Summary
クロマチン免疫沈降と次世代シーケンシング(ChIP-seq)は、転写因子とそれらが制御するゲノム配列との間の相互作用を確立するために使用される方法です。このプロトコルは、例としてサルモネラ腸管セロバーチピムリウム細菌バイオフィルムを使用して、細菌バイオフィルムでChIP-seqを行うための技術を概説する。
Abstract
クロマチン免疫沈降の後にシーケンシング(ChIP-seq)は、転写因子、ヒストン修飾、およびその他のDNA関連タンパク質の調節標的を発見するために使用できる技術です。ChIP-seqデータは、異なる環境条件または細胞型における転写因子の微分結合を見つけるためにも使用することができる。当初、ChIPはマイクロアレイ(ChIPチップ)上でハイブリダイゼーションを介して行われました。しかし、ChIP-seqは、技術の進歩、シーケンシングに対する金融障壁の減少、および大量の高品質なデータ出力を通じて好ましい方法となっています。持続的および慢性感染の主要な供給源である細菌バイオフィルムを用いてChIP-seqを行う技術は、このプロトコルで説明されている。ChIP-seqは、サルモネラ腸管セロバーチピムリウムバイオフィルムおよびプランクトン細胞に対して行われ、マスターバイオフィルムレギュレータCsgDを標的とし、2種類の細胞における微分結合を決定する。ここでは、収穫するバイオフィルムの適量を実証し、プランクトニック対照試料に正規化し、クロスリンカーアクセス用のバイオフィルムを均質化し、高品質なシーケンシング結果を得るための日常的なChIP-seqステップを実行する。
Introduction
細菌バイオフィルムは、自己産生マトリックスに埋め込まれた細胞の構造集合体、乾燥、抗生物質、および宿主免疫応答1に対して耐性である。そのため、持続的および慢性的な感染症を引き起こし、生存と伝染に対する解決策により、研究者に固有の課題を提示します。サルモネラ・エンテロル・チフィムリウム (S.チフィム尿)は、乾燥および抗生物質に耐性を有するバイオフィルム凝集体のフェノ典型的異種集団、および環境ストレスにさらされたときに純粋培養における毒性因子を発現するプランクトン細胞(28°、栄養制限)2を確立することが分かった。これら2種類の細胞は、マスターバイオフィルムレギュレータの不安定発現により生じる、CsgD3.我々は、これは、プランクトニック細胞が短期伝達に関与し、バイオフィルム細胞が新しい宿主に感染する機会が生じるまで環境中で長期的に持続することができるサルモネラ菌のベットヘッジ戦略であるかもしれないという仮説を立てている。csgオペロン発現を制御する規制要素の多くは、5を十分に特徴付けている。しかしながら、adrAおよびcsgオペロン6を除いて、CsgDの規制標的はほとんど知られていない。CsgD規制ネットワークを特定することは、サルモネラのライフサイクルとバイオフィルムが伝送において果たす役割をよりよく理解するのに役立ちます。
クロマチン免疫沈降の後にハイスループットシーケンシング(ChIP-seq)は、タンパク質-DNA相互作用のゲノム全体の同定のための強力なインビボ技術であり、転写因子、ヒストン修飾、またはヌクレオソーム7を含む調節過程に関する情報を提供する。新しい研究は、成長条件と細胞タイプ8との間の微分タンパク質結合を評価するために、この技術を使用しています.クロマチン免疫沈降(ChIP)では、相互作用タンパク質を含むDNA断片が標的タンパク質の抗体選択を通じて濃縮されます。細胞は採取され、DNA結合タンパク質はホルムアルデヒド架橋剤治療を通じて生体内のDNAに架橋されます。細胞は、細胞の内容物を放出し、クロマチンは約200〜600bp断片7にシアリングされる。標的タンパク質に結合したDNA断片は、抗体を用いて免疫沈降され、続いてタンパク質消化9を脱架化して単離する。これらのDNA断片は、マイクロアレイへのハイブリダイゼーション(ChIPチップ)またはゲノム配列10、11への深いシーケンシングおよびマッピングによって一致するタンパク質結合部位を表す。ChIPチップ実験は十分な規制データを生み出しますが、高価なプローブの使用、ハイブリダイゼーション、アレイバイアス12などにより制限されています。ChIP-seqは、ヌクレオチド分解能とカバレッジの増加、信号対雑音比の向上、およびChIPチップ7と比較した場合のアーティファクトの減少により、より大きなダイナミックレンジを有する。
ChIPは、サルモネラ・セロバー・ティフィムリウム13、14、ビブリオ・アルギノリティクス15のクォーラムセンシングAphA調節、エシェリヒアにおけるRpoS規制におけるSfhおよびOmpR調節を分析するために使用されている coli16,結核菌における毒性調節器EspR調節17,シュードモナス・エルギノーサ18におけるAmrZ調節を介した潜在的なジグニン酸シクラーゼ, ならびにVraSR黄色ブドウ球菌の調節19.記載されている細菌ChIP-seq実験は、液体媒体中の細胞の増殖と単一細胞形態での収穫から始まります。しかし、バイオフィルムの解析とそれに対応する遺伝子調節は、成功したChIP-seqプロトコルを生成するための新たな課題のセットを表しています。このプロトコルでは、ChIP-seqはCsgD、Sの差動規制ターゲットを見つけるために使用されます。バイオフィルムおよびプランクトニック細胞型におけるチフィムリウムマスターバイオフィルムレギュレータ。このプロトコルは、ChIP-seqに適量のバイオフィルムを決定し、フラスコ培養からバイオフィルムを収穫し、バイオフィルムおよび単一細胞対照試料を正規化し、バイオフィルムを均質化し、完全な免疫沈降を行うために使用される技術を記述します。これは、細菌バイオフィルムの調節ターゲットを研究するのに有用であり、多くの種に適応することができます。
