Summary
Twee methoden van cholesterolverrijking worden gepresenteerd: de toepassing van cyclodextrine verzadigd met cholesterol om zoogdierweefsels en -cellen te verrijken, en het gebruik van met cholesterol verrijkte fosforlipidengebaseerde dispersies (liposomen) om Xenopus-eocyten te verrijken. Deze methoden zijn instrumenteel voor het bepalen van de impact van verhoogde cholesterolniveaus in moleculaire, cellulaire en orgaanfunctie.
Abstract
Cholesterolverrijking van zoogdierweefsels en -cellen, waaronder Xenopus-eicellen die worden gebruikt voor het bestuderen van de celfunctie, kan worden bereikt met behulp van verschillende methoden. Hier beschrijven we twee belangrijke benaderingen die voor dit doel worden gebruikt. Ten eerste beschrijven we hoe we weefsels en cellen kunnen verrijken met cholesterol met behulp van cyclodextrine verzadigd met cholesterol met behulp van hersenslagaders (weefsels) en hippocampalneuronen (cellen) als voorbeelden. Deze benadering kan worden gebruikt voor elk type weefsel, cellen of cellijnen. Een alternatieve benadering voor cholesterolverrijking omvat het gebruik van low-density lipoprotein (LDL). Het voordeel van deze aanpak is dat het een deel van de natuurlijke cholesterol homeostase machines van de cel gebruikt. Hoewel de cyclodextrinebenadering kan worden toegepast om elk type cel met cholesterol te verrijken, is de LDL-benadering beperkt tot cellen die LDL-receptoren uitdrukken (bijvoorbeeld levercellen, beenmerg-afgeleide cellen zoals bloedleukocyten en weefselmacrofagen), en het verrijkingsniveau is afhankelijk van de concentratie en de mobiliteit van de LDL-receptor. Bovendien, LDL deeltjes omvatten andere lipiden, dus cholesterol levering is niet-specifiek. Ten tweede beschrijven we hoe xenopus-eicellen te verrijken met cholesterol met behulp van een op fosfolipiden gebaseerde dispersie (d.w.z. liposomen) die cholesterol bevat. Xenopus eicellen vormen een populaire heterologe expressie systeem dat wordt gebruikt voor het bestuderen van cel en eiwit functie. Voor zowel de op cyclodextrine gebaseerde cholesterolverrijkingsbenadering van zoogdierweefsel (hersenslagaders) als voor de op fosfolipiden gebaseerde cholesterolverrijkingsbenadering van Xenopus-eocyten, tonen we aan dat het cholesterolgehalte een maximum bereikt na 5 min incubatie. Dit cholesterolgehalte blijft constant tijdens langere incubatieperioden (bijvoorbeeld 60 min). Samen vormen deze gegevens de basis voor geoptimaliseerde temporele omstandigheden voor cholesterolverrijking van weefsels, cellen en Xenopus-eicellen voor functionele studies gericht op het ondervragen van de impact van cholesterolverrijking.
Introduction
Cholesterol, een belangrijke cellulaire lipide, speelt tal van kritische functionele en structurele rollen1,2,3,4,5,6,7,8,9. Van het reguleren van de fysische eigenschappen van het plasmamembraan tot het waarborgen van de levensvatbaarheid van de cel, groei, proliferatie en het dienen als een signalering en voorlopermolecuul in een overvloed aan biochemische paden, cholesterol is een dwingende component die nodig is voor de normale cel- en orgaanfunctie. Als gevolg daarvan, cholesteroltekort resulteert in ernstige fysieke misvormingen en een verscheidenheid van aandoeningen. Aan de andere kant is zelfs een kleine stijging van cholesterol boven fysiologischniveau (2-3x) cytotox1,2,10 en is geassocieerd met de ontwikkeling van aandoeningen, waaronder cardiovasculaire11,,12,13 en neurodegeneratieve ziekten14,15,16,17. Dus, om de kritische functies van cholesterol te ondervragen en om het effect van veranderingen in het cholesterolgehalte te bepalen, zijn verschillende benaderingen ontwikkeld die het gehalte aan cholesterol in weefsels, cellen en Xenopus-eicellen veranderen.
Wijziging van het cholesterolgehalte in weefsels en cellen van zoogdieren
Verschillende benaderingen kunnen worden gebruikt om het cholesterolgehalte in weefsels en cellen te verlagen18. Een benadering omvat hun blootstelling aan statines opgelost in lipoprotaire-deficiënte serum te remmen HMG-CoA reductase, die de snelheid van cholesterolsynthese controles19,20. Echter, deze cholesterolverlagende geneesmiddelen remmen ook de vorming van niet-sterol producten langs de mevalonaat pad. Daarom wordt een kleine hoeveelheid mevalonaat toegevoegd om de vorming van deze producten21 mogelijk te maken en de specificiteit van deze aanpak te verbeteren. Een andere benadering voor het verlagen van het cholesterolgehalte omvat het gebruik van β-cyclodextrines. Deze glucopyranose monomeren bezitten een interne hydrofobe holte met een diameter die overeenkomt met de grootte van sterolen22, die de extractie van cholesterol uit cellen vergemakkelijkt, waardoor ze uit hun eigen cholesterolgehalte23. Een voorbeeld is 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrine (HPβCD), een preklinisch geneesmiddel dat momenteel wordt getest voor de behandeling van de Niemann-Pick type C-ziekte, een genetisch erfelijke fatale stofwisselingsziekte die wordt gekenmerkt door lysosomale cholesterolopslag24. Het niveau van cholesterol uitputting is afhankelijk van de specifieke afgeleide gebruikt. Zo haalt HPβCD cholesterol met een lagere capaciteit dan het gemethyleerde derivaat, methyl-β-cyclodextrine (MβCD)24,25,26,27,28,29,30. Met name kunnen β-cyclodextrines echter naast cholesterol ook andere hydrofobe moleculen extraheren, wat dan kan leiden tot niet-specifieke effecten31. In tegenstelling tot uitputting kunnen cellen en weefsels specifiek worden verrijkt met cholesterol door behandeling met β-cyclodextrine die is voorverzadigd met cholesterol23. Deze aanpak kan ook worden gebruikt als een controle voor de specificiteit van β-cyclodextrines die worden gebruikt voor cholesteroluitputting31. Uitputting van cholesterol uit weefsels en cellen is eenvoudig en kan worden bereikt door het blootstellen van de cellen voor 30-60 min tot 5 mM MβCD opgelost in het medium dat wordt gebruikt voor het opslaan van de cellen. Deze aanpak kan resulteren in een 50% afname van het cholesterolgehalte (bijvoorbeeld in hippocampalneuronen32, rat cerebrale slagaders33). Aan de andere kant, de voorbereiding van de β-cyclodextrine-cholesterol complex voor cholesterolverrijking van weefsel en cellen is complexer, en zal worden beschreven in het protocol sectie.
Een alternatieve benadering voor het verrijken van weefsels en cellen met β-cyclodextrine verzadigd met cholesterol omvat het gebruik van LDL, dat is gebaseerd op LDL-receptoren uitgedrukt in de weefsels/cellen18. Hoewel deze aanpak biedt het voordeel van het gebruik van de natuurlijke cholesterol homeostase machines van de cel, het heeft verschillende beperkingen. Ten eerste kunnen weefsels en cellen die de LDL-receptor niet uitdrukken, niet worden verrijkt met deze aanpak. Ten tweede bevatten LDL-deeltjes naast cholesterol ook andere lipiden. LdL bestaat met name uit het eiwit ApoB100 (25%) en de volgende lipiden (75%): ~6-8% cholesterol, ~45-50% cholesterylester, ~18-24% fosfolipiden, en ~4-8% triacylglycerols34. De levering van cholesterol via LDL-deeltjes is dus niet specifiek. Ten derde kan het percentage van de toename van het cholesterolgehalte door LDL in weefsels en cellen die de LDL-receptor uitdrukken aanzienlijk lager zijn dan de waargenomen toename met cyclodextrine verzadigd met cholesterol. Bijvoorbeeld, in een eerdere studie, verrijking van knaagdieren cerebrale slagaders met cholesterol via LDL resulteerde in slechts een 10-15% stijging van het cholesterolgehalte35. Daarentegen resulteerde de verrijking van deze slagaders met cyclodextrine verzadigd met cholesterol zoals beschreven in de protocolsectie in >50% verhoging van het cholesterolgehalte (zie sectie Representatieve resultaten, figuur 1).
