Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Lokalisering och kvantifiering av begomovirus i Whitefly Vävnader av Immunofluorescens och kvantitativ pcr

Published: February 8, 2020 doi: 10.3791/60731

Summary

Vi beskriver en immunofluorescens och kvantitativ PCR-metod för lokalisering och kvantifiering av begomovirus i insektsvävnader. Immunofluorescensprotokollet kan användas för att kolokalisera virus- och vektorproteiner. Det kvantitativa PCR-protokollet kan utvidgas till att kvantifiera virus i hela whitefly-kroppar och virusinfekterade växter.

Abstract

Begomovirus (släktet Begomovirus, familj Geminiviridae) överförs av whiteflies av Bemisia tabaci komplex på ett ihållande, cirkulerande sätt. Med tanke på de omfattande skador som orsakas av begomovirus att beskära produktionen över hela världen, är det absolut nödvändigt att förstå samspelet mellan begomovirus och deras whitefly vektor. För att göra detta är lokalisering och kvantifiering av viruset i vektorvävnaderna avgörande. Här, med hjälp av tomatgula blad curl virus (TYLCV) som ett exempel, beskriver vi ett detaljerat protokoll för att lokalisera begomovirus i whitefly midguts, primära salivary körtlar, och äggstockar genom immunfluorescens. Metoden är baserad på användning av specifika antikroppar mot ett virusskiktprotein, färgmärkta sekundära antikroppar och ett konfokalmikroskop. Protokollet kan också användas för att kolokalisera begomovirala och whitefly proteiner. Vi beskriver vidare ett protokoll för kvantifiering av TYLCV i whitefly midguts, primära salivary körtlar, hemolymph och äggstockar av kvantitativpcr (qPCR). Med hjälp av primers speciellt utformade för TYLCV, protokollen för kvantifiering möjliggör jämförelse av mängden TYLCV i olika vävnader i whitefly. Det beskrivna protokollet är potentiellt användbart för kvantifiering av begomovirus i kroppen av en whitefly och en virusinfekterad växt. Dessa protokoll kan användas för att analysera spridningsvägen för begomovirus i whitefly eller som ett komplement till andra metoder för att studera whitefly-begomovirus interaktioner.

Introduction

Under de senaste decennierna har begomovirus (släktet Begomovirus, familj Geminiviridae) orsakat allvarliga skador på produktionen av många vegetabiliska, fibrer och prydnadsgrödor över hela världen1. Begomovirus överförs på ett ihållande sätt av whitefly Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae), som är en komplex art som innehåller över 35 kryptiska arter2,3. Begomovirus kan direkt eller indirekt påverka whitefly fysiologi och beteende, såsom fruktsamhet4,livslängd4, och värd preferens5,6. Dessutom varierar överföringseffektiviteten hos en viss begomovirusarter/stam för olika vitfluga kryptiska arter även under samma experimentella förhållanden7,8,9,10, vilket tyder på att det finns en komplex interaktion mellan begomovirus och vitflugor. För att bättre förstå de mekanismer som ligger bakom whitefly-begomovirus interaktioner, lokalisering och kvantifiering av viruset i whitefly vävnader är viktiga.

Tomat gult blad curl virus (TYLCV) är en begomovirus som först rapporterades i Israel men numera orsakar allvarliga skador på tomatproduktion över hela världen11,12. På grund av dess ekonomiska betydelse är det en avde bäst studerade begomovirus13 . Liksom andra monopartite begomovirus, tylCV är en enda sträng cirkulärDNA-virus med en genomstorlek på ca 2.800 nukleotider14. Även om fortfarande under debatt, flera rader av bevis stöder replikering av TYLCV i whiteflies15,16,17. Dessutom har interaktionen mellan TYLCV-partiklar och vitfluga proteiner rapporterats6,18,19,20. För virusöverföring förvärvar whiteflies TYLCV genom att livnära sig på virusinfekterade växter, virions passerar längs matkanalen för att nå matstrupen, penetrera midgutväggen för att nå hemolymph, och sedan flytta in i de primära salivary körtlar (PSGs). Slutligen, virions egested med saliv längs spottatid i växt phloem21. Dessutom visar flera studier att TYLCV kan överföras transovarially från kvinnliga vitflugor till deras avkomma22,23. Med andra ord, för att uppnå produktiv överföring, måste viruset övervinna cellulära hinder inom whitefly att flytta från en vävnad till en annan. Under korsningen av dessa hinder, interaktioner mellan whitefly och virusproteiner kommer sannolikt att uppstå, förmodligen bestämma den effektivitet med vilken virusöverförs.

