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Biochemistry

कोलेस्ट्रॉल के साथ स्तनधारी ऊतकों और ज़ेनोपस ओसाइट्स का संवर्धन

Published: March 25, 2020 doi: 10.3791/60734
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2
1Department of Pharmacology, Addiction Science and Toxicology, The University of Tennessee HSC, 2Department of Chemistry, University of Illinois at Chicago

Summary

कोलेस्ट्रॉल संवर्धन के दो तरीके प्रस्तुत किए जाते हैं: स्तनधारी ऊतकों और कोशिकाओं को समृद्ध करने के लिए कोलेस्ट्रॉल के साथ संतृप्त साइक्लोडेक्स्ट्रिन का अनुप्रयोग, और ज़ेनोपस ओसाइट्स को समृद्ध करने के लिए कोलेस्ट्रॉल-समृद्ध फॉस्फोलिपिड-आधारित फैलाव (लिपोसोम) का उपयोग। ये विधियां आणविक, सेलुलर और अंग समारोह में ऊंचा कोलेस्ट्रॉल के स्तर के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं।

Abstract

कोशिका समारोह का अध्ययन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले ज़ेनोपस ओसाइट्स सहित स्तनधारी ऊतकों और कोशिकाओं का कोलेस्ट्रॉल संवर्धन विभिन्न तरीकों का उपयोग करके पूरा किया जा सकता है। यहां, हम इस उद्देश्य के लिए उपयोग किए जाने वाले दो महत्वपूर्ण दृष्टिकोणों का वर्णन करते हैं। सबसे पहले, हम उदाहरण के रूप में सेरेब्रल धमनियों (ऊतकों) और हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स (कोशिकाओं) का उपयोग कर कोलेस्ट्रॉल के साथ संतृप्त साइक्लोडेक्स्ट्रिन का उपयोग करकोलेस्ट्रॉल के साथ ऊतकों और कोशिकाओं को समृद्ध करने का वर्णन करते हैं। इस दृष्टिकोण का उपयोग किसी भी प्रकार के ऊतक, कोशिकाओं या सेल लाइनों के लिए किया जा सकता है। कोलेस्ट्रॉल संवर्धन के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण में कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (एलडीएल) का उपयोग शामिल है। इस दृष्टिकोण का लाभ यह है कि यह कोशिका के प्राकृतिक कोलेस्ट्रॉल होमोस्टोसिस मशीनरी के हिस्से का उपयोग करता है। हालांकि, जबकि साइक्लोडेक्सट्रिन दृष्टिकोण कोलेस्ट्रॉल के साथ किसी भी सेल प्रकार के ब्याज को समृद्ध करने के लिए लागू किया जा सकता है, एलडीएल दृष्टिकोण उन कोशिकाओं तक सीमित है जो एलडीएल रिसेप्टर्स (जैसे, यकृत कोशिकाओं, बोन मैरो-व्युत्पन्न कोशिकाओं जैसे रक्त ल्यूकोसाइट्स और ऊतक मैक्रोफेज) व्यक्त करते हैं, और संवर्धन का स्तर एलडीएल रिसेप्टर की एकाग्रता और गतिशीलता पर निर्भर करता है। इसके अलावा, एलडीएल कणों में अन्य लिपिड शामिल हैं, इसलिए कोलेस्ट्रॉल डिलीवरी गैर-विशिष्ट है। दूसरा, हम वर्णन करते हैं कि फॉस्फोलिपिड आधारित फैलाव (यानी, लिपोसोम्स) का उपयोग करके कोलेस्ट्रॉल के साथ ज़ेनोपस ओसाइट्स को कैसे समृद्ध किया जाए जिसमें कोलेस्ट्रॉल शामिल है। ज़ेनोपस ओसाइट्स सेल और प्रोटीन फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए उपयोग की जाने वाली एक लोकप्रिय विषमलोगोस अभिव्यक्ति प्रणाली का गठन करता है। स्तनधारी ऊतक (सेरेब्रल धमनियों) के साइक्लोडेक्सट्रिन आधारित कोलेस्ट्रॉल संवर्धन दृष्टिकोण और ज़ेनोपस ओसाइट्स के फॉस्फोलिपिड आधारित कोलेस्ट्रॉल संवर्धन दृष्टिकोण के लिए, हम यह प्रदर्शित करते हैं कि कोलेस्ट्रॉल का स्तर ऊष्मायन के 5 मिन के बाद अधिकतम तक पहुंचता है। कोलेस्ट्रॉल का यह स्तर ऊष्मायन (जैसे, 60 ग्राम) की विस्तारित अवधि के दौरान स्थिर रहता है। साथ में, ये डेटा कोलेस्ट्रॉल संवर्धन के प्रभाव से पूछताछ करने के उद्देश्य से कार्यात्मक अध्ययनों के लिए ऊतकों, कोशिकाओं और ज़ेनोपस ओसाइट्स के कोलेस्ट्रॉल संवर्धन के लिए अनुकूलित लौकिक स्थितियों का आधार प्रदान करते हैं।

Introduction

कोलेस्ट्रॉल, एक प्रमुख सेलुलर लिपिड, कई महत्वपूर्ण कार्यात्मक और संरचनात्मक भूमिकाओं1,2,,3,,44,5,,6,,7,,8,99निभाता है । प्लाज्मा झिल्ली के भौतिक गुणों को विनियमित करने से लेकर कोशिका व्यवहार्यता, विकास, प्रसार और जैव रासायनिक रास्तों की अधिकता में सिग्नलिंग और अग्रदूत अणु के रूप में सेवा करने के लिए, कोलेस्ट्रॉल सामान्य कोशिका और अंग कार्य के लिए आवश्यक एक अनिवार्य घटक है। नतीजतन, कोलेस्ट्रॉल की कमी के परिणामस्वरूप गंभीर शारीरिक विकृतियां और कई प्रकार के विकार होते हैं। दूसरी ओर, शारीरिक स्तर (2-3x) से ऊपर कोलेस्ट्रॉल में थोड़ी वृद्धि साइटोटॉक्सिक1,,2,,10 है और हृदय11,12,,13 और न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों14,,15,,16,,,17सहित विकारों के विकास से जुड़ी हुई है। इस प्रकार, कोलेस्ट्रॉल के महत्वपूर्ण कार्यों से पूछताछ करने और कोलेस्ट्रॉल के स्तर में परिवर्तन के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए, ऊतकों, कोशिकाओं और ज़ेनोपस ओसाइट्स में कोलेस्ट्रॉल की सामग्री को बदलने वाले विभिन्न दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं।

स्तनधारी ऊतकों और कोशिकाओं में कोलेस्ट्रॉल के स्तर में परिवर्तन
ऊतकों और कोशिकाओं में कोलेस्ट्रॉल के स्तर को कम करने के लिए कई दृष्टिकोणों का उपयोग किया जा सकता है। एक दृष्टिकोण में एचएमजी-सीओए रिक्टेज़ को बाधित करने के लिए लिपोप्रोटीन-कमी सीरम में भंग किए गए स्टेटिन के संपर्क में शामिल है, जो कोलेस्ट्रॉल संश्लेषण19,,20की दर को नियंत्रित करता है। हालांकि, ये कोलेस्ट्रॉल कम करने वाली दवाएं मेवालोनाइट पाथवे के साथ गैर-स्टेरोल उत्पादों के गठन को भी रोकती हैं। इसलिए, इन उत्पादों21 के गठन की अनुमति देने और इस दृष्टिकोण की विशिष्टता को बढ़ाने के लिए थोड़ी मात्रा में मेवालोनेट जोड़ा जाता है। कोलेस्ट्रॉल के स्तर को कम करने के लिए एक और दृष्टिकोण में साइक्लोडेक्सट्रिन का उपयोग शामिल है। इन ग्लूकॉपीरनोस मोनोमर में एक आंतरिक हाइड्रोफोबिक गुहा होता है जो एक व्यास के साथ होता है जो स्टेरोल22के आकार से मेल खाता है, जो कोशिकाओं से कोलेस्ट्रॉल निकालने की सुविधा प्रदान करता है, जिससे उन्हें उनके देशी कोलेस्ट्रॉल सामग्री23से कम हो जाता है। एक उदाहरण 2-हाइड्रोक्सीप्रोपिल-साइक्लोडेक्सट्रिन (एचपीईडीडी) है, जो वर्तमान में निमान-पिक टाइप सी रोग के उपचार के लिए परीक्षण किया जा रहा है, जो आनुवंशिक रूप से विरासत में मिली घातक मेटाबोलिक विकार है जो24। कोलेस्ट्रॉल की कमी का स्तर उपयोग किए जाने वाले विशिष्ट व्युत्पन्न पर निर्भर करता है। उदाहरण के लिए, एचपीपीसीडी मिथाइलडेटिव, मिथाइल-साइक्लोडेक्सट्रिन (एमसीडी)24,,25,,26,,27,,28,,29,,30की तुलना में कम क्षमता वाले कोलेस्ट्रॉल को निकालता है। विशेष रूप से, हालांकि, कोलेस्ट्रॉल के अलावा अन्य हाइड्रोफोबिक अणुओं को भी निकाल सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप31गैर-विशिष्ट प्रभाव हो सकते हैं। कमी के विपरीत, कोशिकाओं और ऊतकों को विशेष रूप से कोलेस्ट्रॉल के साथ उपचार के माध्यम से कोलेस्ट्रॉल के साथ समृद्ध किया जा सकता है जिसे कोलेस्ट्रॉल23के साथ पूर्वसंतृप्त किया गया है। इस दृष्टिकोण का उपयोग कोलेस्ट्रॉल की कमी31के लिए उपयोग किए जाने वाले साइक्लोडेक्सट्रिन की विशिष्टता के लिए नियंत्रण के रूप में भी किया जा सकता है। ऊतकों और कोशिकाओं से कोलेस्ट्रॉल की कमी सीधी है और कोशिकाओं के भंडारण के लिए उपयोग किए जाने वाले माध्यम में भंग 5 एमएम एमसीडी के लिए कोशिकाओं को उजागर करके प्राप्त किया जा सकता है। इस दृष्टिकोण के परिणामस्वरूप कोलेस्ट्रॉल की मात्रा में 50% की कमी हो सकती है (उदाहरण के लिए, हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स32,चूहा मस्तिष्क धमनियों33)में। दूसरी ओर, ऊतक और कोशिकाओं के कोलेस्ट्रॉल संवर्धन के लिए साइक्लोडेक्सट्रिन-कोलेस्ट्रॉल कॉम्प्लेक्स तैयार करना अधिक जटिल है, और प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित किया जाएगा।

