Summary
Хроматин иммунопрецитификации в сочетании с следующего поколения секвенирования (ChIP-seq) является метод, используемый для установления взаимодействия между транскрипционными факторами и геномных последовательностей они контролируют. Этот протокол излагаются методы для выполнения CHIP-seq с бактериальными биопленками, используя Salmonella enterica serovar Typhimurium бактериальной биопленки в качестве примера.
Abstract
Хроматин иммунопрецитификации следуют секвенирования (ChIP-seq) является метод, который может быть использован для обнаружения нормативных целей транскрипционных факторов, гистон модификации, и другие ДНК-связанных белков. Данные ChIP-seq также могут быть использованы для поиска дифференциальной привязки транскрипционных факторов в различных условиях окружающей среды или типах клеток. Первоначально, ChIP был выполнен путем гибридизации на microarray (ChIP-чип); однако, ChIP-seq стал предпочтительным методом благодаря технологическим достижениям, снижению финансовых барьеров на пути секвенирования и огромному объему высококачественных данных. Методы выполнения CHIP-seq с бактериальными биопленками, основным источником стойких и хронических инфекций, описаны в этом протоколе. CHIP-seq выполняется на Salmonella enterica serovar Typhimurium биопленки и планктонных клеток, ориентированных на мастер биопленки регулятора, CsgD, для определения дифференциального связывания в двух типах клеток. Здесь мы демонстрируем соответствующее количество биопленки для сбора урожая, нормализуем к планктонскому контрольному образцу, гомогенизируя биопленку для доступа к кросс-ссылкам и выполняя обычные шаги ChIP-seq для получения высококачественных результатов секвенирования.
Introduction
Бактериальные биопленки, структурные агрегаты клеток, встроенных в самостоятельной матрицы, устойчивы к высыханию, антибиотики, и принимающих иммунных реакций1. Как таковые, они вызывают стойкие и хронические инфекции и представляют уникальные проблемы для исследователей из-за их решения для выживания и передачи инфекции. Сальмонеллы энтерика серовара Тифимуриум(S. Typhimurium) было установлено, чтобы установить фенотипично неоднородные популяции биопленки агрегатов, которые устойчивы к высыханию и антибиотики, и планктонных клеток, которые выражают вирулентность факторов в чистой культуре при воздействии экологического стресса (28 кВ, ограничивающих питательных веществ)2. Эти два типа клеток возникают из-за бистабильной экспрессии главного регулятора биопленки, CsgD3. Мы предположили, что это может быть ставка хеджирования стратегии для сальмонеллы, где планктонных клеток участвуют в краткосрочной передачи и биопленки клетки способны сохраняться в долгосрочной перспективе в окружающей среде, пока возможность заразить новый хозяин возникает2,4. Многие из нормативных элементов, которые контролируют экспрессию ргс оперона хорошо характеризуются5. Однако, кроме adrA и csg operon6,известно несколько нормативных целей CsgD. Определение нормативной сети CsgD поможет нам лучше понять жизненный цикл сальмонеллы и роль, которую играют биопленки в передаче.
Хроматин иммунопрецитификации следуют высокой пропускной способности секвенирования (ChIP-seq) является мощным in vivo метод для генома всей идентификации белково-ДНК взаимодействий и предоставляет информацию о нормативных процессов, связанных с транскрипции факторов, гистон изменения, или нуклеосомы7. Новые исследования использовали этот метод для оценки дифференциального связывания белка между условиями роста и типов клеток8. В хроматине иммунопреципиции (ЧИП) фрагменты ДНК с взаимодействующими белками обогащаются путем выбора антител белков-мишеней. Клетки собирают и ДНК-связывающих белков перекрестно ДНК in vivo через формальдегид кросс-ссылка лечения. Клетки лисицируются, высвобождая содержимое клеток, а хроматин срезается примерно в 200-600 bp фрагментов7. Фрагменты ДНК, привязанные к целевому белку, иммунопрецицицициционированы с помощью антител и изолированы путем декроссулинки с последующим перевариванием белка9. Эти фрагменты ДНК представляют собой места связывания белка, совмещенные путем гибридизации с микроаром (ChIP-чип) или путем глубокого секвенирования и отображения последовательности генома10,11. Хотя эксперименты с Чипом Чип-чипа дают адекватные нормативные данные, они ограничены из-за использования дорогих зондов, а также гибридизации и смещениямассива 12. ChIP-seq имеет больший динамический диапазон с увеличенным нуклеотидным разрешением и покрытием, улучшенным соотношением сигнала к шуму и меньшим количеством артефактов по сравнению с ChIP-чипом7.
CHIP был использован для анализа Sfh и OmpR регулирования в Сальмонеллы серововар Typhimurium13,14, кворум зондирования AphA регулирования в Vibrio alginolyticus15, RpoS регулирования в Эшер ichia coli16, вирулентность регулятора EspR регулирования в Mycobacterium туберкулеза17, потенциальные дигуанилат циклазы через регулирование Амре в Pseudomonas aeruginosa18, а также VraSR регулирование в золотистом стафилококке19. Бактериальные эксперименты ChIP-seq, которые были описаны, начинаются с выращивания клеток в жидких носителях и сбора урожая в одноклеточной форме. Тем не менее, анализ биопленок и соответствующее регулирование генов представляет собой новый набор задач для создания успешного протокола ChIP-seq. В этом протоколе, ChIP-seq используется для поиска дифференциальных нормативных целей CsgD, S. Тифимурий мастер биопленки регулятора в биопленки и планктонных типов клеток. Этот протокол описывает методы, используемые для определения соответствующего количества биопленки для CHIP-seq, сбора биопленки из колбы культуры, нормализовать биопленку и одноклеточных образцов управления, гомогенизировать биопленку, и полное иммунопреципции. Это будет полезно для изучения нормативных целей в бактериальных биопленок и может быть адаптирована для многих видов.
Protocol
1. Рост клеток культуры колбы
- Из замороженных запасов, полоса Сальмонеллы серовар Typhimurium штаммов на LB агар (20 мл твердых носителей в 100 мм Петри пластины) с соответствующим антибиотиком и инкубировать при 37 кс для 16-20 ч для получения изолированных колоний.
- Прививать 5 мл LB бульон, содержащий соответствующий антибиотик в 25 мм х 150 мм боросиликаткультурной трубки с 1-3 колоний из полосы пластин от шага 1.1. Инкубировать при 37 градусах Цельсия при встряхивании при 200 об/мин в течение 7 ч.
- Измерьте OD600 культуры бульона с помощью спектрофотометра. Разбавить аликвот культуры 1 в 4 в PBS в 2 мл кюветта и измерить абсорбцию на 600 нм. Наиболее важным фактором на этом этапе мы считаем время роста. Значения OD используются для нормализации культур для доставки нужного количества ячеек в шаге 1.4.
- Добавьте 1,0 OD600 объемэквиваленты клеточной культуры (т.е. 109 клеток) в колбу Erlenmeyer, содержащую 100 мл 1% триптона с соответствующим антибиотиком. Инкубировать при 28 градусах Цельсия при встряхивании при 200 об/мин при 13 ч.
Примечание: Biofilm клетки будут отображаться как агрегированные хлопья и одиночные планктонных клеток в облачных носителях.
2. Сбор клеток без кондиционированного 1% триптона
- Соберите колбу культуры для клеток без кондиционированных 1% триптона. Пипетка колба культуры несколько раз, чтобы смешать перед добавлением в центрифуге трубки.
- Центрифуга при 12000 х г в течение 10 мин при 10 градусах По Цельсию, чтобы гранулировать все клетки.
- Декант супернатант в 0,2 мкм фильтр аудионционный блок, вакуумный фильтр, и распределяться в новую трубку.
Примечание: Biofilm агрегаты придерживаются обычных решений (например, PBS) и будет придерживаться сторон труб и пипетки советы. Так как это позволяет легче манипуляции, мы используем условные средства массовой информации (1% триптона) для перемещения биопленки первоначально и использовать теплый PBS непосредственно перед перекрестной связи (шаг 4.5), чтобы удалить любой белок перекрестных субстратов, которые могут присутствовать в средствах массовой информации.
3. Отделение биопленки и планктонных клеток от колбкультур 2
- Использование стерильной пипетки 25 мл, аликвот колбы культуры в 15 мл труб. Центрифуги на медленной скорости (210 х г)в течение 2 мин, чтобы отделить два типа клеток.
Примечание: Клетки Biofilm должны образовывать свободные гранулы в нижней части трубки - Пипетка супернатант, содержащий планктонных клеток в две 40 мл центрифуговых труб для последующего (шаг 5). Удалите всю оставшуюся жидкость, стараясь не беспокоить гранулы. Повторяйте до тех пор, пока типы клеток не будут отделены от всех носителей культуры колбы.
4. Подготовка агрегатов биопленки
Примечание: Biofilm собирается влажным весом, чтобы дать 25 мкг ДНК, рекомендуемый минимальный исходный материал для CHIP. Коэффициент конверсии биопленки (BCF) С. Тифимурий 1,73 х 108 CFU/mg2. Исследователя подготовляя другие типы биопленки будет нужно эмпирически определить число клеток в вес блока биопленки, который использован для того чтобы найти вес biofilm требуемый для 25 мкг материала старта дна используя это уравнение:
- Точно взвесить крышку 2 мл или винтовую крышку.
- Отрептить биопленку гранулы в 1 мл условного триптона. Переместите переплетенный биопленку в предварительно взвешенную крышку 2 мл или винтовую крышку трубки.
- Центрифуга в течение 1 мин при 11 000 х г при 20 градусах По цельсию
- Тщательно удалите все супернатанты из трубки и взвесьте трубку точно. Вычтите вес трубки из веса трубки с биопленкой, чтобы найти вес биопленки. Она должна составлять 10% от целевого веса биопленки.
- Вымойте клетки, чтобы удалить оставшиеся условные триптона. Добавьте 1 мл теплого PBS в трубку и вихрь осторожно, чтобы повторно приостановить гранулы. Центрифуга в течение 3 мин при 8 000 х г, чтобы гранулировать биопленку и удалить супернатант. Добавьте 1 мл PBS в трубку и вихрь, чтобы повторно приостановить гранулы.
5. Подготовка планктонных клеток
- Запись объема и OD600 планктонского супернатанта от медленной скорости центрифугирования (шаг 3.2) с помощью спектрофотометра
- Рассчитайте необходимый объем для окончательного OD600 из 6.0:
- Охладите центрифугу до 10 градусов по Цельсию и осадок планктонных клеток центрифугированием (10000 х г,10 мин при 10 градусах Цельсия)
- Удалите супернатант и отдохните клеточные гранулы в конечном объеме PBS, рассчитанном в шаге 5.2.
- Повторно измерьте OD600 планктонных клеток с помощью спектрофотометра и разделите объем 6.0 OD600 планктонных элементов в крышку 2 мл или винтовую крышку трубки.
- Довести объем до 1 мл с PBS.
6. Гомогенизирующие клетки
- Добавьте по одной стерилизованной 5 мм из нержавеющей стали в каждую из трубок.
- Гомогенизировать с помощью смесителя мельницы в течение 5 минут на 30 Гц. Наблюдать агрегатные трубы, чтобы подтвердить, что биопленка была разбита на части.
- Перенесите гомогенизированные клетки в новую трубку 1,5 мл, избегая металлической бисовой. Довести объем до 1 мл с PBS.
Примечание: Выполните серийные разбавления для перечисления входных ячеек и убедитесь, что окончательное число ячеек близко к желаемому или прогнозируемому числу.
7. Перекрестное соединение белков с ДНК
- Распределите свежий формальдегид в пробные трубки до конечной концентрации 1%. Инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре на вращающемся колесе.
Внимание: Формальдегид является коррозионным, кожи, глаз, и дыхательные раздражитель, и легковоспламеняющиеся. Распределитесь в дымящийся капюшон. - Добавьте 1 М глицин к конечной концентрации 125 мм, чтобы остановить перекрестные ссылки. Инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре на вращающемся колесе.
8. Мытье клеток для удаления избытка кросслинкера
- Отложение клеток на 8000 х г в течение 3 мин и удалить супернатант
- Приостановите действие гранул в 20 л ингибиторов протеазы 25x и 500 Л фильтра стерилизованных PBS.
- Центрифуга трубки в течение 3 мин на 8000 х г и удалить супернатант.
9. Лисинговые клетки
- Приостановите гранулы в буфере Lysis 600 л (обратитесь к таблице 1)и инкубировать на льду в течение 10 минут.
- Добавьте 1,4 мл буфера разбавления IP (отсылайте к таблице 1)к стерильной трубке 15 мл и переместите лиздированные клетки в трубку 15 мл. Держите трубку на льду в течение 1,5-2 ч, и вихрь мягко и время от времени.
Примечание: Некоторые устойчивые клеточные материалы могут оставаться в трубках. Длительный инкубационный период на льду с случайным вихрем раскроется материалом. Остальная часть будет разбита путем sonication.
10. Фрагментация ДНК путем соникации
- Поместите трубку 15 мл в стакан льда и поместите 3-мм зонд внутри трубки.
- Выполните 5 звуковых раундов 30 с на 20-40% от 400 Вт с 2 мин охлаждения на льду между очередями.
- Осадок осадок осадок осадок материал центрифугирования (8000 х г,10 мин при 4 градусах Цельсия). Перенесите супернатант на новую трубку.
- Дополнительно, выполнить decrosslinking на 65 градусов по Цельсию в течение 30-60 мин и переварить РНК и белка при 45 градусов по Цельсию в течение 30-60 минут, прежде чем работать на 2% агарозный гель, чтобы проверить на надлежащий размер фрагментов.
Примечание: Погрузите зонд в лизат клетки. Держите раствор на льду во время sonicating и отдыха. Не удаляйте трубку в то время как зонд звуковой установки пульсирует. Решение должно выглядеть облачно дозвуковой и ясной после звуковой.
11. Иммунопреципибилирующие комплексы ДНК-белка-антитела
- Подготовка
- Распределите один 1,35 мл аликвот для иммунопреципиции и один 200 qL aliquot в качестве входного контроля. Храните элемент управления входной связью при -80 градусов по Цельсию до тех пор, пока не будут выполнены этапы декроссулинга и переваривания.
- Иммунопрециция с первичными антителами
- Добавьте 10 мкг очищенного белка специфических первичных антител к аликоту 1,35 л. Инкубировать ночь при 4 градусах Цельсия на вращающемся колесе.
Примечание: Основным антителом может быть моноклональное антитело, высококачественная поликлональная сыворотка или коммерческие антитела эпитопа (т.е. анти-FLAG). - Добавьте 50 л магнитных бусинок Protein G в трубки со ступени 11.2.1 и инкубировать при 4 градусах по Цельсию в течение 3 ч на вращающемся колесе.
- Поместите буфер IP-промывки 1, буфер IP-промывки 2 и TE pH 8.0 (обратитесь к таблице 1) в ведро со льдом. Теплый буфер elution до 65 градусов по Цельсию.
Примечание: Не кладите раствор, содержащий буфер элюции на лед. - Привязать магнитные бусы Protein G в сторону труб с помощью магнитной подставки
- Выполните моет: мыть 2x с 750 Л холодный буфер ПРОИП 1, мыть 1x с 750 Л l холодный буфер ПРОМп 2, и мыть 2x с 750 Л холодный TE при pH 8.0. Держите трубки на магнитной подставке во время стирок.
- Добавьте 450 qL буфера IP Elution (отсылайте к таблице 1)к каждой трубке и инкубизируете при 65 градусах По Цельсия в течение 30 минут с нежным вихрем каждые 5 минут.
- Привязывайте бусы к стороне труб с помощью магнитной подставки. Подождите, по крайней мере 2 минуты, пока решение не будет ясно.
- Откажитесь от очищенного супернатанта к новой трубке 1,5 мл, стараясь не мешать магнитному грануле из бисера.
- Добавьте 10 мкг очищенного белка специфических первичных антител к аликоту 1,35 л. Инкубировать ночь при 4 градусах Цельсия на вращающемся колесе.
12. Декроссулинг ДНК-белковых комплексов и переваривание совместной очистки РНК и белка
- Добавьте 2 мкг RNase A и NaCl к конечной концентрации 0,3 М в каждой трубке.
- Инкубировать при 65 градусах Цельсия, за 6 ч или на ночь.
- Полное переваривание белка, добавив 180 мкг Протеиназа K к каждой трубке, затем инкубируя при 45 градусах Цельсия в течение 3-5 ч.
13. Подготовка и секвенирование библиотеки
- Очистка ДНК с помощью магнитных бусин
Примечание: Магнитные бусы предпочтительнее для изоляции небольшого количества ДНК обычно восстанавливается во время CHIP с бактериальными клетками. - Подготовьте библиотеки с помощью комплекта, совместимого с выбранной платформой последовательности.
- Проверьте концентрацию библиотеки с помощью флюорометра и широкого диапазона комплекта dsDNA или комплекта количественной оценки библиотекq qRT-PCR.
Примечание: По нашему опыту, измерения фторометра могут переоценить концентрацию ДНК. - Библиотеки пула, с учетом адекватного охвата каждого образца библиотеки. Для подавления Illumina с salmonellaмы объединили 10-12 библиотек. Добавьте Tris-HCl pH 8.0 к конечной концентрации 1 мМ.
- Последовательность в соответствии со спецификациями выбранной платформы.
Representative Results
Подготовка образцов иммунопреципиции хроматина из бактериальной биопленки включает в себя несколько этапов, как показано на рисунке 1. К ним относятся выращивание биопленки в культуре колбы, сбор условных носителей, сбор достаточного количества биопленки и планктонных клеток в качестве контроля, мытье клеток в PBS, гомогенизация, перекрестные белки ДНК, лизионные клетки, фрагментация ДНК путем звукообразования, иммунопрецифицирование ДНК с соответствующими антителами и белками G шариков, мытье и eluting иммунопреципицита ДНК и очистка.
S. Typhimurium клетки, выращенные в жидкой культуре в условиях биопленки индуцирования проходят фенотип переключения на формирование многоклеточных биопленки агрегатов и планктонных клеток. Эта популяция будет содержать около 40% биопленки агрегатов, которые выражают более высокие уровни дигуанилат циклазы (DGCs) и биопленки регуляторов, и 60% планктонных клеток, которые выражают более высокие уровни вирулентности связанных генов2,4 (Рисунок 2A). В этом протоколе мы описываем метод сбора обоих типов клеток для сравнения участков транскрипции через ChIP-seq; однако, этот протокол может быть адаптирован для других типов биопленок, образованных другими бактериальными видами. Биопленка агрегаты и планктонные клетки разделены медленной скоростью центрифугирования, которая гранулы биопленки и оставляет планктонных клеток в супернатанте2 (Рисунок 2B). Типы клеток затем обрабатываются отдельно для последующих шагов в протоколе.
Рекомендуемое количество ввода ДНК для ChIP-seq составляет 10-25 мкг20. В С. Typhimurium колба культуры, 30 мг биопленки дает около 25 мкг ДНК. Так как биопленки агрегаты имеют обилие белкового внеклеточного материала, мы предположили, что это помешает эффективности перекрестного соединения. Если бы мы просто нормализовали различные типы клеток по количеству клеток, лечение планктонных клеток может привести к неравному количеству перекрестного продукта, представленного для иммунопрецициции. Анализ белка был выполнен для определения эквивалентного количества планктонных клеточных материалов, чтобы соответствовать 30 мг биопленки(рисунок 3). 6.0 OD600 планктонных клеток были собраны в соответствии с 30 мг биопленки.
Biofilm агрегаты должны быть сначала разбиты, чтобы обеспечить равный доступ кросс-ссылки для всех клеток. Мы обнаружили, что наиболее однородный и высокой пропускной способ гомогенизировать клетки с помощью смесителя мельницы и 5 мм из нержавеющей стали бисер(Рисунок 4A). Планктонных клеток рассматриваются таким же образом, чтобы уменьшить переменные в эксперименте ChIP-seq(Рисунок 4B).
После того, как ДНК была фрагментирована sonication, перекрестные, и лечение с RNase и Proteinase K, он может быть визуализирован на 2% агарозный гель. Соникированная ДНК разбита на коллекцию фрагментов, которые появляются как мазок на геле агарозы. Средний размер фрагмента уменьшается с увеличением числа звуковых очередей(рисунок 5). Передача энергии будет варьироваться для различных единиц звукового, поэтому для определения количества звуковых очередей, необходимых для фрагментации ДНК, рекомендуется провести анализ звукообразования в среднем менее 1 кБ. Для нашего эксперимента ChIP-seq мы выбрали 5 очередей.
Руководящие принципы ENCODE рекомендуют подтверждение целевой активности антител с иммуноблотом21. В этом случае мы измерили специфичность и прочность связывания нашего антитела иммуноблотом на целые клеточные лисаты, подготовленные для ЧИП(рисунок 6). Мы подтвердили, что антитела связывается с CsgD-3xFLAG; анти-FLAG и анти-CsgD сигналы colocalize при ожидаемом молекулярном весе (28 kDa)22.
Процедуры CHIP часто дают низкую концентрацию ДНК. Поэтому был выбран метод очистки, который удаляет загрязняющие вещества и сохраняет высокую часть ДНК. Очистка магнитного бусины была выбрана по верховой очистке на основе столбцов, поскольку она лучше сохранила низкие концентрации входных ДНК CHIP(рисунок 7)и удалила загрязняющие вещества (данные не показаны).
Из-за уменьшения исходного количества ДНК, подготовка библиотеки ДНК CHIP может потребовать разбавленных адаптеров и обогащения ПЦР. Перед секвенированием библиотеки могут быть визуализированы трассой Bioanalyzer для подтверждения правильного распределения размера до и после обогащения ПЦР(рисунок 8). Кроме того, если существует известная регулятивная цель фактора транскрипции, qPCR следует использовать для подтверждения обогащения связывающих регионов путем сравнения изменения складских данных между известной целевой и эталонной положенной полоужей генов в иммунопреципицифицированной и звуковой входной ДНК.
Данные chIP-секвенирования должны быть проанализированы путем присвоения показателей качества, обрезки низкокачественных баз, выравнивания вперед и обратного чтения (в парном секвенировании конца), сборки высококачественного эталонного генома, нахождения пиков над фоном и выполнения анализа вниз по течению(рисунок 9А). Анализ ниже по течению должен включать визуализацию и аннотацию пиков, согласованность с биологическими образцами репликации и анализ мотива, и может включать анализ связывания между условиями или типами клеток, а также интеграцию данных с экспрессией генов из известных путей. Для данных ChIP-seq, таких как наша, пики должны быть определены как значительно выше фона(рисунок 9B, C, красные полосы) с определением значения p, а не просто раз-изменение. В конечном счете, отображенные считывания визуализировать против аннотации эталонного генома(рисунок 9D). Плохой результат ChIP-seq будет выглядеть как вход-сек без каких-либо значительных пиков над фоном.
Рисунок 1: Иллюстрация шагов в CHIP-seq с бактериальными биопленками. В описанной процедуре С. Тифимурийные клетки выращиваются в 1% триптон колба культуры на 28 градусов по Цельсию с встряхиванием (1), без клеток кондиционированных носителей собирается для обработки биопленки типов клеток (2), который используется для сбора достаточного количества биопленки и планктонных клеток (3). Эти клетки промывают pbS и гомогенизированы, чтобы разбить биопленку (4). Белки перекрестно к ДНК с формальдегидом кросслинкер, после чего клетки лиздируются, чтобы высвободить содержимое клеток (5). ДНК в клеточном лизате фрагментирована звукованием (6). ДНК, перекрестная к целевому белку, выбирается через иммунопреципицию с антителом, которое связывается с целевым белком и магнитными бусинами Protein G (7). Выбранная ДНК промывается и вымывается из магнитных бусинок Protein G (8) и очищается для подготовки и секвенирования библиотеки (9). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Модель колбы in vitro для изучения С. Разработка биопленки Typhimurium. (A) С. Клетки тифимурия, выращенные в 1% триптона в течение 13 ч при 28 градусах Цельсия, проходят фенотипное переключение на биопленочные агрегаты и планктонных клетки в жидкой фазе культуры колбы. (B) Biofilm агрегаты и планктонных клеток из колбы культуры в (A) были разделены путем центрифугирования на 210 х г в течение 2 мин. Супернатант был собран для подготовки планктонных клеток и гранулы были собраны для подготовки биопленки клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Общие концентрации белка для планктонных клеток и образцов биопленки, собранных из С. Культура фляг Тифимурия. Были проведены анализы колориметрического белка и количество белка по отношению к стандартной кривой BSA было измерено на уровне 750 нм. Содержание белка в пробах лисированных планктонных клеток на уровне 4,0, 6,0 и 8,0 OD600 сравнивалось с 30 мг биопленочных агрегатов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Гомогенизация образцов клеток с С. Типимурий биопленки колбы культур. (A)Biofilm агрегаты из колбы культуры вновь в PBS (слева) были однородны с помощью смесителя мельницы на 30 Гц в течение 5 минут (справа). (B) Планктонных клеток из колбы культуры вновь в PBS были обработаны смеситель мельницы на 30 Гц в течение 5 минут, чтобы обеспечить согласованность между образцами типа клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Анализ соники с помощью доЦИИклеточных лисатов. Биопленка агрегатных и планктонных клеток образцы были разделены, гомогенизированы, перекрестные, и lysed. ДНК-белковые комплексы были sonicated до 8 раз на 30 с на и 2 мин на льду, чтобы разбить ДНК на более мелкие фрагменты. Часть звукового лизата была отделена от 2% агарозного геля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Целевая специфичность анти-FLAG антитела, используемого в ChIP-seq. Специфика антител оценивалась путем иммуноблоттинга против целых клеточных лисатов, приготовленных из фляговых культур С. Typhimurium штаммов, как показано на рисунке. Процедить образцы p3xFLAG/csgD и WT биопленки представляют биопленки агрегаты, собранные из фляг, в то время как штаммы csgD - p3xFLAG и планктонные клетки WT представляют планктонные клетки. Очищенный Его помеченный CsgD был загружен в качестве элемента управления. Целые клеточные лизаты были нормализованы таким образом, что в каждой полосе было проанализировано 30 мкг общего белка. Числа слева относятся к размеру (в kDa) заранее окрашенных молекулярных маркеров веса. Первичные антитела, используемые для верхней пятно было кролика-анти-FLAG поликлональных антител (Сигма-Олдрич #F7425), в то время как нижняя пятно было инкубировано кролика-анти-FLAG вместе с CsgD-специфических моноклональных антител2. Коза анти-кролик IgG (LiCor IRDye 680RD, 925-68071) и коза анти-мышь IgG (LiCor IRDye 800CW, 925-32210) были использованы в качестве вторичных антител. Флуоресцентные сигналы были визуализированы с помощью системы визуализации Odyssey CLx и программного пакета Image Studio 4.0 (Li-Cor Biosciences). Отображаются репрезентативные изображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7: Стратегии очистки на основе столбцов оговования для небольших количеств ДНК в результате экспериментов на Основе ЧИП-сека. Образцы известных количеств ДНК были очищены с помощью комплектов на основе столбцов или магнитных бусин, и концентрация элюата была измерена после очистки. Магнитные бусы показали лучшее восстановление при низких уровнях ДНК, подобно низкому количеству ДНК, обычно встречающихся в конце протокола ChIP-seq, но до подготовки библиотеки NGS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 8: Подготовка ДНК CHIP и последующие библиотеки, визуализированные Bioanalyzer. (A) Средний размер фрагмента геномной ДНК после лиза клетки и звуковой был lt;1000 bp, с большинством фрагментов в диапазоне 200-500 bp. (B) Исходный материал для подготовки библиотеки был ниже обнаружения. (C)Перевязка адаптера и обогащение ПЦР позволяет усилить фрагменты библиотеки. (D) Плохая подготовка библиотеки имеет низкие пики ДНК, нечетные формы или высокие пики молекулярной массы, или обильные пики адаптера примерно на 100 б.п. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 9: Данные ChIP-seq анализируются с помощью биоинформатических инструментов и визуализированы в браузере генома. AFlowchart для типичного биоинформатического анализа данных ChIP-seq. Сырые считыватели для биопленки (сортcsgD , p3xFLAG/csgD)и планктонные клетки («csgD ) были очищены для низкокачественных считывателей и адаптеров, и отображены на S. Тифимурий 14028с геномы (NC_016856,1 для хромосомы и NC_016855,1 для плазмиды) по Bowtie2 (v2.3.3.1) с параметрами по умолчанию23. MACS2 (v2.1.2) был использован для вызова пиков с параметрами '-q 0.01 - nomodel', принимая биопленки репликации как наборы тестирования данных и планктонных, как контроль24. Модуль MACS2 bdgcmp был дополнительно использован для создания фолк-обогащения трек с параметрами '-m FE'. Значительный пик файл ат-обогатительство трек был преобразован в парик файл с помощью bedtools /bedClip/bedGraphToBigWig25 и визуализированы на эталонный геном с помощью интегративной геномики Viewer v2.5.126. Показаны репрезентативные пики (красные полосы). (B) Большой регион в 40 кбит/с, который содержит несколько пиков, является нетипичным результатом, но все еще потенциально ценным. (C) Это более типичный результат, показывающий два значительных пиковых регионов. (D) Увеличить на левой пике в C, показывая читает отображение в регионе S. Typhimurium 14028s геном, содержащий различные промоутеры для uspA и uspB. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Буферы излза |
| Лисис буфер |
| 50 мМ Tris-HCl рН 8.1 |
| 10 мМ EDTA |
| 1% SDS |
| ингибиторы протеазы |
| Буфер разбавления IP |
| 20 мМ Tris-HCl рН 8.1 |
| 2 мм EDTA |
| 150 мМ NaCl |
| 1% Тритон X-100 |
| 0,01% SDS |
| Буферы иммунопреционного иммунитета |
| IP мыть буфер 1 |
| 20 мМ Tris-HCl рН 8.1 |
| 2 мм EDTA |
| 50 мМ NaCl |
| 1% Тритон X-100 |
| 0,1% SDS |
| IP мыть буфер 2 |
| 10 мМ Tris-HCl рН 8.1 |
| 250 мМ LiCl |
| 1 мм EDTA |
| 1% NP-40 |
| 1% дезоксихолиевой кислоты |
| TE (T10E1) pH 8.0 |
| 10 мМ Трис-Хл |
| 1 мм EDTA |
| Буфер элуции |
| 1% SDS |
| 100 мМ NaHCO3 |
Таблица 1. Рецепты буфера.
Discussion
Этот протокол излагается метод для выполнения CHIP-seq с Salmonella enterica serovar Typhimurium биопленки и планктонных клеток из чистой культуры, чтобы найти нормативные цели мастер биопленки регулятора, CsgD. Мы ожидаем дифференциальной связывания информации из-за би-стабильности CsgD в двух типах клеток, с высоким уровнем в биопленки агрегатов и низких уровней в планктонных клетках2,3. Тем не менее, этот метод также может быть применен к другим бактериальным транскрипционным факторам, типам клеток или условиям роста. В частности, этот метод может быть адаптирован к другим бактериальным биопленкам с использованием экспериментально определяемого коэффициента преобразования Для CFU на единицу веса клеток биопленки.
ChIP-seq может быть подвержен усилению технической ошибки путем секвенирования; однако, подтверждение на критических шагах может предотвратить это27. Первичная специфичность антител важна для выбора только целевого фактора транскрипции и ДНК, который он контролирует во время иммунопреципиции7. В этом эксперименте, csgD был слит с плазмид-закодированной меткой 3xFLAG в конце 3' гена, что соответствует C-терминусу CsgD22. Плазмида p3xFLAG без ргСД использовалась в качестве "контроля"(S. Тифимурий 14028 ЗсгД и p3xFLAG). Руководящие принципы ENCODE рекомендуют выполнять иммуноблоты с первичным антителом против интересующего белка, а также лисаты штаммов CHIP и штаммов удаления21. Важно обеспечить, чтобы условия роста были последовательными по всем репликациям, чтобы уменьшить изменчивость связывания транскрипции фактора и результатов секвенирования вниз по течению. Если кто-то тщательно, чтобы обеспечить инокулум размеры и до инокулум условия роста являются последовательными, биопленки рост в колбе культуры соответствует4. Важно подтвердить, что все биопленки были разбиты после гомогенизации, чтобы обеспечить равный доступ реагентов, особенно формальдегида кросс-ссылка, для всех клеток.
Несколько изменений могут позволить исследователям использовать этот протокол для других ДНК-связывающих белков, типов клеток, штаммов, условий роста или лабораторного оборудования. Если он используется для биопленки формирования видов, кроме S. Typhimurium, коэффициент преобразования колонии формирования единиц на единицу веса биопленки должна быть определена экспериментально путем сбора различных количеств биопленки, гомогенизировать биопленку тщательно, и выполнение серийных разбавлений и подсчета пластин для создания стандартной кривой, которая не может быть точной при более низких весах биопленки2. Передача энергии соникиров и сопротивление типа клеток могут отличаться; Поэтому, sonication асссы рекомендуется, чтобы найти количество звуковых очередей, которые будут производить диапазон размеров фрагмента, необходимых для подготовки библиотеки вниз по течению и секвенирования11. Фрагментация хроматина микрококковой нуклеазой является альтернативой звуковому, который производит высокое разрешение мест размещения; однако, этот метод может ввести смещение фрагментации7,28. Диапазон размеров ДНК может быть изменен в зависимости от комплектов подготовки библиотеки и платформ секвенирования. Вместо смесителя можно использовать и другие методы гомогенизации. Например, гомогенизатор стеклянной ткани может быть заменен, но он может аэрозолизировать или неполно разрушить биопленку. С точки зрения контроля, предиммунопрецитифицирующая ДНК может быть нормализована в постсековой обработке и анализе. Макет-IP управления с видами соответствия нормальной сыворотки антитела могут быть использованы в качестве контроля, а13.
Исследователи должны учитывать ограничения этого метода при рассмотрении эксперимента ChIP-seq. Для его адаптации для других типов биопленки могут потребоваться значительные изменения. Например, с Salmonella Typhimurium немедленное повторное приостановление биопленки в PBS приводит к измеримой потере биопленки агрегатов. Иммунопрециция, нацеленная на регулятивные цели транскрипционных факторов бактерий, может привести к очень небольшому количеству ДНК, что является проблемой для очистки и обнаружения на более поздних этапах. Предвзятость может быть введена во время стрижки и вниз по течению манипуляции во время обнаружения библиотеки9. Кроме того, этот метод не показывает уровни экспрессии in vivo в ответ на связывание фактора транскрипции. Исследователи, которые имеют небольшой опыт в области биоинформатики могут быть оспорены анализа трубопровода. Этот метод может быть трудоемким и дорогостоящим; однако стоимость секвенирования зачастую ниже, чем микросхема, и со временем она уменьшается по мере дальнейшего совершенствования технологий.
Немногие методы в литературе описывают ЦИП с бактериями, и большинство бактериальных экспериментов начинаются с простого состояния роста13,14,15,17,18. Подготовка образца CHIP с одиночными клетками проста и представляет меньше проблем, чем подготовка образца CHIP с биопленками агрегатов. Что касается ChIP-seq, предыдущие методы изучения цис-регуляторных схем, в том числе систематическое развитие лигандов путем экспоненциального обогащения (SELEX), электрофоретические перебора подвижности (EMSA), ChIP-чип, удаление промоутера и анализ репортера были дополнены или заменены ChIP-seq29. ChIP-seq заменяет ChIP-чип за счет передовых технологий и доступности секвенирования. Глубокое секвенирование предоставляет исследователям огромные объемы данных, которые могут идентифицировать сайты с более низкой связывающей сродством и более высоким разрешением базовой пары с меньшим исходным материалом, чем ChIP-чип11,30. Анализ данных CHIP из организмов с высоким качеством эталонных геномов, как правило, быстрый и специфический. Кроме того, ChIP-seq является тщательным методом для обнаружения в силико предсказал связывания сайтов, которые не могут быть заняты во всех типах клеток, фазы роста, или экологических условий31.
В будущем этот протокол может быть использован для облегчения понимания бактериального патогенеза, особенно биопленкообразующих организмов. Широкое внедрение этого метода и наличие новых наборов данных может привести к интеграции данных для выявления групп белков, которые совместно локализуются для контроля клеточных процессов в биопленкообразующих микроорганизмах32. Кроме того, данные ChIP-seq и RNA-seq могут быть интегрированы для построения моделей систем ы регулирования33.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантом Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям (NSERC) (#2017-05737) АВ и через ярисловский кафедру в области биотехнологии. Депутат был поддержан NSERC-CREATE стипендию через комплексную программу обучения в области инфекционных заболеваний, безопасности пищевых продуктов и государственной политики (ITraP) в Университете Саскачевана.
Авторы хотели бы поблагодарить Дани Дейла за съемку и монтаж.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose powder | FroggaBio | A87-500G | |
| Balance (Explorer pro) | Ohaus | EP214 | |
| Benchtop Centrifuge (8510R) | Eppendorf | 022627023 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | G2939BA | |
| BR dsDNA kit | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads | Cell Signaling Technology | 9006 | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | COEDTAF-RO ROCHE | |
| Conical tube 15 mL | FroggaBio | TB15-500 | |
| Conical tube 50 mL | FroggaBio | TB50-500 | |
| DC Protein Assay Kit II | BioRad | 5000112 | |
| Disposable Cuvette, 1.5 mL | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
| Electrophoresis equipment (mini-PROTEAN) | Bio-Rad | 1658000 | |
| Floor centrifuge (Sorvall Evolution RC) | Thermo Scientific | 728211 | |
| Fluorometer (Qubit 3.0) | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| GelRed® Nucleic Acid Gel Stain 10 000x in water | Biotium | 41003 | |
| High Sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Incubator (shaking) | VWR | 1570-ZZMFG | |
| Incubator (Water bath shaking) | New Brunswick | G76D | |
| LB media | VWR | 90000-808 | |
| Magnetic stand (DynaMag) | Fisher Scientific | 12321D | |
| Microcentrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5415R | |
| Microcentrifuge Tubes, 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycle) | Illumina | MS-102-3001 | |
| Mixer mill | Retsch | MM400 | |
| Nalgene 115 mL Filter Units, Sterile, 0.2 µm pore size | Thermo Scientific | 73520-980 | |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7370S | |
| NGS Cleanup and Size Select magnetic beads | Machery-Nagel | 744970.5 | |
| Normal mouse serum | AbCam | ab188776 | |
| Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Pipette controller | FroggaBio | MP001 | |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | AM2542 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Rabbit Anti-FLAG Polyclonal Antibody | Sigma-Aldrich | F7425 | |
| RNase A (10 mg/mL; DNase and protease-free) | ThermoFisher Scientific | EN0531 | |
| Rotating wheel | Crystal Technologies & Industries | TR 01A | |
| Safe-Lock Tubes (2.0 mL, colorless) | Eppendorf | 22363344 | |
| Serological pipette 25 mL | FroggaBio | 94024 | |
| Spectrophotometer | Montreal Biotech Inc. | Libra S22 | |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | Qiagen | 69989 | |
| Tapered microtip 1/8" (3mm) Sonicator probe | Sonics & Materials, Inc. | 630-0418 | |
| Tryptone media | VWR | 90000-286 | |
| Ultrasonic Liquid Processor (Sonicator) | Sonics & Materials, Inc. | VC300 | |
| Vacuum equipment (Vacufuge plus) | Eppendorf | 022820001 | |
| Water bath 1 (Lab-line aquabath) | Thermo Scientific | 18000-1 | |
| Water bath 2 (Precision) | Thermo Scientific | 51221044 |
References
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections. Science. 284 (5418), 1318-1322 (1999).
- MacKenzie, K. D., et al. Bistable Expression of CsgD in Salmonella enterica Serovar Typhimurium Connects Virulence to Persistence. Infection and Immunity. 83 (6), 2312-2326 (2015).
- Grantcharova, N., Peters, V., Monteiro, C., Zakikhany, K., Römling, U. Bistable expression of CsgD in biofilm development of Salmonella enterica serovar typhimurium. Journal of Bacteriology. 192 (2), 456-466 (2010).
- MacKenzie, K. D., Palmer, M. B., Köster, W. L., White, A. P. Examining the Link between Biofilm Formation and the Ability of Pathogenic Salmonella Strains to Colonize Multiple Host Species. Frontiers in Veterinary Science. 4, 307 (2017).
- Steenackers, H., Hermans, K., Vanderleyden, J. Salmonella biofilms: an overview on occurrence, structure, regulation and eradication. Food Research International. 45 (2), 502-531 (2012).
- Brombacher, E., Dorel, C., Zehnder, A. J. B., Landini, P. The curli biosynthesis regulator CsgD co-ordinates the expression of both positive and negative determinants for biofilm formation in Escherichia coli. Microbiology. 149, Pt 10 2847-2857 (2003).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).
- Wu, D. -Y., Bittencourt, D., Stallcup, M. R., Siegmund, K. D. Identifying differential transcription factor binding in ChIP-seq. Frontiers in Genetics. 6, 169 (2015).
- Valouev, A., et al. Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChIP-Seq data. Nature Methods. 5 (9), 829-834 (2008).
- Lieb, J. D. Genome-wide mapping of protein-DNA interactions by chromatin immunoprecipitation and DNA microarray hybridization. Methods in Molecular Biology. 224, Clifton, N.J. 99-109 (2003).
- Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).
- Kim, T. H., et al. A high-resolution map of active promoters in the human genome. Nature. 436 (7052), 876-880 (2005).
- Dillon, S. C., et al. Genome-wide analysis of the H-NS and Sfh regulatory networks in Salmonella Typhimurium identifies a plasmid-encoded transcription silencing mechanism. Molecular Microbiology. 76 (5), 1250-1265 (2010).
- Perkins, T. T., et al. ChIP-seq and transcriptome analysis of the OmpR regulon of Salmonella enterica serovars Typhi and Typhimurium reveals accessory genes implicated in host colonization. Molecular Microbiology. 87 (3), 526-538 (2013).
- Gu, D., Liu, H., Yang, Z., Zhang, Y., Wang, Q. Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Technology Reveals Global Regulatory Roles of Low-Cell-Density Quorum-Sensing Regulator AphA in the Pathogen Vibrio alginolyticus. Journal of Bacteriology. 198 (21), 2985-2999 (2016).
- Peano, C., et al. Characterization of the Escherichia coli σ(S) core regulon by Chromatin Immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq) analysis. Scientific Reports. 5 (1), 10469 (2015).
- Blasco, B., et al. Virulence regulator EspR of Mycobacterium tuberculosis is a nucleoid-associated protein. PLoS Pathogens. 8 (3), 1002621 (2012).
- Jones, C. J., et al. ChIP-Seq and RNA-Seq reveal an AmrZ-mediated mechanism for cyclic di-GMP synthesis and biofilm development by Pseudomonas aeruginosa. PLoS pathogens. 10 (3), 1003984 (2014).
- Sengupta, M., Jain, V., Wilkinson, B. J., Jayaswal, R. K. Chromatin immunoprecipitation identifies genes under direct VraSR regulation in Staphylococcus aureus. Canadian Journal of Microbiology. 58 (6), 703-708 (2012).
- Gill, A. Cross-linking chromatin immunoprecipitation (X-ChIP) protocol. , Available from: https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/x_CHip_protocol.pdf (2017).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).
- MacKenzie, K. D., et al. Parallel evolution leading to impaired biofilm formation in invasive Salmonella strains. PLoS Genetics. 15 (6), 1008233 (2019).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9 (9), 137-139 (2008).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Thorvaldsdóttir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).
- Schoppee Bortz, P. D., Wamhoff, B. R. Chromatin immunoprecipitation (ChIP): revisiting the efficacy of sample preparation, sonication, quantification of sheared DNA, and analysis via PCR. PloS One. 6 (10), 26015 (2011).
- Tolstorukov, M. Y., Kharchenko, P. V., Goldman, J. A., Kingston, R. E., Park, P. J. Comparative analysis of H2A.Z nucleosome organization in the human and yeast genomes. Genome Research. 19 (6), 967-977 (2009).
- Geertz, M., Maerkl, S. J. Experimental strategies for studying transcription factor-DNA binding specificities. Briefings in Functional Genomics. 9 (5-6), 362-373 (2010).
- Mardis, E. R. ChIP-seq: welcome to the new frontier. Nature Methods. 4 (8), 613-614 (2007).
- Lee, T. I., et al. Transcriptional regulatory networks in Saccharomyces cerevisiae. Science. 298 (5594), 799-804 (2002).
- Wade, J. T., Struhl, K., Busby, S. J. W., Grainger, D. C. Genomic analysis of protein-DNA interactions in bacteria: insights into transcription and chromosome organization. Molecular Microbiology. 65 (1), 21-26 (2007).
- Myers, K. S., Park, D. M., Beauchene, N. A., Kiley, P. J. Defining bacterial regulons using ChIP-seq. Methods (San Diego, Calif). 86, 80-88 (2015).
