Summary
Kromatin immunutfelling forente med neste-generasjon sekvensering (flis-SEQ) er en metoden pleide opprette vekselvirkningen imellom transkripsjon faktorene og det genomisk sekvenser de administrere. Denne protokollen skisserer teknikker for å utføre ChIP-SEQ med bakteriell biofilm, ved hjelp av Salmonella enterica serovar tyfimurium bakteriell biofilm som et eksempel.
Abstract
Kromatin immunutfelling etterfulgt av sekvensering (ChIP-SEQ) er en teknikk som kan brukes til å oppdage regulatoriske mål av transkripsjon faktorer, histone modifikasjoner, og andre DNA-assosiert proteiner. ChIP-SEQ data kan også brukes til å finne differensial binding av transkripsjon faktorer i ulike miljøforhold eller celletyper. I utgangspunktet ble ChIP utført gjennom hybridisering på en Microarray (ChIP-chip); Imidlertid, ChIP-SEQ er blitt det foretrakk metoden igjennom teknisk fremskritt, avtagende finansiell barriere å sekvensering, og svær beløpene av høy-kvalitet data produksjon. Teknikker for å utføre ChIP-SEQ med bakteriell biofilm, en stor kilde til vedvarende og kroniske infeksjoner, er beskrevet i denne protokollen. ChIP-SEQ utføres på Salmonella enterica serovar tyfimurium biofilm og planktoniske celler, rettet mot Master biofilm regulator, CsgD, å bestemme differensial binding i de to celletyper. Her viser vi riktig mengde biofilm å høste, normalisere til en planktoniske kontroll prøve, homogenisere biofilm for kryss-linker tilgang, og utføre rutine ChIP-SEQ trinn for å få høy kvalitet sekvensering resultater.
Introduction
Bakteriell biofilm, strukturelle aggregater av celler innebygd i en selv-produsert matrise, er motstandsdyktig mot uttørking, antibiotika, og vert immunresponser1. Som sådan, de forårsaker vedvarende og kroniske infeksjoner og presentere unike utfordringer til forskere på grunn av sine løsninger til overlevelse og overføring. Salmonella enterica serovar Tyfimurium (S. Tyfimurium) har blitt funnet å etablere phenotypically heterogene populasjoner av biofilm aggregater som er resistente mot uttørking og antibiotika, og planktoniske celler som uttrykker virulens faktorer i ren kultur når de utsettes for miljømessige stress (28 ° c, begrensende næringsstoffer)2. Disse to celletyper oppstår på grunn av bistabile uttrykk for Master biofilm regulator, CsgD3. Vi har hypotetisk gjennomsnitt at dette kan være en innsats-sikring strategi for Salmonella, der planktoniske cellene delta i kortsiktige overføring og biofilm celler er i stand til å vedvare langsiktig i miljøet før en mulighet til å infisere en ny vert oppstår2,4. Mange av de regulatoriske elementer som styrer CSG operon Expression er godt karakterisert5. Men bortsett fra adrA og CSG operon6, få regulatoriske mål av CsgD er kjent. Identifisering av CsgD regulatoriske nettverk vil hjelpe oss til å bedre forstå Salmonella livssyklus og rollen som biofilm spille i overføringen.
Kromatin immunutfelling føle etter av høy-produksjon sekvensering (flis-SEQ) er en kraftfull inne vivo teknikk for Genova-bred legitimasjonen av protein-DNA vekselsvirkningene og skaffer beskjed opp på regulere prosesser innvolvere transkripsjon faktorene, histone modifiseringer, eller nucleosomes7. Nyere studier har brukt denne teknikken til å vurdere differensial proteinbinding mellom vekstforhold og celletyper8. I kromatin immunutfelling (ChIP), er DNA-fragmenter med samspill proteiner beriket gjennom antistoff valg av målet proteiner. Celler høstes og DNA-bindende proteiner er krysskoblet til DNA in vivo gjennom formaldehyd Cross-linker behandling. Celler er lysert, slippe celleinnholdet, og kromatin er skåret inn om lag 200-600 BP fragmenter7. DNA-fragmenter bundet til målet proteinet er immunoprecipitated ved hjelp av antistoff, og isolert av de-Cross Linking etterfulgt av protein fordøyelsen9. Disse DNA-fragmentene representerer proteinbinding nettsteder matchet av hybridisering til en Microarray (ChIP-chip) eller ved dyp sekvensering og kartlegging til Genova sekvensen10,11. Selv om ChIP-chip eksperimenter yield tilstrekkelige regulatoriske data, de er begrenset på grunn av bruk av dyre sonder, samt hybridisering og array bias12. Flis-SEQ har en større drivkraft omfang med forhøyet nukleotid resolution og presseomtalen, forbedret signal-å-bråk forhold, og færre artefakter når sammenlignet med flis-flis7.
ChIP har blitt brukt til å analysere SFH og OmpR regulering i Salmonella serovar tyfimurium13,14, quorum-sensing AphA regulering i Vibrio alginolyticus15, RpoS regulering i Escherichia coli16, virulens regulator EspR regulering i Mycobacterium tuberkulose17, potensielle diguanylate cyclases gjennom AmrZ regulering i Pseudomonas aeruginosa18, så vel som VraSR regulering i Staphylococcus aureus19. Den bakterielle ChIP-SEQ eksperimenter som har blitt beskrevet begynner med voksende celler i flytende Media og høsting i enkelt celle form. Analyse av biofilm og tilsvarende gen regulering representerer imidlertid et nytt sett med utfordringer for å generere en vellykket ChIP-SEQ-protokoll. I denne protokollen, ChIP-SEQ brukes til å finne differensial regulatoriske mål av CsgD, S. Tyfimurium Master biofilm regulator i biofilm og planktoniske celletyper. Denne protokollen beskriver teknikker som brukes til å bestemme de riktige mengdene av biofilm for ChIP-SEQ, høste biofilm fra kolbe kultur, normalisere biofilm og enkelt cellekontroll prøver, homogenisere biofilm, og fullstendig immunutfelling. Dette vil være nyttig for å studere regulatoriske mål i bakteriell biofilm og kan tilpasses for mange arter.
