Summary
任意の与えられた低分子リガンドに対して所望の親和性および特異性を有する化学的に誘導されたタンパク質二量体化システムを作成することは、多くの生物学的センシングおよび作動アプリケーションを有するであろう。ここでは、ファージディスプレイコンビナトリアル単一ドメイン抗体ライブラリーの段階的選択を介した化学的に誘導された二量体化システムのde novoエンジニアリングのための効率的で一般化可能な方法について説明する。
Abstract
低分子リガンドの存在下でのみ発生するタンパク質二量体化イベントは、生物学的経路の解剖および操作のための低分子バイオセンサの開発を可能にする。現在、化学的に誘導された二量体化(CID)システムは限られており、特定の低分子リガンドに対して所望の感度と選択性を有する新しいシステムをエンジニアリングすることが、タンパク質工学の分野では依然として課題となっています。ここでは、多種多様なリガンドに適用可能なCIDシステムのデノボエンジニアリングに対する、CID(COMBINES-CID)の高スループットスクリーニング方法について説明します。この方法は、ファージディスプレイされたコンビナトリアルnanobodyライブラリの2段階選択を使用して、最初に目的のリガンドに結合する1)「アンカーバインダー」を取得し、次に2)アンカーバインダー-リガンド複合体にのみ結合する「二量体化バインダー」を得る。アンカーバインダーを選択するには、109以上の相補性決定領域(CDR)ランダム化ナノボディのコンビナトリアルライブラリーをビオチン化リガンドでスクリーニングし、バイオ層干渉法(BLI)によって標識されていないリガンドでヒットを検証する。二量体化バインダーを得るために、nanobodyライブラリは、陽性スクリーニングの標的としてアンカーバインダー-リガンド複合体、および負のスクリーニングのための非結合アンカーバインダーでスクリーニングされる。COMBINES-CIDは、他の免疫グロブリン、非免疫グロブリン、または計算的に設計された足場を持つCID結合剤を選択して、薬物、代謝産物、シグナル伝達分子などのインビトロおよびインビボ検出用のバイオセンサーを作成するために広く適用可能です。
Introduction
CIDシステムは、2つのタンパク質が低分子リガンドの存在下でのみ二量体化する(図1)、代謝、シグナル伝達、および他の生物学的経路1を解剖および操作するための多目的なツールを提供する。彼らは、養子T細胞療法の安全性および有効性を改善するための薬物制御T細胞活性化2およびアポトーシス3、4などの生物学的作動における可能性を実証した。さらに、それらは生体内または低分子標的のインビトロ検出のための新しい方法論を提供する。例えば、CIDタンパク質は、インビボ測定のために蛍光レポーター系(例えば、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)5および円形透過蛍光タンパク質)6と遺伝的に融合することができ、またはサンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)様アッセイのアフィニティー試薬として機能する。
幅広い用途にも関わらず、与えられた低分子リガンドで制御できる新しいCIDシステムの作成には大きな課題があります。動物免疫7、invitro選択8、9、および計算タンパク質設計10を含む確立されたタンパク質結合剤工学方法は、バイナリタンパク質リガンド相互作用を介して機能するリガンド結合タンパク質を生成することができる。しかしながら、これらの方法は、リガンド誘発三次CID複合体を作成するのが困難である。いくつかの方法は、同じまたは異なるタンパク質11、12、13、14、15、16に独立して結合する2つのリガンドを化学的に連結することによってCIDを作成するか、または既存の小分子タンパク質複合体17、18を標的とする抗体などの結合剤タンパク質の選択に依存し、したがってリガンドの選択が限られている。
我々は最近、CIDシステム19のデノボエンジニアリングのためのCID(COMBINES-CID)法の選挙をナビゲートするコムバイナリビンデルスを開発しました。この方法は、リガンド誘発二量体化の高い特異性(例えば、アンカー二量体化バインダー解離定数、KD(リガンドなし)/KD(リガンド付き)>1,000)を得ることができる。二量体化特異性は、リガンド結合時に立体構造変化を引き起こす可能性のある柔軟な結合部位を有するアンカーバインダーを使用して達成され、リガンド結合アンカーバインダーのみを認識する立体構造選択的結合剤の選択の基礎を提供する。ナノボディのカンナビジオール(CBD)誘導ヘテロダイマー、ユニバーサル足場と3つの柔軟なCDRループを含むラクダ由来の12〜15kDa機能性抗体断片(図2)20を作成することにより、原理証明を実証した。特に、同じ高品質ライブラリを異なるリガンドに適用できるため、コンビナトリアルタンパク質ライブラリのin vitro選択は、CIDエンジニアリングにとって費用対効果が高く、一般化可能である必要があります。
このプロトコルとビデオでは、CBDをターゲットとして109より高い多様性を持つコンビナトリアル・ナノーネライブラリーをスクリーニングすることにより、アンカー(図3A)と二量体化バインダー(図3B)の2段階のインビトロ選択と検証について説明することに焦点を当てていますが、プロトコルは他のタンパク質ライブラリまたは小分子ターゲットに適用可能である必要があります。CIDバインダーのスクリーニングには通常6~10週間かかります(図4)。
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Protocol
1. 図書館建設