Immunofluorescens är en vanlig teknik för proteindistribution analys. Specificiteten hos antikroppar som är bindande för deras antigen utgör grunden för immunfluorescens. På grund av den ekonomiska betydelsen av TYLCV, monoklonala antikroppar mot TYLCV päls protein har utvecklats, erbjuder ett mycket känsligt sätt att lokalisera viruset24. Kvantitativ PCR (qPCR) möjliggör känslig och specifik kvantifiering av nukleinsyror. Denna teknik baseras oftast på användning av hydrolyssond (t.ex. TaqMan) eller fluorescerande färgämne (t.ex. SYBR Green) detektion. För hydrolys sondbaserad qPCR behövs specifika sonder, vilket därmed ökar kostnaden. Fluorescerande färgämnesbaserad qPCR är enklare och mer kostnadseffektivt, eftersom märkta ampliconspecifika hybridiseringssonder inte krävs25. Hittills har flera studier använt immunofluorescens och qPCR tillsammans med andra metoder för att undersöka komplexa begomovirus-whitefly interaktioner. Pan et al. utförde till exempel qPCR- och immunfluorescensanalys av viruset i vitfluga vävnader och fann att skillnaden i förmåga att överföra tobakslockfritt skjuta virus (TbCSV) mellan vitfluga arter AsiaII 1 och Mellanöstern Asien Mindre 1 (MEAM1) berodde på att viruset effektivt kunde korsa midgut väggen i AsiaII1 men inte MEAM18. På samma sätt, medan Medelhavet (MED) whiteflies lätt kan överföra TYLCV, misslyckas de med att överföra tomatgula blad curl Kina virus (TYLCCNV). Selektiv överföring undersöktes med hjälp av immunofluorescens detektion av virus i PSGs, som visade att TYLCCNV inte lätt korsar PSGs av MED whiteflies26. Immunofluorescens colocalization av TYLCV CP och autofagi markör protein ATG8-II i whitefly midguts visar att autofagi spelar en avgörande roll för att undertrycka infektionen av TYLCV i whitefly27.

Här, med tylcv som exempel, beskriver vi ett protokoll för lokalisering av begomovirus i whitefly midguts, PSGs och äggstockar genom en immunofluorescens teknik. Tekniken innehåller dissekering, fixering och inkubation med primära och färgmärkta sekundära antikroppar. Fluorescenssignaler som visar placeringen av virusproteiner i whitefly vävnaderna kan sedan upptäckas under ett konfokalmikroskop. Ännu viktigare är att detta protokoll kan användas för att kolokalisera begomovirala och whitefly proteiner. Vi beskriver vidare ett protokoll för kvantifiering av TYLCV med SYBR Green-baserade qPCR i whitefly midguts, PSGs, hemolymph och äggstockar, som kan användas för att jämföra mängden virus i olika whitefly vävnad prover.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Whitefly, Virus, Växter och förvärv av viruset