Protocol
1. kolbe kultur cellevekst
- Fra frosne aksjer, stripe Salmonella serovar tyfimurium stammer på lb agar (20 ml solide medier i 100 mm Petri plate) med riktig antibiotika og ruge ved 37 ° c i 16 – 20 h for å få isolerte kolonier.
- Vaksinere 5 mL LB buljong inneholdende riktig antibiotika i en 25 mm x 150 mm Borosilikatglass kultur rør med 1-3 kolonier fra strek plater fra trinn 1,1. Ruge ved 37 ° c med risting ved 200 RPM for 7 timer.
- Mål OD600 av buljong kultur ved hjelp av en spektrofotometer. Fortynne en alikvot av kulturen 1 inne 4 inne PBS inne en 2 mL Cuvette og mål det absorbansen for 600 NM. Vi har funnet den mest kritiske faktoren på dette trinnet for å være tidspunktet for vekst. OD verdiene brukes til å normalisere kulturer å levere ønsket antall celler i trinn 1,4.
- Legg 1,0 OD600 volum tilsvarende cellekultur (dvs. ~ 109 celler) til en Erlenmeyer kolbe inneholder 100 ml 1% tryptone med riktig antibiotika. Ruge ved 28 ° c med risting ved 200 RPM for 13 timer.
Merk: biofilm celler vises som aggregert flak og enkelt planktoniske celler er i skyet Media.
2. samle celle-fri betinget 1% tryptone
- Samle kolbe kultur for celle-gratis conditioned 1% tryptone. Pipette kolbe kultur flere ganger å blande før du legger til en sentrifuge tube.
- Sentrifuger på 12 000 x g for 10 min ved 10 ° c til pellet alle celler.
- Dekanter supernatanten i en 0,2 μm Filterenhet, vakuum filter, og dispensere inn i et nytt rør.
Merk: biofilm aggregater er tilhenger i konvensjonelle løsninger (for eksempel PBS) og vil holde seg til sidene av rør og pipette tips. Siden det gir mulighet for enklere manipulasjon, bruker vi conditioned Media (1% tryptone) å flytte biofilm utgangspunktet og bruke varm PBS umiddelbart før kryss-linking (trinn 4,5) for å fjerne eventuelle protein Cross Linking underlag som kan være til stede i Media.
3. skille biofilm og planktoniske celler fra kolbe kulturer2
- Ved hjelp av en steril 25 mL pipette, alikvot kolbe kultur i 15 mL rør. Sentrifuger ved langsom hastighet (210 x g) i 2 min, for å skille de to celle typene.
Merk: biofilm celler skal danne en løs pellet i bunnen av røret - Pipetter supernatanten inneholdende planktoniske celler i 2 40 mL sentrifugerør for senere (trinn 5). Fjern alle de resterende væsken, være forsiktig med å forstyrre pellet. Gjenta til celle typene er atskilt fra alle flaske kultur mediene.
4. klargjøre biofilm aggregater
Merk: biofilm høstes av våt vekt for å gi 25 mikrogram DNA, det anbefalte minste Start materialet for ChIP. Biofilm Omregningsfaktor (BCF) av S. Tyfimurium er 1,73 x 108 CFU/mg2. Forskere forbereder andre biofilm typer må empirisk definere antall celler per enhet vekt av biofilm, som brukes til å finne vekten av biofilm kreves for 25 μg av DNA starter materiale ved hjelp av denne ligningen:
- Veie en 2 mL snap cap eller skrue cap tube nøyaktig.
- Resuspend biofilm pellet i 1 mL conditioned tryptone. Flytt resuspendert biofilm til en pre-veid 2 mL snap cap eller skrue cap tube.
- Sentrifuger for 1 min ved 11 000 x g ved 20 ° c
- Forsiktig fjerne alle supernatanten fra røret og veie røret nøyaktig. Trekk rør vekten fra vekten av røret med biofilm for å finne vekten av biofilm. Det bør være ± 10% av målet biofilm vekt.
- Vask celler for å fjerne resterende betinget tryptone. Tilsett 1 mL varm PBS til røret og Vortex forsiktig å resuspend pellet. Sentrifuger for 3 min ved 8 000 x g til pellet biofilm og fjern supernatanten. Tilsett 1 mL PBS til røret og Vortex å resuspend pellet.
5. klargjøre planktoniske celler
- Ta opp volumet og OD600 for planktoniske supernatanten fra langsom hastighet sentrifugering (trinn 3,2) ved hjelp av en spektrofotometer
- Beregn ønsket volum for en endelig OD600 av 6,0:
- Avkjøl sentrifuge til 10 ° c og sediment planktoniske celler ved sentrifugering (10 000 x g, 10 min ved 10 ° c)
- Fjern supernatanten og resuspend celle pellet i det endelige volumet av PBS beregnet i trinn 5,2.
- Re-mål OD600 av planktoniske celler ved hjelp av en spektrofotometer og dispensere volumet av 6,0 OD600 planktoniske celler i en 2 ml snap cap eller skrue cap tube.
- Bring volumet til 1 mL med PBS.
6. homogenisere celler
- Tilsett en sterilisert 5 mm rustfritt stål perle til hvert av rørene.
- Homogenisere ved hjelp av en mikser mølle i 5 minutter ved 30 Hz. Observer aggregerte rør for å bekrefte at biofilm er brutt fra hverandre.
- Overfør de homogenisert cellene til en ny 1,5 mL tube, unngå metall perlen. Bring volumet til 1 mL med PBS.
Merk: Utfør seriell fortynninger for å nummerere inn dataceller og kontroller at det endelige celle nummeret er nær ønsket eller anslått nummer.
