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Biochemistry

通过组合单域抗体库的分步噬菌体选择创建高度特异性化学诱导蛋白分解系统

Published: January 14, 2020 doi: 10.3791/60738
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Institute for Protein Design, University of Washington
* These authors contributed equally

Summary

对于任何给定的小分子配体，创建具有所需亲和力和特异性的化学诱导蛋白二聚系统将具有许多生物传感和驱动应用。在这里，我们描述了一种有效的、可通用的方法，通过逐步选择噬菌体显示的组合单域抗体库来对化学诱导的二聚系统进行新工程。

Abstract

仅在小分子配体存在的情况下发生的蛋白质二聚化事件使小分子生物传感器得以发展，用于解剖和操作生物途径。目前，只有有限数量的化学诱导的二聚体（CID）系统存在，并设计具有特定小分子配体的所需灵敏度和选择性的新系统仍然是蛋白质工程领域的一个挑战。我们在这里描述了一种高通量筛选方法，即一种适用于各种配体的CID系统的"新设计"，即CID（联合体）的选配型。此方法使用噬菌体显示的组合 nanobody 库的两步选择来获得 1） "锚活页夹"，首先绑定到感兴趣的配体，然后 2） 仅绑定到锚结物-配体复合物的"二聚体粘结剂"。为了选择锚固粘合剂，使用生物素化配体筛选出超过109个互补性决定区域（CDR）随机纳米体的组合库，并通过生物层干涉法（BLI）对未标记的配体进行验证。为了获得二分化活页夹，nanobody 库筛选了锚活页夹-配体复合物，作为正筛选的目标，未绑定的锚活页夹用于负筛选。ORS-CID广泛适用于选择具有其他免疫球蛋白、非免疫球蛋白或计算设计的支架的CID粘合剂，以创建用于体外和体内检测药物、代谢物、信号分子等的生物传感器。

Introduction

CID系统，其中两种蛋白质仅在小分子配体存在的情况下进行分化（图1），为解剖和操纵代谢、信号和其他生物途径1提供了多功能的工具。他们已经证明了在生物驱动方面的潜力，如药物控制的T细胞活化2和凋亡3，4，以提高采用T细胞治疗的安全性和有效性。此外，它们为体内或体外小分子靶点检测提供了新方法。例如，CID 蛋白可与荧光报告系统（例如荧光共振能量转移 （FRET）5和循环渗透荧光蛋白6进行基因融合，用于实时体内测量，或用作三明治酶链接免疫吸附剂测定 （ELISA） 样的亲和力试剂。

尽管其应用广泛，但创建新的 CID 系统（可通过给定的小分子配体控制）面临重大挑战。已建立的蛋白质粘合剂工程方法包括动物免疫7、体外选择8、9和计算蛋白设计10，可以产生通过二元蛋白-配体相互作用起作用的配体结合蛋白。然而，这些方法很难创建配体引起的三元CID复合物。有些方法通过化学连接两个独立结合相同或不同蛋白质11、12、13、14、15、16的配体而创建CID，或者依靠选择粘合剂蛋白，如针对预先存在的小分子蛋白复合物17、18的抗体，因此配体选择有限。

我们最近开发了一种用于CID系统19的"新工程"的CID（联合体-CID）方法。 该方法可以获得配体诱导的二分化的高特异性（例如，锚点-二聚体解散常数，KD（不含配体）/KD（配体）>1，000）。二聚化特异性是使用具有柔性结合位点的锚点，可在配体结合时引入构象变化，为仅识别配体结合锚活页夹的构象选择性活页夹的选择提供基础。通过创建纳米体大麻二醇（CBD）诱导异体体，从camelid中形成12-15 kDa功能抗体片段，包括一个通用支架和三个灵活的CDR回路（图2）20，从而形成一个可适应小分子表位21、22的结合口袋，从而证明了一种原理证明。值得注意的是，组合蛋白库的体外选择对于CID工程来说应该是经济高效和可通用的，因为相同的高质量库可以应用于不同的配体。

在本协议和视频中，我们重点描述了锚（图3A）和二聚体粘合剂（图3B）的两步体外选择和验证，通过筛选多样性大于109的组合nanobody库，以CBD为目标，但该协议应适用于其他蛋白质库或小分子靶点。CID活页夹的筛选通常需要6~10周（图4）。