कोलेस्ट्रॉल से संतृप्त ऊतकों और कोशिकाओं को समृद्ध करने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण में एलडीएल का उपयोग शामिल है, जो ऊतकों/कोशिकाओं18में व्यक्त एलडीएल रिसेप्टर्स पर निर्भर करता है । हालांकि यह दृष्टिकोण कोशिका के प्राकृतिक कोलेस्ट्रॉल होमोस्टोसिस मशीनरी का उपयोग करने का लाभ प्रदान करता है, इसकी कई सीमाएं हैं। सबसे पहले, ऊतकों और कोशिकाओं है कि एलडीएल रिसेप्टर व्यक्त नहीं करते इस दृष्टिकोण का उपयोग कर समृद्ध नहीं किया जा सकता है । दूसरा, एलडीएल कणों में कोलेस्ट्रॉल के अलावा अन्य लिपिड होते हैं। विशेष रूप से, एलडीएल में प्रोटीन एपीओबी100 (25%) शामिल है और निम्नलिखित लिपिड (75%): ~ 6-8% कोलेस्ट्रॉल, ~ 45-50% कोलेस्टेरिल एस्टर, ~ 18-24% फॉस्फोलिपिड, और34~ 4-8% ट्रायसिलग्लिसॉल34. इस प्रकार, एलडीएल कणों के माध्यम से कोलेस्ट्रॉल की डिलीवरी गैर विशिष्ट है। तीसरा, एलडीएल रिसेप्टर को व्यक्त करने वाले ऊतकों और कोशिकाओं में एलडीएल द्वारा कोलेस्ट्रॉल की मात्रा में वृद्धि का प्रतिशत कोलेस्ट्रॉल के साथ संतृप्त साइक्लोडेक्सट्रिन का उपयोग करके देखी गई वृद्धि से काफी कम हो सकता है। उदाहरण के लिए, पिछले अध्ययन में, एलडीएल के माध्यम से कोलेस्ट्रॉल के साथ कृंतक मस्तिष्क धमनियों के संवर्धन के परिणामस्वरूप कोलेस्ट्रॉल के स्तर में केवल 10-15% की वृद्धिहुई 35। इसके विपरीत, प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित कोलेस्ट्रॉल के साथ संतृप्त साइक्लोडेक्सट्रिन के साथ इन धमनियों के संवर्धन के परिणामस्वरूप कोलेस्ट्रॉल सामग्री में 50% की वृद्धि हुई (प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग देखें, चित्रा 1)।

ज़ेनोपस ओसाइट्स में कोलेस्ट्रॉल के स्तर में परिवर्तन
ज़ेनोपस ओसाइट्स आमतौर पर कोशिका और प्रोटीन फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए उपयोग की जाने वाली हेटेरोलोगस अभिव्यक्ति प्रणाली का गठन करता है। इससे पहले के अध्ययनों से पता चला है कि ज़ेनोपस ओसाइट्स में फॉस्फोलिपिड मोलर अनुपात में कोलेस्ट्रॉल 0.5 ± 0.136है। कोलेस्ट्रॉल के इस आंतरिक उच्च स्तर के कारण, इस प्रणाली में कोलेस्ट्रॉल की सामग्री में वृद्धि चुनौतीपूर्ण है, फिर भी झिल्ली फॉस्फोलिपिड और कोलेस्ट्रॉल से बने फैलाव का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। इस उद्देश्य के लिए हमने जो फॉस्फोलिपिड्स चुना है, वे कृत्रिम प्लानर लिपिड बाइलेयर बनाने के लिए उपयोग किए जाने वाले लोगों के समान हैं और इसमें एल-α-फॉस्फेटिटिलॉयडथेनॉलमाइन (पोप) और 1-पामोलिटोइल-2-ओलियोइल-एसएन-ग्लीसेरो-3-फॉस्फो-एल-सेरीन (चबूतरे) शामिल हैं, जैसा कि प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित है। इस दृष्टिकोण के परिणामस्वरूप कोलेस्ट्रॉल की मात्रा में 50% की वृद्धि हो सकती है (प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग देखें, चित्रा 2)।

फॉस्फोलिपिड आधारित फैलाव के साथ ज़ेनोपस ओसाइट्स को समृद्ध करने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण में कोलेस्ट्रॉल के साथ संतृप्त साइक्लोडेक्सट्रिन का उपयोग शामिल है, जो ऊतकों और कोशिकाओं को समृद्ध करने के तरीके के समान है। हालांकि, हमने कोलेस्ट्रॉल की मात्रा में औसतन ~ 25% की वृद्धि के साथ कम प्रजनन क्षमता और दक्षता के इस दृष्टिकोण को पाया है। यह संभवतः इन दो दृष्टिकोणों की विभिन्न लोडिंग क्षमता (प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग, चित्रा 3देखें) के कारण है। इसके विपरीत, यह दिखाया गया है कि ज़ेनोपस ओसाइट्स से कोलेस्ट्रॉल को कम करने के लिए साइक्लोडेक्सट्रिन का उपयोग करने से कोलेस्ट्रॉल की मात्रा36में ~ 40% की कमी हो सकती है।

यहां, हम कोलेस्ट्रॉल से संतृप्त साइक्लोडेक्सट्रिन के आवेदन के माध्यम से स्तनधारी ऊतकों और कोशिकाओं के कोलेस्ट्रॉल संवर्धन पर ध्यान केंद्रित करते हैं, और लिपोसोम का उपयोग करके ज़ेनोपस ओसाइट्स। दोनों दृष्टिकोणों का उपयोग प्रोटीन फ़ंक्शन पर कोलेस्ट्रॉल के बढ़े हुए स्तर के प्रभाव को रेखांकित करने के लिए किया जा सकता है। प्रोटीन फ़ंक्शन के कोलेस्ट्रॉल मॉड्यूलेशन के तंत्र में प्रत्यक्ष बातचीत8 और/या अप्रत्यक्ष प्रभाव9शामिल हो सकते हैं । जब कोलेस्ट्रॉल प्रत्यक्ष बातचीत के माध्यम से प्रोटीन समारोह को प्रभावित करता है, प्रोटीन गतिविधि पर कोलेस्ट्रॉल के स्तर में वृद्धि का प्रभाव सेल प्रकार, अभिव्यक्ति प्रणाली, या संवर्धन दृष्टिकोण से स्वतंत्र होने की संभावना है । उदाहरण के लिए, हमने इन दो दृष्टिकोणों का उपयोग जी-प्रोटीन गेटेड पर कोलेस्ट्रॉल के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए किया, जो एट्रियल माइओसाइट्स37,हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स32,,38,हेक29339 कोशिकाओं और ज़ेनोपस ओसाइट्स32,,37में व्यक्त किए गए थे। इन अध्ययनों में प्राप्त परिणाम सुसंगत थे: सभी तीन प्रकार की स्तनधारी कोशिकाओं में और उभयचर ओसाइट्स में कोलेस्ट्रॉल अपरेटिव गिर्क चैनल फ़ंक्शन (रिप्रेजेंटेटिव परिणाम अनुभाग देखें, चित्रा 4,हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स के लिए और ज़ेनोपस ओसाइट्स में इसी प्रयोग)। इसके अलावा, इन अध्ययनों में की गई टिप्पणियां एट्रियल माइओसाइट्स37,,40 और हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स32,,38 ताजा जानवरों से अलग-थलग अध्ययनों के परिणामों के अनुरूप थीं जो उच्च कोलेस्ट्रॉल आहार40के अधीन हैं। विशेष रूप से, MοCD का उपयोग करहिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स के कोलेस्ट्रॉल संवर्धन ने कोलेस्ट्रॉल के स्तर और गिरक फ़ंक्शन38दोनों पर उच्च कोलेस्ट्रॉल आहार के प्रभाव को संबोधित करने के लिए उपयोग की जाने वाली एटोरवास्टिन थेरेपी के प्रभाव को उलट दिया। अन्य अध्ययनों में, हमने ज़ेनोपस ओसाइट्स और हेक293 कोशिकाओं41का उपयोग करके अंदर सुधारपोटियम चैनल किर2.1 की कोलेस्ट्रॉल संवेदनशीलता पर उत्परिवर्तनों के प्रभाव की जांच की। फिर, चैनल की संवेदनशीलता पर म्यूटेशन का प्रभाव दो प्रणालियों में समान था।

आणविक, सेलुलर और अंग समारोह पर ऊंचा कोलेस्ट्रॉल के स्तर के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए दोनों संवर्धन विधियों के अनुप्रयोग कई हैं। विशेष रूप से, कोशिकाओं और ऊतकों को समृद्ध करने के लिए साइक्लोडेक्सट्रिन-कोलेस्ट्रॉल परिसरों का उपयोग काफी हद तक इसकी विशिष्टता के कारण बहुत आम है। इस दृष्टिकोण के हालिया उदाहरणों में हर्ग चैनल सक्रियण और अंतर्निहित तंत्र42पर कोलेस्ट्रॉल के प्रभाव का निर्धारण शामिल है , यह खोज कि कोलेस्ट्रॉल जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर को सक्रिय करता है जो हेजहॉग सिग्नलिंग43को बढ़ावा देने के लिए चिकना होजाता है, और झिल्ली से जुड़े लिंकर प्रोटीन44के माध्यम से स्टेम सेल बायोमैकेनिक्स और एडिपोजेनेसिस में कोलेस्ट्रॉल की भूमिका की पहचान करता है। अपने काम में, हमने एमएमसीडी के साथ स्तनधारी ऊतक संवर्धन का उपयोग किया: कोलेस्ट्रॉल परिसर बुनियादी कार्य पर कोलेस्ट्रॉल संवर्धन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए और कैल्शियम के औषधीय प्रोफ़ाइल- और बड़े आचरण के वोल्टेज-गेटेड चैनल (बीके, मैक्सीके) संवहनी चिकनी मांसपेशी35,,45,,46में। अन्य अध्ययनों में, हमने कोलेस्ट्रॉल के साथ ज़ेनोपस ओसाइट्स को समृद्ध करने के लिए फॉस्फोलिपिड आधारित फैलाव दृष्टिकोण का उपयोग किया ताकि कोलेस्ट्रॉल संवेदनशीलता41,,47,,48,,49में किर2.1 और गिरक चैनलों में विभिन्न क्षेत्रों की भूमिकाओं का निर्धारण किया जा सके, साथ ही इनचैनलों 32,50,,51में ख्यात कोलेस्ट्रॉल बाध्यकारी साइटों का निर्धारण किया जा सके।,

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Protocol

जानवरों के साथ सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं टेनेसी स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र (UTHSC) के विश्वविद्यालय में प्रदर्शन किया गया । जानवरों की देखभाल और प्रायोगिक प्रोटोकॉल की समीक्षा की गई और यूटीएचएससी की एनिमल केयर एंड यूज कमेटी द्वारा अनुमोदित किया गया, जो प्रयोगशाला एनिमल केयर इंटरनेशनल के मूल्यांकन और प्रत्यायन के लिए एसोसिएशन द्वारा मान्यता प्राप्त संस्था है ।

1. कोलेस्ट्रॉल के साथ संतृप्त मिथाइल-साइक्लोडेक्सट्रिन का उपयोग करके ऊतकों और कोशिकाओं का संवर्धन