7. krysskobling av proteiner til DNA
- Dispensere fersk formaldehyd i prøverør til en endelig konsentrasjon på 1%. Ruge i 30 minutter ved romtemperatur på et roterende hjul.
Advarsel: formaldehyd er etsende, en hud, øye, og respiratoriske irriterende, og brannfarlig. Dispensere i en avtrekksvifte. - Tilsett 1 M Glycine til en endelig konsentrasjon på 125 mM for å stoppe Cross Linking. Ruge i 5 minutter ved romtemperatur på et roterende hjul.
8. vaske celler for å fjerne overflødig tverrbinder
- Sediment cellene på 8 000 x g i 3 min og fjerne supernatanten
- Resuspend pellet i 20 μL av 25x protease hemmere og 500 μL filter sterilisert PBS.
- Sentrifugerør for 3 min ved 8000 x g og fjern supernatanten.
9. lysering celler
- Resuspend pellet i 600 μL lyse buffer (se tabell 1) og ruge på is i 10 minutter.
- Tilsett 1,4 mL IP-fortynnings buffer (se tabell 1) til et sterilt 15 ml rør og Flytt lysert celler til 15 ml rør. Hold røret på isen for 1.5-2 h, og Vortex forsiktig og noen ganger.
Merk: noe motstandsdyktig celle materiale kan forbli i rør. En lang inkubasjonsperiode på is med sporadiske virvlingen vil bryte fra hverandre materiale. Resten vil bli brutt opp gjennom sonikering.
10. fragmentering DNA ved sonikering
- Plasser 15 mL rør i et beger med is og plasser 3 mm sonden inne i røret.
- Utfør 5 sonikering runder av 30 s på ved 20-40% av 400 W med 2 min kjøling på isen mellom sprekker.
- Sediment igangsatte materiale ved sentrifugering (8000 x g, 10 min ved 4 ° c). Overfør supernatanten til et nytt rør.
- Du kan eventuelt utføre decrosslinking ved 65 ° c i 30 – 60 min og fordøye RNA og protein ved 45 ° c i 30-60 min før du kjører på en 2% agarose gel for å sjekke om det er riktig størrelses fragmenter.
Merk: Senk proben inn i celle lysat. Hold løsningen på isen mens du sonikere og hviler. Ikke Fjern røret mens sonicator sonden er pulserende. Løsningen skal vises skyet pre-sonikering og klar post-sonikering.
11. Immunoprecipitating DNA-protein-antistoff komplekser
- Forberedelse
- Dispensere en 1,35 mL alikvot for immunutfelling og 1 200 μL alikvot som en inngangs kontroll. Oppbevar inngangs kontrollen ved-80 ° c til decrosslinking og fordøye trinnene utføres.
- Immunutfelling med primært antistoff
- Tilsett 10 μg av renset protein-spesifikt primært antistoff til 1,35 μL alikvot. Ruge over natten ved 4 ° c på et roterende hjul.
Merk: det primære antistoff kan være et monoklonale antistoff, polyklonale serum av høy kvalitet eller kommersielt epitope antistoff (dvs. anti-flagg). - Tilsett 50 μL av protein G magnetiske perler til rørene fra trinn 11.2.1 og ruge ved 4 ° c for 3 timer på et roterende hjul.
- Plasser IP vaskebuffer 1, IP vaskebuffer 2, og TE pH 8,0 (se tabell 1) i en is bøtte. Varm eluering buffer til 65 ° c.
Merk: ikke Legg løsningen som inneholder eluering buffer på isen. - Bind protein G magnetiske perler til siden av rørene ved hjelp av en magnetisk stativ
- Utfør vask: vask 2x med 750 μL kald IP vaskebuffer 1, vask 1x med 750 μL kald IP vaskebuffer 2, og vask 2x med 750 μL kald TE ved pH 8,0. Hold rørene på det magnetiske stativet under vasken.
- Tilsett 450 μL av IP eluering buffer (se tabell 1) til hvert rør og ruge ved 65 ° c i 30 min med milde virvlingen hver 5 min.
- Bind perler til siden av rørene ved hjelp av et magnetisk stativ. Vent minst 2 minutter til løsningen er klar.
- Dispensere den tomme supernatanten til en ny 1,5 mL slange, vær forsiktig så du ikke forstyrrer magnet perle pellet.
- Tilsett 10 μg av renset protein-spesifikt primært antistoff til 1,35 μL alikvot. Ruge over natten ved 4 ° c på et roterende hjul.
12. Decrosslinking DNA-protein komplekser og fordøye co-rensende RNA og protein
- Tilsett 2 μg RNase A og NaCl til en endelig konsentrasjon på 0,3 M til hvert rør.
- Ruge ved 65 ° c, for ≥ 6 h, eller over natten.
- Fullstendig protein fordøyelse ved å legge 180 μg proteinase K til hvert rør, deretter incubating ved 45 ° c for 3 – 5 timer.
13. bibliotek forberedelse og sekvensering
- Rens DNA ved hjelp av magnetiske perler
Merk: magnetiske perler foretrekkes for å isolere små mengder DNA vanligvis utvinnes under ChIP med bakterielle celler. - Klargjør biblioteker ved hjelp av et sett som er kompatibelt med den valgte sekvensering plattformen.
- Sjekk biblioteket konsentrasjon med en fluorometer og et bredt spekter dsDNA Kit eller en qRT-PCR biblioteket kvantifisering Kit.
Merk: i vår erfaring kan fluorometer målinger overvurdere DNA-konsentrasjon. - Pool biblioteker, regnskap for tilstrekkelig dekning for hvert bibliotek prøven. For Illumina sekvensering med Salmonella, vi samlet 10-12 biblioteker. Tilsett Tris-HCl pH 8,0 til en endelig konsentrasjon på 1 mM.
