivaires primaires, et les ovaires par immunofluorescence. La méthode est basée sur l’utilisation d’anticorps spécifiques contre une protéine de couche virale, des anticorps secondaires étiquetés colorants et un microscope confocal. Le protocole peut également être utilisé pour colocaliser les protéines bégomovirales et les protéines de la mouche blanche. Nous décrivons en outre un protocole pour la quantification de TYLCV dans les mouches blanches midguts, glandes salivaires primaires, hémolymphe, et ovaires par PCR quantitatif (qPCR). À l’aide d’amorces spécialement conçues pour TYLCV, les protocoles de quantification permettent de comparer la quantité de TYLCV dans différents tissus de la mouche blanche. Le protocole décrit est potentiellement utile pour la quantification des bégomovirus dans le corps d’une mouche blanche et d’une plante infectée par le virus. Ces protocoles peuvent être utilisés pour analyser la voie de circulation des bégomovirus dans la mouche blanche ou comme complément à d’autres méthodes pour étudier les interactions whitefly-begomovirus.
Introduction
Au cours des dernières décennies, les bégomovirus (genre Begomovirus, famille Geminiviridae) ont causé de graves dommages à la production de nombreux légumes, fibres et cultures ornementalesdansle monde 1 . Les begomovirus sont transmis de manière persistante par la mouche blanche Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae), qui est une espèce complexe contenant plus de 35 espèces cryptiques2,3. Les begomovirus peuvent affecter directement ou indirectement la physiologie et le comportement des mouches blanches, tels que la fécondité4, la longévité4, et la préférence de l’hôte5,6. En outre, l’efficacité de transmission d’une espèce/souche de bégomovirus donnée varie pour différentes espèces cryptiques de mouches blanches même dans les mêmes conditions expérimentales7,8,9,10, indiquant qu’il existe une interaction complexe entre les bégomovirus et les mouches blanches. Pour mieux comprendre les mécanismes sous-jacents aux interactions entre la mouche blanche et le bégomovirus, la localisation et la quantification du virus dans les tissus de la mouche blanche sont essentiels.
Le virus de la courbure jaune de la tomate (TYLCV) est un bégomovirus qui a été signalé pour la première fois en Israel, mais qui cause aujourd’hui de graves dommages à la production mondiale de tomates11,12. En raison de son importance économique, il est l’un des bégomovirus les mieux étudiés13. Comme d’autres bégomovirus monopartites, TYLCV est un virus de l’ADN circulaire à brin unique dont la taille du génome est d’environ 2 800 nucléotides14. Bien que toujours en débat, plusieurs lignes de preuve soutiennent la réplication de TYLCV chez les mouches blanches15,16,17. En outre, l’interaction des particules TYLCV et des protéines de la mouche blanche a été signalée6,18,19,20. Pour la transmission du virus, les mouches blanches acquièrent le TYLCV en se nourrissant de plantes infectées par le virus, les virions passent le long du canal alimentaire pour atteindre l’œsophage, pénètrent dans la paroi intermédiaire pour atteindre l’hémolymphe, puis se translocalisent dans les glandes salivaires primaires (GS). Enfin, les virions sont égeées avec de la salive le long du conduit salivaire dans le phlomevégétal 21. En outre, plusieurs études montrent que TYLCV est capable d’être transmis transovarialement des mouches blanches femelles à leur progéniture22,23. En d’autres termes, pour atteindre une transmission productive, le virus doit surmonter les barrières cellulaires à l’intérieur de la mouche blanche pour transloquer d’un tissu à l’autre. Pendant le franchissement de ces barrières, des interactions entre la mouche blanche et les protéines virales sont susceptibles de se produire, ce qui déterminera probablement l’efficacité avec laquelle les virus sont transmis.