नोट: नीचे कोलेस्ट्रॉल संवर्धन प्रोटोकॉल ऊतकों, कोशिकाओं और सेल लाइनों के लिए उपयुक्त है। एक उदाहरण के रूप में, हम स्तनधारी मस्तिष्क धमनियों को समृद्ध करने के लिए किए गए कदमों का वर्णन करते हैं। प्रतिनिधि परिणाम दोनों मस्तिष्क धमनियों(चित्रा 1)और न्यूरॉन्स(चित्रा 4)के लिए प्रदान की जाती हैं ।

  1. कोलेस्ट्रॉल के साथ संतृप्त MοCD की तैयारी
    1. MοCD के 0.064 ग्राम वजन और यह फॉस्फेट के 10 मिलीग्राम युक्त एक फ्लास्क में भंग-बफर खारा (PBS) समाधान 5 mM MοCD की एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए। यह सुनिश्चित करने के लिए कि MtheCD पूरी तरह से भंग हो गया है एक हलचल बार के साथ समाधान हिलाओ।
    2. कोलेस्ट्रॉल पाउडर के 0.0024 ग्राम वजन और यह एक ही फलक में जोड़ने के लिए एक 0.63 m कोलेस्ट्रॉल एकाग्रता प्राप्त करने के लिए। फिर समाधान को जोर-शोर से हिलाएं। संभव के रूप में कई कोलेस्ट्रॉल हिस्सा के रूप में तोड़ने के लिए एक स्पैटुला का प्रयोग करें (कुछ हिस्सा ऊष्मायन तक रहेगा) ।
    3. पराफिन फिल्म की कम से कम दो परतों के साथ फ्लास्क को कवर करें और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में धीरे-धीरे हिलाएं (~ 30 दोलन/मिन)। यह कदम महत्वपूर्ण है ।
    4. 8-16 घंटे के बाद, कमरे के तापमान (आरटी) के समाधान को ठंडा करें, और फिर इसे 0.22 माइक्रोन पोलेथरसल्फोन सिरिंज फिल्टर के माध्यम से कांच की बोतल में फ़िल्टर करें।
      नोट: समाधान में विभिन्न कोलेस्ट्रॉल सांद्रता तक पहुंचने के लिए, कोलेस्ट्रॉल और MοCD दोनों की मात्रा को सरल अनुपात से समायोजित करें। कोलेस्ट्रॉल के साथ मिथाइल-साइक्लोडेक्सट्रिन वाहक का संतृप्ति प्राप्त करने के लिए 8:1 पर MtheCD: कोलेस्ट्रॉल मोलर अनुपात को बनाए रखना महत्वपूर्ण है। कोलेस्ट्रॉल को समृद्ध करने वाले समाधान का उपयोग 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत होने पर तुरंत या कई दिनों के दौरान किया जा सकता है। हालांकि, कोलेस्ट्रॉल को समृद्ध करने की क्षमता समय के साथ गिरावट आती है क्योंकि कोलेस्ट्रॉल कुल दिखाई देता है, और समाधान बादल बन जाता है।
  2. कोलेस्ट्रॉल के साथ संतृप्त MοCD के साथ मस्तिष्क धमनियों का उपचार
    1. एक स्प्राग डाले चूहा (250-300 ग्राम) को 2% आइसोफ्लोरीन के साथ एक कक्ष में रखकर। फिर, एक तेज गिलोटिन या कैंची की एक बड़ी तेज जोड़ी का उपयोग करके एनेस्थेटाइज्ड चूहे को काटना।
      नोट: यदि नियमित रूप से इन प्रक्रियाओं का प्रदर्शन कर रहे हैं, तो गिलोटिन पैनापन के लिए एक कार्यक्रम विकसित करना उपयोगी है। इसके अलावा, कैंची की एक अलग जोड़ी कृंतक decapitation के लिए समर्पित किया जाना चाहिए । कृंतक डेपुटेशन एक टर्मिनल प्रक्रिया है; इसलिए, उपकरणों को बाँझ नहीं होना चाहिए। प्रत्येक उपयोग के बाद साबुन के पानी से सफाई पर्याप्त है।
    2. स्थिति चूहे के सिर आगे का सामना करना पड़ रहा है, शोधकर्ता से दूर । खोपड़ी और मस्तिष्क स्टेम के बीच कैंची की एक मध्यम आकार की जोड़ी के नुकीले हिस्से को रखें, और दोनों पक्षों पर पार्श्व रूप से काटा जाए।
    3. खोपड़ी के आधार पर खींच कर शीर्ष खोपड़ी को खोलने के लिए संदंश का उपयोग करें जहां पार्श्व कटौती की गई थी और ध्यान से मस्तिष्क को हटा दिया गया था। खोपड़ी के भीतर मस्तिष्क को पकड़ने वाली ऑप्टिकल नसों को काटना सुनिश्चित करें।
    4. मस्तिष्क को हटाने के बाद बर्फ पर पीबीएस के साथ बीकर में डाल दिया।
      नोट: मस्तिष्क 4 डिग्री सेल्सियस पर 4-6 घंटे के लिए बर्फ पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    5. एक गैर-बाँझ वातावरण में चूहे के मस्तिष्क को जलमग्न करने के लिए पर्याप्त पीबीएस के साथ एक लच्छेदार विच्छेदन कटोरे में स्थानांतरित करते हैं। इसे आगे बढ़ने से रखने के लिए दिमाग को नीचे पिन करें।
      नोट: चरण 1.2.5 आरटी पर किया जा सकता है यदि जल्दी से प्रदर्शन किया जाता है। अन्यथा, यह बर्फ पर किया जाना चाहिए।
    6. सेरेब्रल धमनियों और उनकी शाखाओं को विच्छेदन करने के लिए तेज संदंश और छोटी सर्जिकल कैंची का उपयोग करें जो आरटी में पीबीएस में माइक्रोस्कोप के तहत मस्तिष्क के आधार पर विलिस के सर्कल का निर्माण करते हैं । यह सुनिश्चित करने के लिए विच्छेदन करते समय कोमल रहें कि धमनी ऊतक फैला या कट न हो । यह कदम महत्वपूर्ण है ।
    7. संक्षेप में धमनी खंडों (1 सेमी तक लंबा) पीबीएस में या तो 96 अच्छी तरह से प्लेट में या बचे हुए रक्त को हटाने के लिए 35 मिमी पकवान में कुल्ला करें, और फिर उन्हें पूरे धमनी खंडों को कवर करने के लिए कोलेस्ट्रॉल-समृद्ध समाधान (चरण 1.1 में तैयार) के पर्याप्त में 10 मिमी के लिए रखें। अगर पर्याप्त मात्रा में कोलेस्ट्रॉल को समृद्ध करने वाला घोल और 96 वेल प्लेट अगर धमनियां छोटी हैं या कोलेस्ट्रॉल को समृद्ध करने वाले घोल की कमी है तो 35 एमएम डिश का इस्तेमाल करें।
      नोट: एक ही दृष्टिकोण एक 60 मिन ऊष्मायन समय का उपयोग कर कोलेस्ट्रॉल के साथ अन्य ऊतकों और कोशिकाओं को समृद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, इस दृष्टिकोण का उपयोग पहले माउस सेरेब्रल धमनियों35,,45,हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स32,एट्रियल माइओसाइट्स37और एचईके 293 कोशिकाओं39के कोलेस्ट्रॉल संवर्धन के लिए किया गया है। कोलेस्ट्रॉल के प्रति संवेदनशील परख (जैसे, कोलेस्ट्रॉल के प्रति संवेदनशील फ्लोरेसेंस डाइ पलिपिन के साथ धुंधला करके ऊतक में कोलेस्ट्रॉल की मात्रा के जैव रासायनिक निर्धारण) के साथ विभिन्न समय बिंदुओं पर कोलेस्ट्रॉल संवर्धन के सत्यापन के आधार पर प्रत्येक ऊतक या सेल प्रकार के लिए न्यूनतम ऊष्मायन समय निर्धारित करने की आवश्यकता होती है।
  3. कोलेस्ट्रॉल के स्तर में किसी भी परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए स्टेरॉयड के प्रति संवेदनशील फ्लोरेसेंस साये फिलिपिन के साथ धमनी ऊतक दाग।
    नोट: प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में, हम कोलेस्ट्रॉल के स्तर में परिवर्तन का आकलन करने के लिए दो दृष्टिकोणों के परिणामों को प्रदर्शित करते हैं: एक जैव रासायनिक परख एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कोलेस्ट्रॉल ऑक्सीडेस आधारित किट (सामग्री की तालिकादेखें) के आवेदन के माध्यम से किया जाता है और स्टेरॉयड के प्रति संवेदनशील फ्लोरेसेंस साये फिलिपिन के साथ धुंधला । पहला दृष्टिकोण निर्माता के निर्देशों का पालन करके किया जा सकता है। बाद के दृष्टिकोण के लिए प्रोटोकॉल नीचे प्रदान किया गया है।
    1. फिलिपिन पाउडर की एक ताजा बोतल का उपयोग करके, डिमेथिल सल्फासऑक्साइड (डीएमएसओ) में 10 मिलीग्राम/mL स्टॉक समाधान तैयार करें। यह कदम महत्वपूर्ण है ।
      नोट: परिणामस्वरूप समाधान प्रकाश के प्रति संवेदनशील है। यदि सही ढंग से तैयार किया जाता है, तो फिलिपिन स्टॉक समाधान पीला है। कुछ फिलिपिन पाउडर बोतल टोपी से चिपके रह सकते हैं। इसलिए, फिलिपिन की पूरी मात्रा को बनाए रखने के लिए डीएमएसओ सॉल्वेंट के साथ बोतल और टोपी को कुल्ला करना महत्वपूर्ण है। एक बार तैयार होने के बाद, फिलिपिन स्टॉक का उपयोग कई दिनों के भीतर किया जाना चाहिए। फिलिपिन पूरी तरह से 5 दिनों के बाद अपनी फ्लोरेसेंस क्षमता खो देता है, यहां तक कि जब अंधेरे में -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है।
    2. कोलेस्ट्रॉल को समृद्ध करने वाले समाधान से धमनी खंडों को हटा दें और उन्हें 5 मिन के लिए पीबीएस के साथ 3x धोएं।
    3. बर्फ पर 15 मिन के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में धमनी खंडों को ठीक करें।
      सावधानी: पैराफॉर्मलडिहाइड प्रकाश-संवेदनशील है। इसलिए अंधेरे में काम जरूर किया जाना चाहिए।
    4. ऊतक को परमीबिलाइज करने और रंगे प्रवेश की सुविधा के लिए आरटी में पीबीएस में 0.5% ट्राइटन में धमनी खंडों को रखें।
    5. एक शेखर पर 5 मिन के लिए PBS के साथ धमनी खंड 3x धोलें। यह कदम महत्वपूर्ण है ।
      नोट: जब ट्राइटन पूरी तरह से बाहर धोया गया है, वहां PBS समाधान की सतह पर कोई बुलबुले नहीं होना चाहिए ।
    6. पीबीएस में फिलिपिन स्टॉक समाधान को 25 μg/mL की अंतिम एकाग्रता के लिए पतला करें । धमनियों को पीबीएस समाधान बनाते हैं और उन्हें अंधेरे में 1 घंटे के लिए पतला फिलिपिन समाधान में रखें। यह कदम महत्वपूर्ण है ।
    7. एक शेखर पर 5 मिन के लिए PBS के साथ धमनी खंड3x rinsing द्वारा फिलिपिन बाहर धोने । यह कदम महत्वपूर्ण है ।
    8. आसुत पानी के साथ संक्षेप में धमनी खंडों कुल्ला, एक कागज नैपकिन के साथ अत्यधिक तरल अवशोषित, और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बढ़ते मीडिया का उपयोग कर एक स्लाइड पर धमनियों माउंट (सामग्री की तालिकादेखें) ।
    9. धमनी को रोलिंग या घुमाने से बचने वाले कवरस्लिप के साथ धमनी को कवर करें और 24 घंटे के लिए आरटी में एक अंधेरे क्षेत्र में सूखने के लिए स्लाइड सेट करें।
    10. बढ़ते मीडिया सूखने के बाद, स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ कवरस्लिप किनारों को सील करें, और नेल पॉलिश को 10-15 00 के लिए सूखने के लिए छोड़ दें। - स्लाइड्स को अंधेरे में -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    11. इमेजिंग से पहले स्लाइड्स को आरटी में समतुल्य करें।
    12. 385-470 एनएम पर 340-380 एनएम और उत्सर्जन पर सेट उत्तेजना के साथ एक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप या एक फ्लोरेसेंस रीडर के साथ ऊतक छवि ।
      सावधानी: फिलिपिन फोटोब्लीच जल्दी; इस प्रकार, नमूनों को तुरंत चित्रित किया जाना चाहिए।