Wijziging van het cholesterolgehalte in Xenopus-eicellen
Xenopus-eicellen vormen een heterolog expressiesysteem dat vaak wordt gebruikt voor het bestuderen van de cel- en eiwitfunctie. Eerdere studies hebben aangetoond dat de cholesterol tot fosfolipide molaire verhouding in Xenopus-eicellen 0,5 ± 0,136is. Vanwege dit intrinsieke hoge cholesterolgehalte is het verhogen van het cholesterolgehalte in dit systeem een uitdaging, maar kan worden bereikt met behulp van dispersies gemaakt van membraanfosfolipiden en cholesterol. De fosfolipiden die we hiervoor hebben gekozen zijn vergelijkbaar met die welke worden gebruikt voor de vorming van kunstmatige vlakke lipide bilagen en omvatten L-α-phosphatidylethanolamine (POPE) en 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine (POPS), zoals beschreven in de protocolsectie. Deze aanpak kan resulteren in >50% verhoging van het cholesterolgehalte (Zie representatieve resultaten sectie, figuur 2).
Een alternatieve benadering voor het verrijken van Xenopus-eicellen met op fosfolipiden gebaseerde dispersies omvat het gebruik van cyclodextrine verzadigd met cholesterol, wat vergelijkbaar is met de manier waarop weefsels en cellen worden verrijkt. Echter, we hebben gevonden deze aanpak te zijn van lage reproduceerbaarheid en efficiëntie, met een gemiddelde van ~ 25% toename van het cholesterolgehalte. Dit is mogelijk te wijten aan de verschillende laadcapaciteit van deze twee benaderingen (Zie representatieve resultaten, figuur 3). In tegenstelling, het is aangetoond dat het gebruik van cyclodextrine om cholesterol uit Xenopus eicellen uit te putten kan resulteren in een ~ 40% daling van het cholesterolgehalte36.
Hier richten we ons op cholesterolverrijking van zoogdierweefsels en -cellen door de toepassing van cyclodextrine verzadigd met cholesterol, en van Xenopus-eicellen met liposomen. Beide benaderingen kunnen worden gebruikt om het effect van verhoogde niveaus van cholesterol op eiwitfunctie af te bepalen. De mechanismen van cholesterolmodulatie van de eiwitfunctie kunnen directe interacties8 en/of indirecte effecten omvatten9. Wanneer cholesterol de eiwitfunctie beïnvloedt via directe interacties, is het effect van een verhoging van het cholesterolgehalte op eiwitactiviteit waarschijnlijk onafhankelijk van het celtype, expressiesysteem of verrijkingsbenadering. Bijvoorbeeld, we gebruikten deze twee benaderingen om het effect van cholesterol op G-eiwit gated naar binnen gating kalium (GIRK) kanalen uitgedrukt in atrium myocyten37, hippocampal neuronen32,38, HEK29339 cellen, en Xenopus eicellen32,37. De resultaten van deze studies waren consistent: in alle drie de soorten zoogdiercellen en in amfibie-eicellen werd de gereglementeerde GIRK-kanaalfunctie (zie sectie Representatieve resultaten, figuur 4, voor hippocampalneuronen en de overeenkomstige experimenten in Xenopus-eicyten). Bovendien kwamen de waarnemingen in deze studies ook overeen met de resultaten van studies uitgevoerd bij atriummyocyten37,,40 en hippocampalneuronen32,38 vers geïsoleerd van dieren die onderworpen zijn aan een hoog cholesterolgehalte dieet40. Met name, cholesterolverrijking van hippocampal neuronen met behulp van MβCD omgekeerd het effect van atorvastatine therapie gebruikt voor het aanpakken van de impact van het hoog cholesteroldieet zowel op het cholesterolgehalte en GIRK functie38. In andere studies onderzochten we het effect van mutaties op de cholesterolgevoeligheid van het naar binnen gaan corrigerende kaliumkanaal Kir2.1 met behulp van zowel Xenopus-eicellen als HEK293-cellen41. Nogmaals, het effect van de mutaties op de gevoeligheid van het kanaal was vergelijkbaar in de twee systemen.
De toepassingen van beide verrijkingsmethoden voor het bepalen van de impact van verhoogde cholesterolniveaus op moleculaire, cellulaire en orgaanfunctie zijn talrijk. In het bijzonder, het gebruik van cyclodextrine-cholesterol complexen om cellen en weefsels te verrijken is zeer gebruikelijk grotendeels te wijten aan de specificiteit. Recente voorbeelden van deze aanpak zijn de bepaling van de impact van cholesterol op herg kanaal activering en onderliggende mechanismen42, de ontdekking dat cholesterol activeert de G-eiwit gekoppelde receptor Gladgestreken ter bevordering van Hedgehog signalering43, en de identificatie van de rol van cholesterol in stamcelbiomechanica en adipogenese door middel van membraan-geassocieerde linker eiwitten44. In ons eigen werk gebruikten we weefselverrijking van zoogdieren met het MβCD:cholesterolcomplex om het effect van cholesterolverrijking op de basisfunctie en het farmacologische profiel van calcium- en voltage-gated kanalen van grote geleiding (BK, MaxiK) in vasculaire gladde spier35,45,,46te bestuderen. In andere studies gebruikten we de op fosfolipiden gebaseerde dispersiebenadering voor het verrijken van Xenopus-eicellen met cholesterol om de rollen van verschillende regio's in Kir2.1- en GIRK-kanalen in cholesterolgevoeligheid41,47,,49te bepalen, evenals om vermeende cholesterolbindende plaatsen in deze kanalen32,50,51te bepalen.48
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele procedures met dieren werden uitgevoerd op de University of Tennessee Health Science Center (UTHSC). De verzorging van dieren en experimentele protocollen werden beoordeeld en goedgekeurd door het Comité voor dierverzorging en -gebruik van de UTHSC, een instelling die is geaccrediteerd door de Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International.
1. Verrijking van weefsels en cellen met methyl-β-cyclodextrine verzadigd met cholesterol
OPMERKING: Het onderstaande cholesterolverrijkingsprotocol is geschikt voor weefsels, cellen en cellijnen. Als voorbeeld beschrijven we de stappen die worden uitgevoerd voor het verrijken van zoogdierslagaders. Representatieve resultaten zijn voorzien voor zowel cerebrale slagaders (Figuur 1) en neuronen (Figuur 4).
- Bereiding van MβCD verzadigd met cholesterol
- Weeg 0,064 g MβCD af en los deze op in een kolf met 10 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om een eindconcentratie van 5 mM MβCD te verkrijgen. Roer de oplossing met een roerstaaf om ervoor te zorgen dat de MβCD volledig is opgelost.
- Weeg 0,0024 g cholesterolpoeder en voeg het toe aan dezelfde kolf om een cholesterolconcentratie van 0,63 mM te verkrijgen. Roer vervolgens de oplossing krachtig. Gebruik een spatel te breken zo veel cholesterol brokken mogelijk (sommige brokken zal blijven tot incubatie).
- Bedek de kolf met ten minste twee lagen paraffinefilm en schud langzaam (~ 30 oscillaties/min) in een waterbad van 37 °C 's nachts. Deze stap is van cruciaal belang.
- Na 8-16 uur koelt u de oplossing voor kamertemperatuur (RT) en filtreer deze vervolgens door een polyethersulfonespuitfilter van 0,22 μm in een glazen fles.
OPMERKING: Om verschillende cholesterolconcentraties in oplossing te bereiken, past u de hoeveelheden cholesterol en MβCD eenvoudig aan. Het is belangrijk om de MβCD:cholesterolmolaire verhouding op 8:1 te handhaven om verzadiging van methyl-β-cyclodextrinedrager met cholesterol te verkrijgen. De cholesterolverrijkende oplossing kan onmiddellijk of in de loop van enkele dagen worden gebruikt als deze bij 4 °C wordt opgeslagen. Echter, de cholesterol-verrijkende vermogen daalt na verloop van tijd als de cholesterol aggregaten verschijnen, en de oplossing wordt troebel.