  1. Bakre whiteflies (MEAM1) på bomull(Gossypium hirsutum cv. Zhemian 1793) i insektssäkra burar i ett växthus vid 26 ± 1 °C med en 14:10 ljus:mörk cykel och 60 ± 10% relativ luftfuktighet.
  2. Utför konventionell PCR baserad på whitefly mitokondriell cytokrom oxidas jag gen för att bestämma renhet whitefly befolkningen.
    1. Samla in 20 vuxna vitflugor och överföra dem individuellt till ett PCR-rör som innehåller 30 μL lysbuffert (10 mM Tris, pH = 8,4, 50 mM KCl, 0,45% [wt/vol] Tween-20, 0,2% [wt/vol] gelatin, 0,45% [vol/vol] Nonidet P 40, 60 g/mL Proteinas K. Kproteinase).
    2. Tillsätt 5–7 keramiska pärlor (2 mm i diameter) i varje PCR-rör och slipa proverna för att utföra vävnadslysen.
    3. Inkubera alla prover vid 65 °C i 1 h följt av 10 min vid 100 °C och centrifugera sedan kort. Använd den här supernatanten som mall för PCR-förstärkning.
      OBS: Inkubationstiden vid 65 °C kan vid behov ökas.
    4. Förbered PCR-reaktionen enligt följande: 1 U av Taq DNA-polymeras, 2 μL 10x buffert (med Mg2+), 1,6 μl dNTP-blandning (2,5 mM), 0,5 μL av varje primer (10 μM vardera), 2 μL vitflugvävnadlysate supernatant och dubbelt destillerat vatten till en total volym på 20 μ perL reaktion. Den främre primer sekvensen är 5'-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3' och den omvända primer sekvensen är 5'-TAATATGGCAGATTAGTGCATTGGA-3'.
      OBS: En negativ kontroll där DNA ersätts med nuclease-fritt vatten och en positiv kontroll med tidigare verifierade MEAM1 whitefly DNA bör ingå.
    5. Utför PCR med hjälp av följande cykelparametrar: inledande denaturering vid 95 °C i 3 min, följt av 35 cykler av denaturering vid 95 °C i 30 s, glödgning vid 50–55 °C för 30 s och förlängning vid 72 °C i 1 min, följt av 72 °C i 10 min.
    6. Smält den förstärkta produkten med begränsningsenzym Taq I. För att göra detta, bereda matsmältningsblandningen med 0,1 μl (1 U) enzym,1 μL 10x Taq I Buffert, 1 μL av BSA, 5 μL förstärkt produkt och dubbelt destillerat vatten till en total volym på 10 μL. Inkubera vid 65 °C för 1 h i en termohjul.
    7. Utför agarose gel elektrofores av proverna genom lastning 5-7 μL av varje smält produkt och en DNA-stege (100-2.000 bp) i brunnarna på en 1% agarose gel. Observera sedan DNA-bandets storlekar genom gelröd färgning i en geldokumentationsmaskin med UV-ljus. Jämför bandets storlekar på de smälta produkterna med den positiva kontrollen för att bestämma renhet av whitefly befolkningen.
  3. Agro-inokulera den smittsamma klon av TYLCV (GenBank anslutningsnummer AM282874.1) (pBINPLUS-SH2-1.4A) i 3-4 true leaf stage tomatplantor(Solanum lycopersicum L. cv. Hezuo 903).
    1. Inokulera 10 ml Luria–Bertani (LB) medium som innehåller kanamycin (50 μg/ml) och rifampicin (50 μg/ml) med en enda koloni. Inkubera vid 28 °C med skakning vid 200 rpm tills OD600 når ~1,5.
    2. Skörda agrobakterier genom centrifugering vid 4000 x g i 10 min. Kassera supernatanten.
    3. Resuspend pellets i 10 ml infiltrationsbuffert, bestående av 200 μM acetosyringone, 10 mM 2-(N-morpholino) etansulfonsyra (MES) och 10 mM MgCl2. Inkubera vid rumstemperatur (RT) för 1–2 h.
    4. Infiltrera 2–3 växtblad med blandningen från steg 1.3.3 med en 1 ml nållös spruta. Underhåll växter i ett växthus vid 26 ± 1 °C.
  4. Ungefär 1 månad senare, utföra en visuell inspektion och välj växter som visar gula curl blad och stunt symtom.
  5. Överför icke-viruliferous whitefly vuxna till TYLCV-infekterade tomatplantor för 48 h för virusförvärv.