- Rekkefølge i henhold til spesifikasjonene for den valgte plattformen.
Representative Results
Utarbeidelse av kromatin immunutfelling prøver fra bakteriell biofilm involverer flere trinn, som vist i figur 1. Disse inkluderer voksende biofilm i kolbe kultur, samle conditioned Media, samle en tilstrekkelig mengde biofilm og planktoniske celler som kontroll, vaske celler i PBS, homogenisering, Cross Linking proteiner til DNA, lysering celler, fragmentering DNA ved sonikering, immunoprecipitating DNA med riktig antistoffer og protein G perler, vasking og tent immunoprecipitated DNA, og rensende DNA for biblioteket forberedelse og sekvensering.
S. tyfimurium celler dyrket i flytende kultur under biofilm-inducing forhold gjennomgår fenotype veksling til å danne flercellede biofilm aggregater og planktoniske celler. Denne populasjonen vil inneholde omtrent 40% biofilm aggregater, som uttrykker høyere nivåer av diguanylate cyclases (DGCs) og biofilm regulatorer, og 60% planktoniske celler, som uttrykker høyere nivåer av virulens-assosierte gener2,4 (figur 2A). I denne protokollen, beskriver vi en metode for å høste begge celletyper for å sammenligne transkripsjon nettsteder gjennom ChIP-SEQ; denne protokollen kan imidlertid tilpasses andre typer biofilm som dannes av andre bakteriearter. Biofilm aggregat og planktoniske celler er adskilt av langsom fart sentrifugering, hvilke pellets biofilm og blader planktoniske celler inne det supernatanten2 (skikkelsen 2B). Celle typene behandles deretter separat for etterfølgende trinn i protokollen.
Den anbefalte mengden DNA-inngang for ChIP-SEQ er 10-25 μg20. I S. Tyfimurium kolbe kultur, 30 mg biofilm gir ca 25 μg DNA. Siden biofilm aggregater har en overflod av proteinaktige ekstracellulære materiale, hypotetisk gjennomsnitt vi at dette ville forstyrre effektiviteten av kryss-linking. Hvis vi bare å normalisere de forskjellige celle typene etter celle nummer, kan behandling av planktoniske celler resultere i en ulik mengde krysskoblet produkt som presenteres for immunutfelling. Et protein analysen ble utført for å bestemme tilsvarende mengde planktoniske celle materiale å matche 30 mg biofilm (Figur 3). 6,0 OD600 av planktoniske celler ble høstet for å matche 30 mg biofilm.
Biofilm aggregater må først brytes fra hverandre for å tillate lik tilgang til kryss-linker til alle celler. Vi fant at den mest ensartede og høy gjennomstrømming måte å homogenisere cellene var ved hjelp av en mikser mill og 5 mm rustfritt stål perle (Figur 4a). Planktoniske-celler behandles på samme måte for å redusere variabler i ChIP-SEQ-eksperimentet (Figur 4B).
Når DNA har blitt fragmentert av sonikering, krysskoblet, og behandlet med RNase og proteinase K, kan det bli vist på en 2% agarose gel. Sonikert DNA er brutt ned i en samling av fragmenter som vises som en flekk på agarose gel. Den gjennomsnittlige fragment størrelsen avtar med et økende antall sonikering sprekker (figur 5). Energi overføring vil variere for ulike sonicator enheter, så en sonikering-analysen anbefales å bestemme antall sonikering sprekker som kreves for å fragment DNA til et gjennomsnitt på mindre enn 1 kb. For våre ChIP-SEQ eksperiment, valgte vi 5 sprekker.
Retningslinjer for koding anbefaler en bekreftelse på antistoff mål bindings aktivitet med en immunoblot21. I dette tilfellet målte vi våre antistoff spesifisitet og styrke av binding av immunoblot på hele cellen lysater forberedt for ChIP (figur 6). Vi har bekreftet at antistoff binder seg til CsgD-3xFLAG; anti-FLAG og anti-CsgD signaler colocalize ved den forventede Molekylvekten (28 kDa)22.
ChIP-prosedyrer gir ofte lave konsentrasjoner av DNA. Derfor en rensing metode som fjerner forurensninger og beholder en høy andel av DNA ble valgt. Magnetisk perle rensing ble valgt over kolonne-basert rensing fordi den beholdt lave konsentrasjoner av input ChIP DNA bedre (figur 7) og fjernet forurensninger (data ikke vist).
På grunn av redusert Start mengder DNA, bibliotek utarbeidelse av ChIP DNA kan kreve fortynnet adaptere og PCR berikelse. Før sekvensering, kan bibliotekene bli visualisere av Bioanalyzer spor for å bekrefte riktig størrelsesfordeling før og etter PCR berikelse (Figur 8). I tillegg, hvis det er en kjent regulatoriske mål av transkripsjon faktor, qPCR bør brukes til å bekrefte berikelse av bindende regioner ved å sammenligne fold endring (∆ ∆ CT) mellom kjente mål og referanse gen sekvens overflod i immunoprecipitated og sonikert input DNA.
ChIP-sekvensering data bør analyseres ved å tildele kvalitet score, trimming lav kvalitet baser, samkjøre fremover og omvendt leser (i sammenkoblede slutten sekvensering), montering til en høy kvalitet referanse Genova, finne topper over bakgrunnen, og utføre nedstrøms analyse (figur 9a). Nedstrøms analyse bør omfatte visualisering og merknad av topper, konsistens med biologiske replikere prøver, og motiv analyse, og kan omfatte differensial bindende analyse mellom betingelser eller celletyper, og data integrasjon med genuttrykk fra kjente trasé. For ChIP-SEQ data som vår, bør toppene identifiseres som betydelig over bakgrunnen (figur 9B, C, Red bars) med en p verdi bestemmelse, ikke bare ved fold-Change. I den endelige analysen, er kartlagt leser er avbildet mot merknad av referansen Genova (figur 9D). En fattig flis-SEQ resultere ville komme like input-SEQ uten alle betydelig toppene over miljøet.