L’immunofluorescence est une technique couramment utilisée pour l’analyse de la distribution de protéines. La spécificité des anticorps se liant à leur antigène forme la base de l’immunofluorescence. En raison de l’importance économique de TYLCV, des anticorps monoclonaux contre la protéine de couche TYLCV ont été développés, offrant un moyen très sensible de localiser le virus24. Le PCR quantitatif (qPCR) permet une quantification sensible et spécifique des acides nucléiques. Cette technique est le plus souvent basée sur l’utilisation de sondes hydrolysques (p. ex. TaqMan) ou de colorant fluorescent (p. ex., SYBR Green). Pour le qPCR à base de sonde d’hydrolyse, des sondes spécifiques sont nécessaires, ce qui augmente le coût. Le qPCR à base de colorant fluorescent est plus simple et plus rentable, car les sondes d’hybridation étiquetées spécifiques à l’amplicon ne sont pas nécessaires25. Jusqu’ici, plusieurs études ont employé l’immunofluorescence et le qPCR avec d’autres méthodes pour étudier les interactions complexes de begomovirus-whitefly. Par exemple, Pan et coll. ont effectué l’analyse qPCR et l’immunofluorescence du virus dans les tissus de la mouche blanche et ont constaté que la différence dans la capacité de transmettre le virus de la pousse bouclée du tabac (TbCSV) entre les espèces de mouches blanches AsiaII 1 et Moyen-Orient Asie mineure 1 (MEAM1) était due au fait que le virus était capable de traverser efficacement la paroi intermédiaire d’AsiaII1 mais pas MEAM18. De même, alors que les mouches blanches méditerranéennes (MED) peuvent facilement transmettre TYLCV, elles ne transmettent pas le virus de la chine de courbure jaune de tomate (TYLCCNV). La transmission sélective a été étudiée à l’aide de la détection d’immunofluorescence du virus dans les PSG, qui a montré que TYLCCNV ne traversent pas facilement les PSG des mouches blanchesMED 26. La colocalisation d’immunofluorescence de TYLCV CP et de la protéine de marqueur d’autophagie ATG8-II dans les mouches blanches montre que l’autophagie joue un rôle critique dans la répression de l’infection de TYLCV dans la mouche blanche27.
Ici, en utilisant TYLCV comme exemple, nous décrivons un protocole pour la localisation des begomovirus dans les mouches blanches, les PSG et les ovaires par une technique d’immunofluorescence. La technique comprend la dissection, la fixation et l’incubation avec des anticorps secondaires primaires et étiquetés par colorant. Les signaux de fluorescence montrant l’emplacement des protéines virales dans les tissus de la mouche blanche peuvent alors être détectés sous un microscope confocal. Plus important encore, ce protocole peut être utilisé pour colocaliser les protéines bégomovirales et les protéines de la mouche blanche. Nous décrivons en outre un protocole pour la quantification de TYLCV utilisant le qPCR à base verte de SYBR dans les midguts de mouche blanche, les PSG, les hémolymphes, et les ovaires, qui peut être employé pour comparer la quantité de virus dans différents échantillons de tissu de mouche blanche.
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Protocol
1. Whitefly, Virus, Plantes, et l’acquisition du virus
- Les mouches blanches arrière (MEAM1) sur coton (Gossypium hirsutum cv. Zhemian 1793) dans des cages à l’épreuve des insectes dans une serre à 26 '1 'C avec un cycle clair:10 de 14:10 et 60 - 10% d’humidité relative.
- Effectuer PCR conventionnel basé sur la mouche blanche mitochondriale cytochrome oxidase I gène pour déterminer la pureté de la population de moucheblanche.
- Recueillir 20 mouches blanches adultes et les transférer individuellement dans un tube PCR contenant 30 l de tampon de lyse (10 mM Tris, pH 8,4, 50 mM KCl, 0,45 % [wt/vol] Tween-20, 0,2 % [wt/vol] gélatine, 0,45 % [vol/vol] Nonidet P 40, 60 g/mL Proteinase K).
- Ajouter 5 à 7 perles de céramique (2 mm de diamètre) dans chaque tube DE PCR et moudre les échantillons pour effectuer la lyse tissulaire.
- Incuber tous les échantillons à 65 oC pendant 1 h, puis 10 min à 100 oC, puis centrifuger brièvement. Utilisez ce supernatant comme modèle pour l’amplification PCR.