2. Dissekering och insamling av midguts, primära salivary körtlar (PSG), äggstockar och Hemolymph av kvinnliga whiteflies

  1. Samla whiteflies med hjälp av aspiration, och sedan placera dem på is för att sätta dem i koma. Lägg till 1x PBS (fosfat-buffrad realine) buffert på ett mikroskop bild, och sedan placera whiteflies i 1x PBS buffert för dissekering under en stereo mikroskop.
    1. För midgut dissekering, bryta buken av whitefly och dra ut midgut med hjälp av en fin akupunktur nål (0,25 mm i diameter). Överför midgut till ren, 1x PBS.
    2. För PSG dissekering, bryta kroppen av whitefly i bröstkorgen nära huvudet från ryggsidan. Sätt sedan in en nål i bröstkorgen för att fixa whitefly, och använd en annan nål för att skaka whitefly tills de två spottkörtlarna är separerade från kroppen. Överför sedan PSG:erna för att rengöra, 1x PBS.
    3. För äggstocken dissekering, helt bryta buken av whitefly, och använd en nål för att separera äggstockarna från andra vävnader. Ta sedan bort överflödiga vävnader genom att pipetting.
    4. För hemolymph samling, tillsätt 10 μL av 1x PBS buffert på ett mikroskop bild, och sedan placera en whitefly i bufferten. För att få hemolymph, försiktigt riva ett hål i buken med hjälp av en fin akupunktur nål, och något trycka på buken för att frigöra hemolymph ut i bufferten. Samla 8 μL av vätskan som hemolymfprovet.

3. Lokalisering av TYLCV i Whitefly Midgut, Primära salivary körtlar och äggstockar genom immunofluorescens

OBS: Förfarandet för lokalisering av TYLCV i midguts presenteras som ett exempel. Metoden kan användas för PSGs och äggstockar.

  1. Dissekera midguts i TBS buffert (10 mM Tris-HCl, 150 mM natriumklorid, pH = 7,5) som beskrivs i steg 2.2.1. Samla 15–20 whitefly midguts, överför dem till en glaspetriskål (3,5 cm i diameter), och ta sedan bort överflödig TBS buffert.
  2. Lägg till 1 ml av 4% paraformaldehyd för att fixa midguts för 2 h vid rumstemperatur, och ta sedan bort den fixativa lösningen. Pipette långsamt för att tvätta midguts 3x i TBS i 2 min vardera.
  3. Inkubera midguts i 1 ml 0,5% Triton X-100 för 30 min för att permeabilisera. Ta sedan bort permeabiliseringslösningen och tvätta midguts 3x med TBST (1x TBS med 0,05% Tween 20) enligt beskrivningen i steg 3.2.
  4. Lägg till 1 ml 1% BSA (bovin serum albumin beredd i TBST) för att blockera midguts. Utför blockeringssteget på RT för 2 h och ta sedan bort blockeringslösningen och tvätta midguts 3x i TBST.
  5. Späd de primära antikropparna (MAb 1C4 mot TYLCV-coatprotein) vid 1:400 med TBST24 och tillsätt lösningen i Petriskålen för att fördjupa midguts. Inkubera vid 4 °C över natten i mörkret. Kassera den primära antikroppslösningen och tvätta 3x i TBST.
  6. Späd de sekundära antikropparna (anti-mus) vid 1:400 med TBST och tillsätt lösningen i Petri skålen för att fördjupa midguts. Inkubera skålen för 2 h på RT i mörkret. Kassera den sekundära antikroppslösningen och tvätta midguts 3x i TBST.
  7. Överför midguts till en tydlig mikroskopbild. Aspirera så mycket TBST utanför bilden som möjligt. Tillsätt 1 droppe DAPI (4', 6-diamidino-2-fenylindol, dihydrochloride) för att färga kärnan, och sedan placera täckslip och tätning med nagellack. Undersök under ett konfokalmikroskop.