- Behandeling van hersenslagaders met MβCD verzadigd met cholesterol
- Euthanaseer een Rat van Sprague Dawley (250-300 g) door het in een kamer met 2% isoflurane te plaatsen. Onthoofd vervolgens de verdoofde rat met behulp van een scherpe guillotine of een grote scherpe schaar.
OPMERKING: Als u deze procedures regelmatig uitvoert, is het handig om een schema voor guillotineverscherping te ontwikkelen. Ook moet een aparte schaar worden gewijd voor knaagdier onthoofding. Knaagdieronthoofding is een terminale procedure; daarom hoeven de instrumenten niet steriel te zijn. Schoonmaken met zeepwater na elk gebruik is voldoende. - Plaats het hoofd van de rat naar voren, weg van de onderzoeker. Plaats het puntige deel van een middelgrote schaar tussen de schedel en de hersenstam, en snijd zijwaarts aan beide zijden.
- Gebruik tangen om de bovenste schedel open te wrikken door te trekken op de basis van de schedel waar de laterale bezuinigingen werden gemaakt en zorgvuldig verwijderen van de hersenen. Zorg ervoor dat de optische zenuwen die de hersenen in de schedel te houden snijden.
- Zet de hersenen in een beker met PBS op ijs na verwijdering.
LET OP: De hersenen kunnen 4-6 uur op ijs worden bewaard bij 4 °C. - In een niet-steriele omgeving breng de rat hersenen naar een gewaxte dissectie kom met voldoende PBS om het onder te dompelen. Pin de hersenen naar beneden om te voorkomen dat het beweegt.
LET OP: Stap 1.2.5 kan bij RT worden uitgevoerd als deze snel wordt uitgevoerd. Anders moet het op ijs gebeuren. - Gebruik scherpe tangen en kleine chirurgische schaar om de cerebrale slagaders en hun takken die de Cirkel van Willis vormen aan de basis van de hersenen onder de microscoop in PBS op RT. Wees voorzichtig bij het ontleden om ervoor te zorgen dat de slagader weefsel niet wordt uitgerekt of gesneden. Deze stap is van cruciaal belang.
- Spoel de slagadersegmenten (tot 1 cm lang) in PBS kort in een 96-putplaat of in een schaal van 35 mm om het overgebleven bloed te verwijderen en plaats ze vervolgens gedurende 10 minuten in voldoende cholesterolverrijkende oplossing (bereid in stap 1.1) om de gehele slagadersegmenten te bedekken. Gebruik een schaal van 35 mm als er een ruime hoeveelheid cholesterolverrijkende oplossing en een 96-putplaat is als de slagaders klein zijn of als er een tekort is aan cholesterolverrijkende oplossing.
OPMERKING: Dezelfde aanpak kan worden gebruikt om andere weefsels en cellen te verrijken met cholesterol met behulp van een incubatietijd van 60 min. Bijvoorbeeld, deze aanpak is eerder gebruikt voor cholesterolverrijking van de muis cerebrale slagaders35,45, hippocampal neuronen32, atrium myocyten37, en HEK 293 cellen39. De minimale incubatietijd moet worden bepaald voor elk weefsel of celtype op basis van de validatie van cholesterolverrijking op verschillende tijdspunten met een cholesterolgevoelige test (bijvoorbeeld de biochemische bepaling van de hoeveelheid cholesterol in het weefsel door vlekken met de cholesterolgevoelige fluorescentiekleurstof filipin).
- Euthanaseer een Rat van Sprague Dawley (250-300 g) door het in een kamer met 2% isoflurane te plaatsen. Onthoofd vervolgens de verdoofde rat met behulp van een scherpe guillotine of een grote scherpe schaar.
- Vlek de slagader weefsel met de steroïde-gevoelige fluorescentie kleurstof filipin om eventuele wijzigingen in het cholesterolgehalte te bepalen.
OPMERKING: In de sectie Representatieve resultaten tonen we de resultaten van twee benaderingen om veranderingen in het cholesterolgehalte te beoordelen: een biochemische test uitgevoerd door de toepassing van een commercieel beschikbare op cholesterol oxidase gebaseerde kit (zie Tabel van materialen) en vlekken met de steroïde-gevoelige fluorescentie kleurstof filipin. De eerste aanpak kan worden uitgevoerd door de instructies van de fabrikant op te volgen. Het protocol voor deze laatste aanpak vindt u hieronder.- Bereid met behulp van een verse fles filipinpoeder een 10 mg/mL-voorraadoplossing in dimethylsulfoxide (DMSO). Deze stap is van cruciaal belang.
LET OP: De resulterende oplossing is lichtgevoelig. Indien correct voorbereid, is de filipin voorraadoplossing geelachtig. Sommige filipin poeder kan vasthouden aan de fles dop. Daarom is het belangrijk om de fles en dop te spoelen met DMSO oplosmiddel om de volledige hoeveelheid filipin te behouden. Eenmaal voorbereid, filipin voorraad moet worden gebruikt binnen enkele dagen. Filipin verliest volledig zijn fluorescentievermogen na 5 dagen, zelfs wanneer opgeslagen in het donker bij -20 °C. - Verwijder de slagadersegmenten uit de cholesterolverrijkende oplossing en was ze 3x met PBS gedurende 5 min.
- Bevestig de slagadersegmenten in 4% paraformaldehyde gedurende 15 min op ijs.
LET OP: Paraformaldehyde is lichtgevoelig. Daarom moeten de werkzaamheden in het donker worden uitgevoerd. - Plaats de slagadersegmenten in 0,5% Triton in PBS bij RT gedurende 10 min om het weefsel te permeabilize en de penetratie van kleurstof te vergemakkelijken.
- Was de slagadersegmenten 3x met PBS gedurende 5 min op een shaker. Deze stap is van cruciaal belang.
LET OP: Wanneer de Triton volledig is uitgewassen, mogen er geen bellen op het oppervlak van de PBS-oplossing zijn. - Verdun de filipin stock oplossing in PBS tot een eindconcentratie van 25 μg/mL. Verwijder de slagaders vormen de PBS-oplossing en plaats ze in de verdunde filipin oplossing voor 1 uur in het donker. Deze stap is van cruciaal belang.
- Was de filipin door het spoelen van de slagader segmenten 3x met PBS voor 5 min op een shaker. Deze stap is van cruciaal belang.
- Spoel de slagadersegmenten kort af met gedestilleerd water, absorbeer overmatige vloeistof met een papieren servet en monteer de slagaders op een glijbaan met behulp van commercieel beschikbare montagemedia (zie Tabel van materialen).
- Bedek de slagader met een uitglijder vermijden rollen of draaien van de slagader en zet de dia's te drogen in een donker gebied op RT voor 24 uur.
- Nadat de montagemedia zijn gedroog, verzegelt u de afdekkingsranden met duidelijke nagellak en laat u de nagellak 10-15 min drogen. Bewaar de dia's in het donker bij -20 °C. Bewaar de dia's in het donker bij -20 °C. Bewaar de dia's in het donker bij -20 °C.
- Equilibrate de dia's naar RT voor beeldvorming.
- Beeld het weefsel met een fluorescentiemicroscoop of een fluorescentielezer met de excitatie ingesteld op 340-380 nm en emissie op 385-470 nm.
LET OP: Filipin fotobleekt snel; monsters moeten dus snel worden afgebeeld.
- Bereid met behulp van een verse fles filipinpoeder een 10 mg/mL-voorraadoplossing in dimethylsulfoxide (DMSO). Deze stap is van cruciaal belang.
2. Verrijking van Xenopus-eicellen met cholesterolverrijkte fosforlipidengebaseerde dispersies (liposomen)
- Voorbereiding van oplossingen
- Om een voorraadoplossing van cholesterol voor te bereiden, los 10 mg cholesterolpoeder op in 1 mL chloroform in een glasbeker of fles van 10 mL. Breng de oplossing over in een glazen fles met een afgesloten glazen fles van 1,5 mL.