Protocol
1. フラスコ培養細胞増殖
- 凍結ストックから、LB寒天(100mmペトリプレート中20mL固体培地)上のストリークサルモネラセロバーチフィムリウム株を適切な抗生物質で、37°Cで16〜20時間インキュベートし、単離されたコロニーを得る。
- ステップ1.1からストリークプレートから1〜3コロニーを有する25mm x 150mmホウケイ酸培養チューブに適切な抗生物質を含む5mL LBブロスを接種する。200 rpmで7時間振とうして37°Cでインキュベートする。
- 分光光度計を用いてブロス培養物のOD600を測定する。培養1のアリコートを2mLキュベットでPBS中の4種のアリコートを希釈し、600nmで吸光度を測定する。この段階で最も重要な要素は成長の時期であることがわかりました。OD値は、手順 1.4 で必要な数のセルを提供するカルチャを正規化するために使用されます。
- 1%トリプトンの100 mLを含むエルレンマイヤーフラスコに1.0 OD 600体積相当の細胞培養物(すなわち〜109細胞)を適切な抗生物質で加えます。28°Cで13時間200rpmで振とうインキュベートします。
注:バイオフィルム細胞は凝集したフレークとして現れ、単一のプランクトニック細胞は曇った媒体にある。
2. 無細胞条件1%トリプトンの収集
- 無細胞条件1%トリプトンのためのフラスコ培養物を収集します。ピペットフラスコ培養は、遠心管に添加する前に数回混合する。
- 10°Cで10分間12,000 x gで遠心分離機を行い、すべての細胞をペレット化する。
- デカント上清を0.2μmフィルターユニットに、真空フィルターを、新しいチューブに分配する。
注:バイオフィルム凝集体は、従来の溶液(例えばPBS)に付着しており、チューブとピペットチップの側面に固執します。操作が容易なため、コンディショニングメディア(1%トリプトン)を使用してバイオフィルムを最初に移動し、架橋直前に暖かいPBSを使用して、メディアに存在する可能性のあるタンパク質架橋基を除去します。
3. バイオフィルムとプランクトニック細胞をフラスコ培養から分離する 2
- 滅菌25mLピペットを使用して、アリコフラスコ培養を15mLチューブに入れます。2分間低速(210xg)で遠心分離し、2種類のセルを分離する。
注:バイオフィルム細胞は、チューブの底部に緩いペレットを形成する必要があります - プランクトン細胞を含む上清を後で用いるために2本の40mL遠心管にピペットする(ステップ5)。ペレットを乱さないように注意して、残りの液体をすべて取り除きます。細胞タイプがすべてのフラスコ培養媒体から分離されるまで繰り返します。
4. バイオフィルム凝集体の調製
注:バイオフィルムは、25μgのDNAを得るために湿った重量によって収穫され、ChIPの推奨最小出発原料である。Sのバイオフィルム変換係数(BCF)。タイフィム尿は 1.73 x 108 CFU/mg2.他のバイオフィルムタイプを準備する研究者は、次の式を使用してDNA出発物質の25μgに必要なバイオフィルムの重量を見つけるために使用されるバイオフィルムの単位重量あたりの細胞数を経験的に定義する必要があります。
- 2 mL のスナップ キャップまたはスクリュー キャップ チューブを正確に計量します。
- 1 mLのコンディショニングトリプトンでバイオフィルムペレットを再サスペンドします。再懸濁バイオフィルムを、事前計量済みの2 mLスナップキャップまたはスクリューキャップチューブに移動します。
- 遠心分離機 11 000 x gで 10 °C
- 慎重にチューブからすべての上清を削除し、正確にチューブの重量を量ります。バイオフィルムでチューブの重量からチューブ重量を引き出し、バイオフィルムの重量を見つけます。標的バイオフィルム重量の±10%である必要があります。
- 細胞を洗浄して、残りの条件付きトリプトンを除去する。チューブと渦に1mLの暖かいPBSを加え、ペレットを軽く再び踏み込む。8 000 x gで3分間遠心分離機を行い、バイオフィルムをペレット化し、上清を除去する。チューブと渦に1mLのPBSを加え、ペレットを再サスペンドします。
5. プランクトニック細胞の準備
- 分光光度計を用いて低速遠心分離からプランクトン上清の体積とOD600を記録する(ステップ3.2)
- 6.0 の最終 OD600に必要なボリュームを計算します。
- 遠心分離機を10°Cに冷却し、遠心分離(10,000 x g、10°Cで10分)で沈下プランクトン細胞を冷却する。
- 上清を取り外し、ステップ5.2で計算したPBSの最終体積で細胞ペレットを再サスペンドします。
- 分光光度計を用いてプランクトンセルのOD600を再測定し、6.0 OD600板系細胞の体積を2mLスナップキャップまたはスクリューキャップチューブに分配します。
- PBS でボリュームを 1 mL にします。
6. 細胞の均質化
- 各チューブに滅菌5mmのステンレスビーズを1つ追加します。
- 30 Hzでミキサーミルを5分間使用して均質化し、凝集管を観察し、バイオフィルムが分解されたことを確認します。
- 均質化された細胞を新しい1.5 mLチューブに移し、金属ビーズを避けます。PBSで音量を1mLにします。