2. कोलेस्ट्रॉल-समृद्ध फॉस्फोलिपिड आधारित फैलाव (लिपोसोम्स) का उपयोग करके ज़ेनोपस ओसाइट्स का संवर्धन

  1. समाधान की तैयारी
    1. कोलेस्ट्रॉल का स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करने के लिए 10 मिलीग्राम ग्लास बीकर या बोतल में क्लोरोफॉर्म के 1 मिलीग्राम में 10 मिलीग्राम कोलेस्ट्रॉल पाउडर घोल लें। समाधान को 1.5 एमएल कैप्ड ग्लास बोतल में स्थानांतरित करें।
      सावधानी- क्लोरोफॉर्म की विषाक्तता और तेजी से वाष्पीकरण को देखते हुए हुड में काम करें और बर्फ पर रिएजेंट रखें।
    2. कोलेस्ट्रॉल से समृद्ध फॉस्फोलिपिड के लिए 150 एमएम केसीएल, 10 एमएम ट्रिस-हेप्स, पीएच = 7.4 बफर तैयार करें। ऐसा करने के लिए, केसीएल के एक एर्लेनमेयर फ्लास्क 5.5905 ग्राम और डबल-आसुत पानी में 0.6057 ग्राम ट्रिस में कुल 0.5 एल वॉल्यूम में भंग करें। एक अन्य फ्लास्क में, केसीएल के 5.5905 ग्राम और डबल-आसुत पानी में 1.19155 ग्राम हेप्स को कुल 0.5 एल वॉल्यूम में भंग करें। एक 1 एल Erlenmeyer फ्लास्क में दो समाधान एक साथ मिलाएं, और एचसीएल के साथ पीएच को 7.4 में समायोजित करें।
      नोट: परिणामस्वरूप 150 एमएम केसीएल, 10 एमएम ट्रिस-हेप्स समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    3. ND96 प्री-मीडियम ओसाइटी टक्यूरिंग (कम कश्मीर+,कम सीए2+)बफर तैयार करने के लिए, 2 एम केसीएल के 1 एमएल, 1 एम एमजीसीएल2,2 एम एनसीएल के 45.5 मिलील के 1 एमएल और 1 एल एर्लेनमेयर फ्लास्क में 1/1 एम नाओएच-हेप्स के 5 मिलीएल को मिलाएं। 900 मीटर डबल आसुत पानी जोड़ें और एचसीएल के साथ पीएच को 7.4 पर समायोजित करें। 1 एल सिलेंडर के समाधान को स्थानांतरित करें और मात्रा को डबल-आसुत पानी के साथ 1 एल तक लाएं। फिर 1 एम सीएसीएल2 का 1.8 एमएल जोड़ें और समाधान को फ़िल्टर करें।
      नोट: एक ND96 समाधान बनाने के लिए इस्तेमाल घटकों के बीच अनुपात में मामूली बदलाव कोलेस्ट्रॉल संवर्धन के लिए महत्वपूर्ण नहीं लगता है, संभवतः क्योंकि ND96 समाधान संवर्धन कदम के दौरान ही इस्तेमाल नहीं किया जाता है, लेकिन भंडारण के लिए । एक उदाहरण एक 1 एल समाधान है जिसमें सोडियम और क्लोराइड आयनों की थोड़ी कम एकाग्रता है, और 1 एम केसीएल2,1 एम एनसीएल के 1 एमएल, 1 एम एचईपीईएस के 5 एमएल और 1 एम सीएसीएल2 (सीए2+ के 1.8 एमएल) को सीए2 + मुक्त समाधान प्राप्त करने के लिए छोड़ा जाता है। नाओएच के साथ 7.4 समाधान के पीएच समायोजित करें। परिणामस्वरूप ND96 oocyte पुलिया समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 महीने तक स्टोर करें।
  2. कोलेस्ट्रॉल लिपोसोम्स के साथ फॉस्फोलिपिड आधारित फैलाव की तैयारी
    1. 12 मिलीग्राम ग्लास ट्यूब में, निम्नलिखित 10 मिलीग्राम/mL क्लोरोफॉर्म-भंग लिपिड समाधानों में से प्रत्येक के 200 माइक्रोन को मिलाएं: एल-α-फॉस्फेटिटिग्थेनॉलमाइन, 1-पामोलिटोइल-2-ओलियोइल-एसएन-ग्लाइसेरो-3-फॉस्फो-एल-सेरीन, और कोलेस्ट्रॉल।
    2. नाइट्रोजन की एक धारा के नीचे धीरे-धीरे सूखने के लिए हुड में क्लोरोफॉर्म को वाष्पित करें। यह कदम महत्वपूर्ण है ।
    3. पीएच = 7.4 पर 150 एमएम केसीएल और 10 एम एम ट्रिस-हेप्स से मिलकर बफर किए गए समाधान के 800 माइक्रोन में लिपिड को निलंबित करें, और पैराफिन फिल्म के साथ कवर करें।
    4. एक दूधिया मिश्रण बनने तक 10 मीटर के लिए 80 किलोवाट पर धीरे से सोनिकेट करें। यह कदम महत्वपूर्ण है ।
      सावधानी: सोनिकिंग करते समय, कांच की नली में फैलाव को धीरे-धीरे कंपन करना चाहिए, छोटी तरंगों का निर्माण करना चाहिए। फैलाव की बूंदें ट्यूब के भीतर कूद नहीं होनी चाहिए।
  3. कोलेस्ट्रॉल के साथ Xenopus oocytes समृद्ध
    नोट: मेंढक oocyte युक्त अंडाशय दो स्रोतों से प्राप्त किया जा सकता है: सबसे पहले, Xenopus laevis महिला मेंढक में घर सर्जरी के उद्देश्य के लिए रखे जा सकते हैं । इस प्रक्रिया को संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया जाना चाहिए । दूसरा, पूरे अंडाशय वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ताओं से खरीदा जा सकता है। पूरे अंडाशय को खरीदने या अलग करने के विकल्प के रूप में और फिर उन्हें 2.3.1-2.3.4 चरणों में वर्णित पचाने के लिए, व्यक्तिगत ओसाइट्स खरीद के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। यदि उत्तरार्द्ध का उपयोग किया जाता है, तो चरण 2.3.1-2.3.4 को छोड़ दिया जा सकता है।
    1. एक ND96 समाधान में ~14 डिग्री सेल्सियस पर हौसले से प्राप्त अंडाशय रखें। इन शर्तों के तहत अंडाशय को 1 सप्ताह तक स्टोर किया जा सकता है।
    2. व्यक्तिगत ओसाइट्स प्राप्त करने के लिए, तेज संदंश का उपयोग करके कई स्थानों पर अंडाशय की थैली को बाधित करें। अंडाशय का हिस्सा 60 मिमी प्लेट में रखें, जिसमें सीए2+ के 5 मिलील के साथ - मुफ्त ND96 0.5 मिलीग्राम/mL कोलेजेनेज़ के साथ पूरक है। आरटी में 15 मिन के लिए ६० दोलनों/मिन में एक कक्षीय शेखर पर हिला ।
      नोट: यह कदम अंडाशय थैली के पाचन को सुनिश्चित करेगा। एंजाइमैटिक गतिविधि को संरक्षित करने के लिए, विस्तारित अवधि (>1 h) के लिए एनडी96 युक्त कोलेजेनेस के भंडारण से बचें। यहां तक कि 15 डिग्री सेल्सियस से कम के ठंडे तापमान पर संक्षिप्त भंडारण किया जाना चाहिए।
    3. एक विस्तृत टिप के साथ एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करना, व्यक्तिगत ओसाइट्स को अलग करने के लिए लगभग 5-10x के ऊपर और नीचे ओसाइट युक्त समाधान को तेजी से पिपेट करें। इस कदम पर, समाधान अंधेरा हो जाएगा।
    4. जल्दी से सीए 2+मुक्त ND96 के साथ oocytes कुल्ला जब तक समाधान पारदर्शी हो जाता है ।
    5. एक संकीर्ण टिप के साथ स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करके 2 मिलीग्राम/मीटर जेंटेमिकिन के साथ पूरक एनडी-96 समाधान को सीए2 +में व्यक्तिगत ओसाइट्स स्थानांतरित करें।
      नोट: यह कदम आवश्यक है जब यह oocytes स्टोर करने के लिए आवश्यक है । व्यक्तिगत ओसाइट्स को 14-17 डिग्री सेल्सियस पर कई दिनों तक इनक्यूबेटर में संग्रहीत किया जा सकता है। हालांकि, जहरीले रसायनों के साथ समाधान के संदूषण से बचने के लिए दिन में कम से कम एक बार सफेद ी करने वाले मृत ओसाइट्स को हटा दिया जाना चाहिए।
    6. कोलेस्ट्रॉल समृद्ध फॉस्फोलिपिड आधारित फैलाव के 90 μL को 96 अच्छी प्लेट के एक कुएं में स्थानांतरित करें।
    7. एनडी96 माध्यम से छह ओसाइट्स को यथासंभव कम माध्यम के साथ अच्छी तरह से स्थानांतरित करें। यह कदम महत्वपूर्ण है ।
      सावधानी: ओसाइट्स को बरकरार रखने के लिए स्थानांतरण के दौरान हवा में ओसाइट्स का पर्दाफाश न करें।
    8. 5-10 0 00 के लिए सेल में ओसाइट्स को एक छोटी कक्षीय गति प्रदान करने के लिए एक त्रि-आयामी प्लेट रोटेटर पर 96 अच्छी प्लेट रखें।
    9. अच्छी तरह से ND96 की एक बूंद जोड़ें, और कोलेस्ट्रॉल समृद्ध oocytes ९६ अच्छी तरह से थाली से एक ३५ मिमी प्लेट के लिए तत्काल उपयोग के लिए ND96 के साथ स्थानांतरित । यह कदम महत्वपूर्ण है ।
    10. निर्माता के निर्देशों का पालन करके कोलेस्ट्रॉल के स्तर में परिवर्तन का आकलन करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कोलेस्ट्रॉल ऑक्सीडेस-आधारित किट (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करें।