4. Kvantifiering av TYLCV i Whitefly Midgut, Primära salivary körtlar, Hemolymph och äggstockar med qPCR

  1. Dissekera whitefly midguts, PSGs, hemolymph, och äggstockar i 1x PBS som beskrivs ovan.
  2. Extrahera DNA av midguts, PSGs, hemolymph, och äggstockar.
    1. Efter dissekering, tvätta midguts, PSGs och äggstockar i ren, 1x PBS buffert 2-3x.
    2. Samla 20 midguts eller 20 PSGs i 5 μL av 1x PBS och överför dem till 25 μL lyslösning. Överför varje äggstock i 5 μL 1x PBS och överför sedan till 25 μL lyslösning individuellt.
    3. Slipa midguts, PSGs och äggstockar prover som beskrivs i steg 1.2.2.
    4. Samla 8 μL hemolymph med 1x PBS i ett PCR-rör och tillsätt sedan 10 μl lyslösning. Blanda ordentligt.
  3. Extrahera DNA från alla prover enligt beskrivningen i 1.2.3.
  4. Förbered två separata qPCR-masterblandningar (18 μL vardera) för TYLCV och den interna kontrollen(β-aktingen) enligt följande: 10 μl SYBR Green mix, 0,8 μL av varje primer (10 μM vardera) och 6,4 μL dubbeldestillerat vatten per reaktion. För TYLCV, den främre primer sekvensen är 5′-GAAGCGACCAGGCGATATAA-3" och den omvända primer sekvensen är 5′-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3". För β-aktin, den främre primer sekvensen är 5′-TCTTCCAGCCATCCTCtTG-3" och den omvända primer sekvensen är 5′-CGGTGATTTCCTTCTGCATT-3".
  5. Fördela 18 μL av mastermixen i injektionsflaskor av qPCR-bandrör eller en 96 brunnsplatta. Tillsätt sedan 2 μL av DNA-proverna i varje injektionsflaskor. Utför alla reaktioner med minst tre tekniska replikat och tre biologiska replikat.
    OBS: Steg 4.5 ska utföras på is.
  6. Stäng qPCR-rören eller försegla 96 brunnsplattorna med självhäftande plåttätning.
  7. Centrifugför att samla in vätskan längst ner på qPCR rör eller 96 brunn tallrik.
  8. Placera rören eller plattan i värmeväxlaren i realtid och utför qPCR.
    1. Utför qPCR med följande cykelparametrar: 95 °C för 30 s, följt av 40 cykler av 95 °C för 5 s och 60 °C för 34 s för primerglödgning och förlängning, 1 cykel vid 95 °C för 15 s, vilket slutar med ett smältningskurvasteg på 60 °C till 95 °C med ett ökningsvärde på 0,5 °C per 15 s.
    2. Välj SYBR som fluorofforsfärgämne och okänd som exempeltyp.
  9. Exportera kvantitativa data till ett kalkylbladsformat och analysera den relativa mängden virus-DNA med metoden 2−ΔΔCT 28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

MEAM1-whitefliesna av B. tabacikomplexoch TYLCV användes som ett exempel här för att beskriva tillvägagångssätten. Översikten över de immunfluorescens- och viruskvantifieringsförfaranden som beskrivs i detta manuskript visas i figur 1. Figur 2 visar representativa resultat av immunofluorescensdetektion av TYLCV och DAPI-färgning i PSGs, midguts och äggstockar, vilket tyder på att TYLCV ackumulerade mer i PSG:erna och midguts, och mindre i äggstockarna. Figur 3 visar den relativa mängden virus i whitefly PSGs, midguts, hemolymph, och äggstockar efter whiteflies matas på TYLCV-infekterade tomat för 24, 48 och 72 h, vilket tyder på att mängden virus ökade i olika whitefly vävnader med ökningen av förvärv tillgångsperioden.