注: シリアル希釈を実行して入力セルを列挙し、最終的なセル番号が目的の数値または予測数に近いかどうかを確認します。
7. タンパク質とDNAの架橋
- 新鮮なホルムアルデヒドをサンプルチューブに1%の最終濃度に分配します。回転ホイールの室温で30分間インキュベートします。
注意:ホルムアルデヒドは腐食性、皮膚、眼、呼吸器刺激性、可燃性である。ヒュームフードで分配します。 - 1 M グリシンを 125 mM の最終濃度に加えて、架橋を停止します。回転ホイールの室温で5分間インキュベートします。
8. 余分な架橋器を除去するための細胞の洗浄
- 細胞を8,000 x gで3分間堆積させ、上清を取り除く
- 25xプロテアーゼ阻害剤の20°Lと500 μLのフィルター滅菌PBSでペレットを再サスペンドします。
- 8000 x gで3分間遠心管を取り除き、上清を取り除く。
9. 細胞のライシング
- ペレットを600μL Lysis緩衝液(表1参照)で再サスペンドし、氷上で10分間インキュベートします。
- 1.4 mL の IP 希釈バッファー (表 1を参照) を無菌の 15 mL チューブに追加し、溶解した細胞を 15 mL チューブに移動します。チューブを氷の上に1.5~2時間置き、渦を穏やかに時折保ちます。
注: 一部の耐性セル材料はチューブ内に残る場合があります。時折渦を伴う氷上の長い潜伏期間は、材料を分解します。残りは超音波処理によって分割されます。
10. 超音波処理によるDNAの断片化
- 15 mL チューブを氷のビーカーに入れ、3 mm プローブをチューブ内に配置します。
- バースト間の氷上で2分冷却して、400 Wの20〜40%で30sの5回の超音波処理ラウンドを実行します。
- 遠心分離による沈殿物(8000 x g、4°Cで10分)。 新しいチューブに上清を移します。
- 必要に応じて、65°Cで30~60分の間、消化RNAとタンパク質を30~60分間消化してから、2%アガロースゲルで走り、適切なサイズの断片を確認します。
注:プローブを細胞リサートに浸漬します。超音波処理と休息中に氷の上に溶液を保ちます。超音波処理器プローブが脈動している間はチューブを取り外しないでください。ソリューションは、曇った前超音波処理と明確なポスト超音波処理が表示される必要があります。
11. DNAタンパク質抗体複合体の免疫沈降
- 準備
- 免疫沈降用用に1.35mLアリコートを1つ、入力コントロールとして200μLアリコート1個を分配します。クロスリンクとダイジェストの手順が実行されるまで、入力コントロールを -80 °C に保管します。
- 一次抗体を用いる免疫沈降
- 精製タンパク質特異的一次抗体を1.35μLアリコートに10μg添加します。回転ホイールで4°Cで一晩インキュベートします。
注:一次抗体は、モノクローナル抗体、高品質ポリクローナル血清または市販のエピトープ抗体(すなわち、抗FLAG)であり得る。 - ステップ11.2.1のチューブに50μLのプロテインG磁気ビーズを加え、回転ホイールで4°Cで3時間インキュベートします。
- IP洗浄バッファー 1、IP 洗浄バッファー 2、および TE pH 8.0 (表 1を参照) をアイスバケットに入れます。65°Cへの温かい溶出バッファー。
注: 溶出バッファーを含む溶液を氷の上に置かないでください。 - 磁気スタンドを使用してタンパク質G磁気ビーズをチューブの側面に結合
- 洗浄を行う:750°LコールドIP洗浄バッファ1で2xを洗浄し、750°LコールドIP洗浄バッファ2で1xを洗浄し、pH 8.0で750 μLコールドTEで2xを洗浄します。管は、ワッシュ中に磁気スタンドに置いておいてください。
- 450 μLのIP溶出バッファ(表1参照)を各チューブに加え、5分ごとに穏やかな渦をして65°Cでインキュベートします。
- 磁気スタンドを使用してビーズをチューブの側面にバインドします。解決策が明らかになるまで、少なくとも2分間待ちます。
- クリアした上清を新しい1.5 mLチューブに分配し、磁気ビーズペレットを乱さないように注意してください。
- 精製タンパク質特異的一次抗体を1.35μLアリコートに10μg添加します。回転ホイールで4°Cで一晩インキュベートします。
12. DNAタンパク質複合体の架橋と共精製RNAとタンパク質の消化
- 各チューブに0.3Mの最終濃度に2μg RNase AとNaClを加えます。
- 65°Cで、≥6時間、または一晩でインキュベートします。
- 各チューブに180μgのプロテイナーゼKを加えて完全なタンパク質消化を行い、45°Cで3~5時間インキュベートします。
13. 図書館の準備と順序付け
- 磁気ビーズを用いてDNAを浄化
注:磁気ビーズは、細菌細胞で通常ChIP中に回収される少量のDNAを単分化するために好ましい。 - 選択したシーケンス プラットフォームと互換性のあるキットを使用してライブラリを準備します。
- フルオロメーターと広い範囲のdsDNAキットまたはqRT-PCRライブラリ定量キットでライブラリ濃度を確認してください。
注:私たちの経験では、蛍光計の測定はDNA濃度を過大評価する可能性があります。 - 各ライブラリ サンプルに対して適切なカバレッジを考慮したプール ライブラリ。サルモネラ菌によるイルミナシーケンシングのために、私たちは10〜12の図書館をプールしました。トリス-HCl pH 8.0を1mMの最終濃度に加えます。
- 選択したプラットフォームの仕様に従ったシーケンス。
Representative Results
細菌バイオフィルムからのクロマチン免疫沈降試料の調製は、図1に示すように、いくつかの工程を伴う。これらには、フラスコ培養におけるバイオフィルムの増殖、コンディショニングメディアの収集、コントロールとしてのバイオフィルムおよびプランクトン細胞の十分な量の収集、PBSでの細胞の洗浄、均質化、DNAへのタンパク質の架橋、細胞のライジング、超音波処理によるDNAの断片化、適切な抗体およびタンパク質GビーズによるDNAの断片化、免疫沈降DNAの洗浄および溶出が含まれる。
S.バイオフィルム誘導条件下で液体培養で増殖したチフィムリウム細胞は、多細胞性バイオフィルム凝集体およびプランクトン細胞を形成するために表現型切り替えを受ける。この集団には、約40%のバイオフィルム凝集体が含まれ、より高いレベルのジグアニレートシククラス(DGC)およびバイオフィルムレギュレータを発現し、60%のプランクトニック細胞が含まれ、これはより高いレベルの毒性関連遺伝子2、4を発現する(図2A)。このプロトコルでは、ChIP-seqを介して転写部位を比較するために両方の細胞タイプを収穫する方法を記述する。しかしながら、このプロトコルは、他の細菌種によって形成される他のタイプのバイオフィルムに適応することができる。バイオフィルム凝集体およびプランクトン細胞は、低速遠心分離によって分離され、これはバイオフィルムをペレットし、上清2に板張り細胞を残す(図2B)。セルの種類は、プロトコルの後続の手順で個別に処理されます。
ChIP-seq の DNA 入力の推奨量は 10 ~ 25 μg20です。S.チフィム尿フラスコ培養により、30mgのバイオフィルムが約25μgのDNAを生じる。バイオフィルム凝集体はタンパク質性細胞外物質が豊富であるため、架橋の効率を妨げると仮定した。細胞数によって異なる細胞型を正規化するだけでは、プランクトニック細胞の治療は、免疫沈降のために提示される架橋産物の不均等な量をもたらす可能性があります。30mgのバイオフィルムに一致するプランクトニック細胞材料の同等量を決定するためにタンパク質アッセイを行った(図3)。6.0OD600のプランクトニック細胞を30mgのバイオフィルムに合わせて回収した。
バイオフィルム凝集体は、すべての細胞へのクロスリンカーの平等なアクセスを可能にするために、最初に分解する必要があります。細胞を均質化する最も均一で高スループットな方法は、ミキサーミルと5mmステンレスビーズを使用していることがわかりました(図4A)。プランクトニック細胞は、ChIP-seq実験の変数を減らすために同じ方法で扱われます(図4B)。
DNAが超音波処理によって断片化され、架橋され、RNaseおよびプロテイナーゼKで処理されると、2%アガロースゲル上で可視化することができます。超音波処理されたDNAは、アガロースゲル上のスミアとして現れる断片のコレクションに分解されます。平均フラグメントサイズは、超音波処理バーストの数が増えるにつれて減少します(図5)。エネルギー移動は超音波装置単位によって異なるため、DNAを平均1kb未満に断片化するために必要な超音波処理バーストの数を決定するために超音波処理アッセイをお勧めします。ChIP-seq の実験では、5 バーストを選択しました。
ENCODEガイドラインは、免疫ブロット21との抗体標的結合活性の確認を推奨する。この場合、ChIPのために調製された全細胞溶解物に対する免疫ブロットによる抗体の特異性と結合強度を測定した(図6)。抗体がCsgD-3xFLAGに結合することを確認した。抗フラグおよび抗CsgDシグナルは、期待される分子量(28 kDa)22で共局在する。
ChIP手順はしばしば低濃度のDNAを生じる。そこで、汚染物質を除去し、DNAの割合を高く保持する精製方法を選択した。磁気ビーズ精製は、低濃度の入力ChIP DNAをより良く保持し(図7)、汚染物質を除去したため、カラムベースの精製よりも選択された(データは示されていない)。
DNAの開始量が減少するため、ChIP DNAのライブラリー調製には希釈アダプターおよびPCR濃縮が必要になることがある。シーケンシングの前に、ライブラリをバイオアナライザトレースで視覚化して、PCRエンリッチメント前後の正しいサイズ分布を確認できます(図8)。さらに、転写因子の既知の調節標的がある場合、qPCRは、免疫沈降および超音波処理された入力DNAにおける既知の標的および参照遺伝子配列の存在量との折り畳み変化(≥〜Ct)を比較することによって結合領域の濃縮を確認するために使用されるべきである。
ChIP シーケンシング データは、品質スコアの割り当て、低品質ベースのトリミング、前方読み取りと逆読み取りの調整 (ペアエンド シーケンス)、高品質の参照ゲノムへのアセンブル、背景の上のピークの検出、下流分析の実行によって分析する必要があります (図 9A)。下流分析には、ピークの可視化と注釈、生物学的反復サンプルとの一貫性、モチーフ分析、および条件または細胞型間の微分結合解析、および既知の経路からの遺伝子発現とのデータ統合が含まれる必要があります。当社のようなChIP-seqデータの場合、ピークは単に折り畳み変化ではなく、p値決定で背景(図9B、C、赤いバー)を大幅に上回る値として識別する必要があります。最終解析では、マップされた読み取りが参照ゲノムのアノテーションに対して視覚化されます (図 9D)。不十分なChIP-seqの結果は、背景の上に有意なピークがない入力seqのように見えます。