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Representative Results

कोलेस्ट्रॉल के साथ ऊतकों और कोशिकाओं को समृद्ध करने के लिए एक साधन के रूप में कोलेस्ट्रॉल के साथ संतृप्त साइक्लोडेक्सट्रिन का उपयोग अच्छी तरह से स्थापित है। यहां, हम पहले कोलेस्ट्रॉल के साथ संतृप्त MοCD का उपयोग कर कोलेस्ट्रॉल के साथ चूहा मस्तिष्क धमनियों को समृद्ध करने के लिए इस व्यापक रूप से इस्तेमाल किए जाने वाले दृष्टिकोण के अनुप्रयोग को प्रदर्शित करते हैं। चित्रा 1एक इमेज्ड सेरेब्रल धमनी चिकनी मांसपेशी परत का एक उदाहरण दिखाता है और 1 घंटे के लिए 6.25 माइक्रोएम-6.25 मीटर से लेकर कोलेस्ट्रॉल की बढ़ती सांद्रता के साथ ऊतक संवर्धन पर प्राप्त फिलिपिन से जुड़े फ्लोरेसेंस में एकाग्रता पर निर्भर वृद्धि को दर्शाता है । इमेजिंग डेटा के इसी मात्रा चित्रा 1बीमें चित्रित किया गया है । विशेष रूप से, 1 एच ऊष्मायन अवधि के बाद कोलेस्ट्रॉल के स्तर में वृद्धि MCD: कोलेस्ट्रॉल परिसर के साथ उपचार के तुरंत बाद देखी गई वृद्धि का ~ 50% था। जैसा कि चित्रा 1सी 1 घंटे के लिए 0.625 m कोलेस्ट्रॉल के साथ इलाज के नमूने के लिए दर्शाता है, उपचारित ऊतकों का उपयोग कर कार्यात्मक अध्ययन कोलेस्ट्रॉल संवर्धन पूरा होने के बाद जितनी जल्दी हो सके किया जाना चाहिए। इसके अलावा, जबकि एक 1 घंटे ऊष्मायन समय आमतौर पर इस दृष्टिकोण का उपयोग कर कोलेस्ट्रॉल के साथ ऊतकों और कोशिकाओं को समृद्ध करने के लिए प्रयोग किया जाता है, ऊष्मायन के 5 मिन आमतौर पर एक कोलेस्ट्रॉल ऑक्सीडासे आधारित जैव रासायनिक परख द्वारा निर्धारित के रूप में सेरेब्रल धमनी कोलेस्ट्रॉल सामग्री में एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण वृद्धि को प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है, के रूप में चित्रा 1डीमें चित्रित । कोलेस्ट्रॉल की मात्रा में वृद्धि उसी स्तर पर रही जब ऊष्मायन समय को बढ़ाकर 60 न्यूनतम(चित्रा 1डी)कर दिया गया था।

कोलेस्ट्रॉल के साथ Xenopus oocytes को समृद्ध करने के साधन के रूप में कोलेस्ट्रॉल समृद्ध लिपोसोम की प्रभावशीलता चित्रा 2ए-सीमें प्रदर्शित की जाती है। हालांकि कोलेस्ट्रॉल की कमी वाले फॉस्फोलिपिड-आधारित फैलाव में कोलेस्ट्रॉल के स्तर में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं देखा गया था,,Aकोलेस्ट्रॉल का स्तर फॉस्फोलिपिड आधारित फैलाव के साथ उपचार के केवल 5 मिन के बाद काफी बढ़ गया था, जिसमें कोलेस्ट्रॉल शामिल था, और उसी स्तर पर बना रहा जब ऊष्मायन समय 60 मिन(चित्रा 2बी)तक बढ़ गया था। इसी तरह का प्रभाव दो मेंढकों से प्राप्त ऑसाइट्स के दो अलग-अलग बैचों में देखा गया था। विशेष रूप से, हालांकि, कोलेस्ट्रॉल के प्रारंभिक स्तर और कोलेस्ट्रॉल की मात्रा में परिवर्तन दोनों दो बैचों के बीच भिन्न थे: बैच 1 में, कोलेस्ट्रॉल की प्रारंभिक एकाग्रता प्रति मिलीग्राम प्रोटीन के प्रति कोलेस्ट्रॉल की 64 μg थी, जबकि बैच 2 में प्रारंभिक एकाग्रता प्रोटीन के प्रति मिलीग्राम कोलेस्ट्रॉल की 45 μg थी, जो बैच 1 में कोलेस्ट्रॉल के प्रारंभिक स्तर का ~ 70% है। 60 मिन के उपचार के बाद, बैच 1 में कोलेस्ट्रॉल की एकाग्रता प्रति मिलीग्राम प्रोटीन के 124 माइक्रोग्राम कोलेस्ट्रॉल थी, जबकि बैच 2 में यह प्रति मिलीग्राम प्रोटीन 67 माइक्रोग्राम कोलेस्ट्रॉल था। इस प्रकार, जबकि बैच 1 में कोलेस्ट्रॉल की एकाग्रता ~ 90% से अधिक बढ़ गई, यह बैच 2 में ~ 50% की वृद्धि हुई। फिर भी, दोनों बैचों में कोलेस्ट्रॉल के स्तर में पर्याप्त वृद्धि इस विषमलॉगस अभिव्यक्ति प्रणाली में व्यक्त प्रोटीन के कार्य पर कोलेस्ट्रॉल के स्तर में वृद्धि के प्रभाव की जांच करने का साधन प्रदान करती है। इसके अलावा, कोलेस्ट्रॉल के साथ Xenopus oocytes को समृद्ध करने के लिए फॉस्फोलिपिड आधारित फैलाव दृष्टिकोण ऊतकों और कोशिकाओं में किए गए कोलेस्ट्रॉल के साथ संतृप्त साइक्लोडेक्सट्रिन के अनुप्रयोग की तुलना में अधिक प्रभावी प्रतीत होता है। जैसा कि चित्रा 3 दर्शाता है, 5mM साइक्लोडेक्सट्रिन का उपयोग करके ओसाइट्स को समृद्ध करने के लिए साइक्लोडेक्सट्रिन-कोलेस्ट्रॉल परिसरों के अनुप्रयोग के परिणामस्वरूप कोलेस्ट्रॉल के स्तर में केवल ~ 25% की औसत वृद्धि हुई।

