Summary
Chromatin-immunoprecipitatie in combinatie met de volgende generatie sequencing (ChIP-SEQ) is een methode die wordt gebruikt om interacties tussen transcriptiefactoren en de genomische sequenties die ze beheersen vast te stellen. Dit protocol schetst technieken voor het uitvoeren van chip-SEQ met bacteriële biofilms, met behulp van salmonella heliobacter Serovar typhimurium bacteriële biofilm als een voorbeeld.
Abstract
Chromatin-immunoprecipitatie gevolgd door sequencing (ChIP-SEQ) is een techniek die kan worden gebruikt om de regelgevings doelen van transcriptiefactoren, Histon-modificaties en andere DNA-geassocieerde eiwitten te ontdekken. ChIP-SEQ-gegevens kunnen ook worden gebruikt voor het vinden van differentiële binding van transcriptiefactoren in verschillende omgevingscondities of celtypen. In eerste instantie, ChIP werd uitgevoerd door hybridisatie op een Microarray (ChIP-chip); echter, ChIP-SEQ is uitgegroeid tot de voorkeursmethode door technologische vooruitgang, het verminderen van financiële barrières voor sequencing, en enorme hoeveelheden van hoge kwaliteit data-output. Technieken van het uitvoeren van ChIP-SEQ met bacteriële biofilms, een belangrijke bron van aanhoudende en chronische infecties, worden beschreven in dit protocol. De chip-SEQ wordt uitgevoerd op salmonella heliobacter Serovar typhimurium biofilm en plankton cellen, gericht op de Master biofilm regulator, csgd, om de differentiële binding in de twee celtypen te bepalen. Hier demonstreren we de juiste hoeveelheid biofilm om te oogsten, normaliseren we naar een plankton controlemonster, homogeniseren biofilm voor cross-linker toegang, en het uitvoeren van routine ChIP-SEQ stappen om hoge kwaliteit sequencing resultaten te verkrijgen.
Introduction
Bacteriële biofilms, structurele aggregaten van cellen ingebed in een zelfgeproduceerde matrix, zijn resistent tegen uitdroging, antibiotica, en gastheer immuunresponsen1. Als zodanig, ze veroorzaken aanhoudende en chronische infecties en presenteren unieke uitdagingen voor onderzoekers als gevolg van hun oplossingen voor overleving en transmissie. Salmonella heliobacter Serovar typhimurium (v. Typhimurium) is gebleken om fenotypisch heterogene populaties van biofilm aggregaten vast te stellen die resistent zijn tegen uitdroging en antibiotica, en plankton cellen die virulentie factoren in zuivere cultuur uitdrukken bij blootstelling aan omgevingsstress (28 °C, beperking van voedingsstoffen)2. Deze twee celtypen ontstaan als gevolg van bistabiele uitdrukking van de Master biofilm regulator, CsgD3. We hebben veronderstelde dat dit een weddenschap-hedging strategie voor salmonellakan zijn, waarbij de plankton cellen deelnemen aan korte termijn transmissie en biofilm cellen in staat zijn om lange termijn in de omgeving te behouden totdat een kans om een nieuwe gastheer te infecteren zich voordoet2,4. Veel van de regelgevende elementen die de CSG -operon-expressie beheersen, zijn goed gekarakteriseerd5. Naast Adra en de CSG -operon6zijn echter weinig regelgevende targets van csgd bekend. Het identificeren van het regelgevende netwerk van CsgD zou ons helpen om de levenscyclus van salmonella en de rol die biofilms in transmissie spelen beter te begrijpen.
Chromatin-immunoprecipitatie gevolgd door een high-throughput sequencing (ChIP-SEQ) is een krachtige in vivo-techniek voor genoom-brede identificatie van eiwit-DNA-interacties en verschaft informatie over regelgevingsprocessen met betrekking tot transcriptiefactoren, Histon-modificaties of nucleosomes7. Nieuwere studies hebben gebruikt deze techniek om te beoordelen van differentiële eiwitbinding tussen groei voorwaarden en celtypen8. In Chromatine-immunoprecipitatie (ChIP) worden DNA-fragmenten met interactie eiwitten verrijkt door antilichaam selectie van de doel eiwitten. Cellen worden geoogst en DNA-bindende eiwitten worden via formaldehyde cross-linker behandeling met DNA in vivo gecrosslinkt. Cellen zijn lysed, vrijgeven van de inhoud van de cel, en chromatine wordt geschoren in ongeveer 200 – 600 BP fragmenten7. DNA-fragmenten gebonden aan het doeleiwit zijn immunoprecipitated met behulp van antilichamen, en geïsoleerd door de-crosslinking gevolgd door eiwit spijsvertering9. Deze DNA-fragmenten vertegenwoordigen eiwithoudende binding sites die worden gematcht door hybridisatie aan een Microarray (ChIP-chip) of door diepe sequencing en mapping aan de genoom sequentie10,11. Hoewel ChIP-chip-experimenten adequate regelgevende gegevens opleveren, zijn ze beperkt vanwege het gebruik van dure sondes, evenals hybridisatie en array bias12. De ChIP-SEQ heeft een groter dynamisch bereik met een verhoogde nucleotide-resolutie en-dekking, een verbeterde signaal-ruis verhouding en minder artefacten in vergelijking met ChIP-chip7.
ChIP is gebruikt om de SFH-en ompr-verordening te analyseren in salmonella Serovar typhimurium13,14, Quorum-sensing APHA-verordening in Vibrio alginolyticus15, rpos-verordening in Escherichia coli16, virulentie regulator ESPR-verordening in Mycobacterium tuberculose17, potentiële diguanylate cyclases via amrz-verordening in Pseudomonas aeruginosa18, evenals vrasr regulatie in Staphylococcus aureus19. De bacteriële ChIP-SEQ-experimenten die zijn beschreven beginnen met groeiende cellen in vloeibare media en oogsten in één cel vorm. De analyse van biofilms en bijbehorende genregulatie vormt echter een nieuwe reeks uitdagingen voor het genereren van een succesvol ChIP-SEQ-protocol. In dit protocol wordt ChIP-SEQ gebruikt om differentiële regelgevende targets van CsgD te vinden, de S. Typhimurium Master biofilm regulator in biofilm en de plankton celtypen. Dit protocol beschrijft technieken die worden gebruikt om de juiste hoeveelheden biofilm te bepalen voor ChIP-seq, oogst biofilm uit de kolf cultuur, Normaliseer biofilm en enkelvoudige celcontrole monsters, homogeniseren biofilm en volledige immunoprecipitatie. Dit zal nuttig zijn voor het bestuderen van de Regelgevingsdoelstellingen in bacteriële biofilms en kan worden aangepast voor vele soorten.