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Protocol

1. 图书馆建设

  1. 使用合成组合单域抗体库，其多样性为±1.23~7.14 x 109，如前所述19。虽然此协议不包括库构造，但可以应用于其他组合绑定器库。

2. 配体靶或配体的生物异化

  1. 生物素化选定的配体，例如，CBD和四氢大麻酚（THC）19，通过各种化学合成策略，取决于目标的适当生物素化位点。

3. 锚活页夹筛选

  1. 选择开始
    1. 开始每一轮选择，接种单个TG1细胞菌落，在37°C下在6mL的2YT中新鲜生长，每分钟250转（rpm），达到600nm（OD600）的吸收度±0.5。在步骤 3.5.1 中孵育冰上的细胞以使用。
  2. 带生物锡结合的链球菌珠的阴性选择
    1. 使用磁分离机架清洗 300 μL 的链霉素涂层磁珠，使用 Tween 缓冲液（PBST，1 x PBS，带 0.05% vol/vol Tween 20%）使用 0.05% 磷酸盐缓冲盐水 3 倍，准备"负选择珠"和 2x 与 1 x PBS。
    2. 在 1 x PBS （pH = 7.4） 中重新悬浮 1 mL 1% 案例素的珠子，并使用生物素添加 5 倍报告的结合容量，使珠子饱和。在室温 （RT） 下在旋转器上孵育 1 小时。
    3. 使用 0.05% PBST 清洗珠子 5 倍，使用 1 x PBS 清洗 3 倍，共洗 8次。
    4. 在 1% 的卷宗/1% BSA 中加入 +1013噬菌体颗粒，在 1 x PBS 中（pH = 7.4），并在 RT 的旋转器上孵育 1 小时。
    5. 孵育后，收集步骤3.3.6中使用的上清液。
  3. 生物亲化配体结扎链球菌珠的正选择
    1. 按照步骤 3.2.1，使用 1/2 用于"负选择珠"的磁珠体积准备"正选择珠"。
    2. 在 1 = PBS 中重新悬浮 1 mL 1% 大小成素的珠子，pH 7.4，并通过添加 5 倍基于手册计算的完整结合容量（使用所选择的生物素化配体）使珠子饱和。在 RT 的旋转器上孵育 1 小时。
    3. 使用 0.05% PBST 清洗珠子 5 倍，使用 1 x PBS 清洗 3 倍，共洗 8次。
    4. 在 1 x PBS（pH = 7.4）中用 1 mL 的 1% casein/1% BSA 块珠，并在 RT 的旋转器上孵育 1 小时，以防止噬菌体与链球菌涂层磁珠之间非特异性结合。
    5. 使用 0.05% PBST 清洗链球菌涂层磁珠 3x，使用 1 x PBS 一次，共洗 4 次。
    6. 使用步骤 3.2.5 中未结合的噬菌体重新悬浮链球蛋白涂层磁珠，并在 RT 的旋转器上孵育 1 小时。
    7. 提取上清液，而不会干扰磁珠。保存未绑定噬菌体作为输入，用于步骤 3.5.1。
    8. 使用 0.05% PBST 清洗珠子 10 倍，使用 1 x PBS 清洗 5 倍。在三次处理之间，将它们转移到一个新的管子，以避免噬菌体非具体绑定到管壁。
  4. 噬菌体显示纳米体的洗脱
    1. 通过添加450 μL的非生物素化配体，使用微摩尔范围内的浓度（例如，10~50 μM），并在RT在旋转器上孵育30分钟，从而具有竞争力的电镀结合性噬菌体。为界界噬菌体的竞争洗脱而选择的配体浓度取决于"锚活页夹"所需的KD。 在初始选择轮中，配体浓度可能相对较高，然后在后几轮中降低。
    2. 收集上清液并保存洗脱的噬菌体作为输出，用于步骤 3.5.2。
  5. 输入/输出起点炎和感染
    1. 对于输入滴定，在 1 x PBS 中准备 10 倍串行稀释，使用步骤 3.3.7 中的输入噬菌体进行 109倍的稀释。使用 107+109次连续稀释，通过将 10 μL 输入噬菌体从每个稀释转移到 70 μL TG1 细胞（OD600的 ±0.5），进行感染。在37°C孵育45分钟，在含有100微克/mL阿霉素和2%（wt/vol）葡萄糖的三个90mm 2YT-琼脂菜肴上将受感染的TG1细胞进行板，并在37°C下孵育过夜。从隔夜板，噬菌体输入可以计算如下：
      Equation 1
    2. 对于输出感染和滴定，将洗脱的噬菌体从 TG1 细胞的步骤 3.4.2 转移到 3 mL（OD600的 ±0.5）。在37°C的水浴中孵育45分钟。然后准备10倍连续稀释在2YT高达103倍，板每个稀释在90毫米2YT-琼脂菜，并在37°C孵育过夜。从隔夜板中，噬菌体输出可以计算如下：
      Equation 1
    3. 在三个 150 mm 2YT-琼脂板上将剩余的受感染 TG1 细胞除以，这些板含有 100 μg/mL 阿霉素和 2%（wt/vol） 葡萄糖。在37°C下孵育板过夜。
  6. 库放大和恢复，用于进一步选择
    1. 每盘加入3 mL 2YT，用无菌细胞刮刀刮擦，并将所有细胞收集到50 mL锥形管中。将收集的细胞与无菌甘油（20% wt/vol 最终浓度）混合。测量混合物的 OD600，并制作 3⁄5 库存等分。储存在-80°C，用于长期储存。
    2. 对于噬菌体抢救，使用 25 mL 的 2YT 介质稀释含噬菌体 TG1 的细菌混合物，辅以 2% 葡萄糖和 100 μg/mL 阿霉素，以 OD600的 ±0.1。在 37°C 和 250 rpm 下培养细胞，到 OD600的 ±0.5。
    3. 在5 x 109 pfu/mL处加入CM13助噬细胞，在37°C和250rpm下孵育45分钟，从而对细胞进行超感染。CM13 帮助器噬菌体提供组装完整噬菌体颗粒所需的噬菌体涂层蛋白质。
    4. 在 8，000 x g下将培养层离心 10 分钟，以去除葡萄糖。使用50 mL的2YT介质，辅以100微克/mL阿霉素和50μg/mL卡那霉素，在25°C和250rpm过夜孵育细胞。
    5. 用1/5体积PEG/NaCl溶液（20%wt/vol聚乙烯乙二醇-6，000和2.5 M NaCl）将上清液转移到新管中，并在上清液中沉淀噬菌体。 轻轻混合，放在冰上1小时。
    6. 在4°C下使用12，000 x g收集噬菌体颗粒30分钟。使用1 mL 1 x PBS重新悬浮颗粒，并将悬浮液转移到微离心管中。在 20，000 x g和 4 °C 下离心管 10 分钟，以去除残留细菌。
    7. 将上清液转移到新的微离心管中，而不会干扰细菌颗粒。使用 1：100 稀释测量 269 nm 和 320 nm 的吸收。噬菌体总数可以使用以下公式23计算：
      Equation 3
    8. 将噬菌体库储存在4°C，用于短期使用，或在-80°C下储存25%甘油，用于长期储存。
    9. 重复三轮选择（步骤 3.1–3.6），进行 3-6 轮或直到观察到所需的浓缩（请参阅结果部分）。盘面和挑选单克隆（第 4 节），以表征其与配体的亲和力和特异性（第 5-7 节）。

4. 单克隆隔离

  1. 要从丰富的子库分离出单个克隆，请准备10倍受噬菌体感染的TG1细胞的连续稀释（步骤3.5.2）。在含有100μg/mL阿霉素和2%（wt/vol）葡萄糖的90 mm 2YT-琼脂菜肴上进行板式连续稀释，并在37°C下孵育过夜。
  2. 从隔夜板中，将单个菌落挑入250 μL的2YT介质中，并在无菌深井板中每孔补充100μg/mL安培林，并在37°C生长过夜。
  3. 从隔夜培养物中，接种10μL至500μL的新鲜2YT介质，辅以100μg/mL安西林。
  4. 将细胞生长到 OD600的 ±0.5，在 5 x 109 pfu/mL 处添加 CM13 助食器噬菌体，并在 37°C 和 250 rpm 下孵育 45 分钟。
  5. 加入500 μL的2YT介质，辅以100微克/mL阿霉素和50μg/mL卡那霉素。在 25°C 和 250 rpm 的转速下孵育过夜。
  6. 在3000 x g的过夜培养物中离心深孔板10分钟。收集含有噬菌体颗粒的上清液，而不会干扰细胞颗粒。
  7. 噬菌体粒子可用于 ELISA 来确定所选克隆对配体的特异性。生物锡或目标的结构同源可用作负对照。

5. ELISA 的锚点活页夹验证

  1. 在涂层缓冲液（100 mM 碳酸盐缓冲液，pH = 8.6）中，在4°C过夜时，使用100 μL的5微克/mL链球菌素涂覆96孔ELISA板。
  2. 使用 0.05% PBST 清洗 ELISA 板 3x，并将 1 μM 生物素探酯靶100 μL添加到目标孔中。在控制井中添加 100 μL 的 1 μM 生物锡或目标同源。在 RT 孵育 1 小时。
  3. 使用 0.05% PBST 洗涤板 5 倍，通过在 1 x PBS 中加入 300 μL 的 1% 盒素来阻止非特异性结合。在 RT 孵育 1 小时。
  4. 使用 0.05%-PBST 清洗 ELISA 板 3x 并加入纯化噬菌体上清液。在 RT 孵育 1 小时。
  5. 使用 0.05% PBST 清洗 ELISA 板 10 倍，并加入 100 μ0 μL 马萝卜过氧化物酶 （HRP）-M13 主要涂层蛋白抗体（1：10，000 稀释 1 x PBS 和 1% 苯甲酰辛）。在 RT 孵育 1 小时。
  6. 使用 0.05% PBST 清洗 ELISA 板 3 倍，并加入 100 μL 四甲基苯甲酸酯 （TMB） 基板。孵育10分钟或直到观察到可见的颜色变化。在分光光度计上加入100 μL的1M HCl，在450nm处读取板，停止反应。
  7. 对于蛋白质表达和纯化，选择对靶子具有高亲和力和特异性的克隆（参见讨论）。

6. 蛋白质表达、纯化和生物异化

  1. 正如先前19日报道的，子克隆从第5节选择克隆，并表达为C端Avi标记和His标记纳米体。
  2. 在大肠杆菌WK6细胞的围质中快速表达选定的纳米体（通常在1L培养物中），通过渗透冲击释放，并使用镍-NTA柱进行纯化（见材料表）。
  3. 用脱盐柱交换缓冲液（1 x PBS，含5%甘油;见材料表）。
  4. 使用商业试剂盒（见材料表）进行生物异位化纳米体的进一步使用。

7. 锚活页夹特性由 BLI

  1. 通过固定链球菌素生物传感器上的 200 nM 生物浸渍锚活结于链球菌活化活化活化活化活合物（参见材料表），使用结合测定缓冲液（1 x PBS （pH = 7.4）、0.05% 补间 20、0.2% BSA、3% 甲醇）分析所选锚活结合和动力学。
  2. 使用数据分析软件通过稳态分析计算锚固活着结体-配体相互作用的解结常数（KD） （参见材料表）。获得的KD值通常范围从个位数到两位数的微摩尔。

8. 二分化粘合剂筛选

注："二聚化粘合剂"的生物盘化筛选与锚固活页夹的筛选相似，但两个关键步骤除外：1） 使用选定的生物回氧化锚活化活化粘合剂和锚固粘结复合物为负极选择二聚化粘结剂和正选择。2） 在洗脱步骤中，100 mM 三乙胺用于洗出仅绑定到锚活结物 -配体目标复合物的正选噬菌体。100 mM 三甲基胺溶液 （pH = 11.5） 用于通过破坏蛋白质相互作用来洗脱阳性克隆。

  1. 选择开始
    1. 开始每一轮选择，在 6 mL 2YT 下，在 37°C 和 250 rpm 下接种单个 TG1 细胞群，在最小介质上新鲜生长，在 OD600 ±0.5。在冰上孵育细胞。
  2. 去除负选纳米体
    1. 使用 400 μL 的链球菌涂层磁珠准备"减法管"，并按照步骤 3.2 进行操作。然而，使用选定的生物素化锚活页夹，添加5倍计算的完全结合能力，并保存步骤8.3.3中使用的未结合噬菌体，而不是与生物素饱和。
  3. 选择正选纳米体
    1. 使用 1/2 用于"减法管"的链球菌涂层磁珠体积，并按照步骤 3.3.2 到 3.3.3 准备"捕获管"。然而，而不是饱和与生物酸化配体，添加五倍计算完全结合能力使用选定的生物仿当锚活页夹。
    2. 要形成正二聚体配体选择的锚点粘结剂复合物，添加足够高浓度的非生物性配体。这将允许大多数链球蛋白绑定锚活页夹形成配体绑定复合体。
    3. 使用从"减法管"中取的未绑定噬菌体，按照步骤 3.3.3 到 3.3.8 进行操作。
  4. 正选纳米体的洗脱
    1. 通过加入450 μL的100 mM三乙胺，并在RT在旋转器上孵育10分钟，使粘结到锚活粘结物-配体复合物的噬菌体。
    2. 收集具有竞争力的洗脱噬菌体，并按照步骤 3.4.1 到 3.4.2 操作。
  5. 进一步多发化粘结剂选择
    1. 按照步骤 3.5 和 3.6 放大和恢复库，以便执行进一步的选择。重复3~6轮选择，或直到观察到所需的浓缩。盘和选取单个克隆（参见第 4 节），以描述其与目标的亲和力和特异性。

9. ELISA 的二分化粘结剂特性

  1. 按照第 4 节中的步骤分离单个克隆，以便通过 ELISA 进行表征。
  2. 为了测试二聚化活化活化候选物与锚活化粘结物复合物的亲和力，请使用 100 μL 的 100 nM 生物位化锚活化活化活化活化活化活化活化活化活化活化活化活化活化活化剂涂覆 ELISA 目标板。孵育1小时后，加入1μM的配体靶，形成锚固粘合剂-配体复合物。
  3. 控制板应单独使用生物仿当锚活页夹进行涂层，以筛选出也可以绑定到自由锚活页夹的克隆。加入100 μL的100 nM生物浸化锚活化活化活化活化活化剂，并在RT下孵育1小时。
  4. 按照第 5.3_5.7 节操作。

10. BLI 的二分化粘结剂特性

  1. 锚活化粘结剂的粘结亲和力和动力学可以通过在带结合测定缓冲液的链球蛋白（SA）生物传感器上固定生物浸化二聚体粘结剂，然后用1μM锚活页夹预平衡配体进行测定。可以使用我们报告的方法19计算交互的KD、k和k。

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Representative Results

我们以CBD为目标筛选多样性大于109的组合nanobody库，描述了锚点和二聚体活化活页夹的两步体选择和验证。在锚点和二聚体粘结剂的连续几轮选择中评估噬菌体生物盘的富集性非常重要。如图5所示，经过 4-6 轮选择后的典型扩充结果很好地表明子库中的潜在命中比率很高，因此可能不需要进一步选择。

单克隆ELISA适用于分析锚点和二聚化活页夹的相对结合亲和力和选择性。图 6A是经过六轮生物平移后具有代表性的锚活页夹选择结果。可以比较高（例如，#87）或低（例如#27）配体选择性的克隆。应选择高选择性克隆作为锚点活页夹候选项。同样，图 6B显示了四轮生物泛化后的二分化粘合剂选择结果。我们通常观察到，仅与配体（例如，#49）或没有（例如#80）一起与固定锚粘结器形成异体体的克隆体。应选择前者，显示二分位化特异性，以便进一步验证。

锚活页夹 ELISA 依赖于生物仿当靶的使用。因此，我们需要使用 BLI 进一步确认对未标记目标的约束。BLI 还允许对结合动力学进行表征。锚点和二聚化活页夹的代表性BLI结果分别如图7A和7B所示。 左面板显示配体浓度相关结合，表明它们适用于构建 CID 系统。右侧面板显示负控件。在配体存在的情况下，计算的锚点和二聚体粘结剂相互作用的KD通常从两位数的纳米摩尔到两位数的微摩尔。它们可能因配体和组合库而异。

执行分析尺寸排除色谱法（SEC），以确认锚点和二聚体粘结剂之间的异质体形成。当锚点和二聚份粘结剂与CBD混合时，观察到一个二分化峰（图8A，红线）。相比之下，在没有CBD（图8A，蓝线）或当每个活页夹单独加载到列时（图8B）未检测到二分化峰值。化学交联用于稳定CID复合物，交叉链接的纳米体与早期洗脱峰的尺寸相对应略有增加。

Figure 1
图1：化学诱导蛋白二聚机制。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2：合成nanobody组合库的生成原理图。该库是通过使用通用的nanobody脚手架，并结合设计分布的氨基酸到三个互补性决定区域（CDR）的三个随机位置，通过三氧化二代Muta成因（TRIM）技术24。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3：（A）锚点和（B）二聚化活化活化筛分的流程图。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图 4：联合体-CID 的时间轴。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图5：每轮生物盘化后，对锚点粘合剂的选择进行噬菌体定量的浓缩。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 6
图6：代表ELISA结果显示正（+）和负（*）克隆。（A） 锚活页夹 ELISA 在六轮选择后从 96 个随机选择的克隆中产生。（B） 经过四轮选择，96个随机挑选的克隆的二分化活页夹ELISA结果。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 7
图7：由BLI进行的锚点和二聚化粘结剂动力学分析。（A） 分析未标记 CBD（左）和 THC（右）的锚活页夹。生物浸渍锚活页夹固定在超级链球菌（SSA）生物传感器上，其度分在CBD的不同浓度上。CBD 绑定（红色曲线）的测量数据已全局拟合（灰色线）。（B） 左图，对与锚活结合剂结合的SA生物传感器固定二聚体粘结剂的BLI分析，预平衡了不同浓度的CBD。右，锚活页夹浓度在无CBD的情况下被定子，并绑定到固定的二分粘结剂。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 8
图8：SEC对锚点和二聚体活化活化之间的异化分析。（A） 在存在或不存在CBD的情况下，二聚化和锚活页夹（每个5μM）在分析前在RT被100μM之比-N-二聚糖-乙二醇（五氯乙二醇）酯交联30分钟。蛋白质标准的洗脱量用三角形标记。（B） 非交联锚点和二聚化活页夹（各30 μM）分别注射。A 和 B 中的色谱图以不同的 Y 比例显示。请点击此处查看此图的较大版本。

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Discussion

为不同轮的生物泛性选择正确浓度的输入噬菌体库至关重要。我们通常从 #1012#1013噬菌体颗粒的输入库开始，其多样性 >109，允许在下拉测定中呈现每个噬菌体克隆的 100~1，000 份拷贝。如果结合测定中的噬菌体浓度过高或过低，则非特异性结合或阳性克隆损失的可能性将增加。锚点或二聚体粘结剂选择通常包括三到六轮生物盘化，输出噬菌体计数通常从 +104开始，并增加到 +108+109。在观察这种扩充后，选择单个克隆进行 ELISA 验证是合适的。额外的生物泛性可能会降低找到合适的低丰度阳性克隆的机会。

设置适当的负控件和选择以提高选择的成功非常重要。例如，使用配体目标的结构模拟将有助于选择配体特异性。在我们的工作中，一个高度相似的模拟，THC，被用作在ELISA和BLI验证锚点和二聚物活页夹19的CBD的控制。在二聚体活页夹选择中，如果锚点活页夹具有相对较低的配体结合亲和力，则自由固结和配体绑定活锚活页夹都可以作为正选择的目标呈现。因此，在负选择期间彻底移除绑定到游用锚活页夹的活页夹非常重要。这可以通过使用自由锚固活页夹执行多轮减法来实现。