Figure 1
Bild 1: Översikt över de protokoll som presenteras i det här dokumentet. (A)Experimentella förfaranden för immunfluorescens i whitefly midguts, PSGs och äggstockar. Vävnader samlades in från TYLCV-infekterade vuxna kvinnliga vitflugor, följt av en rad fixering, permeabilisering, blockering, inkubationsmed primära antikroppar som binder till en TYLCV päls protein, och fluorokrome-konjugerade sekundära antikroppar som binder till de primära antikropparna. Slutligen analyserades prover under ett konfokalmikroskop, vilket möjliggör förvärv av bilder. (B)Experimentellt förfarande för kvantifiering av virus i whitefly midguts, PSGs, äggstockar och hemolymph. Vävnader samlades in från TYLCV-infekterade vuxna kvinnliga vitflugor, och sedan DNA-extraktion utfördes. qPCR utfördes på ett PCR-instrument i realtid, vilket möjliggör förvärv av data som senare kan analyseras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Immunofluorescence upptäckt av TYLCV i de primära spottkörtlarna, midguts och äggstockarna av kvinnliga vuxna vitflugor efter en 48 h virus förvärv sett till tillträdesperioden. Whiteflies fick livnära sig på TYLCV-infekterade tomatplantor för 48 h, och sedan 20 PSGs, 20 midguts, och 20 äggstockar var dissekerade och samlas in. Därefter fastställdes prover i 4% formaldehyd, permeabilized i 0,5% Triton X-100, blockeras i 1% BSA, och sedan ruvade med mus anti-TYLCV monoklonala antikroppar (MAb 1C4 mot TYLCV päls protein)24 och get anti-mus sekundära antikroppar konjugerade till en röd fluorescerande färgämne (dvs. Dylight 549). Nuclei var färgade med DAPI (blå). Immunofluorescenssignaler undersöktes under ett konfokalmikroskop. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Kvantifiering av TYLCV DNA i midguts, hemolymph, primära spottkörtlar och äggstockar i MEAM1 whiteflies. Vuxen matas på TYLCV-infekterade tomatplantor för 24, 48 och 72 h, och sedan whitefly midguts, hemolymph, PSGs och äggstockar dissekerades och samlades in. Därefter utfördes utvinning av DNA och qPCR för midguts(A), hemolymph (B), PSGs(C),och äggstockar(D). Data normaliserades först till whitefly β-actin DNA, och därefter normaliserades den relativa mängden virus som erhölls igen till det på 24 h. NV: Non-viruliferous. Data presenteras som medelvärdet ± SEM av relativ mängd virus. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här beskriver vi ett protokoll för lokalisering och kvantifiering av ett begomovirus i vävnaderna i sin whitefly vektor av immunofluorescens och qPCR. Dissekering representerar det första steget för att lokalisera och kvantifiera viruset i whitefly vävnader. Den whitefly kroppen är ca 1 mm i längd, vilket innebär att vävnaderna är extremt små, och det är svårt att dissekera dem. Dessutom finns det starka kopplingar mellan vävnaderna. Äggstockarna är till exempel tätt kopplade till bakteriocyterna, vilket gör dem svåra att isolera. Här, med tanke på egenskaperna och platserna för de olika vävnaderna, beskriver vi olika metoder för dissekering. Det krävs dock en hel del praxis för att snabbt och exakt dissekera dessa vävnader. Dessutom är det bäst att använda färska whiteflies, eftersom döda insekter skulle öka svårigheten att dissekera. Dessutom måste postdissekering, vävnader rengöras för att undvika kontaminering.

Immunofluorescenstekniken baseras på användning av specifika antikroppar. En lämplig arbetskoncentration för varje antikropp är mycket viktig i bildbehandling, eftersom en hög koncentration av antikroppar minskar signal-till-bakgrundsförhållandet och en låg koncentration kanske inte ger tillräcklig signal. Här använde vi en utspädning på 1:400 för både primära antikroppar och andra antikroppar. Dessa antikroppar bör delas in i små alikvoter och hållas vid -20 °C för att undvika upprepad frysning och upptining. Antikroppsutspädningarna ska beredas precis före användning. När det protokoll som beskrivs här används för att kolokalisera virus- och vitfluga proteiner är det viktigt att de primära antikropparna mot virus- och vitfluga proteiner produceras hos djur av olika arter. Dessutom bör fluorofforerna hos de sekundära antikropparna väljas noggrant för att förhindra utfall mellan kanaler. Med tanke på den lilla storleken på whitefly vävnader, bör de alltid tvättas under mikroskopför att undvika förlust. Även om immunofluorescens är mycket känslig, är det relativt mer tidskrävande och kostsamt jämfört med andra metoder virusplats såsom fluorescens i situ Hybridiseringar (FISH). Dessutom kan antikroppar mot begomovirus inte vara tillgängliga för köp.