LET OP: Met het oog op de toxiciteit en snelle verdamping van chloroform, werken in de kap en houden reagentia op ijs. - Bereid een 150 mM KCl, 10 mM Tris-HEPES, pH = 7,4 buffer voor cholesterolverrijkte fosfolipiden. Los hiervoor op in een Erlenmeyer-kolf van 5,5905 g KCl en 0,6057 g Tris in dubbel gedestilleerd water tot een totaal volume van 0,5 L. Los in een andere kolf 5,5905 g KCl en 1,19155 g HEPES op in dubbel gedestilleerd water tot een totaal volume van 0,5 L. Meng de twee oplossingen samen in een 1 L Erlenmeyer kolf en pas de pH aan op 7,4 met HCl.
LET OP: Bewaar de resulterende 150 mM KCl, 10 mM Tris-HEPES oplossing bij 4 °C. - Voor de voorbereiding van ND96 pre-medium eicelkweken (lage K+, lage Ca2+) buffer, combineren 1 mL van 2 M KCl, 1 mL van 1 M MgCl2,45,5 mL van 2 M NaCl, en 5 mL van 1/1 M NaOH-HEPES in een 1 L Erlenmeyer kolf. Voeg 900 mL dubbel gedestilleerd water toe en stel de pH aan op 7,4 met HCl. Breng de oplossing over op een 1 L-cilinder en breng het volume naar 1 L met dubbel gedestilleerd water. Voeg vervolgens 1,8 mL van 1 M CaCl2 toe en filter de oplossing.
OPMERKING: Lichte variaties in de verhoudingen tussen de componenten die worden gebruikt om een ND96-oplossing te maken, lijken niet van cruciaal belang voor cholesterolverrijking, mogelijk omdat de ND96-oplossing niet wordt gebruikt tijdens de verrijkingsstap zelf, maar voor opslag. Een voorbeeld is een 1 L-oplossing met een iets lagere concentratie natrium- en chloride-ionen, en wordt gemaakt door het combineren van 2 mL van 1 M KCl, 1 mL van 1 M MgCl2,82,5 mL van 1 M NaCl, 5 mL van 1 M HEPES en 1,8 mL van 1 M CaCl2 (Ca2+ wordt weggelaten om een Ca2+ vrije oplossing te verkrijgen). Stel de pH van de oplossing aan op 7,4 met NaOH. Bewaar de resulterende ND96-eicelkweekoplossing maximaal 1 maand op 4 °C.
- Om een voorraadoplossing van cholesterol voor te bereiden, los 10 mg cholesterolpoeder op in 1 mL chloroform in een glasbeker of fles van 10 mL. Breng de oplossing over in een glazen fles met een afgesloten glazen fles van 1,5 mL.
- Bereiding van de op fosfolipide gebaseerde dispersie met cholesterolliposomen
- Combineer in een glazen buis van 12 mL 200 μL van elk van de volgende 10 mg/mL chloorform-opgeloste lipideoplossingen: L-α-phosphatidylethanolamine, 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine en cholesterol.
- Verdamp de chloroform in de kap om langzaam te drogen onder een stroom stikstof. Deze stap is van cruciaal belang.
- Hang de lipiden op in 800 μL gebufferde oplossing bestaande uit 150 mM KCl en 10 mM Tris-HEPES bij pH = 7,4, en bedek met paraffinefilm.
- Sonicaer zachtjes op 80 kHz gedurende 10 min tot een melkachtig mengsel wordt gevormd. Deze stap is van cruciaal belang.
LET OP: Bij het soniceren moet de dispersie in de glazen buis voorzichtig trillen en kleine golven vormen. Druppels dispersie mogen niet in de buis springen.
- Xenopus-eicellen verrijken met cholesterol
OPMERKING: Kikker-eicelbevattende eierstokken kunnen worden verkregen uit twee bronnen: Ten eerste kunnen Xenopus laevis vrouwelijke kikkers worden gehuisvest met het oog op interne chirurgie. Deze procedure moet worden goedgekeurd door het Institutioneel Comité voor dierverzorging en -gebruik. Ten tweede kunnen hele eierstokken worden gekocht bij commerciële leveranciers. Als alternatief voor de aankoop of isolatie van hele eierstokken en vervolgens verteren zoals beschreven in stappen 2.3.1-2.3.4, individuele eicellen zijn commercieel beschikbaar voor aankoop. Als deze laatste worden gebruikt, kunnen stappen 2.3.1-2.3.4 worden overgeslagen.- Bewaar de vers verkregen eierstokken op ~14 °C in een ND96-oplossing. Onder deze omstandigheden kunnen de eierstokken maximaal 1 week worden bewaard.
- Om individuele eicellen te verkrijgen, verstoor de eierstokzak op meerdere plaatsen met behulp van scherpe tangen. Plaats de eierstokbrokken in een plaat van 60 mm, met 5 mL ca2+-vrije ND96 aangevuld met 0,5 mg/mL collageenase. Schud op een orbitale shaker bij 60 oscillaties/min gedurende 15 min bij RT.
OPMERKING: Deze stap zorgt voor de vertering van de eierstokzak. Om enzymatische activiteit te behouden, moet u voorkomen dat collageenase met ND96 voor langere tijd wordt opgeslagen (>1 h). Zelfs korte opslag moet worden uitgevoerd bij koele temperaturen van minder dan 15 °C. - Met behulp van een overdracht pipet met een brede tip, krachtig pipetteer de eicelhoudende oplossing op en neer ongeveer 5-10x om individuele eicellen te scheiden. Bij deze stap wordt de oplossing donker.
- Spoel de eicellen snel af met Ca2+-vrije ND96 tot de oplossing transparant wordt.
- Breng individuele eicellen over naar Ca2+-met ND-96 oplossing aangevuld met 2 mg/mL gentamicin met behulp van een transferpipet met een smalle punt.
OPMERKING: Deze stap is essentieel wanneer het nodig is om de eicellen op te slaan. Individuele eicellen kunnen meerdere dagen in een couveuse worden bewaard bij 14-17 °C. Dode eicellen die witachtig zijn, moeten echter ten minste eenmaal per dag worden verwijderd om verontreiniging van de oplossing met giftige chemicaliën te voorkomen. - Breng 90 μL van de met cholesterol verrijkte fosforlipidengebaseerde dispersie over in één put van een 96-putplaat.
- Breng tot zes eicellen van het ND96 medium naar de put met zo weinig medium mogelijk. Deze stap is van cruciaal belang.
LET OP: Stel de eicellen tijdens de overdracht niet bloot aan de lucht om de eicellen intact te houden. - Plaats de 96 put plaat op een drie-dimensionale platform rotator om een kleine orbitale beweging te bieden aan de eicellen in de cel voor 5-10 min.
- Voeg een druppel ND96 toe aan de put en breng de met cholesterol verrijkte eicellen van de 96-putplaat over naar een 35 mm plaat met ND96 voor direct gebruik. Deze stap is van cruciaal belang.
- Gebruik een in de handel verkrijgbare kit op basis van cholesteroloxidase (zie Materiaaltafel)om veranderingen in het cholesterolgehalte te beoordelen door de instructies van de fabrikant op te volgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het gebruik van cyclodextrine verzadigd met cholesterol als middel voor het verrijken van weefsels en cellen met cholesterol is goed ingeburgerd. Hier tonen we eerst de toepassing van deze veelgebruikte aanpak voor het verrijken van de hersenenslagaders van ratten met cholesterol met behulp van MβCD verzadigd met cholesterol. Figuur 1A toont een voorbeeld van een afgebeelde cerebrale slagader gladde spierlaag en toont de concentratie-afhankelijke toename van filipin-geassocieerde fluorescentie verkregen op weefselverrijking met toenemende concentraties van cholesterol variërend van 6,25 μM-6,25 mM voor 1 uur. Overeenkomstige kwantificering van de beeldvormingsgegevens wordt afgebeeld in figuur 1B. Met name de stijging van het cholesterolgehalte 2 uur na de incubatietijd van 1 uur was ~ 50% van de toename die onmiddellijk na de behandeling met het MβCD:cholesterolcomplex werd waargenomen. Zoals figuur 1C aantoont voor het monster dat gedurende 1 uur met 0,625 mM cholesterol wordt behandeld, moeten functionele studies met behulp van de behandelde weefsels zo snel mogelijk worden uitgevoerd nadat de cholesterolverrijking is voltooid. Bovendien, terwijl een 1 uur incubatietijd wordt vaak gebruikt om weefsels en cellen te verrijken met cholesterol met behulp van deze aanpak, 5 min van de incubatie is meestal voldoende om een statistisch significante toename van de cerebrale slagader cholesterolgehalte zoals bepaald door een cholesterol oxidase gebaseerde biochemische test, zoals afgebeeld in figuur 1Dte bereiken. De stijging van het cholesterolgehalte bleef op hetzelfde niveau toen de incubatietijd werd verhoogd tot 60 min(figuur 1D).