कोशिकाओं को समृद्ध करने के लिए साइक्लोडेक्सट्रिन-आधारित दृष्टिकोण की प्रभावशीलता को हिप्पोकैम्पस(चित्र4ए)के सीए1 क्षेत्र से ताजा रूप से अलग न्यूरॉन्स में भी प्रदर्शित किया जाता है। जैसा कि चित्र 4बी से पता चलता है, 60 न्यूनतम के लिए कोलेस्ट्रॉल के साथ संतृप्त MοCD में न्यूरॉन्स के ऊष्मायन के परिणामस्वरूप फिलिपिन से जुड़े फ्लोरेसेंस द्वारा निर्धारित कोलेस्ट्रॉल के स्तर में 2x से अधिक की वृद्धि हुई। इस दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, हमने हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स में व्यक्त गिरक चैनलों पर कोलेस्ट्रॉल में वृद्धि के प्रभाव का परीक्षण किया। जैसा कि चित्र4सी दर्शाता है, कोलेस्ट्रॉल के स्तर में इस परिवर्तन के परिणामस्वरूप गिर्क धाराओं में उल्लेखनीय वृद्धि हुई। इसी तरह, हमने मस्तिष्क में व्यक्त प्राथमिक गिरक उपइकाई, गिरके2 पर कोलेस्ट्रॉल संवर्धन के प्रभाव का परीक्षण किया, जो ज़ेनोपस ओसाइट्स हेटेरोलॉगस अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग कररहा था। इस उद्देश्य के लिए, हमने GIRK2 ^(GIRK2_E152D), GIRK2 का एक पोर उत्परिवर्ती व्यक्त किया जो ज़ेनोपस ओसाइट्स में इसकी झिल्ली अभिव्यक्ति और गतिविधि52 को बढ़ाता है, और फॉस्फोलिपिड आधारित फैलाव दृष्टिकोण का उपयोग करके 60 मिन के लिए कोलेस्ट्रॉल के साथ ओसाइट्स को समृद्ध करता है। जैसा कि आंकड़े 4डी-एफ प्रदर्शित करते हैं, कोलेस्ट्रॉल के स्तर में वृद्धि के परिणामस्वरूप गिर्क चैनल फ़ंक्शन पर न्यूरॉन्स में कोलेस्ट्रॉल के स्तर में वृद्धि के प्रभाव के समान धाराओं में उल्लेखनीय वृद्धि हुई। ये डेटा आगे प्रोटीन गतिविधि और सेलुलर समारोह पर कोलेस्ट्रॉल के स्तर में वृद्धि के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए ऊपर वर्णित दो दृष्टिकोणों की प्रभावशीलता, स्थिरता और उपयोगिता प्रदर्शित करते हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: कोलेस्ट्रॉल के साथ संतृप्त मिथाइल-साइक्लोडेक्सट्रिन का उपयोग करके कोलेस्ट्रॉल के साथ चूहे सेरेब्रल धमनियों का प्रतिनिधि संवर्धन। (क)एक इमेज्ड सेरेब्रल धमनी चिकनी मांसपेशी परत का एक उदाहरण जो ऊतक संवर्धन में एकाग्रता पर वृद्धि का प्रदर्शन करता है, जिसमें 1 घंटे के लिए 6.25 माइक्रोएम-6.25 मीटर से लेकर कोलेस्ट्रॉल की सांद्रता में वृद्धि के साथ ऊतक संवर्धन पर प्राप्त किया गया है ।(बी)में इमेजिंग डेटा की मात्रा(ए)। वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर में अंतर्निहित "माप" समारोह का उपयोग करके पूरी छवि की फ्लोरेसेंस तीव्रता माप नकाप किया गया था। प्रत्येक कोलेस्ट्रॉल एकाग्रता पर, अलग पशु दाताओं से काटा गया था कि धमनियों से 3 छवियों को एकत्र किया गया। प्रत्येक कोलेस्ट्रॉल एकाग्रता के लिए, डेटा मतलब ± मानक त्रुटि के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । (C)सेरेब्रल धमनी चिकनी मांसपेशी परत खंडों में कोलेस्ट्रॉल का स्तर 0.625 मीटर कोलेस्ट्रॉल के साथ 1 घंटे ऊष्मायन अवधि के तुरंत बाद, और उपचार की शुरुआत के बाद 3 घंटे (यानी, 1 घंटे का ऊष्मायन पीबीएस में 2 घंटे के बाद)। (घ)कोलेस्ट्रॉल ऑक्सीडेस आधारित जैव रासायनिक परख द्वारा निर्धारित ऊष्मायन समय पर कोलेस्ट्रॉल के स्तर की निर्भरता। एक महत्वपूर्ण अंतर एक तारक (* पी ♫ 0.05) द्वारा इंगित किया जाता है। पैनल(ए)(कोलेस्ट्रॉल सांद्रता 0 mM-0.625 mM),(बी),और(सी)उत्तर एट अल45से संशोधित किया गया है. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: लिपोसोम का उपयोग करके कोलेस्ट्रॉल के साथ ज़ेनोपस ओसाइट्स का प्रतिनिधि संवर्धन। (A)नियंत्रण के कोलेस्ट्रॉल के स्तर में गुना परिवर्तन ज़ेनोपस ओसाइट्स को 5-60 मीटर के लिए कोलेस्ट्रॉल-मुक्त लिपोसोम में इनक्यूबेटेड किया गया है।(बी)5-60 मिन के लिए कोलेस्ट्रॉल-समृद्ध लिपोसोम ्स में इनक्यूबेटेड ज़ेनोपस ओसाइट्स के कोलेस्ट्रॉल के स्तर में गुना परिवर्तन। चित्रित नियंत्रण बार 5 मिन के लिए कोलेस्ट्रॉल मुक्त लिपोसोम में ऊष्मायन को संदर्भित करता है और तुलना के रूप में दिखाया गया है। (ग)5 और 60 मिन के लिए कोलेस्ट्रॉल समृद्ध लिपोसोम का उपयोग करके ज़ेनोपस ओसाइट्स के दो विभिन्न बैचों के कोलेस्ट्रॉल संवर्धन के प्रभाव की तुलना। एक महत्वपूर्ण अंतर एक तारक (* पी ♫ 0.05) द्वारा इंगित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: कोलेस्ट्रॉल के साथ संतृप्त मिथाइल-साइक्लोडेक्सट्रिन का उपयोग करके कोलेस्ट्रॉल के साथ ज़ेनोपस ओसाइट्स का प्रतिनिधि संवर्धन। (A)नियंत्रण के कोलेस्ट्रॉल के स्तर में गुना परिवर्तन Xenopus oocytes नियंत्रण ND96 मीडिया में 5-60 min के लिए इनक्यूबेटेड ।(B)5-60 मीटर के लिए कोलेस्ट्रॉल के साथ संतृप्त Mcd में इनक्यूबेटेड Xenopus oocytes के कोलेस्ट्रॉल के स्तर में गुना परिवर्तन । चित्रित नियंत्रण बार 5 मिन के लिए नियंत्रण मीडिया में ऊष्मायन को संदर्भित करता है और एक तुलना के रूप में दिखाया गया है। एक महत्वपूर्ण अंतर एक तारक (* पी ♫ 0.05) द्वारा इंगित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: कोशिकाओं और ज़ेनोपस ओसाइट्स में प्रोटीन कार्य पर कोलेस्ट्रॉल संवर्धन के अध्ययन के प्रतिनिधि उदाहरण: जी-प्रोटीन पर कोलेस्ट्रॉल का प्रभाव अंदर की ओर पोटेशियम चैनलों को सुधारने। (क)फिलिपिन से जुड़े फ्लोरेसेंस सिग्नल ऑफ हिप्पोकैम्पल सीए1 पिरामिड न्यूरॉन चूहों से नियंत्रण पर (बाएं) बनाम कोलेस्ट्रॉल-समृद्ध (दाएं)। (ख)नियंत्रण और कोलेस्ट्रॉल समृद्ध हौसले से अलग हिप्पोकैम्पल CA1 पिरामिड न्यूरॉन्स से प्राप्त फिलिपिन से जुड़े फ्लोरेसेंस संकेतों का सारांश डेटा । कोलेस्ट्रॉल संवर्धन 1 घंटे (एन = 12-14) के लिए कोलेस्ट्रॉल के साथ संतृप्त MοCD में न्यूरॉन्स इनक्यूबेटिंग द्वारा हासिल किया गया था । (C)आयनिक वर्तमान (I) वोल्टेज (V) सीए1 क्षेत्र से हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स में गिर्क धाराओं परवर्णितकोलेस्ट्रॉल संवर्धन के प्रभाव को दर्शाती है। (घ)प्रतिनिधि गिरक2 पर कोलेस्ट्रॉल समृद्ध फॉस्फोलिपिड आधारित लिपोसोम्स का उपयोग करके कोलेस्ट्रॉल संवर्धन के प्रभाव को दर्शाते हैं ^ (GIRK2_E152D) ने ज़ेनोपस ओसाइट्स में -80 एमवी और +80 एमवी पर व्यक्त किया। (ई)सारांश डेटा(डी)पर -80 एमवी (एन = 6-9) । एक महत्वपूर्ण अंतर एक तारक (* पी ♫ 0.05) द्वारा इंगित किया जाता है। बुकिया एट अल32से उपआंकड़े(बी-ई)में बदलाव किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

कोलेस्ट्रॉल के साथ स्तनधारी ऊतकों और कोशिकाओं और Xenopus oocytes को समृद्ध करने के तरीके जटिल मैक्रोमॉलिक्यूलर सिस्टम (जैसे, प्रोटीन) और सेलुलर और अंग समारोह पर व्यक्तिगत आणविक प्रजातियों पर ऊंचा कोलेस्ट्रॉल के स्तर के प्रभाव की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का गठन करते हैं। इस पेपर में हमने दो पूरक दृष्टिकोण बताए हैं जो इस तरह के अध्ययनों को सुगम बनाते हैं । सबसे पहले, हमने बताया कि कोलेस्ट्रॉल से संतृप्त MοCD का उपयोग करके कोलेस्ट्रॉल के साथ ऊतकों और कोशिकाओं को कैसे समृद्ध किया जाए। हमने दिखादिया कि सेरेब्रल धमनी खंडों में, इस दृष्टिकोण के परिणामस्वरूप कोलेस्ट्रॉल के स्तर में ~ 50% की वृद्धि हुई। इसके अलावा, हाल ही में एक अध्ययन में, हमने दिखाया कि एक ही दृष्टिकोण CA1 क्षेत्र से हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स में कोलेस्ट्रॉल की मात्रा में 2x से अधिक वृद्धि की ओर जाता है । इसके विपरीत, हालांकि, Xenopus oocytes को समृद्ध करने के साधन के रूप में इस दृष्टिकोण को नियोजित करने के परिणामस्वरूप ज़ेनोपस ओसाइट्स में कोलेस्ट्रॉल की मात्रा में केवल ~ 25% की वृद्धि हुई। इस प्रकार, ज़ेनोपस ओसाइट्स को समृद्ध करने के लिए, हमने एक फॉस्फोलिपिड-आधारित फैलाव दृष्टिकोण विकसित किया है जिसके परिणामस्वरूप कोलेस्ट्रॉल के स्तर में कम से कम ~ 50% की वृद्धि होती है। यह संभव है कि ज़ेनोपस ओसाइट्स को समृद्ध करने के लिए इस दृष्टिकोण का लाभ MοCD: कोलेस्ट्रॉल जटिल दृष्टिकोण की लोडिंग क्षमता की तुलना में बढ़ी हुई लोडिंग क्षमता से उपजा है। यह भी संभव है कि जबकि MοCD: कोलेस्ट्रॉल जटिल दृष्टिकोण ऊतकों और कोशिकाओं को समृद्ध करने के लिए अनुकूलित है, प्रोटोकॉल के आगे अनुकूलन के लिए Xenopus oocytes समृद्ध करने के लिए अपने आवेदन में सुधार की आवश्यकता है ।

कोलेस्ट्रॉल के साथ ज़ेनोपस ओसाइट्स को समृद्ध करने के लिए उपयोग किए जाने वाले फॉस्फोलिपिड-आधारित फैलाव में दो लिपिड शामिल हैं जिनका उपयोग व्यापक रूप से प्लानर लिपिड बाइलेयर (यानी एल-α-फॉस्फेटिइडलथेनॉमाइन और 1-पामोलिटोइल-2-ओलियोइल-एसएन-ग्लिसेरो-3-फॉस्फो-एल-सेरिन) बनाने के लिए किया जाता है। हालांकि, एक पूर्व अध्ययन में, यह दिखाया गया था कि ज़ेनोपस ओसाइट्स को लिपोसोम्स से कोलेस्ट्रॉल का उपयोग करके समृद्ध किया जा सकता है जिसमें फॉस्फेटिलिकॉलकोलिन और चोलेट36शामिल थे। इस विधि के परिणामस्वरूप प्लाज्मा झिल्ली में कोलेस्ट्रॉल/फॉस्फोलिपिड मोलर अनुपात में 0.5 ± 0.1 से 0.9 ± 0.1 तक वृद्धि हुई, जिसमें 71% के संवर्धन का औसत प्रतिशत था। संवर्धन का यह औसत प्रतिशत कोलेस्ट्रॉल सामग्री में वृद्धि के औसत स्तर के समान है जिसे हमने देखा (~ 70.5%), यह सुझाव देते हुए कि फैलाव बनाने के लिए उपयोग किए जाने वाले फॉस्फोलिपिड का चुनाव इस दृष्टिकोण का उपयोग करके कोलेस्ट्रॉल के साथ ज़ेनोपस ओसाइट्स को समृद्ध करने के लिए महत्वपूर्ण नहीं है।