REMARQUE : Le temps d’incubation à 65 oC peut être augmenté si nécessaire. - Préparer la réaction PCR comme suit : 1 U de polymérase d’ADN Taq, 2 L de tampon de 10x (avec Mg2),1,6 l de mélange dNTP (2,5 mL), 0,5 L de chaque apprêt (10 M chacun), 2 l de lysate de tissu de mouche blanche supernatant, et l’eau distillée à un volume total de 20 l par réaction. La séquence d’amorce avant est 5'-TTGATTTTTTGGTCATCATCCAGAAGT-3' et la séquence d’amorce inversée est de 5'-TAATATGGCAGATTAGTGCATTGGA-3'.
REMARQUE : Un contrôle négatif où l’ADN est substitué à de l’eau sans nucléane et un contrôle positif avec l’ADN de la mouche blanche MEAM1 précédemment vérifié devrait être inclus. - Effectuer pcR en utilisant les paramètres de cycle suivants : dénaturation initiale à 95 oC pendant 3 min, suivie de 35 cycles de dénaturation à 95 oC pour 30 s, d’annealing à 50 à 55 oC pour 30 s, et d’extension à 72 oC pendant 1 min, suivie de 72 oC pendant 10 min.
- Dig le produit amplifié avec l’enzyme de restriction Taq I. Pour ce faire, préparer le mélange de digestion avec 0,1 L (1 U) d’enzyme, 1 L de 10x Taq I Buffer, 1 L de BSA, 5 'L de produit amplifié, et double de l’eau distillée à un volume total de 10 'L. Incuber à 65 oC pendant 1 h dans un thermocycleur.
- Effectuer l’électrophorèse de gel d’agarose des échantillons en chargeant 5 à 7 l de chaque produit digéré et une échelle d’ADN (100-2 000 pb) dans les puits d’un gel agarose de 1 %. Ensuite, observez les tailles de bande d’ADN par coloration rouge gel dans une machine de documentation de gel utilisant la lumière UV. Comparez la taille des bandes des produits digérés au contrôle positif pour déterminer la pureté de la population de mouches blanches.
- Agro-inoculer le clone infectieux de TYLCV (numéro d’adhésion GenBank AM282874.1) (pBINPLUS-SH2-1.4A) en 3-4 vraies plantes de tomate à stade folique(Solanum lycopersicum L. cv. Hezuo 903).
- Inoculer 10 ml de milieu Luria-Bertani (LB) contenant de la kanamycine (50 g/mL) et de la rifampicine (50 g/mL) avec une seule colonie. Incuber à 28 oC en secouant à 200 tr/min jusqu’à ce que l’OD600 atteigne 1,5.
- Récolter les agrobactéries par centrifugation à 4 000 x g pendant 10 min. Jeter le supernatant.
- Resuspendre les granulés dans 10 ml de tampon d’infiltration, composé de 200 m d’acétosyringone, 10 mM 2-(N-morpholino) d’acide sulfonique d’éthane (MES) et 10 mM MgCl2. Incuber à température ambiante (RT) pendant 1 h et 2 h.
- Infiltrer les feuilles végétales de 2 à 3 à l’aide du mélange à partir de l’étape 1.3.3 avec une seringue sans aiguille de 1 ml. Maintenir les plantes dans une serre à 26 o1 oC.
- Environ 1 mois plus tard, effectuez une inspection visuelle et choisissez des plantes montrant la feuille de boucle jaune et les symptômes de cascade.
- Transférer les adultes de la mouche blanche non virulife sur des plants de tomates infectés par TYLCV pendant 48 h pour l’acquisition du virus.
2. Dissection et collection de Midguts, Glandes salivaires primaires (PSG), ovaires et hémolymphiques des mouches blanches femelles
- Recueillir les mouches blanches en utilisant l’aspiration, puis les placer sur la glace pour les mettre dans le coma. Ajouter 1x tampon PBS (saline tampon tampon de phosphate) sur une lame de microscope, puis placer les mouches blanches dans le tampon 1x PBS pour la dissection sous un microscope stéréo.
- Pour la dissection de l’intestin moyen, briser l’abdomen de la mouche blanche et retirer le midgut à l’aide d’une fine aiguille d’acupuncture (0,25 mm de diamètre). Transférer le midgut pour nettoyer, 1x PBS.