De effectiviteit van met cholesterol verrijkte liposomen als middel om Xenopus-eicellen te verrijken met cholesterol wordt aangetoond in figuur 2A-C. Hoewel er geen significante verandering werd waargenomen in het cholesterolgehalte in de controle fosfolipide gebaseerde dispersies ontbreekt cholesterol (Figuur 2A), cholesterolgehalte aanzienlijk verhoogd na slechts 5 min van de behandeling met de fosfolipide gebaseerde dispersies die cholesterol opgenomen, en bleef op hetzelfde niveau toen de incubatietijd werd verhoogd tot 60 min (Figuur 2B). Een soortgelijk effect werd waargenomen in twee verschillende partijen eicellen die werden verkregen van twee kikkers. Met name, zowel de initiële niveaus van cholesterol en de verandering in cholesterolgehalte varieerden tussen de twee partijen: in batch 1 was de initiële concentratie cholesterol 64 μg cholesterol per mg eiwit, terwijl de initiële concentratie in batch 2 45 μg cholesterol per mg eiwit was, wat ~70% is van de initiële niveaus van cholesterol in batch 1. Na een behandeling van 60 min was de concentratie cholesterol in batch 1 1 124 μg cholesterol per mg eiwit, terwijl het in batch 2 67 μg cholesterol per mg eiwit was. Dus, terwijl de concentratie van cholesterol verhoogd met meer dan ~ 90% in batch 1, het steeg met ~ 50% in batch 2. Niettemin biedt de aanzienlijke verhoging van het cholesterolgehalte in beide partijen de middelen om het effect van een verhoging van het cholesterolgehalte op de functie van eiwitten uitgedrukt in dit heterologe expressiesysteem te onderzoeken. Bovendien lijkt de op fosfolipiden gebaseerde dispersiebenadering voor het verrijken van Xenopus-eicellen effectiever dan de toepassing van cyclodextrine verzadigd met cholesterol zoals gedaan in weefsels en cellen. Zoals figuur 3 aantoont, de toepassing van cyclodextrine-cholesterol complexen om eicellen te verrijken met behulp van 5mM cyclodextrine resulteerde in een gemiddelde van slechts ~ 25% stijging van het cholesterolgehalte.
De effectiviteit van de cyclodextrine-gebaseerde aanpak voor het verrijken van cellen wordt ook aangetoond in neuronen vers geïsoleerd van de CA1-regio van de hippocampus (Figuur 4A). Zoals figuur 4B laat zien, resulteerde de incubatie van de neuronen in MβCD verzadigd met cholesterol gedurende 60 min in meer dan 2x verhoging van het cholesterolgehalte, zoals bepaald door de filipin-geassocieerde fluorescentie. Met behulp van deze aanpak hebben we het effect van de toename van cholesterol op GIRK-kanalen getest, uitgedrukt in hippocampalneuronen. Zoals figuur 4C aantoont, resulteerde deze verandering in het cholesterolgehalte in een aanzienlijke toename van GIRK-stromen. Op dezelfde manier testten we het effect van cholesterolverrijking op de primaire GIRK-subeenheid uitgedrukt in de hersenen, GIRK2, met behulp van het Xenopus-eicellen heterologe expressiesysteem. Hiertoe hebben we GIRK2^ (GIRK2_E152D), een poriemutant van GIRK2, die de membraanexpressie en activiteit52 in Xenopus-eicellen verhoogt, overdreven en de eicellen gedurende 60 min verrijkt met cholesterol met behulp van de op fosfolipiden gebaseerde dispersiebenadering. Zoals cijfers 4D-F aantonen, resulteerde de verhoging van het cholesterolgehalte in een aanzienlijke toename van stromingen die vergelijkbaar zijn met het effect van een verhoogd cholesterolgehalte in neuronen op girk-kanaalfunctie. Deze gegevens tonen verder de effectiviteit, consistentie en het nut van de twee hierboven beschreven benaderingen voor het bepalen van de impact van verhoogde cholesterolniveaus op eiwitactiviteit en cellulaire functie.
Figuur 1: Representatieve verrijking van de cerebrale slagaders van ratten met cholesterol met methyl-β-cyclodextrine verzadigd met cholesterol. (A) Een voorbeeld van een afgebeelde cerebrale slagader gladde spierlaag waaruit blijkt dat de concentratie-afhankelijke toename van filipin-geassocieerde fluorescentie verkregen op weefselverrijking met toenemende concentraties van cholesterol variërend van 6,25 μM-6,25 mM voor 1 h. (B) Kwantificering van de beeldvormingsgegevens in (A). Fluorescentieintensiteit meting van het gehele beeld werd uitgevoerd met behulp van de ingebouwde "Measurement" functie in commerciële software. Bij elke cholesterolconcentratie werden ≥3-beelden verzameld uit slagaders die werden geoogst van afzonderlijke dierlijke donoren. Voor elke cholesterolconcentratie worden gegevens gepresenteerd als de gemiddelde ± standaardfout. (C) Cholesterolgehalte in cerebrale slagader gladde spierlaag segmenten onmiddellijk na een 1 uur incubatietijd met 0,625 mM cholesterol, en 3 uur na het begin van de behandeling (dat wil zeggen, 1 uur incubatie gevolgd door 2 uur in PBS). dD) Afhankelijkheid van het cholesterolgehalte op de incubatietijd zoals bepaald door een biochemische test op basis van cholesteroloxidase. Een significant verschil wordt aangegeven door een sterretje (*p ≤ 0,05). Panelen (A) (cholesterolconcentraties 0 mM-0,625 mM), (B) en (C) zijn gewijzigd van Noord et al.45. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Representatieve verrijking van Xenopus-eicellen met cholesterol met behulp van liposomen. (A) Vouw verandering in cholesterolgehalte van de controle Xenopus eicellen geïncubeerd in cholesterol-vrije liposomen voor 5-60 min. (B) Vouw verandering in cholesterolgehalte van Xenopus eicellen geïncubeerd in cholesterolverrijkte liposomen voor 5-60 min. De afgebeelde controlebalk verwijst naar incubatie in cholesterolvrije liposomen gedurende 5 min en wordt getoond als een vergelijking. ( C) Vergelijking van het effect van cholesterolverrijking van twee verschillende partijen Xenopus-eicellen met cholesterolverrijkte liposomen gedurende 5 en 60 min. Een significant verschil wordt aangegeven door een sterretje (*p ≤ 0,05). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Representatieve verrijking van Xenopus-eicellen met cholesterol met methyl-β-cyclodextrine verzadigd met cholesterol. (A) Vouw verandering in het cholesterolgehalte van de controle Xenopus eicellen geïncubeerd in de controle ND96 media voor 5-60 min. (B) Vouw verandering in cholesterolgehalte van Xenopus eicellen geïncubeerd in MβCD verzadigd met cholesterol voor 5-60 min. De afgebeelde controlebalk verwijst naar incubatie in controlemedia gedurende 5 min en wordt weergegeven als een vergelijking. Een significant verschil wordt aangegeven door een sterretje (*p ≤ 0,05). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Representatieve voorbeelden van studies naar cholesterolverrijking op eiwitfunctie in cellen en Xenopus-eicellen: de impact van cholesterol op G-eiwit naar binnen corrigerende kaliumkanalen. (A) Filipin-geassocieerdfluorescentiesignaal van hippocampal CA1 piramidale neuron van ratten op controle (links) versus cholesterol verrijkt (rechts). (B) Samenvatting van de filipin-geassocieerde fluorescentiesignalen verkregen uit controle en cholesterolverrijkte vers geïsoleerde hippocampal CA1 piramidale neuronen. Cholesterolverrijking werd bereikt door het uitbroeden van de neuronen in MβCD verzadigd met cholesterol gedurende 1 uur (n = 12-14). (C) Ionische stroom (I)-voltage(V) curve die het effect van cholesterolverrijking weergeeft zoals beschreven in (B) op GIRK-stromen in hippocampalneuronen uit de CA1-regio. dD) Representatieve sporen die het effect van cholesterolverrijking met cholesterolverrijkte fosfolipiden gebaseerde liposomen op GIRK2^ (GIRK2_E152D) uitgedrukt in Xenopus-eicellen bij -80 mV en +80 mV. (E) Samenvatting van (D) op -80 mV (n = 6-9). Een significant verschil wordt aangegeven door een sterretje (*p ≤ 0,05). Subcijfers (B-E) zijn gewijzigd van Bukiya et al.32. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Methoden om weefsels en cellen van zoogdieren te verrijken en Xenopus-eicellen met cholesterol vormen een krachtig instrument voor het onderzoeken van het effect van verhoogde cholesterolniveaus op individuele moleculaire soorten, op complexe macromoleculaire systemen (bijvoorbeeld eiwitten) en op cellulaire en orgaanfunctie. In dit document hebben we twee complementaire benaderingen beschreven die dergelijke studies vergemakkelijken. Eerst beschreven we hoe we weefsels en cellen kunnen verrijken met cholesterol met behulp van MβCD verzadigd met cholesterol. We hebben aangetoond dat in cerebrale slagader segmenten, deze aanpak resulteerde in een toename van ~ 50% in cholesterolgehalte. Bovendien, in een recente studie, toonden we aan dat dezelfde aanpak leidt tot een meer dan 2x toename van het cholesterolgehalte in hippocampal neuronen uit de CA1 regio. In tegenstelling, echter, met behulp van deze aanpak als een middel om Xenopus eicellen te verrijken resulteerde in slechts ~ 25% toename van het cholesterolgehalte in Xenopus eicellen. Dus, voor het verrijken van Xenopus eicellen, hebben we een fosfolipide-gebaseerde dispersie benadering die consequent resulteert in ten minste ~ 50% verhoging van het cholesterolgehalte. Het voordeel van deze aanpak voor het verrijken van Xenopus-eicellen komt voort uit een verbeterde laadcapaciteit in vergelijking met de laadcapaciteit van de MβCD:cholesterol-complexbenadering. Het is ook mogelijk dat, terwijl de MβCD: cholesterol complexe aanpak is geoptimaliseerd voor het verrijken van weefsels en cellen, verdere optimalisatie van het protocol nodig is om de toepassing ervan te verbeteren voor het verrijken van Xenopus eicellen.
De op fosfolipiden gebaseerde dispersie die wordt gebruikt om Xenopus-eicellen te verrijken met cholesterol omvat twee lipiden die op grote schaal worden gebruikt om vlakke lipidebilagen te maken (d.w.z. L-α-phosphatidylethanolamine en 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine). Echter, in een eerdere studie, het werd aangetoond dat Xenopus eicellen kunnen ook worden verrijkt met behulp van cholesterol van liposomen die fosforatidylcholine en cholaat36opgenomen . Deze methode resulteerde in een verhoging van de cholesterol/fosfolipide molaire verhouding in het plasmamembraan van 0,5 ± 0,1 tot 0,9 ± 0,1 met een gemiddeld verrijkingspercentage van 71%. Dit gemiddelde percentage van verrijking is zeer vergelijkbaar met het gemiddelde niveau van verhoging van het cholesterolgehalte dat we waargenomen (~ 70,5%), wat suggereert dat de keuze van fosfolipiden gebruikt om de dispersie te vormen is niet van cruciaal belang voor het verrijken van Xenopus eicellen met cholesterol met behulp van deze aanpak.
Elk beschreven protocol omvat verschillende kritieke stappen. Na het bereiden van een MβCD:cholesterolmengsel met een 8:1-molaire verhouding om de verzadiging van MβCD met cholesterol te garanderen, is het van cruciaal belang om de kolf te bedekken met ten minste twee lagen paraffinefilm en deze 's nachts in een langzaam schuddend 37 °C-waterbad te plaatsen. Bij het ontleden van weefsels voor cholesterolbehandeling is het belangrijk om voorzichtig te zijn om ervoor te zorgen dat het weefsel niet wordt uitgerekt of gesneden. Na het permeabiliseren van het weefsel om de penetratie van kleurstof te vergemakkelijken, is het van cruciaal belang om de weefselsegmenten in PBS grondig te wassen. Weefselkleuring in fillipin moet worden uitgevoerd in het donker, en de fillipin moet zorgvuldig worden uitgewassen nadat de kleuring is voltooid. Bij de voorbereiding van cholesterolverrijkte fosforlipidengebaseerde dispersies, is het van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de dispersie in de glazen buis zachtjes trilt, kleine golven vormt, om scheiding van de cholesterol van de dispersie te voorkomen. Voor cholesterolbehandeling van Xenopus-eicellen is het belangrijk om de eicellen van het ND96-medium naar de put over te brengen met de cholesterolverrijkte fosforlipiden-gebaseerde dispersie met zo weinig mogelijk medium, terwijl de eicellen niet worden blootgesteld aan lucht om de eicellen intact te houden. Het is belangrijk op te merken dat als gevolg van de intrinsieke machines in weefsels, cellen en Xenopus-eicellen, het cholesterolgehalte kan equilibraleren en na verloop van tijd terugkeren naar hun oorspronkelijke niveau. Daarom moeten functionele studies onmiddellijk na de incubatietijd worden uitgevoerd. Hier hebben we aangetoond dat dit begrip in cerebrale slagaders verrijkt met cholesterol, waaruit blijkt dat de stijging van het cholesterolgehalte 2 uur na een incubatietijd van 1 uur was ongeveer de helft van de toename waargenomen onmiddellijk na de incubatietijd.
Ondanks het volgen van de hierboven beschreven kritische stappen, kunnen zich verschillende uitdagingen voordoen. Bijvoorbeeld, een verhoging van het cholesterolgehalte kan niet worden waargenomen na de cholesterol-verrijkende behandeling. Als dit het geval is, kan het nodig zijn om de concentratie van cholesterol in de cholesterol-verrijkende media te verhogen. Hetzelfde geldt voor cholesterolverrijking van weefsels, cellen en Xenopus-eicellen. Bij de voorbereiding van behandelingen met behulp van de MβCD:cholesterolcomplexe benadering moet de hoeveelheid MβCD echter worden verhoogd met de verhoging van de cholesterolconcentratie om een 8:1-molaire verhouding met cholesterol te behouden. Bovendien kan het nodig zijn om een verse cholesterolverrijkende oplossing voor te bereiden, omdat cholesterol de neiging heeft om uit de oplossing neer te slaan en de oplossing zijn cholesterolverrijkende efficiëntie verliest. Na cholesterolverrijking is het mogelijk dat een filipinsignaal niet wordt waargenomen. Als dit het geval is, kan het nodig zijn om een vers filipin poeder te gebruiken om een nieuwe voorraad voor te bereiden en het experiment te herhalen. Filipin fluorescentie neemt snel af en de voorraadoplossing kan niet langer dan enkele dagen worden opgeslagen. Een beperking van filipin vlekken is dat het lijkt te herkennen steroïden andere dan cholesterol. Zo hebben we onlangs een toename van het filipin-geassocieerde fluorescentiesignaal in de cerebrale slagaders van ratten aangetoond na verrijking met coprostanol45. Dus, filipin kleuring resultaten moeten worden geïnterpreteerd met de nodige voorzichtigheid, en bij twijfel, alternatieve benaderingen moeten worden gebruikt om de resultaten te bevestigen. Een mogelijkheid zou zijn om een biochemische test uit te voeren door de toepassing van een commercieel beschikbare cholesterol oxidase-gebaseerde kit.