図1:細菌バイオフィルムを用いたChIP-seqのステップの図説明した手順において、S.チフィムリウム細胞は、振とう(1)で28°Cで1%トリプトンフラスコ培養で増殖し、細胞フリーのコンディショニングメディアは、バイオフィルム細胞タイプ(2)を処理するために収集され、これは十分な量のバイオフィルムおよびプランクトン細胞を収集するために使用される(3)。これらの細胞をPBSで洗浄し、均質化してバイオフィルムを分解する(4)。タンパク質はホルムアルデヒド架橋剤でDNAに架橋され、その後細胞は細胞内容物を放出するために糖化される(5)。細胞リサート中のDNAは、超音波処理によって断片化される(6)。標的タンパク質に架橋されたDNAは、標的タンパク質とプロテインG磁気ビーズに結合する抗体による免疫沈降を介して選択される(7)。選択したDNAをプロテインG磁気ビーズ(8)から洗浄・溶出し、ライブラリー調製およびシーケンシングのために精製する(9)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:Sを研究するためのインビトロフラスコモデルチフィムリウムバイオフィルム開発(A) S.28°で13時間1%トリプトンで増殖したチフィム尿細胞は、フラスコ培養の液相中にバイオフィルム凝集体およびプランクトン細胞を形成する表現型切り替えを受ける。(B)(A)中のフラスコ培養物からバイオフィルム凝集体およびプランクトン細胞を2分間210xgで遠心分離して分離した。上清を板上球用に回収し、バイオフィルム細胞製剤用にペレットを採取した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:Sから採取したプランクトニック細胞およびバイオフィルム細胞試料の総タンパク質濃度。チフィムフラスコ文化。比色タンパク質アッセイを行い、BSA標準曲線に対するタンパク質量を750nmで測定した。4.0、6.0、および8.0 OD600における分解プランクトン細胞試料のタンパク質含有量を、30mgのバイオフィルム凝集体と比較した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:Sからの細胞試料の均質化チフィム尿バイオフィルムフラスコ培養物。(A)PBSに再懸濁したフラスコ培養物からのバイオフィルム凝集体(左)を、30Hzのミキサーミルを用いて5分間均質化した(右)。(B)PBSに再懸濁したフラスコ培養物のプランクトン細胞を、細胞型試料間の一貫性を確保するために30Hzで5分間ミキサーミルで処理した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:プレChIP細胞リザートを有する超音波処理アッセイバイオフィルム凝集体およびプランクトニック細胞試料を分離し、均質化し、架橋し、および分解した。DNAタンパク質複合体を30オンで8回まで超音波処理し、氷上で2分オフにしてDNAを小さな断片に分解した。超音波処理されたリサートの一部を2%アガロースゲル上で分離した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:ChIP-seqで使用される抗FLAG抗体の標的結合特異性。抗体特異性は、Sのフラスコ培養物から調製された全細胞リザスに対する免疫ブロッティングによって評価された。図に示すようにチフィム尿株。ひずみ ≥csgD + p3xFLAG/csgDおよび WT バイオフィルム サンプルはフラスコから採取されたバイオフィルム凝集体を表し、ひずみ ≥csgD ± p3xFLAG および WT 板緊張細胞はプランクトン細胞を表します。精製された His タグ付き CsgD がコントロールとして読み込まれました。細胞全体のリソートを正規化し、各レーンで30μgの全タンパク質を分析した。左側の数字は、事前染色された分子量マーカーのサイズ(kDa)を指します。上部ブロットに用いた一次抗体はウサギ抗FLAGポリクローナル抗体(シグマ-アルドリッチ#F7425)であったのに対し、下ブロットはCsgD特異的モノクローナル抗体2と共にウサギ抗FLAGでインキュベートした。ヤギ抗ウサギIgG(LiCor IRDye 680RD、925-68071)およびヤギ抗マウスIgG(LiCor IRDye 800CW、925-32210)を二次抗体として使用した。蛍光シグナルは、オデッセイCLxイメージングシステムとImage Studio 4.0ソフトウェアパッケージ(Li-Corバイオサイエンス)を用いて可視化した。代表的な画像が表示されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:ChIP-seq実験に起因する少量のDNAに対するカラムまたは磁気ビーズベースの精製戦略。既知の量のDNAのサンプルをカラムベースのキットまたは磁気ビーズを用いて精製し、溶出物の濃度を後精製して測定した。磁気ビーズは、ChIP-seqプロトコルの終わりに一般的に遭遇するDNAの低量と同様に、低DNAレベルでより良い回復を示したが、NGSライブラリの準備の前に。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図8:バイオアナライザによって可視化されたChIP DNA製剤とその後のライブラリ(A)細胞分解および超音波処理後のゲノムDNAの平均断片サイズは<1000 bpであり、200〜500bpの範囲の断片の大部分を有する。(B)ライブラリー調製用の出発材料は検出を下回った。(C) アダプターライゲーションおよび PCR エンリッチメントにより、ライブラリーフラグメントの増幅が可能です。(D) ライブラリの準備が不十分な場合は、DNA ピークが低い、奇数形または高分子量のピーク、または約 100 bp の豊富なアダプタピークを持っています。