Protocol
1. maatkolf kweek celgroei
- Uit bevroren voorraden, streak salmonella Serovar typhimurium stammen op lb agar (20 ml Solid media in 100 mm Petri plaat) met het juiste antibioticum en inbroed bij 37 °c gedurende 16 – 20 uur om geïsoleerde kolonies te verkrijgen.
- Inoculeren 5 mL LB bouillon met het geschikte antibioticum in een 25 mm x 150 mm boor silicaat cultuur buis met 1 – 3 kolonies van streak platen uit stap 1,1. Incuberen bij 37 °C met schudden bij 200 rpm gedurende 7 uur.
- Meet od600 van de Bouillon-cultuur met behulp van een spectrofotometer. Verdun een aliquot cultuur 1 in 4 in PBS in een 2 mL cuvette en meet de extinctie bij 600 nm. We hebben bij deze stap de meest kritische factor gevonden om de tijd van groei te zijn. De OD-waarden worden gebruikt om de culturen te normaliseren om het gewenste aantal cellen in stap 1,4 te leveren.
- Voeg 1,0 od600 volume equivalent van celkweek (d.w.z. ~ 109 cellen) toe aan een erlenmeyer kolf met 100 ml 1% vorming met het geschikte antibioticum. Inbroed bij 28 °C bij een schud snelheid van 200 rpm gedurende 13 uur.
Opmerking: biofilm cellen zullen verschijnen als samengevoegde vlokken en enkelvoudige plankton cellen in de bewolkte media.
2. het verzamelen van geconditioneerde cel-vrij 1% vorming
- Verzamel de kolf cultuur voor een cel-vrij met 1% Tryptone. Pipetteer de kweek verschillende malen om te mengen voordat u deze toevoegt aan een centrifugebuis.
- Centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 10 °c om alle cellen te pellet.
- Decanterende supernatant in een filter Unit van 0,2 μm, vacuüm filter en doseer in een nieuwe buis.
Opmerking: biofilm aggregaten zijn aanhanger van conventionele oplossingen (bijv. PBS) en blijven aan de zijkanten van de buizen en pipetpunten plakken. Omdat het zorgt voor eenvoudigere manipulatie, gebruiken we geconditioneerde media (1% Tryptone) om biofilm in eerste instantie te verplaatsen en gebruiken warme PBS onmiddellijk voor het cross-linken (stap 4,5) om eventuele eiwit crosslinking-substraten te verwijderen die in de media aanwezig kunnen zijn.
3. scheiding van biofilm en plankton cellen uit kolf culturen2
- Gebruik een steriele 25 mL Pipet, aliquot kolf cultuur in 15 mL tubes. Centrifugeer bij lage snelheid (210 x g) gedurende 2 minuten om de twee celtypen te scheiden.
Opmerking: biofilm cellen moeten een losse pellet vormen aan de onderkant van de buis - Pipetteer de supernatant met plankton cellen in 2 40 mL centrifugebuizen voor later (stap 5). Verwijder alle resterende vloeistof, wees voorzichtig om de pellet niet te storen. Herhaal dit totdat de celtypen van alle kweekmedia van de kolf zijn gescheiden.
4. biofilmaggregaten voorbereiden
Opmerking: biofilm wordt geoogst met een nat gewicht om 25 μg DNA te leveren, het aanbevolen minimum startmateriaal voor de ChIP. De biofilm Conversion factor (BCF) van S. Typhimurium is 1,73 x 108 kve/mg2. Onderzoekers die andere biofilm typen voorbereiden, moeten het aantal cellen empirisch definiëren per gewichtseenheid van biofilm, dat wordt gebruikt om het gewicht van biofilm te vinden dat nodig is voor 25 μg DNA-uitgangsmateriaal met behulp van deze vergelijking:
- Weeg een 2 mL snap dop of schroefdop buis nauwkeurig af.
- Rebreng de biofilm pellet in 1 mL geconditioneerde Tryptone. Verplaats de geresuspendeerde biofilm in een vooraf gewogen 2 mL snap dop of schroefdop buis.
- Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 11 000 x g bij 20 °c
- Verwijder voorzichtig alle supernatant uit de buis en weeg de buis nauwkeurig af. Trek het buis gewicht af van het gewicht van de buis met biofilm om het gewicht van biofilm te vinden. Het moet ± 10% van het beoogde biofilm gewicht zijn.
- Spoel cellen om de overgebleven geconditioneerde Tryptone te verwijderen. Voeg 1 mL warme PBS toe aan de buis en Vortex zachtjes om de pellet te hervatten. Centrifugeer 3 min bij 8 000 x g naar pellet biofilm en verwijder het supernatant. Voeg 1 mL PBS toe aan de tube en Vortex om de pellet te hervatten.
5. plankton cellen voorbereiden
- Neem het volume en de OD600 van de plankton supernatant op bij langzame centrifugeren (stap 3,2) met behulp van een spectrofotometer
- Bereken het vereiste volume voor een laatste OD600 van 6,0:
- Koel de centrifuge af tot 10 °C en sediment plankton cellen door centrifugeren (10.000 x g, 10 min bij 10 °c)
- Verwijder de supernatant en rebreng de celpellet in het laatste volume van PBS, berekend in stap 5,2.
- Meet OD600 van de plankton cellen opnieuw met behulp van een spectrofotometer en verdeel het volume van 6,0 od600 plankton cellen in een 2 ml snap dop of schroefdop buis.
- Breng het volume naar 1 mL met PBS.
6. cellen homogeniseren
- Voeg één gesteriliseerde 5 mm roestvrijstalen kraal toe aan elk van de buizen.
- Homogeniseren met behulp van een mixer molen gedurende 5 minuten bij 30 Hz. Houd rekening met samengevoegde buisjes om te bevestigen dat biofilm uit elkaar is gebroken.
- Breng de gehomogeniseerde cellen over naar een nieuwe tube van 1,5 mL, waarbij de metalen kraal wordt vermeden. Breng het volume naar 1 mL met PBS.