वर्णित प्रत्येक प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम शामिल हैं। एक MοCD तैयार करने के बाद: कोलेस्ट्रॉल के साथ MοCD के संतृप्ति सुनिश्चित करने के लिए एक 8:1 मोलर अनुपात पर कोलेस्ट्रॉल मिश्रण, यह पैराफिन फिल्म की कम से दो परतों के साथ फ्लास्क को कवर करने के लिए महत्वपूर्ण है और यह एक धीरे मिलाते हुए ३७ डिग्री सेल्सियस पानी स्नान रात भर में सेट । कोलेस्ट्रॉल उपचार के लिए ऊतकों को विच्छेदन करते समय यह सुनिश्चित करने के लिए कोमल होना महत्वपूर्ण है कि ऊतक फैला या कट न हो। रंगकी पैठ की सुविधा के लिए ऊतक को परमीबिलाइज करने के बाद, पीबीएस में ऊतक खंडों को अच्छी तरह से धोना महत्वपूर्ण है। फिलिफिन में ऊतक धुंधला अंधेरे में प्रदर्शन करने की जरूरत है, और धुंधला पूरा होने के बाद भराव को सावधानी से धोया जाना चाहिए। कोलेस्ट्रॉल से समृद्ध फॉस्फोलिपिड आधारित फैलाव तैयार करते समय, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि कांच की ट्यूब में फैलाव धीरे-धीरे कंपन करता है, छोटी तरंगों का निर्माण करता है, ताकि कोलेस्ट्रॉल को फैलाव से अलग होने से बचा जा सके। ज़ेनोपस ओसाइट्स के कोलेस्ट्रॉल उपचार के लिए, ओसाइट्स को एनडी96 माध्यम से अच्छी तरह से कोलेस्ट्रॉल-समृद्ध फॉस्फोलिपिड-आधारित फैलाव के साथ अच्छी तरह से स्थानांतरित करना महत्वपूर्ण है, जबकि ओसाइट्स को हवा में ओसाइट्स को उजागर नहीं करना है ताकि ओसाइट्स को बरकरार रखा जा सके। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि ऊतकों, कोशिकाओं और ज़ेनोपस ओसाइट्स में आंतरिक मशीनरी के कारण, कोलेस्ट्रॉल का स्तर समतुल्य हो सकता है, और फिर समय के साथ अपने मूल स्तर पर वापस लौट सकता है। नतीजतन, ऊष्मायन समय के तुरंत बाद कार्यात्मक अध्ययन किए जाने की आवश्यकता है। यहां, हमने कोलेस्ट्रॉल से समृद्ध मस्तिष्क धमनियों में इस धारणा का प्रदर्शन किया है, जिसमें यह दर्शाया गया है कि 1 एच ऊष्मायन अवधि के बाद कोलेस्ट्रॉल के स्तर 2 घंटे में वृद्धि ऊष्मायन अवधि के तुरंत बाद देखी गई वृद्धि का लगभग आधा था।

ऊपर वर्णित महत्वपूर्ण कदमों का पालन करने के बावजूद, कई चुनौतियां पैदा हो सकती हैं। उदाहरण के लिए, कोलेस्ट्रॉल को समृद्ध करने वाले उपचार के बाद कोलेस्ट्रॉल के स्तर में वृद्धि नहीं देखी जा सकती है। अगर यही स्थिति रही तो कोलेस्ट्रॉल को समृद्ध करने वाले मीडिया में कोलेस्ट्रॉल की एकाग्रता बढ़ाना जरूरी हो सकता है। यही ऊतकों, कोशिकाओं और ज़ेनोपस ओसाइट्स के कोलेस्ट्रॉल संवर्धन के लिए भी लागू होता है। हालांकि, MοCD: कोलेस्ट्रॉल जटिल दृष्टिकोण का उपयोग कर उपचार की तैयारी में, कोलेस्ट्रॉल के साथ 8:1 मोलर अनुपात बनाए रखने के लिए कोलेस्ट्रॉल एकाग्रता में वृद्धि के साथ MοCD की मात्रा में वृद्धि की जानी चाहिए । इसके अतिरिक्त, एक ताजा कोलेस्ट्रॉल-समृद्ध समाधान तैयार करना आवश्यक हो सकता है, क्योंकि कोलेस्ट्रॉल समाधान से बाहर निकलता है, और समाधान अपनी कोलेस्ट्रॉल-समृद्ध दक्षता खो देता है। कोलेस्ट्रॉल संवर्धन के बाद, यह संभव है कि एक फिलिपिन संकेत नहीं मनाया जाएगा। अगर यही स्थिति रही तो नया स्टॉक तैयार करने और प्रयोग दोहराने के लिए नए सिरे से फिलिपिन पाउडर का इस्तेमाल करना जरूरी हो सकता है। फिलिपिन फ्लोरेसेंस में जल्दी गिरावट आती है, और स्टॉक समाधान को कई दिनों से अधिक समय तक संग्रहीत नहीं किया जा सकता है। फिलिपीन धुंधला की एक सीमा यह है कि यह कोलेस्ट्रॉल के अलावा अन्य स्टेरॉयड पहचान करने लगता है. उदाहरण के लिए, हमने हाल ही में कोप्रोस्टानोल45के साथ संवर्धन के बाद चूहे सेरेब्रल धमनियों में फिलिपिन से जुड़े फ्लोरेसेंस सिग्नल में वृद्धि का प्रदर्शन किया है। इस प्रकार, फिलिपिन धुंधला परिणाम सावधानी के साथ व्याख्या की जानी चाहिए, और जब संदेह में, परिणामों की पुष्टि करने के लिए वैकल्पिक दृष्टिकोण नियोजित किया जाना चाहिए। एक संभावना के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कोलेस्ट्रॉल oxidase आधारित किट के आवेदन के माध्यम से एक जैव रासायनिक परख प्रदर्शन किया जाएगा ।

संक्षेप में, प्रस्तुत दृष्टिकोण 50% के करीब या उससे अधिक के कोलेस्ट्रॉल संवर्धन को प्राप्त करने में बहुत प्रभावी हैं। दरअसल, MοCD: कोलेस्ट्रॉल जटिल दृष्टिकोण है कि मस्तिष्क धमनियों में कोलेस्ट्रॉल के स्तर में ~ 50% में परिणाम एलडीएल का उपयोग करने के लिए इन ऊतकों को समृद्ध करने की तुलना में बहुत अधिक कुशल है, जो कोलेस्ट्रॉल35में महज ~ 10% की वृद्धि में परिणाम है. यही बात ज़ेनोपस ओसाइट्स को समृद्ध करने के लिए कोलेस्ट्रॉल-समृद्ध फॉस्फोलिपिड आधारित फैलाव (लिपोसोम्स) के आवेदन पर भी लागू होती है। जैसा कि ऊपर वर्णित है, इस दृष्टिकोण के परिणामस्वरूप कोलेस्ट्रॉल के स्तर में कम से कम 50% की वृद्धि होती है। महत्वपूर्ण बात यह है कि इन विट्रो उपज परिणामों में कोलेस्ट्रॉल संवर्धन के लिए ये दो दृष्टिकोण जो जानवरों को उच्च कोलेस्ट्रॉल आहार32,37,,40,,53,,54के अधीन करके प्राप्त कोलेस्ट्रॉल वृद्धि के साथ तुलनीय हैं।, इसके अलावा, सप्ताह भर के उच्च कोलेस्ट्रॉल आहार के विपरीत, इन विट्रो दृष्टिकोण ों को कोलेस्ट्रॉल के स्तर में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण और स्थिर-राज्य वृद्धि तक पहुंचने के लिए कुछ मिनटों के ऊष्मायन समय की आवश्यकता होती है।

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Disclosures

डॉ ए एम Dopico एक विशेष, अंशकालिक, संघीय कर्मचारी और शराब के दुरुपयोग और शराब पर राष्ट्रीय सलाहकार परिषद के वर्तमान सदस्य है ।

Acknowledgments

इस काम को अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (एआर-डी) से एक वैज्ञानिक विकास अनुदान (11SDG5190025) द्वारा समर्थित किया गया था, और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान R01 अनुदान एए-०२३७६४ (ए. एन.बी.), और एचएल-१०४६३१ और R37 एए-११५६० (A.M.D. ) द्वारा समर्थित था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amplex Red Cholesterol Assay Kit Invitrogen A12216
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA set Thermo Scientific 23208
Brain PE 25Mg in Chloroform Avanti Lipids 840022C
16:0-18:1 PS 25Mg Chloroform Avanti Lipids 840034C
Cholesterol 100Mg Powder Sigma C8667
KCl Fisher P217
Trizma base Sigma T6066
HEPES Corning 61-034-RO
MgCl2 Fisher M33
NaCl Fisher S271
KH2PO4 Fisher P285
MgSO4 EMD Chemicals MX0070-1
EDTA VWR E177
Dextrose Anhydrous Fisher BP350
NaHCO3 Sigma S6014
CaCl2 Sigma C3881
Blood Gas Tank nexAir
NaOH Fisher S318
1.5mL tubes Fisher S35818
Gastight Syringe 100uL Hamilton 1710
Microliter Syringe 25uL Hamilton 702
12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tube Pyrex 8120-12
Chloroform Fisher C298
Support Stand Homescience Tools CE-STAN5X8
Universal Clamp, 3-Prong Homescience Tools CE-CLPUNIV
Sonicator Laboratory Supplies G112SP1G
3D rotator mixer Benchmark Scientific B3D 1308
96 well plate Sigma BR781602
N2 gas nexAir
Glass beakers 40ml-1L Fisher 02-540
Ice Machine Scotsman CU1526MA-1
Ice bucket Fisher 50-136-7764
1X PBS Corning 21-031-CM
TritonX Fisher BP151-100
Sonic Dismembrator Fisher Model 100
Eppendorf microcentrifuge Eppendorf Model 5417R
Amber bottles Fisher 03-251-420
Corning™ Disposable Glass Pasteur Pipets FIsher 13-678-4A
Parafilm FIsher 50-998-944
Isotemp™ BOD Refrigerated Incubator FIsher 97-990E
Oocytes Xenoocyte™ 10005
Rat Envigo Sprague Dawley weight 250g
Methyl-β-cyclodextrin Sigma C4555
Water bath incubator with shaker Precision 51221080 Lowest shaker setting O/N 37 °C
Filipin Sigma SAE0088-1ML
DMSO Fisher BP231
Paraformaldehyde 4% Mallinckrodt 2621
DI H2O University DI source
ProLong Gold antifade reagnet Invitrogen P10144
Microslides 75x25mm Frosted Diagger G15978A
Forceps Fine Science Tools 11255-20
Microscope Coverslip Diagger G15972B
Clear nail polish Revlon 771 Clear
Labeling Tape Fisher 15-901-20F
Securline Lab Marker II Sigma Z648205-5EA
BD 10mL Syringe Fisher 14-823-16E
1.2 μm syringe filter VWR 28150-958
KimWipes Fisher 06-666A
pH probe Sartorus py-p112s
pH meter Denver instrument Model 225
70% ETOH Pharmco 211USP/NF
Timer Fisher 02-261-840
Steno book Staples 163485