Nyckeln till framgångsrik tillämpning av qPCR för kvantifiering av viruset i whitefly vävnader ligger i utformningen av lämpliga primers och urval av endogena referensgener. Rodríguez et al. beskrev kriterierna för att utforma qPCR primers i detalj25, som också gäller i utformningen av virus primers. I denna studie valdes β-actin som referensgen för viruskvantifiering i vitfluga vävnader. I vissa fall (t.ex. RNA-gener) bör dock andra endogena gener användas som referensgener om de är lämpliga för den experimentella designen29. För att få stabila och korrekta resultat bör vitflugor av samma utvecklingsstadium användas, eftersom vitflugor av olika utvecklingsstadier har differentialkapacitet för att förvärva och överföra virus22. Dessutom, medan vi använde 20 PSGs eller midguts som ett prov, använde vi en hemolymph samlas in från en whitefly som ett prov för qPCR analys. Detta beror på det faktum att insamlingen av hemolymph är tidskrävande och DNA av hemolymph prover är sårbara för nedbrytning om inte bearbetas i tid. Detta protokoll kan också användas för att kvantifiera mängden virus i whitefly hela kroppen och virus-infekterade växter.

Sammanfattningsvis beskriver vi ett effektivt och känsligt protokoll för att lokalisera och kvantifiera begomovirus i whitefly vävnader genom immunofluorescens och qPCR, respektive. Detta protokoll kan också anpassas för lokalisering och kvantifiering av andra begomovirus. Dessutom kan protokollet om immunfluorescens användas för att kolokalisera virala och vita fly proteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av National Key Research and Development Program (Bidragsnummer: 2017YFD0200600), den öronmärkta fonden för China Agriculture Research System (bidragsnummer: CARS-23-D07) och Bill & Melinda Gates Foundation (Investment ID OPP11497777 ). Vi tackar professor Jian-Xiang Wu för att ge TYLCV CP antikroppar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% Paraformaldehyde MultiSciences F0001
4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) Abcam ab104139
Bovine Serum Albumin (BSA) MultiSciences A3828
CFX Connect Real-Time PCR Detection System Bio-RAD 185-5201
Confocal microscopy Zeiss LSM800
Dylight 549-goat anti-mouse Earthox E032310-02 Secondary antibody
Monoclonal antibody (MAb 1C4) Primary antibody
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sangon Biotech B548119-0500
Stereo microscope Zeiss Stemi 2000-C
TB green premix Ex Taq (Tli RNase H Plus) TaKaRa RR820A qPCR master mix
Thermocycler Thermofisher A41182
Tissuelyzer Shaghai jingxin Tissuelyser-48
Triton-X-100 BBI life sciences 9002-93-1
Tween 20 BBI life sciences 9005-64-5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rojas, M. R., et al. World management of geminiviruses. Annual Review of Phytopathology. 56, 637-677 (2018).
  2. De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).
  3. Navas-Castillo, J., Fiallo-Olive, E., Sanchez-Campos, S. Emerging virus diseases transmitted by whiteflies. Annual Review of Phytopathology. 49, 219-248 (2011).
  4. Liu, J., et al. Viral infection of tobacco plants improves performance of Bemisia tabaci but more so for an invasive than for an indigenous biotype of the whitefly. Journal of Zhejiang University-Science B. 11 (1), 30-40 (2010).
  5. Legarrea, S., Barman, A., Marchant, W., Diffie, S., Srinivasan, R. Temporal effects of a begomovirus infection and host plant resistance on the preference and development of an insect vector, Bemisia tabaci, and implications for epidemics. PLoS One. 10 (11), 0142114 (2015).
  6. Fang, Y., et al. Tomato yellow leaf curl virus alters the host preferences of its vector Bemisia tabaci. Scientific Reports. 3, 2876 (2013).
  7. Guo, T., et al. Comparison of transmission of papaya leaf curl China virus among four cryptic species of the whitefly Bemisia tabaci complex. Scientific Reports. 5, 15432 (2015).
  8. Pan, L. L., et al. Differential efficiency of a begomovirus to cross the midgut of different species of whiteflies results in variation of virus transmission by the vectors. Science China-Life Sciences. 61 (10), 1254-1265 (2018).
  9. Pan, L. L., Cui, X. Y., Chen, Q. F., Wang, X. W., Liu, S. S. Cotton leaf curl disease: which whitefly is the vector. Phytopathology. 108 (10), 1172-1183 (2018).