Opmerking: Voer seriële verdunningen uit om invoercellen te inventariseren en controleer of het uiteindelijke celnummer dicht bij het gewenste of voorspelde getal ligt.
7. dwarsbinding van eiwitten aan DNA
- Breng verse formaldehyde in de monsterbuisjes tot een eindconcentratie van 1%. Inincuberen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op een draaiend wiel.
Voorzichtig: formaldehyde is corrosief, een huid, oog, en respiratoir irriterend en ontvlambaar. Doseer in een rook afzuigkap. - Voeg 1 M glycine toe aan een eindconcentratie van 125 mM om crosslinking te stoppen. Inincuberen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op een draaiend wiel.
8. het wassen van cellen om overtollige als verwijderen
- Sediment de cellen gedurende 3 minuten bij 8.000 x g en verwijder de supernatant
- Respendeer de pellet in 20 μL van 25x proteaseremmers en 500 μL filter gesteriliseerd PBS.
- Centrifuge buis gedurende 3 minuten bij 8000 x g en verwijder het supernatant.
9. lyserende cellen
- Rebreng de pellet in 600 μL Lysisbuffer (Zie tabel 1) en inbroed gedurende 10 minuten op ijs.
- Voeg 1,4 mL IP-verdunningsbuffer (Zie tabel 1) toe aan een steriele buis van 15 ml en verplaats de gelyseerd-cellen naar de buis van 15 ml. Houd de buis op ijs voor 1,5 – 2 uur, en Vortex zachtjes en af en toe.
Opmerking: sommige resistente celmaterialen kunnen in tubes achterblijven. Een lange incubatietijd op ijs met incidentele grondig zal materiaal breken. De rest wordt opgesplitst via sonicatie.
10. fragmenteren van DNA door sonicatie
- Plaats de 15 mL buis in een bekerglas ijs en plaats de 3 mm sonde in de buis.
- Voer 5 ultrasoonapparaatrondes van 30 s uit bij 20 – 40% van 400 W met 2 min koeling op ijs tussen uitbarstingen.
- Sediment neergeprecipiteerd materiaal door centrifugeren (8000 x g, 10 min bij 4 °c). Breng de supernatant over naar een nieuwe buis.
- Voer desgewenst decrosslinking uit bij 65 °C gedurende 30 – 60 minuten en verteerbaar RNA en eiwitten bij 45 °C gedurende 30-60 min voor het uitvoeren van een 2% agarose gel om te controleren op de juiste grootte fragmenten.
Opmerking: Dompel de sonde onder in de cel lysaat. Houd de oplossing op ijs terwijl u soniceert en rust. Verwijder de buis niet terwijl de sonicator-sonde pulserend is. De oplossing moet troebel zijn pre-sonicatie en duidelijke post-sonicatie.
11. immunoprecipiterende DNA-eiwit-antilichaam complexen
- Voorbereiding
- Verdeel één 1,35 mL aliquot voor immunoprecipitatie en 1 200 μL aliquot als invoercontrole. Bewaar het ingangs besturingselement bij-80 °C tot decrosslinking en verwerk stappen worden uitgevoerd.
- Immunoprecipitatie met primair antilichaam
- Voeg 10 μg gezuiverd proteïne-specifiek primair antilichaam toe aan de 1,35 μL aliquot. Inincuberen bij 4 °C op een draaiend wiel.
Opmerking: het primaire antilichaam kan een monoklonaal antilichaam zijn, hoogwaardig polyklonale serum of commercieel epitoop antilichaam (d.w.z. tegen de vlag). - Voeg 50 μL proteïne G magnetische parels toe aan de buizen uit stap 11.2.1 en inbroed bij 4 °C gedurende 3 uur op een draaiend wiel.
- Plaats IP Wash buffer 1, IP Wash buffer 2 en TE pH 8,0 (Zie tabel 1) in een ijsemmer. Warme elutie buffer tot 65 °C.
Opmerking: plaats geen oplossing met elutie buffer op ijs. - Bind de proteïne G magnetische kralen aan de zijkant van de buizen met behulp van een magnetische standaard
- Washes uitvoeren: was 2x met 750 μL Cold IP Wash buffer 1, was 1x met 750 μL Cold IP Wash buffer 2 en was 2x met 750 μL Cold TE bij pH 8,0. Houd de buizen op de magnetische standaard tijdens het wassen.
- Voeg 450 μL IP-elutie buffer (Zie tabel 1) toe aan elke buis en inbroed bij 65 °c gedurende 30 minuten met zachte grondig om de 5 minuten.
- BIND kralen aan de zijkant van de buizen met behulp van een magnetische standaard. Wacht minstens 2 minuten totdat de oplossing helder is.
- Breng de gewiste supernatant aan op een nieuwe 1,5 mL Tube, voorzichtig om de magnetische kraal pellet niet te storen.
- Voeg 10 μg gezuiverd proteïne-specifiek primair antilichaam toe aan de 1,35 μL aliquot. Inincuberen bij 4 °C op een draaiend wiel.
12. decrosslinking van DNA-eiwitcomplexen en verteerd co-zuiverende RNA en eiwitten
- Voeg 2 μg RNase A en NaCl toe aan een eindconcentratie van 0,3 M per buis.
- Incuberen bij 65 °C, gedurende ≥ 6 uur of 's nachts.
- Volledige eiwit vertering door toevoeging van 180 μg proteinase K aan elke buis, vervolgens incuberen bij 45 °C gedurende 3 – 5 h.
13. voorbereiding en sequencing van bibliotheken
- Purify DNA met behulp van magnetische kralen
Opmerking: magnetische kralen hebben de voorkeur voor het isoleren van de kleine hoeveelheden DNA die gewoonlijk worden teruggewonnen tijdens de ChIP met bacteriële cellen. - Bereid bibliotheken voor met behulp van een kit die compatibel is met het geselecteerde platform voor sequentiëren.
- Controleer de concentratie van de bibliotheek met een fluor meter en een breed assortiment dsDNA-Kit of een QRT-PCR Library kwantificering Kit.
Opmerking: in onze ervaring kunnen metingen van de fluor meter de DNA-concentratie overschatten. - Pool Bibliotheken, accounting voor voldoende dekking voor elk bibliotheek voorbeeld. Voor Illumina-sequencing met salmonellahebben we 10 – 12 bibliotheken samengevoegd. Voeg tris-HCl pH 8,0 toe aan een eindconcentratie van 1 mM.
- Volgorde volgens de specificaties van het geselecteerde platform.
Representative Results
Voorbereiding van Chromatine-immunoprecipitatie monsters uit bacteriële biofilm omvat verschillende stappen, zoals weergegeven in Figuur 1. Deze omvatten groeiende biofilm in de kolf cultuur, het verzamelen van geconditioneerde media, het verzamelen van een voldoende hoeveelheid biofilm-en plankton cellen als controle, het wassen van cellen in PBS, homogenisatie, crosslinking van eiwitten aan DNA, lyserende cellen, fragmenteren van DNA door sonicatie, immunoprecipiterend DNA met de juiste antilichamen en proteïne G kralen, wassen en eluering van immunoprecipitated DNA, en zuiverende DNA voor
S. typhimurium cellen geteeld in vloeibare cultuur onder biofilm-inducerende voorwaarden ondergaan fenotype overschakelen naar het vormen van multicellulaire biofilm aggregaten en plankton cellen. Deze populatie bevat ongeveer 40% biofilm aggregaten, die hogere niveaus van diguanylate Cycladen (dgc's) en biofilmregulatoren uitdrukken, en 60% plankton cellen, die hogere niveaus van virulentie-geassocieerde genen2,4 uitdrukken (Figuur 2A). In dit protocol beschrijven we een methode om beide celtypen te oogsten om transcriptie sites te vergelijken via ChIP-SEQ; Dit protocol kan echter worden aangepast voor andere soorten biofilms gevormd door andere bacteriesoorten. Biofilm aggregaten en plankton cellen worden gescheiden door centrifugeren met langzame snelheid, die biofilm pellets en plankton cellen in de supernatant2 (Figuur 2B) laat. De celtypen worden vervolgens afzonderlijk behandeld voor de volgende stappen in het protocol.
De aanbevolen hoeveelheid DNA-invoer voor ChIP-SEQ is 10-25 μg20. In S. Tyhimurium kolf cultuur, 30 mg biofilm levert ongeveer 25 μg DNA. Aangezien biofilm aggregaten een overvloed aan proteinaceeuze extracellulaire materialen hebben, veronderstellen we dat dit de efficiëntie van cross-linking zou verstoren. Als we gewoon de verschillende celtypen op celnummer normaliseren, kan de behandeling van plankton cellen resulteren in een ongelijke hoeveelheid gecrosslinked product gepresenteerd voor immunoprecipitatie. Er werd een eiwit test uitgevoerd om de equivalente hoeveelheid plankton celmateriaal te bepalen die overeenkomt met 30 mg biofilm (Figuur 3). 6,0 OD600 van plankton cellen werden geoogst om te matchen met 30 mg biofilm.
Biofilm aggregaten moeten eerst worden gesplitst om gelijke toegang van cross-linker naar alle cellen mogelijk te maken. We ontdekten dat de meest uniforme en high-throughput manier om de cellen te homogeniseren met behulp van een mixer molen en 5 mm roestvrijstalen kraal (Figuur 4a). Plankton cellen worden op dezelfde manier behandeld om de variabelen in het ChIP-SEQ-experiment te verminderen (Figuur 4B).
Zodra het DNA is gefragmenteerd door sonicatie, crosslinked, en behandeld met RNase en proteinase K, kan het worden gevisualiseerd op een 2% agarose gel. Gesoniceerd DNA wordt onderverdeeld in een verzameling fragmenten die als een uitstrijkje op de agarose-gel verschijnen. De gemiddelde fragment grootte neemt af met een toenemend aantal ultrasoonapparaatuitbarstingen (Figuur 5). Energie overdracht zal variëren voor verschillende sonicator-eenheden, dus een ultrasoonapparaattest wordt aanbevolen om het aantal sonicatie-uitbarstingen te bepalen die nodig zijn om DNA te fragmenteren tot een gemiddelde van minder dan 1 KB. Voor ons ChIP-SEQ experiment kozen we 5 bursts.
Richtlijnen voor coderen bevelen een bevestiging van doelbinding van antilichamen aan met een immunoblot21. In dit geval hebben we de specificiteit en kracht van het antilichaam gemeten door immunoblot op hele celllysates bereid voor ChIP (Figuur 6). We bevestigden dat het antilichaam bindt aan de CsgD-3Xvlag; anti-FLAG en anti-CsgD signalen colocaliseren op het verwachte molecuulgewicht (28 kDa)22.
ChIP procedures leveren vaak lage concentraties DNA op. Daarom is gekozen voor een zuiveringsmethode die verontreinigingen verwijdert en een groot deel van het DNA behoudt. Magnetische kraal zuivering werd gekozen over op kolom gebaseerde zuivering omdat het lage concentraties van input ChIP DNA beter behield (Figuur 7) en verwijderde verontreinigingen (gegevens niet weergegeven).
Vanwege de lagere uitgangs hoeveelheden van DNA, kan de bibliotheek bereiding van ChIP DNA verdunde adapters en PCR-verrijking vereisen. Voorafgaand aan de sequencing kunnen bibliotheken door Bioanalyzer Trace worden gevisualiseerd om de juiste grootteverdeling voor en na PCR-verrijking te bevestigen (Figuur 8). Bovendien, als er een bekende regelgevende doelstelling van de transcriptiefactor is, moet qPCR worden gebruikt om de verrijking van bindende gebieden te bevestigen door de vouw verandering (∆ ∆ CT) te vergelijken tussen de bekende doel-en referentie-gensequentie overvloed in een immunoprecipitated en gesoniceerd input DNA.
ChIP sequentiegegevens moeten worden geanalyseerd door kwaliteitsscores toe te wijzen, lage kwaliteits grondslagen te trimmen, voorwaartse en omgekeerde leesbewerkingen uit te voeren (in gekoppelde eind volgorde), te assembleren op een hoogwaardig referentie-genoom, pieken boven de achtergrond te vinden en downstream-analyses uit te voeren (Figuur 9a). Downstreamanalyse moet visualisatie en aantekening van pieken omvatten, consistentie met biologische replicaatmonsters en motief analyse, en kan bestaan uit differentiële bindende analyse tussen condities of celtypen en gegevensintegratie met genexpressie uit bekende trajecten. Voor ChIP-SEQ-gegevens zoals de onze, moeten pieken worden geïdentificeerd als aanzienlijk boven de achtergrond (Figuur 9B, C, Rode staven) met een p -waarde bepaling, niet alleen door fold-Change. Uiteindelijk worden de in kaart gebrachte leesbewerkingen gevisualiseerd tegen de aantekening van het referentie-genoom (Figuur 9D). Een slechte ChIP-SEQ resultaat lijkt als input-SEQ zonder enige belangrijke pieken boven de achtergrond.
Figuur 1: illustratie van stappen in chip-SEQ met bacteriële biofilms. In de beschreven procedure, S. Typhimurium cellen worden gekweekt in 1% Tryptone kolf cultuur bij 28 ° c met schudden (1), cel-vrij geconditioneerde media wordt verzameld voor de behandeling van biofilmceltypen (2), die wordt gebruikt om een voldoende hoeveelheid biofilm en plankton cellen te verzamelen (3). Deze cellen worden gewassen met PBS en gehomogeniseerd om biofilm uit elkaar te breken (4). Eiwitten zijn gecrosslinkt naar DNA met een formaldehyde Crosslinker, waarna cellen worden gelyseerd om celinhoud vrij te geven (5). DNA in het cellysaat is gefragmenteerd door sonicatie (6). DNA-kruislings gekoppeld aan het doeleiwit wordt geselecteerd door middel van immunoprecipitatie met een antilichaam dat zich bindt aan de doel proteïne-en proteïne G-magnetische kralen (7). Geselecteerd DNA wordt gewassen en geeleerd uit proteïne G magnetische kralen (8) en gezuiverd voor bibliotheek voorbereiding en sequencing (9). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: in vitro kolf model voor het bestuderen van S. Biofilm ontwikkeling van typhimurium. (A) S. Typhimurium cellen die zijn gekweekt in 1% vorming gedurende 13 uur bij 28 °c ondergaan fenotype switching om biofilm aggregaten en plankton cellen in de vloeibare fase van de kolf cultuur te vormen. B) biofilmaggregaten en plankton cellen uit de kolf cultuur in (A) werden gescheiden door centrifugeren bij 210 x g gedurende 2 minuten. De supernatant werd geoogst voor plankton celpreparaten en de pellet werd geoogst voor biofilmcelpreparaten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: totaal eiwit concentraties voor plankton cellen en biofilmcelmonsters geoogst van S. Tyhimurium kolf cultuur. Er werden colorimetrische proteïne testen uitgevoerd en de eiwit bedragen ten opzichte van een standaard curve van BSA werden gemeten bij 750 nm. Het eiwitgehalte van gelyseerd plankton celmonsters bij 4,0, 6,0 en 8,0 OD600 werd vergeleken met 30 mg biofilmaggregaten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: homogenisatie van celmonsters van S. Tyhimurium biofilm kolf culturen. A) biofilm aggregaten uit de in PBS (links) geresuspendeerde fles cultuur werden gehomogeniseerd met een meng molen bij 30 Hz gedurende 5 minuten (rechts). B) plankton cellen uit de in PBS geresuspendeerde kolf cultuur werden gedurende 5 minuten door mixer molen op 30 Hz verwerkt om consistentie tussen de monsters van het celtype te waarborgen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Sonicatie test met pre-chip celllysates. Biofilm aggregaat en plankton celmonsters werden gescheiden, gehomogeniseerd, gecrosslinked en lysed. DNA-eiwitcomplexen werden tot 8 keer gesoniceerd bij 30 s aan en 2 min op ijs om DNA in kleinere fragmenten te breken. Een deel van het gesoniceerde lysaat werd gescheiden op een 2% agarose gel. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: doel bindende specificiteit van Anti-Flag-antilichamen die in de chip-SEQ worden gebruikt. De specificiteit van het antilichaam werd beoordeeld aan de hand van immunoblotting tegen hele celllysaten bereid uit de kolf culturen van de S. Typhimurium stammen zoals afgebeeld. Stam ∆ csgD + p3xFLAG/csgd en WT biofilm monsters vertegenwoordigen biofilm aggregaten geoogst uit kolven, terwijl de stam ∆csgd ± p3xFLAG en WT plankton cellen plankton cellen vertegenwoordigen. Gezuiverde zijn gelabelde CsgD werd geladen als een controle. De gehele cellysaten werden genormaliseerd zodat in elke rijstrook 30 μg totaal eiwit werd geanalyseerd. Nummers aan de linkerzijde verwijzen naar de grootte (in kDa) van het voorgebeitst molecuulgewicht markeringen. Primair antilichaam gebruikt voor de bovenste vlek was konijn-anti-FLAG Polyklonale antilichamen (sigma-Aldrich #F7425), terwijl de onderste vlek werd geïnineerd met konijn-anti-FLAG samen met een CsgD-specifiek monoklonaal antilichaam2. Geit anti-konijn IgG (LiCor IRDye 680RD, 925-68071) en geit anti-muis IgG (LiCor IRDye 800CW, 925-32210) werden gebruikt als secundaire antilichamen. Fluorescerende signalen werden gevisualiseerd met behulp van het Odyssey CLx Imaging System en image Studio 4,0 softwarepakket (Li-Cor Biosciences). Representatieve afbeeldingen worden weergegeven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: zuiverings strategieën op basis van kolommen of magnetische kraal voor kleine hoeveelheden DNA als gevolg van chip-SEQ-experimenten. Monsters van bekende hoeveelheden DNA werden gezuiverd met behulp van kolom-gebaseerde Kits of magnetische kralen en de concentratie van het eluaat werd gemeten na zuivering. Magnetische kralen toonden een beter herstel bij lage DNA-niveaus, vergelijkbaar met de lage hoeveelheden DNA die meestal aan het einde van het ChIP-SEQ-protocol zijn aangetroffen, maar voorafgaand aan de voorbereiding van NGS Library. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 8: chip-DNA-preparaten en daaropvolgende bibliotheken gevisualiseerd door Bioanalyzer. (A) gemiddelde fragment grootte van GENOMISCH DNA na cellyse en sonicatie was < 1000 BP, met een meerderheid van fragmenten in het bereik van 200 – 500 BP. B) uitgangsmateriaal voor de voorbereiding van de bibliotheek was onder detectie. C) met adapter ligatie en PCR-verrijking kunnen bibliotheek fragmenten worden uitgebreid. (D) een slechte bibliotheek preparaat heeft lage DNA pieken, oneven of hoog moleculair gewicht pieken, of overvloedige adapter pieken bij ongeveer 100 BP. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 9: chip-SEQ-gegevens worden geanalyseerd met behulp van bioinformatische hulpmiddelen en gevisualiseerd op een genoom browser. A. stroomdiagram voor een typische bioinformatische analyse van chip-SEQ-gegevens. RAW-leesbewerkingen voor biofilm (∆csgd strain + P3xFLAG/csgd) en plankton cellen (∆csgd + p3xFLAG) werden gereinigd voor lees-en adapters van lage kwaliteit, en toegewezen aan S. Typhimurium 14028s genomen (NC_016856..., voor het chromosoom en NC_016855....) door Bowtie2 (v 2.3.3.1) met standaard parameters23. MACS2 (v 2.1.2) werd gebruikt om de pieken te noemen met parameters van '-q 0,01-nomodel ', waarbij biofilm-replicaties als testgegevens sets en de plankton als control24werden genomen. De MACS2 bdgcmp module werd verder gebruikt voor het genereren van fold-verrijkings spoor met parameters van '-m FE '. Het belangrijke piek bestand met vouw verrijkings spoor werd omgevormd tot een pruik-bestand met behulp van bedtools/bedClip/bedGraphToBigWig25 en gevisualiseerd op het referentie-genoom met behulp van integratieve Genomics Viewer v 2.5.126. Representatieve pieken worden weergegeven (rode balken). (B) grote regio van ~ 40 KBP, die meerdere pieken bevat, is een atypisch resultaat, maar nog steeds potentieel waardevol. (C) Dit is een meer typisch resultaat, dat twee belangrijke piek gebieden weergeeft. (D) zoom in op linker piek in C, met lees toewijzing aan de regio van de S. Typhimurium 14028s genoom met divergente promoters voor USPA en uspb. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Celllysisbuffers |
| Lysisbuffer |
| 50 mM tris-HCl pH 8,1 |
| 10 mM EDTA |
| 1% SDS |
| Proteaseremmers |
| IP-verdunningsbuffer |
| 20 mM tris-HCl pH 8,1 |
| 2 mM EDTA |
| 150 mM NaCl |
| 1% Triton X-100 |
| 0,01% SDS |
| Immunoprecipitation-buffers |
| IP Wash buffer 1 |
| 20 mM tris-HCl pH 8,1 |
| 2 mM EDTA |
| 50 mM NaCl |
| 1% Triton X-100 |
| 0,1% SDS |
| IP Wash buffer 2 |
| 10 mM tris-HCl pH 8,1 |
| 250 mM LiCl |
| 1 mM EDTA |
| 1% NP-40 |
| 1% deoxycholzuur |
| TE (T10E1) pH 8,0 |
| 10 mM tris-HCl |
| 1 mM EDTA |
| Elutie buffer |
| 1% SDS |
| 100 mM Nahco3 p.a. |
Tabel 1. Buffer recepten.
Discussion
Dit protocol schetst een techniek voor het uitvoeren van chip-SEQ met salmonella heliobacter Serovar typhimurium biofilm en plankton cellen uit zuivere cultuur, om regelgevings doelen van de Master biofilm regulator, csgd, te vinden. We verwachten differentiële bindende informatie als gevolg van de bi-stabiliteit van csgd in de twee celtypen, met hoge niveaus in biofilmaggregaten en lage niveaus in plankton cellen2,3. Deze techniek kan echter ook worden toegepast op andere bacteriële transcriptiefactoren, celtypen of groeiomstandigheden. In het bijzonder kan deze techniek worden aangepast aan andere bacteriële biofilms met behulp van een experimenteel bepaalde omrekeningsfactor voor CFU per gewichtseenheid van biofilmcellen.
ChIP-SEQ kunnen worden vatbaar voor versterking van technische fouten door middel van sequencing; bevestiging bij kritieke stappen kan echter deze27voorkomen. Primaire antilichaam specificiteit is belangrijk voor het selecteren van alleen de doel transcriptiefactor en de DNA-besturingselementen tijdens immunoprecipitatie7. In dit experiment werd csgd samengesmolten tot een plasmide-gecodeerde 3xflag tag aan het 3 ' einde van het gen, overeenkomend met het C-eindpunt van csgd22. De p3xFLAG plasmide zonder csgD werd gebruikt als een "controle" (S. Typhimurium 14028 ∆ csgD + p3xFLAG). Richtlijnen voor coderen raden het uitvoeren van immunoblots met primair antilichaam tegen het eiwit van belang, en eiwitlysaten van chip stammen en deletie stammen21. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de groeiomstandigheden consistent zijn voor replicaten om de variabiliteit in transcriptiefactor binding en downstream sequentie resultaten te verminderen. Als men voorzichtig is om te zorgen voor entmateriaal groottes en pre-entmateriaal groeiomstandigheden consistent zijn, is biofilm groei in de kolf cultuur consistent4. Het is belangrijk om te bevestigen dat alle biofilm is gebroken na homogenisatie, om te zorgen voor gelijke toegang van reagentia, met name formaldehyde cross-linker, naar alle cellen.
Verschillende wijzigingen kunnen onderzoekers in staat stellen om dit protocol te gebruiken voor andere DNA-bindende eiwitten, celtypen, stammen, groeiomstandigheden of labapparatuur. Als het wordt gebruikt voor andere biofilmvormende soorten dan S. Typhimurium, de omrekeningsfactor van kolonie vormende eenheden per eenheid gewicht van biofilm moet worden bepaald experimenteel door het oogsten van verschillende hoeveelheden biofilm, homogeniseren van de biofilm grondig, en het uitvoeren van seriële verdunningen en plaat telling om een standaard curve te creëren, die mogelijk niet nauwkeurig bij lagere biofilm gewichten2. Sonicator-energie overdracht en celtype weerstand kunnen verschillen; Daarom wordt een ultrasoonapparaattest aanbevolen om het aantal sonicatie-uitbarstingen te vinden die het fragment groottebereik produceren dat nodig is voor de downstream-bibliotheek voorbereiding en volgordebepaling11. Chromatin fragmentatie door micrococcal Nuclease is een alternatief voor ultrasoonapparaat dat een hoge resolutie van bezettings locaties produceert; echter, deze methode kan leiden tot fragmentatie bias7,28. Het DNA-groottebereik kan worden gewijzigd afhankelijk van downstream bibliotheek voorbereidings kits en sequencing platforms. Andere homogenisatie methoden kunnen worden gebruikt in plaats van de Meng molen. Bijvoorbeeld, een homogenisator van glasweefsel kan worden vervangen, maar het kan aerosolize of incompleet breken biofilm. In termen van controles, pre-immunoprecipitate DNA kan worden genormaliseerd in de verwerking en analyse na sequentiëren. Een mock-IP-controle met soort-matched normale antilichamen serum kan worden gebruikt als een controle als goed13.
Onderzoekers moeten rekening houden met de beperkingen van deze methode bij het overwegen van een ChIP-SEQ-experiment. Belangrijke wijzigingen kunnen nodig zijn om deze aan te passen voor andere soorten biofilms. Bijvoorbeeld, met salmonella typhimurium onmiddellijke resuspensie van BIOFILM in PBS leidt tot meetbaar verlies van biofilm aggregaten. Immunoprecipitatie gericht op regelgevings doelen van transcriptiefactoren in bacteriën kan resulteren in zeer kleine hoeveelheden DNA, wat een uitdaging is voor zuivering en detectie in latere stappen. Bias kan worden geïntroduceerd tijdens het scheren en downstream manipulatie tijdens de bibliotheek detectie9. Bovendien wordt deze methode niet weergeven in vivo expressieniveaus in reactie op transcriptiefactor binding. Onderzoekers die weinig ervaring hebben met bio-informatica, kunnen door de analyse pijplijn worden uitgedaagd. Deze methode kan tijd intensief en duur zijn; de kosten van sequencing zijn echter vaak lager dan een microarray en nemen in de loop van de tijd af naarmate technologische verbeteringen nog steeds worden doorgevoerd.
Enkele methoden in de literatuur beschrijven de chip met bacteriën, en de meeste bacteriële experimenten beginnen met een eenvoudige groei voorwaarde13,14,15,17,18. ChIP Monstervoorbereiding met enkelvoudige cellen is eenvoudig en presenteert minder uitdagingen dan ChIP Monstervoorbereiding met biofilm aggregaten. Wat de ChIP-SEQ betreft, zijn eerdere methoden voor het bestuderen van CIS-regelgevende circuits, waaronder systematische evolutie van liganden door exponentiële verrijking (SELEX), elektroforetisch mobiliteits verschuiving-assays (EMSA), ChIP chip, promotor deletie en reporter analyse aangevuld of vervangen door ChIP-SEQ29. ChIP-SEQ vervangt ChIP-chip door voortschrijdende technologieën en de beschikbaarheid van sequencing. Deep sequencing biedt onderzoekers enorme hoeveelheden gegevens die sites kunnen identificeren met een lagere bindingsaffiniteit en een hogere basislaag resolutie met minder startmateriaal dan chip-chip11,30. De analyse van chip gegevens van organismen met kwalitatief hoogwaardige referentie-genomen is over het algemeen snel en specifiek. Bovendien is de ChIP-SEQ een grondige methode voor het ontdekken in silico voorspelde binding sites die mogelijk niet in alle celtypen, groeifase of omgevingscondities31worden bezet.
In de toekomst kan dit protocol worden gebruikt om het begrip van bacteriële pathogenese, met name biofilmvormende organismen, te vergemakkelijken. Een brede acceptatie van deze techniek en de beschikbaarheid van nieuwe datasets kan leiden tot data-integratie om groepen eiwitten te identificeren die co-localiseren om cellulaire processen in biofilmvormende micro-organismen te beheersen32. Bovendien kunnen ChIP-SEQ-en RNA-SEQ-gegevens worden geïntegreerd om regelgevingssysteem modellen33te bouwen.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gesteund door een subsidie van de Raad voor Natuurwetenschappen en ingenieurs onderzoek (NSERC) (#2017-05737) naar AW en via de Jarislowsky-stoel in de biotechnologie. MP werd gesteund door een NSERC-CREATE-beurs via het geïntegreerde opleidingsprogramma in besmettelijke ziekten, voedselveiligheid en openbare beleid (ITraP) aan de Universiteit van Saskatchewan.
De auteurs willen Dani Dale bedanken voor het filmen en bewerken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose powder | FroggaBio | A87-500G | |
| Balance (Explorer pro) | Ohaus | EP214 | |
| Benchtop Centrifuge (8510R) | Eppendorf | 022627023 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | G2939BA | |
| BR dsDNA kit | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads | Cell Signaling Technology | 9006 | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | COEDTAF-RO ROCHE | |
| Conical tube 15 mL | FroggaBio | TB15-500 | |
| Conical tube 50 mL | FroggaBio | TB50-500 | |
| DC Protein Assay Kit II | BioRad | 5000112 | |
| Disposable Cuvette, 1.5 mL | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
| Electrophoresis equipment (mini-PROTEAN) | Bio-Rad | 1658000 | |
| Floor centrifuge (Sorvall Evolution RC) | Thermo Scientific | 728211 | |
| Fluorometer (Qubit 3.0) | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| GelRed® Nucleic Acid Gel Stain 10 000x in water | Biotium | 41003 | |
| High Sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Incubator (shaking) | VWR | 1570-ZZMFG | |
| Incubator (Water bath shaking) | New Brunswick | G76D | |
| LB media | VWR | 90000-808 | |
| Magnetic stand (DynaMag) | Fisher Scientific | 12321D | |
| Microcentrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5415R | |
| Microcentrifuge Tubes, 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycle) | Illumina | MS-102-3001 | |
| Mixer mill | Retsch | MM400 | |
| Nalgene 115 mL Filter Units, Sterile, 0.2 µm pore size | Thermo Scientific | 73520-980 | |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7370S | |
| NGS Cleanup and Size Select magnetic beads | Machery-Nagel | 744970.5 | |
| Normal mouse serum | AbCam | ab188776 | |
| Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Pipette controller | FroggaBio | MP001 | |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | AM2542 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Rabbit Anti-FLAG Polyclonal Antibody | Sigma-Aldrich | F7425 | |
| RNase A (10 mg/mL; DNase and protease-free) | ThermoFisher Scientific | EN0531 | |
| Rotating wheel | Crystal Technologies & Industries | TR 01A | |
| Safe-Lock Tubes (2.0 mL, colorless) | Eppendorf | 22363344 | |
| Serological pipette 25 mL | FroggaBio | 94024 | |
| Spectrophotometer | Montreal Biotech Inc. | Libra S22 | |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | Qiagen | 69989 | |
| Tapered microtip 1/8" (3mm) Sonicator probe | Sonics & Materials, Inc. | 630-0418 | |
| Tryptone media | VWR | 90000-286 | |
| Ultrasonic Liquid Processor (Sonicator) | Sonics & Materials, Inc. | VC300 | |
| Vacuum equipment (Vacufuge plus) | Eppendorf | 022820001 | |
| Water bath 1 (Lab-line aquabath) | Thermo Scientific | 18000-1 | |
| Water bath 2 (Precision) | Thermo Scientific | 51221044 |
References
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections. Science. 284 (5418), 1318-1322 (1999).