- Pour la dissection du PSG, casser le corps de la mouche blanche dans le thorax près de la tête du côté dorsal. Ensuite, insérez une aiguille dans le thorax pour fixer la mouche blanche, et utilisez une autre aiguille pour secouer la mouche blanche jusqu’à ce que les deux glandes salivaires soient séparées du corps. Ensuite, transférer les PSG pour nettoyer, 1x PBS.
- Pour la dissection des ovaires, briser complètement l’abdomen de la mouche blanche, et utiliser une aiguille pour séparer les ovaires des autres tissus. Ensuite, retirer l’excès de tissus par pipetting.
- Pour la collection d’hémolymphes, ajouter 10 l de tampon DE 1 x PBS sur une lame de microscope, puis placer une mouche blanche dans le tampon. Pour obtenir l’hémolymphe, déchirer doucement un trou dans l’abdomen à l’aide d’une fine aiguille d’acupuncture, et appuyez légèrement sur l’abdomen pour libérer l’hémolymphe dans le tampon. Recueillir 8 L du liquide comme échantillon d’hémolymphe.
3. Localisation de TYLCV dans Whitefly Midgut, Primary Salivary Glands, and Ovaries by Immunofluorescence
REMARQUE: La procédure de localisation de TYLCV dans le midguts est présentée comme un exemple. La méthode peut être utilisée pour les PSG et les ovaires.
- Disséquer les mi-guts dans le tampon du SCT (10 mM Tris-HCl, 150 mM de chlorure de sodium, pH à 7,5) tel que décrit à l’étape 2.2.1. Recueillir 15 à 20 mouches blanches, les transférer dans un plat Petri en verre (3,5 cm de diamètre), puis enlever l’excès de tampon TBS.
- Ajouter 1 ml de paraformaldéhyde de 4 % pour fixer les mi-guts pendant 2 h à température ambiante, puis retirer la solution fixative. Pipette lentement pour laver les mi-guts 3x dans le SCT pendant 2 min chacun.
- Incuber les mi-guts dans 1 ml de 0,5% Triton X-100 pendant 30 min à la perméabilize. Ensuite, retirez la solution de perméabilisation et lavez le midguts 3x avec TBST (1x TBS avec 0,05% Tween 20) comme décrit à l’étape 3.2.
- Ajouter 1 ml de 1% de BSA (albumine de sérum bovin préparé en TBST) pour bloquer les mi-guts. Effectuer l’étape de blocage à RT pendant 2 h, puis retirer la solution de blocage et laver les midguts 3x en TBST.
- Diluer les anticorps primaires (MAb 1C4 contre la protéine de couche TYLCV) à 1:400 avec TBST24 et ajouter la solution dans le plat Petri pour immerger les mi-guts. Incuber à 4 oC toute la nuit dans l’obscurité. Jeter la solution d’anticorps primaire et laver 3x dans TBST.
- Diluer les anticorps secondaires (anti-souris) à 1:400 avec TBST et ajouter la solution dans le plat Petri pour immerger les mi-guts. Incuber le plat pendant 2 h à RT dans l’obscurité. Jetez la solution d’anticorps secondaire et lavez les midguts 3x en TBST.
- Transférer les mi-guts sur une lame de microscope claire. Aspirez autant de TBST sur la diapositive que possible. Ajouter 1 goutte de DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochlorure) pour tacher le noyau, puis placer le bordereau et sceller avec du vernis à ongles. Examiner sous un microscope confocal.
4. Quantification de TYLCV dans Whitefly Midgut, Primary Salivary Glands, Hemolymph, and Ovaries with qPCR
- Disséquer les mouches blanches midguts, PSGs, hémolymphe, et les ovaires dans 1x PBS comme décrit ci-dessus.
- Extraire l’ADN des mi-guts, des PSG, des hémolymphes et des ovaires.
- Après la dissection, lavez les mi-guts, les PSG et les ovaires dans un tampon PBS propre 2 x 3x.
- Recueillir 20 midguts ou 20 PSG dans 5 L de 1x PBS et les transférer dans une solution de lyse de 25 L. Transférer chaque ovaire en 5 L de 1x PBS, puis transférer dans une solution de lyse de 25 L individuellement.
- Broyer les échantillons de midguts, de PSG et d’ovaires tels que décrits à l’étape 1.2.2.
- Recueillir 8 L d’hémolymphe avec 1x PBS dans un tube PCR, puis ajouter 10 L de solution de lyse. Mélanger.
- Extraire l’ADN de tous les échantillons tels que décrits dans 1.2.3.
- Préparer deux mélanges principaux qPCR distincts (18 l chacun) pour TYLCV et le contrôle interne (gène del’actine) comme suit : 10 l de mélange SYBR Green, 0,8 L de chaque amorce (10 M chacun) et 6,4 l d’eau distillée double par réaction. Pour TYLCV, la séquence d’amorce avant est de 5-GAAGCGACCACGATATAA-3 et la séquence d’amorce inversée est de 5-GGAACATCAGGGCTCGATA-3. Pour l’actine, la séquence d’amorce avant est de 5-TCTCACGCCATCTTTTTTTG-3 et la séquence d’amorce inversée est de 5-CGGTGATTTCCTCCTGCATT-3.
- Distribuer 18 l l de la maquette principale en flacons de tubes à bande qPCR ou une plaque de puits de 96. Ensuite, ajoutez 2 ll des échantillons d’ADN dans chaque flacon. Effectuez toutes les réactions avec au moins trois répliques techniques et trois répliques biologiques.
REMARQUE : L’étape 4.5 doit être effectuée sur la glace. - Fermez les tubes qPCR ou scellez les 96 plaques de puits avec un joint adhésif.
- Centrifugeuse pour recueillir le liquide au fond des tubes qPCR ou 96 plaques de puits.
- Placez les tubes ou la plaque dans le cycler thermique en temps réel et effectuez qPCR.
- Effectuer le qPCR en utilisant les paramètres de cycle suivants : 95 oC pour 30 s, suivi de 40 cycles de 95 oC pour 5 s et de 60 oC pour 34 s pour l’amorce et l’allongement, 1 cycle à 95 oC pour 15 s, se terminant par une courbe de fusion de 60 à 95 oC avec une augmentation de 0,5 oC pour 15 s.
- Choisissez SYBR comme colorant fluorophore et inconnu comme type d’échantillon.
- Exporter les données quantitatives vers un format de feuille de calcul et analyser la quantité relative d’ADN viral par la méthode 2'CT 28.
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Representative Results
Les mouches blanches MEAM1 du complexe B. tabaci et de TYLCV ont été utilisées comme exemple ici pour décrire les procédures. L’aperçu des procédures d’immunofluorescence et de quantification virale décrites dans ce manuscrit est présenté à la figure 1. La figure 2 montre les résultats représentatifs de la détection de l’immunofluorescence des taches tyLCV et DAPI dans les PSG, les intestins intermédiaires et les ovaires, ce qui indique que le TYLCV s’est accumulé davantage dans les PSG et les mi-guts, et moins dans les ovaires. La figure 3 montre la quantité relative de virus dans les GDP, les intestins, les hémolymphes et les ovaires des mouches blanches après que les mouches blanches se soient nourries de tomates infectées par le TYLCV pendant 24, 48 et 72 h, ce qui indique que la quantité de virus a augmenté dans différents tissus de la mouche blanche avec l’augmentation de la période d’accès à l’acquisition.