  10. Fiallo-Olive, E., Pan, L. L., Liu, S. S., Navas-Castillo, J. Transmission of begomoviruses and other whitefly-borne viruses: dependence on the vector species. Phytopathology. , (2019).
  11. Cohen, S., Nitzany, F. E. Transmission and host range of the tomato yellow leaf curl virus. Phytopathology. 56, 1127-1131 (1966).
  12. Moriones, E., Navas-Castillo, J. Tomato yellow leaf curl virus, an emerging virus complex causing epidemics worldwide. Virus Research. 71 (1-2), 123-134 (2000).
  13. Ghanim, M. A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector. Virus Research. 186, 47-54 (2014).
  14. Navot, N., Pichersky, E., Zeidan, M., Zamir, D., Czosnek, H. Tomato yellow leaf curl virus - a whitefly-transmitted geminivirus with a single genomic component. Virology. 185 (1), 151-161 (1991).
  15. Sanchez-Campos, S., et al. Tomato yellow leaf curl virus: No evidence for replication in the insect vector Bemisia tabaci. Scientific Reports. 6, 30942 (2016).
  16. Pakkianathan, B. C., et al. Replication of tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector, Bemisia tabaci. Journal of Virology. 89 (19), 9791-9803 (2015).
  17. Rodriguez-Negrete, E. A., et al. A sensitive method for the quantification of virion-sense and complementary-sense DNA strands of circular single-stranded DNA viruses. Scientific Reports. 4, 6438 (2014).
  18. Gotz, M., et al. Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions. Journal of Virology. 86 (24), 13241-13252 (2012).
  19. Zhao, J., Chi, Y., Zhang, X. J., Wang, X. W., Liu, S. S. Implication of whitefly vesicle associated membrane protein-associated protein B in the transmission of Tomato yellow leaf curl virus. Virology. 535, 210-217 (2019).
  20. Maluta, N. K., Garzo, E., Moreno, A., Lopes, J. R., Fereres, A. Tomato yellow leaf curl virus benefits population growth of the Q biotype of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae). Neotropical Entomology. 43 (4), 385-392 (2014).
  21. Czosnek, H., Hariton-Shalev, A., Sobol, I., Gorovits, R., Ghanim, M. The incredible journey of begomoviruses in their whitefly vector. Viruses. 9 (10), 273 (2017).
  22. Wei, J., et al. Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).
  23. Ghanim, M., Morin, S., Zeidan, M., Czosnek, H. Evidence for transovarial transmission of tomato yellow leaf curl virus by its vector, the whitefly Bemisia tabaci. Virology. 240 (2), 295-303 (1998).
  24. Xie, Y., et al. Highly sensitive serological methods for detecting tomato yellow leaf curl virus in tomato plants and whiteflies. Virology Journal. 10, 142 (2013).
  25. Arya, M., et al. Basic principles of real-time quantitative PCR. Expert Review of Molecular Diagnostics. 5 (2), 209-219 (2005).
  26. Wei, J., et al. Specific cells in the primary salivary glands of the whitefly Bemisia tabaci control retention and transmission of begomoviruses. Journal of Virology. 88 (22), 13460-13468 (2014).
  27. Wang, L. L., et al. The autophagy pathway participates in resistance to tomato yellow leaf curl virus infection in whiteflies. Autophagy. 12 (9), 1560-1574 (2016).
  28. Arocho, A., Chen, B. Y., Ladanyi, M., Pan, Q. L. Validation of the 2(-Delta Delta Ct) calculation as an alternate method of data analysis for quantitative PCR of BCR-ABL P210 transcripts. Diagnostic Molecular Pathology. 15 (1), 56-61 (2006).
  29. Li, R., et al. Reference gene selection for qRT-PCR analysis in the sweetpotato whitefly, Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae). PLoS One. 8 (1), 53006 (2013).

Tags

Immunologi och infektion Utgåva 156 immunofluorescens kvantitativ PCR Bemisia tabaci Tomat gula blad curl virus,dissekering primära salivary körtel midgut
Lokalisering och kvantifiering av begomovirus i Whitefly Vävnader av Immunofluorescens och kvantitativ pcr
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ban, F. X., Yin, T. Y., Guo, Q.,More

Ban, F. X., Yin, T. Y., Guo, Q., Pan, L. L., Liu, Y. Q., Wang, X. W. Localization and Quantification of Begomoviruses in Whitefly Tissues by Immunofluorescence and Quantitative PCR. J. Vis. Exp. (156), e60731, doi:10.3791/60731 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter