Summary
A imunoprecipitação de cromatina, juntamente com o sequenciamento de última geração (ChIP-seq), é um método usado para estabelecer interações entre fatores de transcrição e as sequências genômicas que eles controlam. Este protocolo descreve técnicas para a realização de ChIP-seq com biofilmes bacterianos, usando salmonella enterica serovar Typhimurium biofilme bacteriano como um exemplo.
Abstract
A imunoprecipitação de cromatina seguida pelo sequenciamento (ChIP-seq) é uma técnica que pode ser usada para descobrir os alvos regulatórios de fatores de transcrição, modificações de histona e outras proteínas associadas ao DNA. Os dados chip-seq também podem ser usados para encontrar a ligação diferencial de fatores de transcrição em diferentes condições ambientais ou tipos de células. Inicialmente, o ChIP foi realizado por meio de hibridização em um microarray (chip ChIP); no entanto, chip-seq tornou-se o método preferido através de avanços tecnológicos, diminuindo as barreiras financeiras para sequenciamento, e enormes quantidades de saída de dados de alta qualidade. Técnicas de realização de ChIP-seq com biofilmes bacterianos, uma das principais fontes de infecções persistentes e crônicas, são descritas neste protocolo. O ChIP-seq é realizado em salmonella enterica serovar Typhimurium biofilm e células planctônicas, visando o regulador mestre de biofilme, CsgD, para determinar a ligação diferencial nos dois tipos de células. Aqui, demonstramos a quantidade adequada de biofilme para a colheita, normalizando-se em uma amostra de controle planctônico, homogeneizando o biofilme para acesso entre linker e realizando etapas rotineiras de ChIP-seq para obter resultados de sequenciamento de alta qualidade.
Introduction
Biofilmes bacterianos, agregados estruturais de células embutidos em uma matriz auto-produzida, são resistentes à dessecação, antibióticos e host respostas imunes1. Como tal, eles causam infecções persistentes e crônicas e apresentam desafios únicos para os pesquisadores devido às suas soluções para a sobrevivência e transmissão. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. O tyfhimurium) foi encontrado para estabelecer populações fenotipicamente heterogêneas de agregados biofilme que são resistentes à dessecação e antibióticos, e células planctônicas que expressam fatores de virulência na cultura pura quando expostas ao estresse ambiental (28 °C, limitando nutrientes)2. Estes dois tipos de células surgem devido à expressão biestável do regulador biofilme mestre, CsgD3. Temos a hipótese de que esta pode ser uma estratégia de cobertura de aposta para Salmonella, onde as células planctônicas participar de células de transmissão de curto prazo e biofilme são capazes de persistir a longo prazo no ambiente até que uma oportunidade para infectar um novo hospedeiro surge2,4. Muitos dos elementos regulatórios que controlam a expressão csg operon são bem caracterizados5. No entanto, além de adra e o csg operon6, poucas metas regulamentares de CsgD são conhecidos. Identificar a rede regulatória csgd nos ajudaria a entender melhor o ciclo de vida de Salmonella e o papel que os biofilmes desempenham na transmissão.
A imunoprecipitação de cromatina, seguida de sequenciamento de alta produtividade (ChIP-seq) é uma poderosa técnica in vivo para identificação em todo o genoma de interações de dna de proteínas e fornece informações sobre processos regulatórios envolvendo fatores de transcrição, modificações de histona ou nucleossomos7. Estudos mais recentes têm usado esta técnica para avaliar a ligação proteica diferencial entre as condições de crescimento e os tiposde células 8. Na imunoprecipitação de cromatina (ChIP), fragmentos de DNA com proteínas interagindo são enriquecidos através da seleção de anticorpos das proteínas-alvo. As células são colhidas e as proteínas de ligação ao DNA estão cruzadas com o DNA in vivo através do tratamento cross-linker de formaldeído. As células são lysed, liberando o conteúdo celular, e cromatina é cortado em cerca de 200-600 fragmentos bp7. Fragmentos de DNA ligados à proteína alvo são imunoprecipitados usando anticorpos, e isolados por descruzamento seguido de digestão deproteínas 9. Estes fragmentos de DNA representam locais de ligação de proteína saqueados pela hibridização a um microarray (Chip ChIP) ou por sequenciamento e mapeamento profundo para a sequência do genoma10,11. Embora os experimentos com chip ChIP produzam dados regulatórios adequados, eles são limitados devido ao uso de sondas caras, bem como hibridização e viés de matriz12. ChIP-seq tem uma gama dinâmica maior com maior resolução de nucleotídeos e cobertura, melhor relação sinal-ruído, e menos artefatos quando comparado ao Chip ChIP7.
ChIP tem sido usado para analisar a regulamentação Sfh e OmpR em Salmonella serovar Typhimurium13,14, quorum-sensoriamento apha regulamento em Vibrio alginolyticus15, rpos regulamento em E scherichia coli16, regulamento espR regulador de virulência em Mycobacterium tuberculosis17, potenciais cicestas diguanylate através da regulamentação AmrZ em Pseudomonas aeruginosa18, bem como VraSR regulamento em Staphylococcus aureus19. Os experimentos bacterianos chip-seq que foram descritos começam com o cultivo de células em mídia líquida e colheita em forma de célula única. No entanto, a análise de biofilmes e regulação gênica correspondente representa um novo conjunto de desafios para gerar um protocolo ChIP-seq bem-sucedido. Neste protocolo, chip-seq é usado para encontrar diferencial metas regulamentares de CsgD, o S. Typhimurium mestre regulador biofilme em biofilme e tipos de células planctônicas. Este protocolo descreve técnicas usadas para determinar as quantidades apropriadas de biofilme para ChIP-seq, biofilme de colheita da cultura do frasco, normalizar amostras de biofilme e controle de células únicas, homogeneizar biofilme e imunoprecipitação completa. Isso será útil para estudar os alvos regulatórios em biofilmes bacterianos e pode ser adaptado para muitas espécies.
Protocol
1. Crescimento da célula cultural do frasco
- De estoques congelados, raia Salmonella serovar Typhimurium cepas em LB ágar (20 mL mídia sólida em 100 milímetros placa de Petri) com o antibiótico apropriado e incubar em 37 ° C para 16-20 h para obter colônias isoladas.
- Inocular 5 mL caldo LB contendo o antibiótico apropriado em um tubo de cultura borosilicato de 25 mm x 150 mm com 1-3 colônias de placas de raia do passo 1.1. Incubar a 37 °C com agitação a 200 rpm para 7 h.
- Medir OD600 da cultura do caldo usando um espectrômetro. Diluir um alibamento da cultura 1 em 4 em PBS em um cuvette de 2 mL e medir a absorção em 600 nm. Nós encontramos o fator o mais crítico nesta etapa para ser a época do crescimento. Os valores do OD são usados para normalizar as culturas para entregar o número desejado de pilhas na etapa 1.4.
- Adicione 1,0 OD600 volume equivalente da cultura celular (ou seja, ~ 109 células) para um frasco Erlenmeyer contendo 100 mL de 1% tripptone com o antibiótico apropriado. Incubar a 28 °C com agitação em 200 rpm para 13 h.
Nota: As células biofilme aparecerão como flocos agregados e células planctônicas individuais estão na mídia nublada.
2. Coleta de células sem 1% tripptone condicionado
- Coletar cultura frasco para celular condicionado 1% tripptone. Cultura do frasco da pipeta diversas vezes para misturar antes de adicionar a um tubo da centrífuga.
- Centrífuga a 12.000 x g por 10 min a 10 °C para pelotas todas as células.
- Decantar supernatant em uma unidade de filtro de 0,2 μm, filtro de vácuo, e dispensar em um novo tubo.
Nota: Os agregados biofilme são aderentes em soluções convencionais (por exemplo, PBS) e ficarão nas laterais de tubos e pontas de pipetas. Uma vez que permite uma manipulação mais fácil, usamos meios de comunicação condicionados (1% tryptone) para mover biofilme inicialmente e usar PBS quente imediatamente antes de cross-linking (passo 4,5) para remover quaisquer substratos de ligação de proteína que poderiam estar presentes na mídia.
3. Separando células biocinematográficas e planctônicas das culturas de frasco2
- Usando uma pipeta estéril de 25 mL, cultura de frasco de alíquota em tubos de 15 mL. Centrífuga em velocidade lenta (210 x g)por 2 min, para separar os dois tipos de células.
Nota: As células biofilme devem formar uma pelota solta na parte inferior do tubo - Pipeta o supernatant contendo células planctônicas em dois tubos de centrífuga de 40 mL para mais tarde (passo 5). Retire todo o líquido restante, tomando cuidado para não perturbar a pelota. Repita até que os tipos de células tenham sido separados de todos os meios de cultura de frasco.
4. Preparar agregados de biofilme
Nota: Biofilme é colhido por peso molhado para produzir 25 μg de DNA, o material mínimo recomendado de partida para ChIP. O Fator de Conversão de Biofilme (BCF) de S. Typhimurium é 1,73 x 108 CFU/mg2. Pesquisadores preparando outros tipos de biofilme terão de definir empiricamente o número de células por unidade de peso do biofilme, que é usado para encontrar o peso do biofilme necessário para 25 μg de material inicial de DNA usando esta equação:
- Pese uma tampa snap de 2 mL ou tubo de tampa de rosca com precisão.
- Resuspenda a pelota biofilme em 1 mL de tripptone condicionada. Mova o biofilme resuspendido em um tubo pré-pesado de 2 mL snap cap ou chave de rosca.
- Centrífuga por 1 min a 11 000 x g a 20 °C
- Retire cuidadosamente todos os supernatant do tubo e pesar o tubo com precisão. Subtraia o peso do tubo do peso do tubo com biofilme para encontrar o peso do biofilme. Deve ser ±10% do peso do biofilme alvo.
- Lave as células para remover a triptona condicionada restante. Adicione 1 mL de PBS quente para o tubo e vórtice suavemente para resuspender a pelota. Centrífuga por 3 min a 8 000 x g para pellet biofilme e remover o supernatant. Adicione 1 mL de PBS para o tubo e vórtice para resuspender a pelota.
5. Preparar células planctônicas
- Registre o volume e o OD600 do supernatant planktonic da centrífugação da velocidade lenta (etapa 3.2) usando um espectrômetro
- Calcule o volume necessário para um OD final600 de 6,0:
- Arrefecer a centrífuga a 10 °C e sedimentar células planctônicas por centrifugação (10.000 x g,10 min a 10 °C)
- Retire o supernatant e resuspender a pelota celular no volume final de PBS calculado na etapa 5.2.
- Remeça o OD600 das células planctônicas usando um espectrômetro e dispense o volume de 6,0 células planctônicas OD600 em uma tampa snap de 2 mL ou tubo de tampa de rosca.
- Traga o volume a 1 mL com PBS.
6. Células homogeneizantes
- Adicione uma conta de aço inoxidável esterilizada de 5 mm a cada um dos tubos.
- Homogeneize usando uma fábrica de batedeiras por 5 min a 30 Hz. Observe tubos agregados para confirmar que o biofilme foi quebrado.
- Transfira as células homogeneizadas para um novo tubo de 1,5 mL, evitando a conta de metal. Traga o volume para 1 mL com PBS.
Nota: Realizar diluições em série para enumerar as células de entrada e verificar se o número final da célula está perto do número desejado ou previsto.
7. Ligação cruzada de proteínas ao ADN
- Dispense o formaldeído fresco em tubos de amostra a uma concentração final de 1%. Incubar por 30 min à temperatura ambiente em uma roda giratória.
Cuidado: O formaldeído é corrosivo, uma pele, olho e irritante respiratório, e inflamável. Dispense em um capô de fumaça. - Adicione 1 M de glicina a uma concentração final de 125 mM para parar de cruzar. Incubar por 5 min à temperatura ambiente em uma roda giratória.
8. Células de lavagem para remover crosslinker em excesso
- Sedimente as células a 8.000 x g por 3 min e remover o supernatant
- Resuspenda a pelota em 20 μL de inibidores da protease 25x e 500 μL de PBS esterilizado do filtro.
- Tubo de centrífuga por 3 min a 8000 x g e remover o supernatant.
9. Células de linhá-de-lysing
- Resuspenda a pelota em 600 μL Lysis buffer (referem-se à Tabela 1)e incubam no gelo por 10 min.
- Adicione 1,4 mL de buffer de diluição IP (consulte a Tabela 1) a um tubo estéril de 15 mL e mova as células lofetadas para o tubo de 15 mL. Mantenha o tubo no gelo por 1,5-2 h, e vórtice suavemente e ocasionalmente.
Nota: Algum material celular resistente pode permanecer em tubos. Um longo período de incubação no gelo com vórtice ocasional vai quebrar o material. O restante será dividido através de sonication.
10. Fragmentação do DNA por sonication
- Coloque o tubo de 15 mL em um copo de gelo e coloque a sonda de 3 mm dentro do tubo.
- Executar 5 rodadas de som de 30 s em 20-40% de 400 W com 2 min refrigeração no gelo entre rajadas.
- Sedimento precipitado material por centrífuga (8000 x g, 10 min em 4 °C). Transfira o supernatant para um novo tubo.
- Opcionalmente, realize decrosslinking em 65 °C para 30-60 min e digerem RNA e proteína a 45 °C por 30-60 min antes de correr em um gel agarose de 2% para verificar se há fragmentos de tamanho adequados.
Nota: Mergulhe a sonda no lysate celular. Mantenha a solução no gelo enquanto sonora e descansando. Não retire o tubo enquanto a sonda sonicator está pulsando. A solução deve parecer nublado pré-sonorização e pós-sonication claro.
11. Imunoprecipitação de complexos de anticorpos de DNA-proteína
- Preparação
- Dispense um alíquo de 1,35 mL para imunoprecipitação e um alíquo de 200 μL como controle de entrada. Guarde o controle de entrada em -80 °C até que decrosslinking e digerimento etapas são realizadas.
- Imunoprecipitação com anticorpos primários
- Adicione 10 μg de anticorpo primário específico de proteína purificada ao alibado de 1,35 μL. Incubar durante a noite a 4 °C em uma roda giratória.
Nota: O anticorpo primário pode ser um anticorpo monoclonal, soro policlonal de alta qualidade ou anticorpo epitope comercial (ou seja, anti-FLAG). - Adicione 50 μL de contas magnéticas de proteína G aos tubos do passo 11.2.1 e incubar-se a 4 °C por 3 h em uma roda rotativa.
- Coloque o tampão de lavagem IP 1, o buffer de lavagem IP 2 e o TE pH 8.0 (consulte a Tabela 1)em um balde de gelo. Tampão de elução quente a 65 °C.
Nota: Não coloque a solução contendo tampão de elução no gelo. - Ligue as contas magnéticas Protein G ao lado dos tubos usando um suporte magnético
- Executar lave: lave 2x com 750 μL tampão de lavagem IP fria 1, lave 1x com 750 μL tampão de lavagem IP fria 2 e lave 2x com 750 μL TE frio no pH 8.0. Mantenha os tubos no suporte magnético durante lavandas.
- Adicione 450 μL de tampão de elução IP (consulte a Tabela 1)a cada tubo e incubar a 65 °C por 30 min com vórtice suave a cada 5 min.
- Ligue as contas ao lado dos tubos usando um suporte magnético. Espere pelo menos 2 min até que a solução esteja clara.
- Dispense o supernatant cancelado a um tubo novo de 1.5 mL, sendo cuidadoso não perturbar a pelota magnética do grânulo.
- Adicione 10 μg de anticorpo primário específico de proteína purificada ao alibado de 1,35 μL. Incubar durante a noite a 4 °C em uma roda giratória.
12. Decrosslinking complexos de proteína de DNA e digestão co-purificação de RNA e proteína
- Adicione 2 μg RNase A e NaCl a uma concentração final de 0,3 M em cada tubo.
- Incubar a 65 °C, para ≥6 h, ou durante a noite.
- Digestão completa de proteínas, adicionando 180 μg Proteinase K para cada tubo, em seguida, incubando a 45 °C para 3-5 h.
13. Preparação e sequenciamento da biblioteca
- Purificar o DNA usando contas magnéticas
Nota: As contas magnéticas são preferidas para isolar as pequenas quantidades de DNA geralmente recuperadas durante o ChIP com células bacterianas. - Prepare bibliotecas usando um kit compatível com a plataforma de sequenciamento selecionada.
- Verifique a concentração da biblioteca com um flódromo e um kit dsDNA de ampla gama ou um kit de quantificação da biblioteca qRT-PCR.
Nota: Em nossa experiência, as medidas do flódromo podem superestimar a concentração do ADN. - Bibliotecas de piscina, responsáveis por cobertura adequada para cada amostra da biblioteca. Para o sequenciamento de Illumina com salmonella,agrupamos 10 a 12 bibliotecas. Adicione o Tris-HCl pH 8.0 a uma concentração final de 1 mM.
- Sequência de acordo com as especificações da plataforma selecionada.
Representative Results
A preparação de amostras de imunoprecipitação de cromatina de biofilme bacteriano envolve vários passos, como mostra a Figura 1. Estes incluem o cultivo de biofilme na cultura do frasco, coleta de mídia condicionada, coleta de uma quantidade adequada de biofilme e células planctônicas como controle, células de lavagem em PBS, homogeneização, proteínas crosslinking ao DNA, células de latividade, fragmentação de DNA por sonoridade, imunoprecipitação de DNA com os anticorpos apropriados e proteína suficiência G beads lavagem, dna imunoprecipitado e imunoprecipitação de dna, e purifying DNA para preparação e sequenciamento da biblioteca.
As células S. Typhimurium cultivadas na cultura líquida condições indutoras de biofilme passam por uma mudança de fenótipo para formar agregados de biofilme multicelulares e células planctônicas. Esta população conterá aproximadamente 40% de agregados biofilmes, que expressam níveis mais elevados de ciclases diguanylate (DGCs) e reguladores de biofilme, e 60% de células planctônicas, que expressam níveis mais elevados de genes associados à virulência2,4 (Figura 2A). Neste protocolo, descrevemos um método para colher ambos os tipos de células para comparar os locais de transcrição através do ChIP-seq; no entanto, este protocolo pode ser adaptado para outros tipos de biofilmes formados por outras espécies bacterianas. Os agregados biofilme e as células planctônicas são separados por centrífugade de velocidade lenta, que pelotas biofilme e deixa células planctônicas no supernatant2 (Figura 2B). Os tipos de células são então tratados separadamente para etapas subsequentes no protocolo.
A quantidade recomendada de entrada de DNA para ChIP-seq é de 10-25 μg20. Em S. Cultura do frasco de typhimurium, 30 mg de biofilme produz aproximadamente 25 μg DNA. Uma vez que os agregados biofilme têm uma abundância de material extracelular proteáceo, nós hipotetizamos que isso iria interferir com a eficiência da ligação cruzada. Se nós devemos simplesmente normalizar os tipos diferentes da pilha pelo número de pilha, o tratamento de pilhas planktonic pode conduzir a uma quantidade desigual de produto crosslinked apresentado para o immunoprecipitation. Um ensaio proteico foi realizado para determinar a quantidade equivalente de material celular planctônico para combinar com 30 mg de biofilme (Figura 3). 6.0 OD600 de células planctônicas foram colhidas para coincidir com 30 mg biofilme.
Os agregados biofilme devem primeiro ser separados para permitir a igualdade de acesso de ligação cruzada a todas as células. Descobrimos que a maneira mais uniforme e de alta taxa de produção para homogeneizar as células estava usando uma fábrica de batedeira e 5 mm de contas de aço inoxidável(Figura 4A). As células planctônicas são tratadas da mesma forma para reduzir variáveis no experimento ChIP-seq(Figura 4B).
Uma vez que o DNA foi fragmentado por sonication, crosslinked, e tratado com RNase e Proteinase K, ele pode ser visualizado em um gel de 2% agarose. O DNA sônico é dividido em uma coleção de fragmentos que aparecem como uma mancha no gel agarose. O tamanho médio do fragmento diminui com um número crescente de estouros da sonication(figura 5). Transferência de energia irá variar para diferentes unidades sonicator, assim que um ensaio de som é recomendado para determinar o número de explosões de sonication necessárias para fragmentar o DNA para uma média de menos de 1 kb. Para o nosso experimento ChIP-seq, escolhemos 5 explosões.
As diretrizes do ENCODE recomendam uma confirmação da atividade de ligação ao alvo de anticorpos com um imunoblot21. Neste caso, medimos a especificidade e a força do nosso anticorpo de ligação por imunoblota em lysates celulares inteiras preparadas para ChIP (Figura 6). Confirmamos que o anticorpo se liga ao CsgD-3xFLAG; sinais anti-FLAG e anti-CsgD colocalizam o peso molecular esperado (28 kDa)22.
Os procedimentos chip muitas vezes produzem baixas concentrações de DNA. Portanto, um método de purificação que remove contaminantes e retém uma alta proporção do DNA foi escolhido. A purificação de contas magnéticas foi escolhida em vez de purificação baseada em colunas porque reteve baixas concentrações de DNA ChIP de entrada melhor (Figura 7) e removeu contaminantes (dados não mostrados).
Devido à redução dos montantes iniciais de DNA, a preparação da biblioteca do DNA ChIP pode exigir adaptadores diluídos e enriquecimento de PCR. Antes do sequenciamento, as bibliotecas podem ser visualizadas pelo rastreamento bioanalisar para confirmar a distribuição correta de tamanho antes e depois do enriquecimento de PCR(Figura 8). Além disso, se houver um alvo regulatório conhecido do fator de transcrição, qPCR deve ser usado para confirmar o enriquecimento de regiões de ligação, comparando a mudança de dobra (?ct) entre alvo conhecido e abundância de seqüência de genes de referência no DNA de entrada imunoprecipitada e sônica.
Os dados de sequenciamento do ChIP devem ser analisados atribuindo pontuações de qualidade, aparando bases de baixa qualidade, alinhando leituras para a frente e reversa (em sequenciamento final emparelhado), montagem em um genoma de referência de alta qualidade, encontrando picos acima do fundo e realizando análise a jusante(Figura 9A). A análise a jusante deve incluir visualização e anotação de picos, consistência com amostras de replicação biológica e análise de motivos, e pode incluir análise de ligação diferencial entre condições ou tipos de células e integração de dados com expressão gênica de vias conhecidas. Para os dados chip-seq, como o nosso, os picos devem ser identificados como significativamente acima do fundo(Figura 9B, C, barras vermelhas) com uma determinação de valor p, não simplesmente por mudança de dobra. Em última análise, as leituras mapeadas são visualizadas contra a anotação do genoma de referência(Figura 9D). Um resultado pobre chip-seq pareceria como entrada-seq sem quaisquer picos significativos acima do fundo.
Figura 1: Ilustração dos passos em ChIP-seq com biofilmes bacterianos. No procedimento descrito, S. As células de tyfhimurium são cultivadas em 1% da cultura do frasco tryptone a 28 °C com agitação (1), a mídia condicionada sem células é coletada para lidar com tipos de células biofilme (2), que é usada para coletar uma quantidade adequada de células biofilme e pranchatônica (3). Essas células são lavadas com PBS e homogeneizadas para quebrar biofilme (4). As proteínas são cruzadas ao ADN com um crosslinker do formaldeído, depois do qual as pilhas são lysed para liberar índices da pilha (5). O DNA no lysato celular é fragmentado pela sonorização (6). O ADN cruzado à proteína do alvo é selecionado através da imunoprecipitação com um anticorpo que se liga à proteína alvo e às contas magnéticas protein g (7). O DNA selecionado é lavado e eluted dos grânulos magnéticos da proteína G (8) e purificado para a preparação e o seqüenciamento da biblioteca (9). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Modelo de frasco in vitro para estudar S. Desenvolvimento do biofilme de Typhimurium. (A) S. Células de timúbulo cultivadas em 1% triptina por 13 h a 28 °C passam por enfeótipo de comutação para formar agregados de biofilme e células planctônicas na fase líquida da cultura do frasco. (B) Os agregados biofilme e as células planctônicas da cultura do frasco em (A) foram separados através da centrifugação a 210 x g por 2 min. O supernatant foi colhido para preparações planktonic da pilha e a pelota foi colhida para preparações da pilha do biofilme. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 3: Concentrações totais de proteínas para células planctônicas e amostras de células biofilme colhidas de S. Cultura do frasco de Typhimurium. Os ensaios colorimétricos da proteína foram executados e as quantidades da proteína relativas a uma curva padrão de BSA foram medidas em 750 nm. O índice de proteína de amostras de células planctônicas lofadas em 4,0, 6,0 e 8,0 OD600 foi comparado a 30 mg de agregados de biofilme. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 4: Homogeneização de amostras celulares de S. Culturas de garrafas de biofilme typhimurium. (A)Os agregados biofilme da cultura do frasco resuspendidos na PBS (esquerda) foram homogeneizados usando uma fábrica de batedeiras a 30 Hz por 5 min (direita). (B) Células planctônicas da cultura do frasco resuspendidas na PBS foram processadas pela fábrica de misturadors a 30 Hz por 5 min para garantir a consistência entre amostras de tipo celular. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 5: Ensaio de sonication com lysates celulares pré-ChIP. As amostras agregadas e de células planctônicas biofilme foram separadas, homogeneizadas, cruzadas e lizadas. Complexos de proteína de DNA foram sonorizados até 8 vezes aos 30 s e 2 min fora no gelo para quebrar o DNA em fragmentos menores. Uma parte do lysate sonicated foi separada em um gel de agarose de 2%. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 6: Especificidade vinculante ao alvo do anticorpo anti-FLAG usado no ChIP-seq. A especificidade do anticorpo foi avaliada pela imunoblotting contra lysates celulares inteiras preparadas a partir de culturas de frasco do S. Cepas de typhimurium como mostrado. As amostras de biofilme de cepa csgD + p3xFLAG/csgD e WT representam agregados biofilmecolhidos de frascos, enquanto as células planctônicascsgD ± p3xFLAG e WT representam células planctônicas. O CsgD purificado foi carregado como controle. As lysates inteiras da pilha foram normalizadas de modo que 30 μg da proteína total fossem analisados em cada pista. Os números à esquerda referem-se ao tamanho (em kDa) dos marcadores de peso molecular prestained. O anticorpo primário usado para a mancha superior era o anticorpo policlonal coelho-anti-FLAG (Sigma-Aldrich #F7425), enquanto a mancha inferior foi incubada com coelho-anti-FLAG, juntamente com um anticorpo monoclonal específico do CsgD2. O anti-coelho de cabra IgG (LiCor IRDye 680RD, 925-68071) e o anti-rato de cabra IgG (LiCor IRDye 800CW, 925-32210) foram usados como anticorpos secundários. Sinais fluorescentes foram visualizados usando o sistema de imagem Odyssey CLx e o pacote de software Image Studio 4.0 (Li-Cor Biosciences). Imagens representativas são mostradas. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 7: Estratégias de purificação baseadas em contas magnéticas ou de coluna para pequenas quantidades de DNA resultantes de experimentos ChIP-seq. Amostras de quantidades conhecidas de DNA foram purificadas por meio de kits baseados em colunas ou contas magnéticas e a concentração do eluate foi medida após a purificação. As contas magnéticas mostraram melhor recuperação em baixos níveis de DNA, semelhantes às baixas quantidades de DNA normalmente encontradas no final do protocolo ChIP-seq, mas antes da preparação da biblioteca NGS. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 8: Preparações de DNA chip e bibliotecas subsequentes visualizadas pela Bioanalyzer. (A)O tamanho médio do fragmento de DNA genômico após a lyse celular e sonication foi <1000 bp, com a maioria dos fragmentos na faixa de 200-500 bp. (B)O material inicial para a preparação da biblioteca estava abaixo da detecção. C) A ligadura adaptador e o enriquecimento de PCR permitem a amplificação de fragmentos de biblioteca. (D)Uma preparação pobre da biblioteca tem baixos picos do ADN, picos de forma impar ou elevados do peso molecular, ou picos abundantes do adaptador em aproximadamente 100 bp. Clique por aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: Os dados chip-seq são analisados usando ferramentas bioinformáticas e visualizados em um navegador genoma. A. Fluxograma para análise bioinformática típica de dados ChIP-seq. Leituras cruas para biofilme (cepacsgD + p3xFLAG/csgD)e células planctônicas(csgD + p3xFLAG) foram limpas para leituras e adaptadores de baixa qualidade, e mapeadas para S. Genomas de Typhimurium 14028s (NC_016856.1 para o cromossoma e NC_016855.1 para o plasmídeo) por Bowtie2 (v2.3.3.1) com parâmetros padrão23. Macs2 (v2.1.2) foi usado para chamar os picos com parâmetros de '-q 0.01 -- nomodel', fazendo réplicas de biofilme como conjuntos de dados de teste e pranchatônicos como controle24. O módulo macs2 bdgcmp foi usado ainda para gerar pista de enriquecimento dobrável com parâmetros de '-m FE'. O arquivo de pico significativo com faixa de enriquecimento dobrável foi transformado em um arquivo de peruca usando bedtools/bedClip/bedGraphToBigWig25 e visualizado no genoma de referência usando Genômica Integrativa Viewer v2.5.126. Os picos representativos são mostrados (barras vermelhas). (B) Grande região de ~ 40 kbp, que contém vários picos, é um resultado atípico, mas ainda potencialmente valioso. (C)Este é um resultado mais típico, mostrando duas regiões de pico significativas. (D)Zoom no pico esquerdo em C, mostrando lê mapeamento para a região do S. Genoma de Typhimurium 14028s que contem promotores divergentes para uspA e uspB. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
| Amortecedores da lyse da pilha |
| Tampão de lyse |
| 50 mM Tris-HCl pH 8.1 |
| 10 mM EDTA |
| 1% SDS |
| inibidores da protease |
| Tampão de diluição IP |
| 20 mM Tris-HCl pH 8.1 |
| 2 mM EDTA 2 mM EDTA |
| 150 mM NaCl 150 mM NaCl |
| 1% Triton X-100 |
| 0,01% SDS |
| Amortecedores de imunoprecipitação |
| Tampão de lavagem IP 1 |
| 20 mM Tris-HCl pH 8.1 |
| 2 mM EDTA 2 mM EDTA |
| 50 mM NaCl |
| 1% Triton X-100 |
| 0,1% SDS |
| Tampão de lavagem IP 2 |
| 10 mM Tris-HCl pH 8.1 |
| 250 mM LiCl 250 mM LiCl |
| 1 mM EDTA |
| 1% NP-40 |
| 1% de ácido desoxicólico |
| TE (T10E1) pH 8.0 |
| 10 mM Tris-HCl 10 mM Tris-HCl |
| 1 mM EDTA |
| Tampão de elução |
| 1% SDS |
| 100 mM NaHCO3 |
Tabela 1. Receitas tampão.
Discussion
Este protocolo descreve uma técnica para a realização de ChIP-seq com Salmonella enterica serovar Typhimurium biofilme e células planctônicas da cultura pura, para encontrar alvos regulamentares do regulador biofilme mestre, CsgD. Esperamos informações diferenciais de ligação devido à biestabilidade da CsgD nos dois tipos de células, com altos níveis em agregados de biofilme e baixos níveis nas células planctônicas2,3. No entanto, esta técnica também pode ser aplicada a outros fatores de transcrição bacteriana, tipos de células ou condições de crescimento. Em particular, esta técnica pode ser adaptada a outros biofilmes bacterianos usando um fator de conversão experimentalmente determinado para A UE por unidade de peso das células biofilme.
O ChIP-seq pode ser propenso à amplificação de erro técnico por meio do sequenciamento; no entanto, a confirmação em etapas críticas pode evitar este27. A especificidade primária do anticorpo é importante para selecionar apenas o fator de transcrição alvo e o DNA que ele controla durante a imunoprecipitação7. Neste experimento, csgD foi fundido a uma etiqueta 3xFLAG codificada em plasmídeo na extremidade 3' do gene, correspondente ao C-terminus de CsgD22. O plasmídeo p3xFLAG sem csgD foi usado como um "controle" (S. Typhimurium 14028 csgD + p3xFLAG). As diretrizes do ENCODE recomendam a realização de imunoblotes com anticorpos primários contra a proteína de interesse, e as lysates das cepas e tensões de exclusão chip21. É importante garantir que as condições de crescimento sejam consistentes em todas as réplicas para reduzir a variabilidade nos resultados de sequenciamento de fatores de transcrição e downstream. Se for preciso garantir que tamanhos de inóculo e condições de crescimento pré-inóculo sejam consistentes, o crescimento de biofilmes na cultura do frasco é consistente4. É importante confirmar que todo o biofilme foi quebrado após a homogeneização, para garantir a igualdade de acesso de reagentes, particularmente formaldeído cross-linker, para todas as células.
Várias modificações podem permitir que os pesquisadores usem esse protocolo para outras proteínas de ligação ao DNA, tipos de células, cepas, condições de crescimento ou equipamentos de laboratório. Se for usado para espécies biocinematográficas que não s. Typhimurium, o fator de conversão de unidades de formação de colônias por peso unitário de biofilme precisa ser determinado experimentalmente apartir da colheita de diferentes quantidades de biofilme, homogeneizando o biofilme completamente, e realizando diluições em série e contagem de placas para criar uma curva padrão, que pode não ser precisa em pesos de biofilme mais baixos2. A transferência de energia sonicator e a resistência do tipo celular podem diferir; portanto, um ensaio de sonication é recomendado para encontrar o número de explosões de somque irá produzir a faixa de tamanho do fragmento necessário para a preparação da biblioteca a jusante e seqüenciamento11. A fragmentação da cromatina por nuclease microcócica é uma alternativa à sonorização que produz alta resolução de locais de ocupação; no entanto, este método pode introduzir viés de fragmentação7,28. A faixa de tamanho do DNA pode ser alterada dependendo dos kits de preparação da biblioteca a jusante e das plataformas de sequenciamento. Outros métodos de homogeneização podem ser usados em vez da fábrica de batedeiras. Por exemplo, um homogeneizador de tecido de vidro pode ser substituído, mas pode aerossolizar ou quebrar incompletamente o biofilme. Em termos de controles, o DNA pré-imunoprecipitado pode ser normalizado no processamento e análise pós-sequenciamento. Um controle de mock-IP com soro de anticorpo normal compatível com espécies pode ser usado como um controle também13.
Os pesquisadores devem considerar as limitações a este método ao considerar um experimento ChIP-seq. Modificações significativas podem ser necessárias para adaptá-lo para outros tipos de biofilme. Por exemplo, com salmonella typhimurium resuspensão imediata de biofilme na PBS leva à perda mensurável de agregados biofilme. A imunoprecipitação que visa alvos regulatórios de fatores de transcrição em bactérias pode resultar em quantidades muito pequenas de DNA, o que é um desafio para a purificação e detecção em etapas posteriores. Viés pode ser introduzido durante a tosquia e manipulação a jusante durante a detecção da biblioteca9. Além disso, este método não revela níveis de expressão in vivo em resposta à ligação do fator de transcrição. Pesquisadores que têm pouca experiência em bioinformática podem ser desafiados pelo pipeline de análise. Este método pode ser intensivo em termos de tempo e caro; no entanto, o custo do sequenciamento é muitas vezes menor do que um microarray e está diminuindo ao longo do tempo como melhorias tecnológicas continuam a ser feitas.
Poucos métodos na literatura descrevem ChIP com bactérias, e a maioria dos experimentos bacterianos começa com uma simples condição de crescimento13,14,15,17,18. A preparação da amostra chip com células individuais é simples e apresenta menos desafios do que a preparação da amostra ChIP com agregados de biofilme. Quanto à ChIP-seq, métodos anteriores de estudo de circuitos cis-regulatórios, incluindo a evolução sistemática dos ligantes por enriquecimento exponencial (SELEX), ensaios de mudança de mobilidade eletrofética (EMSA), ChIP-chip, exclusão de promotores e análise de repórterforam complementados ou substituídos por ChIP-seq29. A ChIP-seq está substituindo o Chip ChIP devido ao avanço das tecnologias e à disponibilidade de sequenciamento. O sequenciamento profundo fornece aos pesquisadores grandes quantidades de dados que podem identificar sites com menor afinidade de ligação e maior resolução de pares de base com menos material inicial do que o Chip ChIP11,30. A análise dos dados do ChIP de organismos com genomas de referência de alta qualidade é geralmente rápida e específica. Além disso, chip-seq é um método completo para descobrir em silico previu sites de ligação que não podem ser ocupados em todos os tipos de células, fase de crescimento, ou condições ambientais31.
No futuro, este protocolo pode ser usado para facilitar a compreensão da patogênese bacteriana, particularmente organismos formadores de biofilme. A ampla adoção dessa técnica e a disponibilidade de novos conjuntos de dados podem levar à integração de dados para identificar grupos de proteínas que co-localizam para controlar processos celulares em microorganismos formadores debiofilme32. Além disso, os dados ChIP-seq e RNA-seq podem ser integrados para criar modelos de sistema regulatório33.
Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada por uma subvenção do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia (NSERC) (#2017-05737) para a AW e através da Cadeira Jarislowsky em Biotecnologia. O MP foi apoiado por uma bolsa NSERC-CREATE através do Programa Integrado de Treinamento em Doenças Infecciosas, Segurança Alimentar e Políticas Públicas (ITraP) da Universidade de Saskatchewan.
Os autores gostariam de agradecer a Dani Dale por filmar e editar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose powder | FroggaBio | A87-500G | |
| Balance (Explorer pro) | Ohaus | EP214 | |
| Benchtop Centrifuge (8510R) | Eppendorf | 022627023 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | G2939BA | |
| BR dsDNA kit | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads | Cell Signaling Technology | 9006 | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | COEDTAF-RO ROCHE | |
| Conical tube 15 mL | FroggaBio | TB15-500 | |
| Conical tube 50 mL | FroggaBio | TB50-500 | |
| DC Protein Assay Kit II | BioRad | 5000112 | |
| Disposable Cuvette, 1.5 mL | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
| Electrophoresis equipment (mini-PROTEAN) | Bio-Rad | 1658000 | |
| Floor centrifuge (Sorvall Evolution RC) | Thermo Scientific | 728211 | |
| Fluorometer (Qubit 3.0) | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| GelRed® Nucleic Acid Gel Stain 10 000x in water | Biotium | 41003 | |
| High Sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Incubator (shaking) | VWR | 1570-ZZMFG | |
| Incubator (Water bath shaking) | New Brunswick | G76D | |
| LB media | VWR | 90000-808 | |
| Magnetic stand (DynaMag) | Fisher Scientific | 12321D | |
| Microcentrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5415R | |
| Microcentrifuge Tubes, 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycle) | Illumina | MS-102-3001 | |
| Mixer mill | Retsch | MM400 | |
| Nalgene 115 mL Filter Units, Sterile, 0.2 µm pore size | Thermo Scientific | 73520-980 | |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7370S | |
| NGS Cleanup and Size Select magnetic beads | Machery-Nagel | 744970.5 | |
| Normal mouse serum | AbCam | ab188776 | |
| Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Pipette controller | FroggaBio | MP001 | |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | AM2542 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Rabbit Anti-FLAG Polyclonal Antibody | Sigma-Aldrich | F7425 | |
| RNase A (10 mg/mL; DNase and protease-free) | ThermoFisher Scientific | EN0531 | |
| Rotating wheel | Crystal Technologies & Industries | TR 01A | |
| Safe-Lock Tubes (2.0 mL, colorless) | Eppendorf | 22363344 | |
| Serological pipette 25 mL | FroggaBio | 94024 | |
| Spectrophotometer | Montreal Biotech Inc. | Libra S22 | |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | Qiagen | 69989 | |
| Tapered microtip 1/8" (3mm) Sonicator probe | Sonics & Materials, Inc. | 630-0418 | |
| Tryptone media | VWR | 90000-286 | |
| Ultrasonic Liquid Processor (Sonicator) | Sonics & Materials, Inc. | VC300 | |
| Vacuum equipment (Vacufuge plus) | Eppendorf | 022820001 | |
| Water bath 1 (Lab-line aquabath) | Thermo Scientific | 18000-1 | |
| Water bath 2 (Precision) | Thermo Scientific | 51221044 |
References
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