Figure 1 : Aperçu des protocoles présentés dans le présent document. (A) Procédures expérimentales pour l’immunofluorescence chez les mouches blanches, les PSG et les ovaires. Des tissus ont été rassemblés des mouches blanches femelles adultes TYLCV-infectées, suivies d’une série de fixation, de perméabilisation, de blocage, d’incubations avec des anticorps primaires qui se lient à une protéine de couche tyLCV, et d’anticorps secondaires fluorochrome-conjugués qui se lient aux anticorps primaires. Enfin, des échantillons ont été analysés au microscope confocal, permettant l’acquisition d’images. (B) Procédure expérimentale pour la quantification du virus chez les mouches blanches, les GS, les ovaires et les hémolymphes. Des tissus ont été rassemblés des mouches blanches femelles adultes TYLCV-infectées, et puis l’extraction d’ADN a été exécutée. qPCR a été réalisé sur un instrument PCR en temps réel, permettant l’acquisition de données qui peuvent être analysées par la suite. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Détection d’immunofluorescence de TYLCV dans les glandes salivaires primaires, les midguts, et les ovaires des mouches blanches adultes femelles après une période d’acquisition de virus de 48 h. Les mouches blanches ont été autorisées à se nourrir de plants de tomates infectés par le TYLCV pendant 48 h, puis 20 PSG, 20 midguts et 20 ovaires ont été disséqués et recueillis. Ensuite, les échantillons ont été fixés dans 4% de formaldéhyde, perméabilisé dans 0.5% Triton X-100, bloqué dans 1% BSA, puis incubé avec la souris anti-TYLCV anticorps monoclonaux (MAb 1C4 contre la protéine de couche TYLCV)24 et chèvre anti-souris anticorps secondaires conjugués à un colorant fluorescent rouge (c.-à-d., Dylight 549). Les noyaux étaient tachés de DAPI (bleu). Des signaux d’immunofluorescence ont été examinés sous un microscope confocal. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Quantification de l’ADN TYLCV chez les intestins intermédiaires, les hémolymphes, les glandes salivaires primaires et les ovaires chez les mouches blanches MEAM1. Adulte nourri sur les plants de tomates tyLCV-infectés pour 24, 48, et 72 h, puis les mouches blanches midguts, hémolymphe, PSG, et les ovaires ont été disséqués et recueillis. Ensuite, l’extraction de l’ADN et qPCR ont été effectuées pour les midguts (A), hémolymphe (B), PSGs (C), et les ovaires (D). Les données ont d’abord été normalisées à l’ADN de la mouche blanche, puis la quantité relative de virus obtenue a été de nouveau normalisée à celle à 24 h. NV : Non-viruliferous. Les données sont présentées comme la moyenne - SEM de quantité relative de virus. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Ici nous décrivons un protocole pour la localisation et la quantification d’un bégomovirus dans les tissus de son vecteur de mouche blanche par immunofluorescence et qPCR. La dissection représente la première étape pour localiser et quantifier le virus dans les tissus de la mouche blanche. Le corps de la mouche blanche mesure environ 1 mm de longueur, ce qui signifie que les tissus sont extrêmement petits et qu’il est difficile de les disséquer. En outre, il existe des liens étroits entre les tissus. Par exemple, les ovaires sont étroitement liés aux bactériocytes, ce qui les rend difficiles à isoler. Ici, compte tenu des caractéristiques et des emplacements des différents tissus, nous décrivons différentes approches pour la dissection. Cependant, beaucoup de pratique est nécessaire pour disséquer rapidement et avec précision ces tissus. En outre, il est préférable d’utiliser des mouches blanches fraîches, parce que les insectes morts augmenterait la difficulté de dissection. De plus, après la dissection, les tissus doivent être nettoyés pour éviter la contamination.
La technique d’immunofluorescence est basée sur l’utilisation d’anticorps spécifiques. Une concentration de travail appropriée pour chaque anticorps est très importante dans l’imagerie, parce qu’une forte concentration d’anticorps réduit le rapport signal-arrière et une faible concentration peut ne pas fournir un signal suffisant. Ici, nous avons utilisé une dilution de 1:400 pour les anticorps primaires et les deuxièmes anticorps. Ces anticorps doivent être divisés en petits aliquots et conservés à -20 oC pour éviter le gel et la décongélation répétés. Les dilutions d’anticorps doivent être préparées juste avant utilisation. Lorsque le protocole décrit ici est utilisé pour colocaliser les protéines virales et les protéines de la mouche blanche, il est important que les anticorps primaires contre les protéines virales et les protéines de mouche blanche soient produits chez les animaux de différentes espèces. En outre, les fluorophores des anticorps secondaires doivent être choisis avec soin pour empêcher le saignement entre les canaux. En outre, compte tenu de la petite taille des tissus de mouche blanche, ils doivent toujours être lavés sous le microscope pour éviter la perte. Bien que l’immunofluorescence soit très sensible, elle est relativement plus longue et coûteuse par rapport à d’autres méthodes d’implantation du virus comme les hybridations in situ de fluorescence (FISH). En outre, les anticorps contre les begomovirus peuvent ne pas être disponibles à l’achat.