Figur 1: illustrasjon av trinnene i ChIP-SEQ med bakteriell biofilm. I den beskrevne prosedyren, S. Tyfimurium celler dyrkes i 1% Tryptone kolbe kultur ved 28 ° c med risting (1), celle-fri betinget Media er samlet for håndtering av biofilm celletyper (2), som brukes til å samle en tilstrekkelig mengde biofilm og planktoniske celler (3). Disse cellene vaskes med PBS og homogenisert å bryte fra hverandre biofilm (4). Proteiner er krysskoblet til DNA med en formaldehyd tverrbinder, hvoretter celler lysert for å frigjøre celleinnhold (5). DNA i cellen lysat er fragmentert ved sonikering (6). DNA-krysskoblet til mål proteinet velges gjennom immunutfelling med et antistoff som binder seg til mål proteinet og protein G magnetiske perler (7). Valgt DNA er vasket og eluert fra protein G magnetiske perler (8) og renset for biblioteket forberedelse og sekvensering (9). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: in vitro kolbe modell for å studere S. Tyfimurium biofilm utvikling. (A) S. Tyfimurium celler dyrket i 1% tryptone for 13 t ved 28 ° c gjennomgår fenotype veksling til å danne biofilm aggregater og planktoniske celler i væskefasen av kolbe kulturen. (B) biofilm aggregater og planktoniske celler fra kolbe kulturen i (A) ble separert gjennom sentrifugering ved 210 x g for 2 min. Supernatanten ble høstet for planktoniske celle preparater og pellet ble høstet for biofilm celle preparater. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Total proteinkonsentrasjon for planktoniske celler og biofilm celleprøver høstet fra S. Tyfimurium kolbe kultur. Fargemetrisk protein analyser ble utført og protein beløp i forhold til en BSA standard kurve ble målt ved 750 NM. Protein innhold av lysert planktoniske celleprøver på 4,0, 6,0, og 8,0 OD600 ble sammenlignet med 30 mg biofilm aggregater. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: homogenisering av celleprøver fra S. Tyfimurium biofilm kolbe kulturer. (A) biofilm aggregater fra kolbe kultur RESUSPENDERT i PBS (venstre) ble homogenisert ved hjelp av en mikser Mill ved 30 Hz i 5 min (høyre). (B) planktoniske celler fra kolbe kultur RESUSPENDERT i PBS ble behandlet av mikser Mill ved 30 Hz i 5 min for å sikre konsistens mellom celle type prøver. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: sonikering analysen med pre-ChIP celle lysater. Biofilm aggregerte og planktoniske celleprøver ble separert, homogenisert, krysskoblet og lysert. DNA-protein komplekser ble sonikert opp til 8 ganger på 30 s på og 2 minutter av på isen for å bryte DNA i mindre fragmenter. En del av sonikert lysat ble separert på en 2% agarose gel. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Target-bindende spesifisitet av anti-Flag antistoff som brukes i ChIP-SEQ. Antistoff spesifisitet ble vurdert av proteinimmunoblotting mot hele cellen lysater utarbeidet fra kolbe kulturer av S. Tyfimurium stammer som vist. Sil ∆ csgD + p3xFLAG/csgD og WT biofilm prøver representerer biofilm aggregater høstet fra flasker, mens belastningen ∆csgD ± p3xFLAG og WT planktoniske celler representerer planktoniske celler. Renset hans-merket CsgD ble lastet som en kontroll. Hele celle lysater ble normalisert slik at 30 μg av totalt protein ble analysert i hvert felt. Tallene til venstre refererer til størrelsen (i kDa) til de prestained molekylvekt markørene. Primært antistoff som brukes for den øvre blot var Rabbit-anti-FLAG polyklonale antistoff (Sigma-Aldrich #F7425), mens den nedre blot ble inkubert med Rabbit-anti-flagg sammen med en CsgD-spesifikke monoklonale antistoff2. Goat anti-kanin IgG (LiCor IRDye 680RD, 925-68071) og geit anti-mus IgG (LiCor IRDye 800CW, 925-32210) ble brukt som sekundære antistoffer. Fluorescerende signaler ble avbildet ved hjelp av Odyssey CLx Imaging system og image Studio 4,0 programvarepakke (Li-cor biovitenskap). Representative bilder vises. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: kolonne-eller magnetisk perle-baserte rensing strategier for små mengder DNA som følge av ChIP-SEQ eksperimenter. Prøver av kjente mengder DNA ble renset ved hjelp av kolonne-baserte kits eller magnetiske perler og konsentrasjonen av eluatet ble målt etter rensing. Magnetiske perler viste bedre utvinning på lavt DNA-nivå, lik den lave mengder DNA vanligvis oppstått på slutten av ChIP-SEQ-protokollen, men før NGS biblioteket forberedelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: chip DNA forberedelser og påfølgende biblioteker visualisere av Bioanalyzer. (A) gjennomsnittlig fragment størrelse på genomisk DNA etter cellelyse og sonikering var < 1000 BP, med et flertall av fragmenter i 200 – 500 BP rekkevidde. (B) Start materiale for biblioteket forberedelse var under deteksjon. (C) adapter-LIGATION og PCR-berikelse gir forsterkning av biblioteks fragmenter. (D) en dårlig biblioteket forberedelse har lave DNA-topper, odde formet eller høy molekylvekt topper, eller rikelig adapter topper på ca 100 BP. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Skikkelsen 9: flis-SEQ data er analysert benytter Bioinformatic verktøy og visualisere opp på en Genova kikker. A. flytdiagram for typisk Bioinformatic analyse av ChIP-SEQ-data. RAW-leser for biofilm (∆csgD belastning + P3xFLAG/csgD) og planktoniske-celler (∆csgD + p3xFLAG) ble rengjort for lavkvalitets leser og adaptere, og tilordnet til S. Tyfimurium 14028s genomer (NC_016856 .1 for kromosom og NC_016855 .1 for plasmider) ved Bowtie2 (v 2.3.3.1) med standard parametere23. MACS2 (v 2.1.2) ble brukt til å ringe toppene med parametere av '-q 0,01--nomodel ', tar biofilm replikerer som testing datasett og planktoniske seg som kontroll24. Den MACS2 bdgcmp modulen ble videre brukt til å generere fold-berikelse spor med parametre for '-m FE '. Det vesentlige topp arkiv med folde-berikelse bane var forvandlet å en parykk arkiv benytter bedtools/bedClip/bedGraphToBigWig25 og visualisere på henvisning Genova benytter integrerende Genomics seer v 2.5.126. Representative topper vises (røde striper). (B) stor region av ~ 40 KBP, som inneholder flere topper, er et atypisk resultat, men likevel potensielt verdifullt. (C) Dette er et mer typisk resultat, som viser to betydelige topp områder. (D) Zoom inn på venstre topp i C, viser leser kartlegging til regionen av S. Tyfimurium 14028s-Genova som inneholder forskjellige arrangører for uspA og uspB. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Cellelyse Rings buffere |
| Lyseringsbuffer |
| 50 mM Tris-HCl pH 8,1 |
| 10 mM EDTA |
| 1% SDS |
| protease hemmere |
| Buffer for IP-fortynning |
| 20 mM pH-8,1 i Tris-HCl |
| 2 mM EDTA |
| 150 mM NaCl |
| 1% Triton X-100 |
| 0,01% SDS |
| Immunutfelling buffere |
| IP vaskebuffer 1 |
| 20 mM pH-8,1 i Tris-HCl |
| 2 mM EDTA |
| 50 mM NaCl |
| 1% Triton X-100 |
| 0,1% SDS |
| IP vaskebuffer 2 |
| 10 mM pH 8,1 Tris-HCl |
| 250 mM LiCl |
| 1 mM EDTA |
| 1% NP-40 |
| 1% deoxycholic syre |
| TE (T10E1) pH 8,0 |
| 10 mM Tris-HCl |
| 1 mM EDTA |
| Eluering buffer |
| 1% SDS |
| 100 mM NaHCO3 |
Tabell 1. Buffer oppskrifter.
Discussion
Denne protokollen skisserer en teknikk for å utføre ChIP-SEQ med Salmonella enterica serovar tyfimurium biofilm og planktoniske celler fra ren kultur, for å finne regulatoriske mål av Master biofilm regulator, CsgD. Vi forventer differensial bindende informasjon på grunn av bi-stabiliteten av CsgD i de to celletyper, med høye nivåer i biofilm aggregater og lave nivåer i planktoniske celler2,3. Imidlertid kan denne teknikken også brukes til andre bakterielle transkripsjon faktorer, celletyper, eller vekstforhold. Spesielt kan denne teknikken tilpasses andre bakterielle biofilm ved hjelp av en eksperimentelt bestemt Omregningsfaktor for CFU per enhet vekt av biofilm celler.
ChIP-SEQ kan være tilbøyelig til forsterkning av teknisk feil gjennom sekvensering; bekreftelse på kritiske trinn kan imidlertid forhindre denne27. Primær antistoff spesifisitet er viktig for å velge bare målet transkripsjon faktor og DNA det styrer under immunutfelling7. I dette eksperimentet ble csgD smeltet til en plasmider-kodet 3xFLAG-kode på 3-enden av genet, tilsvarende C-Terminus i csgD22. Den p3xFLAG plasmider uten csgD ble brukt som en "kontroll" (S. Tyfimurium 14028 ∆ csgD + p3xFLAG). KODE retningslinjer anbefaler å utføre immunoblots med primære antistoff mot protein av interesse, og lysater av ChIP stammer og sletting stammer21. Det er viktig å sikre at vekst forholdene er konsekvente på tvers av replikerer for å redusere variasjoner i transkripsjon faktor binding og nedstrøms sekvensering resultater. Hvis man er nøye med å sikre inokulum størrelser og pre-inokulum vekstforhold er konsekvente, biofilm vekst i kolbe kultur er konsistent4. Det er viktig å bekrefte at alle biofilm har blitt brutt fra hverandre etter homogenisering, for å sikre lik tilgang av reagenser, spesielt formaldehyd Cross-linker, til alle celler.
Flere modifikasjoner kan gjøre det mulig for forskere å bruke denne protokollen for andre DNA-bindende proteiner, celletyper, belastninger, vekstforhold eller laboratorieutstyr. Hvis den brukes til biofilm andre arter enn S. Tyfimurium, Omregningsfaktor av koloni forming enheter per enhet vekt av biofilm må fastsettes eksperimentelt ved høsting ulike mengder biofilm, homogenisere biofilm grundig, og utføre seriell fortynninger og plate telling å lage en standard kurve, som kanskje ikke er nøyaktig ved lavere biofilm vekter2. Sonicator energi overføring og celle type motstand kan variere; Derfor er en sonikering-analysen anbefales å finne antall sonikering sprekker som vil produsere fragment størrelsesområdet som kreves for nedstrøms biblioteket forberedelse og sekvensering11. Kromatin fragmentering av micrococcal nuklease er et alternativ til sonikering som produserer høy oppløsning av belegg områder; Denne metoden kan imidlertid innføre fragmentering bias7,28. DNA-størrelsesområdet kan endres avhengig av nedstrøms biblioteket forberedelse kits og sekvensering plattformer. Andre metoder for homogenisering kan brukes i stedet for mikseren mill. For eksempel kan et glass vev homogenisator erstattes, men det kan aerosolize eller ufullstendig bryte opp biofilm. Når det gjelder kontroller, kan pre-immunoprecipitate DNA bli normalisert i post-sekvensering prosessering og analyse. En mock-IP kontroll med arter-matchet normalt antistoff serum kan brukes som en kontroll i tillegg13.