我们协议的一个限制是，目标分子需要生物适应化，用于锚固活页夹的选择，并且只能使用一个或几个锚活页夹进行二分化选择。使用生物酸酯靶点可以丰富活页夹，部分地与生物锡和目标之间的链接结合。因此，使用 BLI 或其他技术使用未标记的目标验证命中非常重要。为二聚物活化活页夹选择选择单个或几个锚固活页夹可降低识别具有适当灵敏度和特异性的 CID 系统的机会。因此，选择的多路复用能力有待于与其他技术的耦合进一步提高，例如，单分子交互测序（SMI-Seq），它实现了"逐库库"蛋白质-蛋白质相互作用筛选25。

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Disclosures

华盛顿大学已经申请了与这项工作有关的临时专利。

Acknowledgments

这项工作得到了华盛顿大学创新奖（L.G.）的资助，美国国家卫生研究院（1R35GM128918到L.G.）的资助，以及华盛顿大学（L.G.）的启动基金。H.J.得到了华盛顿研究基金会本科生奖学金的支持。K.W.得到了华盛顿大学蛋白质设计研究所的本科奖学金的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Step Ultra TMB ELISA substrate solution Thermo Fisher Scientific 34029
Agar Thermo Fisher Scientific BP1423-2
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit (3 kDa cutoff) Millipore UFC900324
Ampicillin Thermo Fisher Scientific BP1760-25
Bio-Rad Protein Assay Kit II Bio-Rad 5000002
BirA biotin-protein ligase standard reaction kit Avidity BirA500
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153-50G
Casein Sigma-Aldrich C7078-1KG
CM13 Helper phage Antibody Design Labs PH020L
D-(+)-Glucose monohydrate Alfa Aesar A11090
Dynabeads M-280 Streptavidin Thermo Fisher Scientific 11205D
DynaMag-2 Magnet Thermo Fisher Scientific 12321D
EDTA Thermo Fisher Scientific BP120-1
Fast DNA Ladder New England Biolabs N3238S
FastDigest BglI Thermo Fisher Scientific FD0074
Glycerol Thermo Fisher Scientific BP229-1
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg GE Healthcare 28989335
HiPrep 26/10 Desalting Column GE Healthcare 17508701
HisTrap-FF-1ml GE Healthcare 11000458
Imidazole Alfa Aesar 161-0718
IPTG Thermo Fisher Scientific 34060
Kanamycin Thermo Fisher Scientific BP906-5
M13 Major Coat Protein Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-53004
NaCl Sigma-Aldrich S3014-500G
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermo Fisher Scientific ND-2000
Nunc 96-Well Polypropylene DeepWell Storage Plates Thermo Fisher Scientific 260251
Nunc MaxiSorp Thermo Fisher Scientific 44-2404-21
Octet RED96 ForteBio N/A
pADL-23c Phagemid Vector Antibody Design Labs PD0111
PEG-6000 Sigma-Aldrich 81260-1KG
Platinum SuperFi DNA Polymerase Invitrogen 12351010
PureLink PCR Purification Kit Thermo Fisher Scientific K310001
QIAprep Spin M13 Kit Qiagen 27704
Recovery Medium Lucigen 80026-1
SpectraMax Plus 384 Molecular Devices N/A
Sucrose Sigma-Aldrich S0389-1KG
Super Streptavidin (SSA) Biosensors ForteBio 18-5057
Superdex 75 increase 10/300 GL Column GE Healthcare 28-9909-44
T4 DNA Ligase Thermo Fisher Scientific 15224-025
TG1 Electrocompetent Cells Lucigen 60502-1
Triethylamine Sigma-Aldrich 471283-100mL
Trizma Base Sigma-Aldrich T1503
Tryptone Thermo Fisher Scientific BP9726-5
Tween 20 Thermo Fisher Scientific BP337-500
Yeast Extract Thermo Fisher Scientific BP1422-2
Zeba Spin Desalting Column Thermo Fisher Scientific 89882

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References

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生物化学， 问题 155， 化学诱导的二聚体， 组合抗体库， nanobody， 大麻二醇， 噬菌体显示， 酶链接免疫吸附剂测定
通过组合单域抗体库的分步噬菌体选择创建高度特异性化学诱导蛋白分解系统
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Gomez-Castillo, L., Watanabe, K., Jiang, H., Kang, S., Gu, L. Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library. J. Vis. Exp. (155), e60738, doi:10.3791/60738 (2020).

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