図9:ChIP-seqデータをバイオインフォマティクスツールを用いて解析し、ゲノムブラウザで可視化する。ChIP-seqデータの典型的なバイオインフォマティクス分析のためのフローチャートバイオフィルム(csgD株+p3xFLAG/csgD)およびプランクトニック細胞(csgD + p3xFLAG)の生の読み取りは、低品質の読み取りおよびアダプターのために洗浄され、Sにマッピングされた。デフォルトパラメータ23を有するBowtie2(v2.3.3.1)によるチフィム尿14028sゲノム(染色体のNC_016856.1、プラスミドのNC_016855.1)。MACS2(v2.1.2)は、テストデータセットとしてバイオフィルム複製を制御24としてテストデータセットおよびプランクトニックものとして取り込み、'-q 0.01 -- nomodel'のパラメータを使用してピークを呼び出すために使用されました。MACS2 bdgcmpモジュールはさらに'-m FE'のパラメータを持つ折りたたみエンリッチメントトラックを生成するために使用されました。折りたたみ濃縮トラックを持つ重要なピークファイルは、ベッドツール/ベッドクリップ/ベッドGraphToBigWig25を使用してウィッグファイルに変換され、統合ゲノムビューアv2.5.126を使用して参照ゲノム上で可視化されました。代表的なピークが表示されます(赤いバー)。(B) 複数のピークを含む ~40 kbp の大きな領域は、非定型的な結果ですが、依然として価値がある可能性があります。(C) これはより典型的な結果であり、2つの有意なピーク領域を示す。(D) C の左ピークにズームインし、Sの領域に対する読み取りマッピングを示します。uspAおよびuspBのための発散プロモーターを含むチフィム尿14028sゲノム。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 細胞リシスバッファー |
| リシス緩衝液 |
| 50 mM トリス-HCl pH 8.1 |
| 10 mM EDTA |
| 1% SDS |
| プロテアーゼ阻害剤 |
| IP希釈バッファー |
| 20 mM トリス-HCl pH 8.1 |
| 2 mM EDTA |
| 150 mM ナCl |
| 1% トリトン X-100 |
| 0.01% SDS |
| 免疫沈降バッファー |
| IP洗浄バッファ 1 |
| 20 mM トリス-HCl pH 8.1 |
| 2 mM EDTA |
| 50 mM ナCl |
| 1% トリトン X-100 |
| 0.1% SDS |
| IP洗浄バッファ2 |
| 10 mM トリス-HCl pH 8.1 |
| 250 mM LiCl |
| 1 mM EDTA |
| 1% NP-40 |
| 1% デオキシコール酸 |
| TE (T10E1)pH 8.0 |
| 10 mM トリス HCl |
| 1 mM EDTA |
| 溶出バッファー |
| 1% SDS |
| 100 mM ナフコ3 |
表 1.バッファレシピ。
Discussion
このプロトコルは、サルモネラ腸管セロバルチピムリウムバイオフィルムおよびプランクトニック細胞を用いてChIP-seqを行う技術を概説し、マスターバイオフィルムレギュレータCsgDの調節目標を見つける。2種類の細胞におけるCsgDの二重安定性による微分結合情報が期待され、バイオフィルム凝集体が高く、プランクトニック細胞2、3のレベルが低いと期待される。しかし、この技術は、他の細菌転写因子、細胞型、または増殖条件にも適用することができる。特に、この技術は、バイオフィルム細胞の単位重量当たりのCFUに対して実験的に決定された変換因子を用いて他の細菌バイオフィルムに適合させることができる。
ChIP-seqは、シーケンスによって技術的なエラーの増幅を受けやすいことができます。ただし、重要な手順で確認すると、この27を防ぐことができます。一次抗体特異性は、免疫沈降7の際に制御する標的転写因子およびDNAのみを選択するために重要である。この実験では、csgDを遺伝子の3'末端でプラスミドコード3xFLAGタグに融合し、CsgD22のC末端に対応した。csgDを含まないp3xFLAGプラスミドを「対照」(S.)として用いた。タイフィム尿 14028 ≥csgD + p3xFLAG).ENCODEガイドラインは、目的のタンパク質に対して一次抗体を用いて免疫ブロットを行い、ChIP株および欠失株21の溶解物を行う。転写因子結合および下流シーケンシング結果の変動性を低減するために、反復間で増殖条件が一貫していることを確認することが重要です。1つは、接種サイズとプレ接種の成長条件が一貫していることを確認するために注意している場合,フラスコ培養におけるバイオフィルムの成長は一貫している4.均質化後にすべてのバイオフィルムが分解されたことを確認し、試薬、特にホルムアルデヒド架橋剤からすべての細胞への平等なアクセスを確保することが重要です。
いくつかの改変により、研究者は他のDNA結合タンパク質、細胞型、株、増殖条件、またはラボ機器にこのプロトコルを使用することができます。S以外のバイオフィルム形成種に用いられる場合。Typhimuriumは、バイオフィルムの単位重量当たりのコロニー形成単位の変換因子を実験的に決定する必要があり、バイオフィルムの異なる量を収穫し、バイオフィルムを完全に均質化し、連続希釈およびプレートカウントを行って標準的な曲線を作成し、これはより低いバイオフィルム重量2では正確ではないかもしれない。超音波処理器のエネルギー移動と細胞タイプの抵抗は異なる場合があります。したがって、超音波発生は、下流のライブラリの準備とシーケンシング11に必要なフラグメントサイズの範囲を生成する超音波処理バーストの数を見つけることをお勧めします。マイクロコッカルヌクレアーゼによるクロマチン断片化は、占有部位の高解像度を生成する超音波処理に代わるものである。ただし、この方法では断片化バイアスが7,28に生じる可能性があります。DNAサイズの範囲は、下流のライブラリ準備キットとシーケンシングプラットフォームに応じて変更される場合があります。均質化の他の方法は、ミキサーミルの代わりに使用され得る。例えば、ガラス組織ホモジナイザーは置換され得るが、バイオフィルムをエアロゾル化または不完全に分解することがある。対照の観点から、前免疫沈降DNAは、シーケンシング後の処理および分析において正規化することができる。種一致正常抗体血清を有するモックIP制御は、13と同様に対照として使用することができる。
研究者は、ChIP-seq実験を検討する際に、この方法の制限を考慮する必要があります。他のバイオフィルムタイプに適応するために重要な改変が必要な場合があります。例えば、PBSにおけるバイオフィルムのサルモネラ・チフィムリウム即時再懸濁液は、バイオフィルム凝集体の測定可能な損失につながる。細菌の転写因子の調節因子を標的とする免疫沈降は、非常に少量のDNAをもたらす可能性があり、これは後の段階での精製および検出のための課題である。バイアスは、ライブラリ検出9の間にせん断および下流操作中に導入することができる。さらに、この方法は、転写因子結合に応答して生体内発現レベルを明らかにしない。バイオインフォマティクスの経験がほとんどない研究者は、分析パイプラインに挑戦するかもしれません。このメソッドは、時間がかかり、コストがかかる場合があります。しかし、シーケンシングのコストはマイクロアレイよりも低いことが多く、技術の改善が続く中で時間の経過とともに減少しています。
文献中の少数の方法は細菌を用いたChIPを記述し、ほとんどの細菌実験は単純な増殖条件13、14、15、17、18から始まる。単一細胞によるChIPサンプル調製は簡単であり、バイオフィルム凝集体を用いたChIPサンプル調製よりも少ない課題を提示する。ChIP-seqに関しては、指数濃縮(SELEX)によるリガンドの系統的進化を含むシス調節回路を研究する以前の方法、電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)、ChIPチップ、プロモーター欠失およびレポーター分析が補完またはChIP-seq29に置き換えられている。ChIP-seqは、技術の進歩とシーケンシングの可用性により、ChIPチップを置き換えています。ディープシーケンシングは、ChIPチップ11、30よりも少ない開始材料で結合親和性が低く、ベースペア分解能が高いサイトを識別できる膨大な量のデータを研究者に提供します。高品質の基準ゲノムを持つ生物からのChIPデータの分析は、一般的に高速かつ特異的です。さらに、ChIP-seqは、すべての細胞タイプ、増殖期、または環境条件31において占有されない可能性のあるシリコ予測結合部位で発見するための徹底的な方法である。
将来的には、このプロトコルは、細菌病因、特にバイオフィルム形成生物の理解を容易にするために使用することができる。この技術の広範な採用と新しいデータセットの利用可能性は、バイオフィルム形成微生物32における細胞プロセスを制御するために共局在するタンパク質のグループを同定するためのデータ統合につながる可能性がある。さらに、ChIP-seqおよびRNA-seqデータを統合して規制システムモデル33を構築することができます。
Disclosures
著者らは、競合する財政的利益がないことを宣言する。
Acknowledgments
この研究は、自然科学工学研究会議(NSERC)(#2017-05737)からAWへの助成金とバイオテクノロジーのヤリスロウスキー議長の助成金によって支援されました。MPは、サスカチュワン大学の感染症、食品安全、公共政策(ITraP)の統合トレーニングプログラムを通じてNSERC-CREATE奨学金によって支援されました。
著者たちは、撮影と編集をしてくれたダニ・デールに感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose powder | FroggaBio | A87-500G | |
| Balance (Explorer pro) | Ohaus | EP214 | |
| Benchtop Centrifuge (8510R) | Eppendorf | 022627023 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | G2939BA | |
| BR dsDNA kit | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads | Cell Signaling Technology | 9006 | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | COEDTAF-RO ROCHE | |