Forskning må betenke begrensningene å denne metoden når betenke en flis-SEQ eksperiment. Det kan være nødvendig med betydelige endringer for å tilpasse den til andre biofilm typer. For eksempel, med Salmonella tyfimurium umiddelbare blanding av BIOFILM i PBS fører til målbar tap av biofilm aggregater. Immunutfelling målretting regulatoriske mål av transkripsjon faktorer i bakterier kan resultere i svært små mengder DNA, som er en utfordring for rensing og deteksjon på senere trinn. Bias kan innføres under klipping og nedstrøms manipulasjon under biblioteket deteksjon9. I tillegg, denne metoden ikke avslører i vivo uttrykks nivåer som svar på transkripsjon faktor binding. Forskere som har liten erfaring i bioinformatikk kan bli utfordret av analysen rørledningen. Denne metoden kan være tidkrevende og dyrt; Imidlertid er kostnaden for sekvensering ofte lavere enn en Microarray og er synkende over tid som teknologiske forbedringer fortsetter å bli gjort.
Noen metoder i litteraturen beskriver ChIP med bakterier, og de fleste bakterielle eksperimenter begynner med en enkel vekst tilstand13,14,15,17,18. ChIP prøve utarbeidelse med enkeltceller er grei og presenterer færre utfordringer enn ChIP prøveforberedelse med biofilm aggregater. Idet for flis-SEQ, foregående metoder av studerer CIS-regulere krets, inkluderer systematisk utviklingen av ligander av eksponentiell berikelse (SELEX), Elektroforetiske transportabel Skift analyser (EMSA), flis-flis, promoter overstrekingen og reporter analyse ha blitt supplert eller erstattet av flis-SEQ29. ChIP-SEQ erstatter ChIP-chip på grunn av fremmarsj teknologier og tilgjengelighet av sekvensering. Deep sekvensering gir forskere med massive mengder data som kan identifisere områder med lavere bindende affinitet og høyere base pair oppløsning med mindre Start materiale enn ChIP-chip11,30. Analyse av ChIP data fra organismer med høy kvalitet referanse genomer er generelt rask og spesifikk. I tillegg er ChIP-SEQ en grundig metode for å oppdage i silisiummangan spådd bindende områder som kanskje ikke er opptatt i alle celletyper, vekstfase, eller miljømessige forhold31.
I fremtiden, kan denne protokollen brukes til å lette forståelsen av bakteriell patogenesen, spesielt biofilm-forming organismer. Fleksibel bruk av denne teknikken og tilgjengelighet av nye datasett kan føre til data integrasjon for å identifisere grupper av proteiner som co-lokalisere å kontrollere cellulære prosesser i biofilm-forming mikroorganismer32. Dessuten, flis-SEQ og RNA-SEQ data kan integrert å bygge regulere system modeller33.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av en bevilgning fra Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) (#2017-05737) til AW og gjennom Jarislowsky Chair i bioteknologi. MP ble støttet av en NSERC-CREATE stipend gjennom Integrated Training program i smittsomme sykdommer, mattrygghet og offentlig politikk (ITraP) ved Universitetet i Saskatchewan.
Forfatterne vil gjerne takke Dani Dale for filming og redigering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose powder | FroggaBio | A87-500G | |
| Balance (Explorer pro) | Ohaus | EP214 | |
| Benchtop Centrifuge (8510R) | Eppendorf | 022627023 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | G2939BA | |
| BR dsDNA kit | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads | Cell Signaling Technology | 9006 | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | COEDTAF-RO ROCHE | |
| Conical tube 15 mL | FroggaBio | TB15-500 | |
| Conical tube 50 mL | FroggaBio | TB50-500 | |
| DC Protein Assay Kit II | BioRad | 5000112 | |
| Disposable Cuvette, 1.5 mL | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
| Electrophoresis equipment (mini-PROTEAN) | Bio-Rad | 1658000 | |
| Floor centrifuge (Sorvall Evolution RC) | Thermo Scientific | 728211 | |
| Fluorometer (Qubit 3.0) | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| GelRed® Nucleic Acid Gel Stain 10 000x in water | Biotium | 41003 | |
| High Sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Incubator (shaking) | VWR | 1570-ZZMFG | |
| Incubator (Water bath shaking) | New Brunswick | G76D | |
| LB media | VWR | 90000-808 | |
| Magnetic stand (DynaMag) | Fisher Scientific | 12321D | |
| Microcentrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5415R | |
| Microcentrifuge Tubes, 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycle) | Illumina | MS-102-3001 | |
| Mixer mill | Retsch | MM400 | |
| Nalgene 115 mL Filter Units, Sterile, 0.2 µm pore size | Thermo Scientific | 73520-980 | |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7370S | |
| NGS Cleanup and Size Select magnetic beads | Machery-Nagel | 744970.5 | |
| Normal mouse serum | AbCam | ab188776 | |
| Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Pipette controller | FroggaBio | MP001 | |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | AM2542 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Rabbit Anti-FLAG Polyclonal Antibody | Sigma-Aldrich | F7425 | |
| RNase A (10 mg/mL; DNase and protease-free) | ThermoFisher Scientific | EN0531 | |
| Rotating wheel | Crystal Technologies & Industries | TR 01A | |
| Safe-Lock Tubes (2.0 mL, colorless) | Eppendorf | 22363344 | |
| Serological pipette 25 mL | FroggaBio | 94024 | |
| Spectrophotometer | Montreal Biotech Inc. | Libra S22 | |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | Qiagen | 69989 | |
| Tapered microtip 1/8" (3mm) Sonicator probe | Sonics & Materials, Inc. | 630-0418 | |
| Tryptone media | VWR | 90000-286 | |
| Ultrasonic Liquid Processor (Sonicator) | Sonics & Materials, Inc. | VC300 | |
| Vacuum equipment (Vacufuge plus) | Eppendorf | 022820001 | |
| Water bath 1 (Lab-line aquabath) | Thermo Scientific | 18000-1 | |
| Water bath 2 (Precision) | Thermo Scientific | 51221044 |
References
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections. Science. 284 (5418), 1318-1322 (1999).