- MacKenzie, K. D., et al. Bistable Expression of CsgD in Salmonella enterica Serovar Typhimurium Connects Virulence to Persistence. Infection and Immunity. 83 (6), 2312-2326 (2015).
- Grantcharova, N., Peters, V., Monteiro, C., Zakikhany, K., Römling, U. Bistable expression of CsgD in biofilm development of Salmonella enterica serovar typhimurium. Journal of Bacteriology. 192 (2), 456-466 (2010).
- MacKenzie, K. D., Palmer, M. B., Köster, W. L., White, A. P. Examining the Link between Biofilm Formation and the Ability of Pathogenic Salmonella Strains to Colonize Multiple Host Species. Frontiers in Veterinary Science. 4, 307 (2017).
- Steenackers, H., Hermans, K., Vanderleyden, J. Salmonella biofilms: an overview on occurrence, structure, regulation and eradication. Food Research International. 45 (2), 502-531 (2012).
- Brombacher, E., Dorel, C., Zehnder, A. J. B., Landini, P. The curli biosynthesis regulator CsgD co-ordinates the expression of both positive and negative determinants for biofilm formation in Escherichia coli. Microbiology. 149, Pt 10 2847-2857 (2003).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).
- Wu, D. -Y., Bittencourt, D., Stallcup, M. R., Siegmund, K. D. Identifying differential transcription factor binding in ChIP-seq. Frontiers in Genetics. 6, 169 (2015).
- Valouev, A., et al. Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChIP-Seq data. Nature Methods. 5 (9), 829-834 (2008).
- Lieb, J. D. Genome-wide mapping of protein-DNA interactions by chromatin immunoprecipitation and DNA microarray hybridization. Methods in Molecular Biology. 224, Clifton, N.J. 99-109 (2003).
- Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).
- Kim, T. H., et al. A high-resolution map of active promoters in the human genome. Nature. 436 (7052), 876-880 (2005).
- Dillon, S. C., et al. Genome-wide analysis of the H-NS and Sfh regulatory networks in Salmonella Typhimurium identifies a plasmid-encoded transcription silencing mechanism. Molecular Microbiology. 76 (5), 1250-1265 (2010).
- Perkins, T. T., et al. ChIP-seq and transcriptome analysis of the OmpR regulon of Salmonella enterica serovars Typhi and Typhimurium reveals accessory genes implicated in host colonization. Molecular Microbiology. 87 (3), 526-538 (2013).
- Gu, D., Liu, H., Yang, Z., Zhang, Y., Wang, Q. Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Technology Reveals Global Regulatory Roles of Low-Cell-Density Quorum-Sensing Regulator AphA in the Pathogen Vibrio alginolyticus. Journal of Bacteriology. 198 (21), 2985-2999 (2016).
- Peano, C., et al. Characterization of the Escherichia coli σ(S) core regulon by Chromatin Immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq) analysis. Scientific Reports. 5 (1), 10469 (2015).
- Blasco, B., et al. Virulence regulator EspR of Mycobacterium tuberculosis is a nucleoid-associated protein. PLoS Pathogens. 8 (3), 1002621 (2012).
- Jones, C. J., et al. ChIP-Seq and RNA-Seq reveal an AmrZ-mediated mechanism for cyclic di-GMP synthesis and biofilm development by Pseudomonas aeruginosa. PLoS pathogens. 10 (3), 1003984 (2014).
- Sengupta, M., Jain, V., Wilkinson, B. J., Jayaswal, R. K. Chromatin immunoprecipitation identifies genes under direct VraSR regulation in Staphylococcus aureus. Canadian Journal of Microbiology. 58 (6), 703-708 (2012).
- Gill, A. Cross-linking chromatin immunoprecipitation (X-ChIP) protocol. , Available from: https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/x_CHip_protocol.pdf (2017).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).
- MacKenzie, K. D., et al. Parallel evolution leading to impaired biofilm formation in invasive Salmonella strains. PLoS Genetics. 15 (6), 1008233 (2019).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9 (9), 137-139 (2008).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Thorvaldsdóttir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).
- Schoppee Bortz, P. D., Wamhoff, B. R. Chromatin immunoprecipitation (ChIP): revisiting the efficacy of sample preparation, sonication, quantification of sheared DNA, and analysis via PCR. PloS One. 6 (10), 26015 (2011).
- Tolstorukov, M. Y., Kharchenko, P. V., Goldman, J. A., Kingston, R. E., Park, P. J. Comparative analysis of H2A.Z nucleosome organization in the human and yeast genomes. Genome Research. 19 (6), 967-977 (2009).
- Geertz, M., Maerkl, S. J. Experimental strategies for studying transcription factor-DNA binding specificities. Briefings in Functional Genomics. 9 (5-6), 362-373 (2010).
- Mardis, E. R. ChIP-seq: welcome to the new frontier. Nature Methods. 4 (8), 613-614 (2007).
- Lee, T. I., et al. Transcriptional regulatory networks in Saccharomyces cerevisiae. Science. 298 (5594), 799-804 (2002).
- Wade, J. T., Struhl, K., Busby, S. J. W., Grainger, D. C. Genomic analysis of protein-DNA interactions in bacteria: insights into transcription and chromosome organization. Molecular Microbiology. 65 (1), 21-26 (2007).
- Myers, K. S., Park, D. M., Beauchene, N. A., Kiley, P. J. Defining bacterial regulons using ChIP-seq. Methods (San Diego, Calif). 86, 80-88 (2015).