| Conical tube 15 mL | FroggaBio | TB15-500 | |
| Conical tube 50 mL | FroggaBio | TB50-500 | |
| DC Protein Assay Kit II | BioRad | 5000112 | |
| Disposable Cuvette, 1.5 mL | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
| Electrophoresis equipment (mini-PROTEAN) | Bio-Rad | 1658000 | |
| Floor centrifuge (Sorvall Evolution RC) | Thermo Scientific | 728211 | |
| Fluorometer (Qubit 3.0) | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| GelRed® Nucleic Acid Gel Stain 10 000x in water | Biotium | 41003 | |
| High Sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Incubator (shaking) | VWR | 1570-ZZMFG | |
| Incubator (Water bath shaking) | New Brunswick | G76D | |
| LB media | VWR | 90000-808 | |
| Magnetic stand (DynaMag) | Fisher Scientific | 12321D | |
| Microcentrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5415R | |
| Microcentrifuge Tubes, 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycle) | Illumina | MS-102-3001 | |
| Mixer mill | Retsch | MM400 | |
| Nalgene 115 mL Filter Units, Sterile, 0.2 µm pore size | Thermo Scientific | 73520-980 | |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7370S | |
| NGS Cleanup and Size Select magnetic beads | Machery-Nagel | 744970.5 | |
| Normal mouse serum | AbCam | ab188776 | |
| Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Pipette controller | FroggaBio | MP001 | |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | AM2542 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Rabbit Anti-FLAG Polyclonal Antibody | Sigma-Aldrich | F7425 | |
| RNase A (10 mg/mL; DNase and protease-free) | ThermoFisher Scientific | EN0531 | |
| Rotating wheel | Crystal Technologies & Industries | TR 01A | |
| Safe-Lock Tubes (2.0 mL, colorless) | Eppendorf | 22363344 | |
| Serological pipette 25 mL | FroggaBio | 94024 | |
| Spectrophotometer | Montreal Biotech Inc. | Libra S22 | |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | Qiagen | 69989 | |
| Tapered microtip 1/8" (3mm) Sonicator probe | Sonics & Materials, Inc. | 630-0418 | |
| Tryptone media | VWR | 90000-286 | |
| Ultrasonic Liquid Processor (Sonicator) | Sonics & Materials, Inc. | VC300 | |
| Vacuum equipment (Vacufuge plus) | Eppendorf | 022820001 | |
| Water bath 1 (Lab-line aquabath) | Thermo Scientific | 18000-1 | |
| Water bath 2 (Precision) | Thermo Scientific | 51221044 |
References
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