- MacKenzie, K. D., et al. Bistable Expression of CsgD in Salmonella enterica Serovar Typhimurium Connects Virulence to Persistence. Infection and Immunity. 83 (6), 2312-2326 (2015).
- Grantcharova, N., Peters, V., Monteiro, C., Zakikhany, K., Römling, U. Bistable expression of CsgD in biofilm development of Salmonella enterica serovar typhimurium. Journal of Bacteriology. 192 (2), 456-466 (2010).
- MacKenzie, K. D., Palmer, M. B., Köster, W. L., White, A. P. Examining the Link between Biofilm Formation and the Ability of Pathogenic Salmonella Strains to Colonize Multiple Host Species. Frontiers in Veterinary Science. 4, 307 (2017).
- Steenackers, H., Hermans, K., Vanderleyden, J. Salmonella biofilms: an overview on occurrence, structure, regulation and eradication. Food Research International. 45 (2), 502-531 (2012).
- Brombacher, E., Dorel, C., Zehnder, A. J. B., Landini, P. The curli biosynthesis regulator CsgD co-ordinates the expression of both positive and negative determinants for biofilm formation in Escherichia coli. Microbiology. 149, Pt 10 2847-2857 (2003).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).
- Wu, D. -Y., Bittencourt, D., Stallcup, M. R., Siegmund, K. D. Identifying differential transcription factor binding in ChIP-seq. Frontiers in Genetics. 6, 169 (2015).
- Valouev, A., et al. Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChIP-Seq data. Nature Methods. 5 (9), 829-834 (2008).
- Lieb, J. D. Genome-wide mapping of protein-DNA interactions by chromatin immunoprecipitation and DNA microarray hybridization. Methods in Molecular Biology. 224, Clifton, N.J. 99-109 (2003).
- Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).
- Kim, T. H., et al. A high-resolution map of active promoters in the human genome. Nature. 436 (7052), 876-880 (2005).
- Dillon, S. C., et al. Genome-wide analysis of the H-NS and Sfh regulatory networks in Salmonella Typhimurium identifies a plasmid-encoded transcription silencing mechanism. Molecular Microbiology. 76 (5), 1250-1265 (2010).
- Perkins, T. T., et al. ChIP-seq and transcriptome analysis of the OmpR regulon of Salmonella enterica serovars Typhi and Typhimurium reveals accessory genes implicated in host colonization. Molecular Microbiology. 87 (3), 526-538 (2013).
- Gu, D., Liu, H., Yang, Z., Zhang, Y., Wang, Q. Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Technology Reveals Global Regulatory Roles of Low-Cell-Density Quorum-Sensing Regulator AphA in the Pathogen Vibrio alginolyticus. Journal of Bacteriology. 198 (21), 2985-2999 (2016).
- Peano, C., et al. Characterization of the Escherichia coli σ(S) core regulon by Chromatin Immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq) analysis. Scientific Reports. 5 (1), 10469 (2015).
- Blasco, B., et al. Virulence regulator EspR of Mycobacterium tuberculosis is a nucleoid-associated protein. PLoS Pathogens. 8 (3), 1002621 (2012).
- Jones, C. J., et al. ChIP-Seq and RNA-Seq reveal an AmrZ-mediated mechanism for cyclic di-GMP synthesis and biofilm development by Pseudomonas aeruginosa. PLoS pathogens. 10 (3), 1003984 (2014).
- Sengupta, M., Jain, V., Wilkinson, B. J., Jayaswal, R. K. Chromatin immunoprecipitation identifies genes under direct VraSR regulation in Staphylococcus aureus. Canadian Journal of Microbiology. 58 (6), 703-708 (2012).
- Gill, A. Cross-linking chromatin immunoprecipitation (X-ChIP) protocol. , Available from: https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/x_CHip_protocol.pdf (2017).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).
- MacKenzie, K. D., et al. Parallel evolution leading to impaired biofilm formation in invasive Salmonella strains. PLoS Genetics. 15 (6), 1008233 (2019).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9 (9), 137-139 (2008).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Thorvaldsdóttir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).
- Schoppee Bortz, P. D., Wamhoff, B. R. Chromatin immunoprecipitation (ChIP): revisiting the efficacy of sample preparation, sonication, quantification of sheared DNA, and analysis via PCR. PloS One. 6 (10), 26015 (2011).
- Tolstorukov, M. Y., Kharchenko, P. V., Goldman, J. A., Kingston, R. E., Park, P. J. Comparative analysis of H2A.Z nucleosome organization in the human and yeast genomes. Genome Research. 19 (6), 967-977 (2009).
- Geertz, M., Maerkl, S. J. Experimental strategies for studying transcription factor-DNA binding specificities. Briefings in Functional Genomics. 9 (5-6), 362-373 (2010).
- Mardis, E. R. ChIP-seq: welcome to the new frontier. Nature Methods. 4 (8), 613-614 (2007).
- Lee, T. I., et al. Transcriptional regulatory networks in Saccharomyces cerevisiae. Science. 298 (5594), 799-804 (2002).
- Wade, J. T., Struhl, K., Busby, S. J. W., Grainger, D. C. Genomic analysis of protein-DNA interactions in bacteria: insights into transcription and chromosome organization. Molecular Microbiology. 65 (1), 21-26 (2007).
- Myers, K. S., Park, D. M., Beauchene, N. A., Kiley, P. J. Defining bacterial regulons using ChIP-seq. Methods (San Diego, Calif). 86, 80-88 (2015).