La clé du succès de l’application du qPCR pour la quantification du virus dans les tissus de la mouche blanche réside dans la conception d’amorces appropriées et la sélection de gènes de référence endogènes. Rodràguez et coll. ont décrit en détail les critères de conception des amorces qPCR25, qui s’appliquent également à la conception des amorces virales. Dans cette étude, l’actine a été sélectionnée comme gène de référence pour la quantification du virus dans les tissus de la mouche blanche. Cependant, dans certains cas (p. ex. gènes de l’ARN), d’autres gènes endogènes devraient être utilisés comme gènes de référence s’ils conviennent à la conception expérimentale29. En outre, pour obtenir des résultats stables et précis, les mouches blanches du même stade de développement devraient être utilisées, parce que les mouches blanches de différents stades de développement possèdent des capacités différentielles pour acquérir et transmettre des virus22. De plus, bien que nous utilisions 20 GSP ou midguts comme échantillon, nous avons utilisé un hémolymphe prélevé sur une mouche blanche comme échantillon pour l’analyse qPCR. Cela est dû au fait que la collecte de l’hémolymphe prend beaucoup de temps et que l’ADN des échantillons d’hémolymphe est vulnérable à la dégradation s’il n’est pas traité en temps opportun. Ce protocole peut également être utilisé pour quantifier la quantité de virus dans l’ensemble du corps et les plantes infectées par le virus.
En résumé, nous décrivons un protocole efficace et sensible pour localiser et quantifier les bégomovirus dans les tissus de la mouche blanche par immunofluorescence et qPCR, respectivement. Ce protocole peut également être adapté à la localisation et à la quantification d’autres bégomovirus. En outre, le protocole d’immunofluorescence peut être utilisé pour colocaliser les protéines virales et les protéines de la mouche blanche.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le National Key Research and Development Program (numéro de subvention: 2017YFD0200600), le fonds affecté au Système de recherche agricole de la Chine (numéro de subvention : CARS-23-D07) et la Fondation Bill et Melinda Gates (Investment ID OPP1149777 ). Nous remercions le professeur Jian-Xiang Wu d’avoir fourni des anticorps TYLCV CP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Paraformaldehyde | MultiSciences | F0001 | |
| 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) | Abcam | ab104139 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MultiSciences | A3828 | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio-RAD | 185-5201 | |
| Confocal microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Dylight 549-goat anti-mouse | Earthox | E032310-02 | Secondary antibody |
| Monoclonal antibody (MAb 1C4) | Primary antibody | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548119-0500 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| TB green premix Ex Taq (Tli RNase H Plus) | TaKaRa | RR820A | qPCR master mix |
| Thermocycler | Thermofisher | A41182 | |
| Tissuelyzer | Shaghai jingxin | Tissuelyser-48 | |
| Triton-X-100 | BBI life sciences | 9002-93-1 | |
| Tween 20 | BBI life sciences | 9005-64-5 |
References
- Rojas, M. R., et al. World management of geminiviruses. Annual Review of Phytopathology. 56, 637-677 (2018).
- De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).
- Navas-Castillo, J., Fiallo-Olive, E., Sanchez-Campos, S. Emerging virus diseases transmitted by whiteflies. Annual Review of Phytopathology. 49, 219-248 (2011).
- Liu, J., et al. Viral infection of tobacco plants improves performance of Bemisia tabaci but more so for an invasive than for an indigenous biotype of the whitefly. Journal of Zhejiang University-Science B. 11 (1), 30-40 (2010).
- Legarrea, S., Barman, A., Marchant, W., Diffie, S., Srinivasan, R. Temporal effects of a begomovirus infection and host plant resistance on the preference and development of an insect vector, Bemisia tabaci, and implications for epidemics. PLoS One. 10 (11), 0142114 (2015).
- Fang, Y., et al. Tomato yellow leaf curl virus alters the host preferences of its vector Bemisia tabaci. Scientific Reports. 3, 2876 (2013).
- Guo, T., et al. Comparison of transmission of papaya leaf curl China virus among four cryptic species of the whitefly Bemisia tabaci complex. Scientific Reports. 5, 15432 (2015).