Samengevat, de gepresenteerde benaderingen zijn zeer effectief in het bereiken van cholesterolverrijking van dicht bij of meer dan 50%. Inderdaad, de MβCD: cholesterol complexe aanpak die resulteert in ~ 50% in cholesterolgehalte in cerebrale slagaders is veel efficiënter dan het gebruik van LDL om deze weefsels te verrijken, wat resulteert in een louter ~ 10% toename van cholesterol35. Hetzelfde geldt voor de toepassing van met cholesterol verrijkte fosforlipiden gebaseerde dispersies (liposomen) om Xenopus-eocyten te verrijken. Zoals hierboven beschreven, deze aanpak resulteert consequent in ten minste een 50% stijging van het cholesterolgehalte. Belangrijk is dat deze twee benaderingen voor cholesterolverrijking in vitro yield resultaten die vergelijkbaar zijn met de cholesterolverhoging verkregen door de dieren te onderwerpen aan een hoog cholesterolgehalte dieet32,37,40,53,54. Bovendien, in tegenstelling tot weken-lange hoog cholesterolgehalte diëten, in vitro benaderingen vereisen slechts een paar minuten incubatietijd om een statistisch significante en steady-state verhoging van het cholesterolgehalte te bereiken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. A. M. Dopico is een speciale, part-time, federale werknemer en huidig lid van de National Advisory Council on Alcohol Abuse and Alcoholism.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een Scientist Development Grant (11SDG5190025) van de American Heart Association (naar A.R.-D.), en door het National Institute of Health R01 verleent AA-023764 (naar A.N.B.), en HL-104631 en R37 AA-11560 (aan A.M.D.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplex Red Cholesterol Assay Kit | Invitrogen | A12216 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA set | Thermo Scientific | 23208 | |
| Brain PE 25Mg in Chloroform | Avanti Lipids | 840022C | |
| 16:0-18:1 PS 25Mg Chloroform | Avanti Lipids | 840034C | |
| Cholesterol 100Mg Powder | Sigma | C8667 | |
| KCl | Fisher | P217 | |
| Trizma base | Sigma | T6066 | |
| HEPES | Corning | 61-034-RO | |
| MgCl2 | Fisher | M33 | |
| NaCl | Fisher | S271 | |
| KH2PO4 | Fisher | P285 | |
| MgSO4 | EMD Chemicals | MX0070-1 | |
| EDTA | VWR | E177 | |
| Dextrose Anhydrous | Fisher | BP350 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| Blood Gas Tank | nexAir | ||
| NaOH | Fisher | S318 | |
| 1.5mL tubes | Fisher | S35818 | |
| Gastight Syringe 100uL | Hamilton | 1710 | |
| Microliter Syringe 25uL | Hamilton | 702 | |
| 12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tube | Pyrex | 8120-12 | |
| Chloroform | Fisher | C298 | |
| Support Stand | Homescience Tools | CE-STAN5X8 | |
| Universal Clamp, 3-Prong | Homescience Tools | CE-CLPUNIV | |
| Sonicator | Laboratory Supplies | G112SP1G | |
| 3D rotator mixer | Benchmark Scientific | B3D 1308 | |
| 96 well plate | Sigma | BR781602 | |
| N2 gas | nexAir | ||
| Glass beakers 40ml-1L | Fisher | 02-540 | |
| Ice Machine | Scotsman | CU1526MA-1 | |
| Ice bucket | Fisher | 50-136-7764 | |
| 1X PBS | Corning | 21-031-CM | |
| TritonX | Fisher | BP151-100 | |
| Sonic Dismembrator | Fisher | Model 100 | |
| Eppendorf microcentrifuge | Eppendorf | Model 5417R | |
| Amber bottles | Fisher | 03-251-420 | |
| Corning™ Disposable Glass Pasteur Pipets | FIsher | 13-678-4A | |
| Parafilm | FIsher | 50-998-944 | |
| Isotemp™ BOD Refrigerated Incubator | FIsher | 97-990E | |
| Oocytes | Xenoocyte™ | 10005 | |
| Rat | Envigo | Sprague Dawley | weight 250g |
| Methyl-β-cyclodextrin | Sigma | C4555 | |
| Water bath incubator with shaker | Precision | 51221080 | Lowest shaker setting O/N 37 °C |
| Filipin | Sigma | SAE0088-1ML | |
| DMSO | Fisher | BP231 | |
| Paraformaldehyde 4% | Mallinckrodt | 2621 | |
| DI H2O | University DI source | ||
| ProLong Gold antifade reagnet | Invitrogen | P10144 | |
| Microslides 75x25mm Frosted | Diagger | G15978A | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Microscope Coverslip | Diagger | G15972B | |
| Clear nail polish | Revlon | 771 Clear | |
| Labeling Tape | Fisher | 15-901-20F | |
| Securline Lab Marker II | Sigma | Z648205-5EA | |
| BD 10mL Syringe | Fisher | 14-823-16E | |
| 1.2 μm syringe filter | VWR | 28150-958 | |
| KimWipes | Fisher | 06-666A | |
| pH probe | Sartorus | py-p112s | |
| pH meter | Denver instrument | Model 225 | |
| 70% ETOH | Pharmco | 211USP/NF | |
| Timer | Fisher | 02-261-840 | |
| Steno book | Staples | 163485 |
References
- Yeagle, P. L. Cholesterol and the cell membrane. Biochimica et Biophysica Acta. 822, 267-287 (1985).
- Yeagle, P. L. Modulation of membrane function by cholesterol. Biochimie. 73, 1303-1310 (1991).
- Gimpl, G., Burger, K., Fahrenholz, F. Cholesterol as modulator of receptor function. Biochemistry. 36, 10959-10974 (1997).
- Maxfield, F. R., van Meer, G. Cholesterol, the central lipid of mammalian cells. Current Opinion in Cell Biology. 22, 422-429 (2010).
- Goluszko, P., Nowicki, B. Membrane cholesterol: a crucial molecule affecting interactions of microbial pathogens with mammalian cells. Infection and Immunity. 73, 7791-7796 (2005).
- Ramprasad, O. G., et al. Changes in cholesterol levels in the plasma membrane modulate cell signaling and regulate cell adhesion and migration on fibronectin. Cell Motility and Cytoskeleton. 64, 199-216 (2007).
- Rosenhouse-Dantsker, A., Mehta, D., Levitan, I. Regulation of Ion Channels by Membrane Lipids. Comprehensive Physiology. 2, 31-68 (2012).
- Direct mechanisms in cholesterol modulation of protein function. Advances in Experimental Medicine and Biology. Rosenhouse-Dantsker, A., Bukiya, A. N. , Springer Nature. Switzerland. 1135 (2019).
- Cholesterol modulation of protein function: sterol specificity and indirect mechanisms. Advances in Experimental Medicine and Biology. Rosenhouse-Dantsker, A., Bukiya, A. N. , Springer Nature. Switzerland. 1115 (2019).
- Kellner-Weibel, G., Geng, Y. J., Rothblat, G. H. Cytotoxic cholesterol is generated by the hydrolysis of cytoplasmic cholesteryl ester and transported to the plasma membrane. Atherosclerosis. 146, 309-319 (1999).
- Kruth, H. S. Lipoprotein cholesterol and atherosclerosis. Current Molecular Medicine. 1, 633-653 (2001).
- Ross, R. Atherosclerosis--an inflammatory disease. The New England Journal of Medicine. 340, 115-126 (1999).
- Steinberg, D. Atherogenesis in perspective: hypercholesterolemia and inflammation as partners in crime. Nature Medicine. 8, 1211-1217 (2002).
- Ho, Y. S., Poon, D. C. H., Chan, T. F., Chang, R. C. C. From small to big molecules: How do we prevent and delay the progression of age- related neurodegeneration? Current Pharmaceutical Design. 18, 15-26 (2012).
- Stefani, M., Liguri, G. Cholesterol in Alzheimer's disease: Unresolved questions. Current Alzheimer Research. 6, 15-29 (2009).
- Ong, W. Y., Halliwell, B. Iron, atherosclerosis, and neurodegeneration: A key role for cholesterol in promoting iron-dependent oxidative damage? Annals of the New York Academy of Sciences. 1012, 51-64 (2004).
- Igoumenou, A., Ebmeier, K. P. Diagnosing and managing vascular dementia. Practitioner. 256, 13-16 (2012).