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References

  1. Yeagle, P. L. Cholesterol and the cell membrane. Biochimica et Biophysica Acta. 822, 267-287 (1985).
  2. Yeagle, P. L. Modulation of membrane function by cholesterol. Biochimie. 73, 1303-1310 (1991).
  3. Gimpl, G., Burger, K., Fahrenholz, F. Cholesterol as modulator of receptor function. Biochemistry. 36, 10959-10974 (1997).
  4. Maxfield, F. R., van Meer, G. Cholesterol, the central lipid of mammalian cells. Current Opinion in Cell Biology. 22, 422-429 (2010).
  5. Goluszko, P., Nowicki, B. Membrane cholesterol: a crucial molecule affecting interactions of microbial pathogens with mammalian cells. Infection and Immunity. 73, 7791-7796 (2005).
  6. Ramprasad, O. G., et al. Changes in cholesterol levels in the plasma membrane modulate cell signaling and regulate cell adhesion and migration on fibronectin. Cell Motility and Cytoskeleton. 64, 199-216 (2007).
  7. Rosenhouse-Dantsker, A., Mehta, D., Levitan, I. Regulation of Ion Channels by Membrane Lipids. Comprehensive Physiology. 2, 31-68 (2012).
  8. Direct mechanisms in cholesterol modulation of protein function. Advances in Experimental Medicine and Biology. Rosenhouse-Dantsker, A., Bukiya, A. N. , Springer Nature. Switzerland. 1135 (2019).
  9. Cholesterol modulation of protein function: sterol specificity and indirect mechanisms. Advances in Experimental Medicine and Biology. Rosenhouse-Dantsker, A., Bukiya, A. N. , Springer Nature. Switzerland. 1115 (2019).
  10. Kellner-Weibel, G., Geng, Y. J., Rothblat, G. H. Cytotoxic cholesterol is generated by the hydrolysis of cytoplasmic cholesteryl ester and transported to the plasma membrane. Atherosclerosis. 146, 309-319 (1999).
  11. Kruth, H. S. Lipoprotein cholesterol and atherosclerosis. Current Molecular Medicine. 1, 633-653 (2001).
  12. Ross, R. Atherosclerosis--an inflammatory disease. The New England Journal of Medicine. 340, 115-126 (1999).
  13. Steinberg, D. Atherogenesis in perspective: hypercholesterolemia and inflammation as partners in crime. Nature Medicine. 8, 1211-1217 (2002).
  14. Ho, Y. S., Poon, D. C. H., Chan, T. F., Chang, R. C. C. From small to big molecules: How do we prevent and delay the progression of age- related neurodegeneration? Current Pharmaceutical Design. 18, 15-26 (2012).
  15. Stefani, M., Liguri, G. Cholesterol in Alzheimer's disease: Unresolved questions. Current Alzheimer Research. 6, 15-29 (2009).
  16. Ong, W. Y., Halliwell, B. Iron, atherosclerosis, and neurodegeneration: A key role for cholesterol in promoting iron-dependent oxidative damage? Annals of the New York Academy of Sciences. 1012, 51-64 (2004).
  17. Igoumenou, A., Ebmeier, K. P. Diagnosing and managing vascular dementia. Practitioner. 256, 13-16 (2012).
  18. Luu, W., Gelissen, I. C., Brown, A. J. Manipulating Cholesterol Status Within Cells. Methods in Molecular Biology. 1583, 41-52 (2017).
  19. Egom, E. E. A., Hafeez, H. Biochemistry of statins. Advances in Clinical Chemistry. 73, 127-168 (2016).
  20. Igel, M., Sudhop, T., von Bergmann, K. Pharmacology of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase inhibitors (statins), including rosuvastatin and pitavastatin. Journal of Clinical Pharmacology. 42, 835-845 (2002).
  21. Nakanishi, M., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Multivalent control of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase. Mevalonate-derived product inhibits translation of mRNA and accelerates degradation of enzyme. The Journal of Biological Chemistry. 263, 8929-8937 (1988).
  22. López, C. A., de Vries, A. H., Marrink, S. J. Molecular Mechanism of Cyclodextrin Mediated Cholesterol Extraction. PLoS Computational Biology. 7, e1002020 (2011).
  23. Christian, A. E., Haynes, M. P., Phillips, M. C., Rothblat, G. H. Use of cyclodextrins for manipulating cellular cholesterol content. Journal of Lipid Research. 38, 2264-2272 (1997).
  24. Dai, S., et al. Methyl-β-cyclodextrin restores impaired autophagy flux in Niemann-Pick C1-deficient cells through activation of AMPK. Autophagy. 13, 1435-1451 (2017).
  25. Chen, F. W., Li, C., Ioannou, Y. A. Cyclodextrin induces calcium- dependent lysosomal exocytosis. PLoS One. 5, e15054 (2010).
  26. Soga, M., et al. HPGCD outperforms HPBCD as a potential treatment for Niemann-Pick disease type C during disease modeling with iPS cells. Stem Cells. 33, 1075-1088 (2015).
  27. Maetzel, D., et al. Genetic and chemical correction of cholesterol accumulation and impaired autophagy in hepatic and neural cells derived from Niemann-Pick Type C patient-specific iPS cells. Stem Cell Reports. 2, 866-880 (2014).
  28. Sarkar, S., et al. Impaired autophagy in the lipid-storage disorder Niemann-Pick type C1 dis- ease. Cell Reports. 5, 1302-1315 (2013).
  29. Rosenbaum, A. I., Zhang, G., Warren, J. D., Maxfield, F. R. Endocytosis of beta-cyclodextrins is responsible for cholesterol reduction in Niemann-Pick type C mutant cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 5477-5482 (2010).
  30. Yu, D., et al. Niemann-Pick Disease Type C: Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neuronal Cells for Modeling Neural Disease and Evaluating Drug Efficacy. Journal of Biomolecular Screening. 19, 1164-1173 (2014).
  31. Zidovetzki, R., Levitan, I. Use of cyclodextrins to manipulate plasma membrane cholesterol content: evidence, misconceptions and control strategies. Biochimica et Biophysica Acta. 1768, 1311-1324 (2007).
  32. Bukiya, A. N., Durdagi, S., Noskov, S., Rosenhouse-Dantsker, A. Cholesterol up-regulates neuronal G protein-gated inwardly rectifying potassium (GIRK) channel activity in the hippocampus. The Journal of Biological Chemistry. 292, 6135-6147 (2017).
  33. Bukiya, A. N., Vaithianathan, T., Kuntamallappanavar, G., Asuncion-Chin, M., Dopico, A. M. Smooth muscle cholesterol enables BK β1 subunit-mediated channel inhibition and subsequent vasoconstriction evoked by alcohol. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 31, 2410-2423 (2011).
  34. Hegele, R. A. Plasma lipoproteins: genetic influences and clinical implications. Nature Reviews Genetics. 10, 109-121 (2009).
  35. Bisen, S., et al. Distinct mechanisms underlying cholesterol protection against alcohol-induced BK channel inhibition and resulting vasoconstriction. Biochimica et Biophysica Acta. 1861, 1756-1766 (2016).
  36. Santiago, J., et al. Probing the Effects of Membrane Cholesterol in the Torpedo californica Acetylcholine Receptor and the Novel Lipid-exposed Mutation αC418W in Xenopus Oocytes. The Journal of Biological Chemistry. 276, 46523-46532 (2001).
  37. Deng, W., et al. Hypercholesterolemia induces up-regulation of KACh cardiac currents via a mechanism independent of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and Gβγ. The Journal of Biological Chemistry. 287, 4925-4935 (2012).
  38. Bukiya, A. N., Blank, P. S., Rosenhouse-Dantsker, A. Cholesterol intake and statin use regulate neuronal G protein-gated inwardly rectifying potassium channels by cholesterol and PI(4,5)P2. Journal of Lipid Research. 60, 19-29 (2019).
  39. Bukiya, A. N., et al. Cholesterol increases the open probability of cardiac KACh currents. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1848, 2406-2413 (2015).
  40. Bukiya, A. N., Rosenhouse-Dantsker, A. Hypercholesterolemia effect on potassium channels. Hypercholesterolemia. Kumar, S. A. , Intech. 95-119 (2015).
  41. Rosenhouse-Dantsker, A., et al. Distant cytosolic residues mediate a two-way molecular switch that controls the modulation of Kir channels by cholesterol and PI(4,5)P2. The Journal of Biological Chemistry. 287, 40266-40278 (2012).
  42. Chun, Y. S., Oh, H. G., Park, M. K., Cho, H., Chung, S. Cholesterol regulates HERG K+ channel activation by increasing phospholipase C β1 expression. Channels. 7, 275-287 (2013).
  43. Luchetti, G., et al. Cholesterol activates the G-protein coupled receptor Smoothened to promote Hedgehog signaling. eLife. 5, e20304 (2016).
  44. Sun, S., et al. Cholesterol-dependent modulation of stem cell biomechanics: application to adipogenesis. Journal of Biomechanical Engineering. , In Press (2019).
  45. North, K., Bisen, S., Dopico, A. M., Bukiya, A. N. Tyrosine 450 in the Voltage- and Calcium-Gated Potassium Channel of Large Conductance Channel Pore-Forming (slo1) Subunit Mediates Cholesterol Protection against Alcohol-Induced Constriction of Cerebral Arteries. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 367, 234-244 (2018).
  46. Bukiya, A. N., Dopico, A. M. Regulation of BK Channel Activity by Cholesterol and Its Derivatives. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1115, 53-75 (2019).
  47. Rosenhouse-Dantsker, A., Leal-Pinto, E., Logothetis, D. E., Levitan, I. Comparative analysis of cholesterol sensitivity of Kir channels: role of the CD loop. Channels. 4, 63-66 (2010).
  48. Rosenhouse-Dantsker, A., Logothetis, D. E., Levitan, I. Cholesterol Sensitivity of Kir2.1 is controlled by a belt of residues around the cytosolic pore. Biophysical Journal. 100, 381-389 (2011).
  49. Rosenhouse-Dantsker, A., Noskov, S. Y., Logothetis, D. E., Levitan, I. Cholesterol sensitivity of Kir2.1 depends on functional inter-links between the N and C termini. Channels. 7, 303-312 (2013).
  50. Rosenhouse-Dantsker, A., Noskov, S., Durdagi, S., Logothetis, D. E., Levitan, I. Identification of novel cholesterol-binding regions in Kir2 channels. The Journal of Biological Chemistry. 288, 31154-31164 (2013).
  51. Bukiya, A. N., Rosenhouse-Dantsker, A. Synergistic activation of G protein-gated inwardly rectifying potassium channels by cholesterol and PI(4,5)P2. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1859, 1233-1241 (2017).
  52. Yi, A., Lin, Y. F., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Yeast screen for constitutively active mutant G protein-activated potassium channels. Neuron. 29, 657-667 (2001).
  53. Bukiya, A., Dopico, A. M., Leffler, C. W., Fedinec, A. Dietary cholesterol protects against alcohol-induced cerebral artery constriction. Alcoholism, Clinical and Experimental Research. 38, 1216-1226 (2014).
  54. Simakova, M. N., Bisen, S., Dopico, A. M., Bukiya, A. N. Statin therapy exacerbates alcohol-induced constriction of cerebral arteries via modulation of ethanol-induced BK channel inhibition in vascular smooth muscle. Biochemical Pharmacology. 145, 81-93 (2017).

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कोलेस्ट्रॉल के साथ स्तनधारी ऊतकों और <em>ज़ेनोपस</em> ओसाइट्स का संवर्धन
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Slayden, A., North, K., Bisen, S., Dopico, A. M., Bukiya, A. N., Rosenhouse-Dantsker, A. Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol. J. Vis. Exp. (157), e60734, doi:10.3791/60734 (2020).

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