- Pan, L. L., et al. Differential efficiency of a begomovirus to cross the midgut of different species of whiteflies results in variation of virus transmission by the vectors. Science China-Life Sciences. 61 (10), 1254-1265 (2018).
- Pan, L. L., Cui, X. Y., Chen, Q. F., Wang, X. W., Liu, S. S. Cotton leaf curl disease: which whitefly is the vector. Phytopathology. 108 (10), 1172-1183 (2018).
- Fiallo-Olive, E., Pan, L. L., Liu, S. S., Navas-Castillo, J. Transmission of begomoviruses and other whitefly-borne viruses: dependence on the vector species. Phytopathology. , (2019).
- Cohen, S., Nitzany, F. E. Transmission and host range of the tomato yellow leaf curl virus. Phytopathology. 56, 1127-1131 (1966).
- Moriones, E., Navas-Castillo, J. Tomato yellow leaf curl virus, an emerging virus complex causing epidemics worldwide. Virus Research. 71 (1-2), 123-134 (2000).
- Ghanim, M. A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector. Virus Research. 186, 47-54 (2014).
- Navot, N., Pichersky, E., Zeidan, M., Zamir, D., Czosnek, H. Tomato yellow leaf curl virus - a whitefly-transmitted geminivirus with a single genomic component. Virology. 185 (1), 151-161 (1991).
- Sanchez-Campos, S., et al. Tomato yellow leaf curl virus: No evidence for replication in the insect vector Bemisia tabaci. Scientific Reports. 6, 30942 (2016).
- Pakkianathan, B. C., et al. Replication of tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector, Bemisia tabaci. Journal of Virology. 89 (19), 9791-9803 (2015).
- Rodriguez-Negrete, E. A., et al. A sensitive method for the quantification of virion-sense and complementary-sense DNA strands of circular single-stranded DNA viruses. Scientific Reports. 4, 6438 (2014).
- Gotz, M., et al. Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions. Journal of Virology. 86 (24), 13241-13252 (2012).
- Zhao, J., Chi, Y., Zhang, X. J., Wang, X. W., Liu, S. S. Implication of whitefly vesicle associated membrane protein-associated protein B in the transmission of Tomato yellow leaf curl virus. Virology. 535, 210-217 (2019).
- Maluta, N. K., Garzo, E., Moreno, A., Lopes, J. R., Fereres, A. Tomato yellow leaf curl virus benefits population growth of the Q biotype of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae). Neotropical Entomology. 43 (4), 385-392 (2014).
- Czosnek, H., Hariton-Shalev, A., Sobol, I., Gorovits, R., Ghanim, M. The incredible journey of begomoviruses in their whitefly vector. Viruses. 9 (10), 273 (2017).
- Wei, J., et al. Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).
- Ghanim, M., Morin, S., Zeidan, M., Czosnek, H. Evidence for transovarial transmission of tomato yellow leaf curl virus by its vector, the whitefly Bemisia tabaci. Virology. 240 (2), 295-303 (1998).
- Xie, Y., et al. Highly sensitive serological methods for detecting tomato yellow leaf curl virus in tomato plants and whiteflies. Virology Journal. 10, 142 (2013).
- Arya, M., et al. Basic principles of real-time quantitative PCR. Expert Review of Molecular Diagnostics. 5 (2), 209-219 (2005).
- Wei, J., et al. Specific cells in the primary salivary glands of the whitefly Bemisia tabaci control retention and transmission of begomoviruses. Journal of Virology. 88 (22), 13460-13468 (2014).
- Wang, L. L., et al. The autophagy pathway participates in resistance to tomato yellow leaf curl virus infection in whiteflies. Autophagy. 12 (9), 1560-1574 (2016).
- Arocho, A., Chen, B. Y., Ladanyi, M., Pan, Q. L. Validation of the 2(-Delta Delta Ct) calculation as an alternate method of data analysis for quantitative PCR of BCR-ABL P210 transcripts. Diagnostic Molecular Pathology. 15 (1), 56-61 (2006).
- Li, R., et al. Reference gene selection for qRT-PCR analysis in the sweetpotato whitefly, Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae). PLoS One. 8 (1), 53006 (2013).