- Luu, W., Gelissen, I. C., Brown, A. J. Manipulating Cholesterol Status Within Cells. Methods in Molecular Biology. 1583, 41-52 (2017).
- Egom, E. E. A., Hafeez, H. Biochemistry of statins. Advances in Clinical Chemistry. 73, 127-168 (2016).
- Igel, M., Sudhop, T., von Bergmann, K. Pharmacology of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase inhibitors (statins), including rosuvastatin and pitavastatin. Journal of Clinical Pharmacology. 42, 835-845 (2002).
- Nakanishi, M., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Multivalent control of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase. Mevalonate-derived product inhibits translation of mRNA and accelerates degradation of enzyme. The Journal of Biological Chemistry. 263, 8929-8937 (1988).
- López, C. A., de Vries, A. H., Marrink, S. J. Molecular Mechanism of Cyclodextrin Mediated Cholesterol Extraction. PLoS Computational Biology. 7, e1002020 (2011).
- Christian, A. E., Haynes, M. P., Phillips, M. C., Rothblat, G. H. Use of cyclodextrins for manipulating cellular cholesterol content. Journal of Lipid Research. 38, 2264-2272 (1997).
- Dai, S., et al. Methyl-β-cyclodextrin restores impaired autophagy flux in Niemann-Pick C1-deficient cells through activation of AMPK. Autophagy. 13, 1435-1451 (2017).
- Chen, F. W., Li, C., Ioannou, Y. A. Cyclodextrin induces calcium- dependent lysosomal exocytosis. PLoS One. 5, e15054 (2010).
- Soga, M., et al. HPGCD outperforms HPBCD as a potential treatment for Niemann-Pick disease type C during disease modeling with iPS cells. Stem Cells. 33, 1075-1088 (2015).
- Maetzel, D., et al. Genetic and chemical correction of cholesterol accumulation and impaired autophagy in hepatic and neural cells derived from Niemann-Pick Type C patient-specific iPS cells. Stem Cell Reports. 2, 866-880 (2014).
- Sarkar, S., et al. Impaired autophagy in the lipid-storage disorder Niemann-Pick type C1 dis- ease. Cell Reports. 5, 1302-1315 (2013).
- Rosenbaum, A. I., Zhang, G., Warren, J. D., Maxfield, F. R. Endocytosis of beta-cyclodextrins is responsible for cholesterol reduction in Niemann-Pick type C mutant cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 5477-5482 (2010).
- Yu, D., et al. Niemann-Pick Disease Type C: Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neuronal Cells for Modeling Neural Disease and Evaluating Drug Efficacy. Journal of Biomolecular Screening. 19, 1164-1173 (2014).
- Zidovetzki, R., Levitan, I. Use of cyclodextrins to manipulate plasma membrane cholesterol content: evidence, misconceptions and control strategies. Biochimica et Biophysica Acta. 1768, 1311-1324 (2007).
- Bukiya, A. N., Durdagi, S., Noskov, S., Rosenhouse-Dantsker, A. Cholesterol up-regulates neuronal G protein-gated inwardly rectifying potassium (GIRK) channel activity in the hippocampus. The Journal of Biological Chemistry. 292, 6135-6147 (2017).
- Bukiya, A. N., Vaithianathan, T., Kuntamallappanavar, G., Asuncion-Chin, M., Dopico, A. M. Smooth muscle cholesterol enables BK β1 subunit-mediated channel inhibition and subsequent vasoconstriction evoked by alcohol. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 31, 2410-2423 (2011).
- Hegele, R. A. Plasma lipoproteins: genetic influences and clinical implications. Nature Reviews Genetics. 10, 109-121 (2009).
- Bisen, S., et al. Distinct mechanisms underlying cholesterol protection against alcohol-induced BK channel inhibition and resulting vasoconstriction. Biochimica et Biophysica Acta. 1861, 1756-1766 (2016).
- Santiago, J., et al. Probing the Effects of Membrane Cholesterol in the Torpedo californica Acetylcholine Receptor and the Novel Lipid-exposed Mutation αC418W in Xenopus Oocytes. The Journal of Biological Chemistry. 276, 46523-46532 (2001).
- Deng, W., et al. Hypercholesterolemia induces up-regulation of KACh cardiac currents via a mechanism independent of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and Gβγ. The Journal of Biological Chemistry. 287, 4925-4935 (2012).
- Bukiya, A. N., Blank, P. S., Rosenhouse-Dantsker, A. Cholesterol intake and statin use regulate neuronal G protein-gated inwardly rectifying potassium channels by cholesterol and PI(4,5)P2. Journal of Lipid Research. 60, 19-29 (2019).
- Bukiya, A. N., et al. Cholesterol increases the open probability of cardiac KACh currents. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1848, 2406-2413 (2015).
- Bukiya, A. N., Rosenhouse-Dantsker, A. Hypercholesterolemia effect on potassium channels. Hypercholesterolemia. Kumar, S. A. , Intech. 95-119 (2015).
- Rosenhouse-Dantsker, A., et al. Distant cytosolic residues mediate a two-way molecular switch that controls the modulation of Kir channels by cholesterol and PI(4,5)P2. The Journal of Biological Chemistry. 287, 40266-40278 (2012).
- Chun, Y. S., Oh, H. G., Park, M. K., Cho, H., Chung, S. Cholesterol regulates HERG K+ channel activation by increasing phospholipase C β1 expression. Channels. 7, 275-287 (2013).
- Luchetti, G., et al. Cholesterol activates the G-protein coupled receptor Smoothened to promote Hedgehog signaling. eLife. 5, e20304 (2016).
- Sun, S., et al. Cholesterol-dependent modulation of stem cell biomechanics: application to adipogenesis. Journal of Biomechanical Engineering. , In Press (2019).
- North, K., Bisen, S., Dopico, A. M., Bukiya, A. N. Tyrosine 450 in the Voltage- and Calcium-Gated Potassium Channel of Large Conductance Channel Pore-Forming (slo1) Subunit Mediates Cholesterol Protection against Alcohol-Induced Constriction of Cerebral Arteries. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 367, 234-244 (2018).
- Bukiya, A. N., Dopico, A. M. Regulation of BK Channel Activity by Cholesterol and Its Derivatives. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1115, 53-75 (2019).
- Rosenhouse-Dantsker, A., Leal-Pinto, E., Logothetis, D. E., Levitan, I. Comparative analysis of cholesterol sensitivity of Kir channels: role of the CD loop. Channels. 4, 63-66 (2010).
- Rosenhouse-Dantsker, A., Logothetis, D. E., Levitan, I. Cholesterol Sensitivity of Kir2.1 is controlled by a belt of residues around the cytosolic pore. Biophysical Journal. 100, 381-389 (2011).
- Rosenhouse-Dantsker, A., Noskov, S. Y., Logothetis, D. E., Levitan, I. Cholesterol sensitivity of Kir2.1 depends on functional inter-links between the N and C termini. Channels. 7, 303-312 (2013).
- Rosenhouse-Dantsker, A., Noskov, S., Durdagi, S., Logothetis, D. E., Levitan, I. Identification of novel cholesterol-binding regions in Kir2 channels. The Journal of Biological Chemistry. 288, 31154-31164 (2013).
- Bukiya, A. N., Rosenhouse-Dantsker, A. Synergistic activation of G protein-gated inwardly rectifying potassium channels by cholesterol and PI(4,5)P2. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1859, 1233-1241 (2017).
- Yi, A., Lin, Y. F., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Yeast screen for constitutively active mutant G protein-activated potassium channels. Neuron. 29, 657-667 (2001).
- Bukiya, A., Dopico, A. M., Leffler, C. W., Fedinec, A. Dietary cholesterol protects against alcohol-induced cerebral artery constriction. Alcoholism, Clinical and Experimental Research. 38, 1216-1226 (2014).
- Simakova, M. N., Bisen, S., Dopico, A. M., Bukiya, A. N. Statin therapy exacerbates alcohol-induced constriction of cerebral arteries via modulation of ethanol-induced BK channel inhibition in vascular smooth muscle. Biochemical Pharmacology. 145, 81-93 (2017).