- 前に説明したように、~1.23~7.14 x 109の多様性を有する合成コンビナトリアル単一ドメイン抗体ライブラリーを使用する。このプロトコルにはライブラリの構築は含まれていませんが、他の組み合わせバインダーライブラリに適用できます。
2. リガンド標的またはリガンドのビオチニル化
- 選択されたリガンドをビオチン化し、例えば、CBDおよびテトラヒドロカンナビノール(THC)19は、標的の適切なビオチニル化部位に応じて、種々の化学合成戦略を介して。
3. アンカーバインダースクリーニング
- 選択範囲の開始
- 単一のTG1細胞コロニーを接種し、37°Cで2YTの6 mLで新たに成長し、毎分250回転(rpm)で600 nm(OD600)の吸光度〜0.5に成長して、すべての選択を開始します。ステップ3.5.1で使用するために氷上の細胞をインキュベートする。
- ビオチン結合ストレプトアビジンビーズを用いた陰性選択
- 磁気分離ラックを使用してストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズを300μL洗浄して「ネガティブ選択ビーズ」を準備し、Tweenバッファーで0.05%リン酸緩衝生理食塩水を3x(PBST、1×PBS、0.05%vol/vol Tween 20%)1 x PBS で 2x を使用します。
- 1x PBS(pH=7.4)に1%カゼインの1mLでビーズを再懸濁し、ビオチンを用いて報告された結合容量を5倍添加してビーズを飽和させる。1時間ローテーターで室温(RT)でインキュベートします。
- 1 x PBSを使用して0.05%PBSTと3xを使用してビーズ5xを洗浄し、合計8回の洗浄を行います。
- 1xカゼイン/1%BSAに~1013ファージ粒子を1×PBS(pH =7.4)で添加し、1時間ローテータのRTでインキュベートします。
- インキュベーション後、ステップ3.3.6で使用する上清を収集する。
- ビオチン化リガンド結合ストレプトアビジンビーズを用いた陽性選択
- ステップ3.2.1に続く「ネガティブセレクションビーズ」に使用するビーズのボリュームを1/2で「ポジティブセレクションビーズ」を用意します。
- 1×PBSで1mL1%カゼインでビーズを再懸濁し、pH7.4と選択したビオチン化リガンドを用いて手動に基づいて算出された完全結合容量を5倍添加してビーズを飽和させる。1時間ローテーターでRTでインキュベートします。
- 1 x PBSを使用して0.05%PBSTと3xを使用してビーズ5xを洗浄し、合計8回の洗浄を行います。
- 1%カゼイン/1%BSAの1mLでビーズを1×PBS(pH = 7.4)でブロックし、ファージとストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズとの間の非特異的結合を防ぐために、1時間のローテーターでRTでインキュベートします。
- ストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズ3xを0.05%PBSTを使用し、1×PBSを使用して1回、合計4回の洗浄を行います。
- ステップ3.2.5から採取した非結合ファージを使用してストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズを再サスペンドし、1時間ローテーターでRTでインキュベートします。
- 磁気ビーズを邪魔することなく上清を抽出します。手順 3.5.1 で使用する非バインド ファージを入力として保存します。
- 1 x PBSを使用して、0.05%PBSTと5xを使用してビーズ10xを洗浄します。3つの間に、各ワッシュは、チューブの壁に非特異的に結合したファージを避けるために、新しいチューブにそれらを転送します。
- ファージ表示ナノボディの溶出
- 非ビオチン化リガンドの450μLを添加することにより、マイクロモル範囲(例えば、10〜50μM)の濃度を使用し、30分間ローテータ上のRTでインキュベートすることにより、競合的に結合したファージを溶出する。結合ファージの競合溶出のための選択されたリガンド濃度は、「アンカーバインダー」の所望のKDに依存する。リガンド濃度は、最初の選択ラウンドでは比較的高く、その後のラウンドで減少することができます。
- 上清を収集し、ステップ3.5.2で使用するために、出力として溶出ファージを保存します。
- 入出力滴定と感染
- 入力滴定の場合は、ステップ3.3.7の入力ファージを使用して、1 x PBSで10xシリアル希釈を109倍に準備します。107~109個のシリアル希釈を使用して、各希釈から 70 μL TG1 細胞 (~0.5 の OD600)に 10 μL 入力ファージを転送して感染を行います。37°Cで45分間インキュベートし、100μg/mLアンピシリンと2%(wt/vol)グルコースを含む3つの90mm 2YT寒天皿に感染したTG1細胞をプレートし、37°Cで一晩インキュベートします。一晩のプレートから、ファージ入力は次のように計算できます。
- 出力感染および滴定のために、TG1細胞のステップ3.4.2から3 mL(~0.5のOD600)に溶出したファージを移す。37°Cの水浴で45分間インキュベートする。次に、2YTで10倍のシリアル希釈を103倍まで準備し、90mm 2YT寒天料理に各希釈液をプレートし、37°Cで一晩インキュベートします。一晩のプレートから、ファージ出力は次のように計算できます。
- 残りの感染したTG1細胞を、100μg/mLアンピシリンと2%(wt/vol)グルコースを含む3つの150 mm 2YT-寒天プレートに分割します。37°Cで一晩プレートをインキュベートする。
- 入力滴定の場合は、ステップ3.3.7の入力ファージを使用して、1 x PBSで10xシリアル希釈を109倍に準備します。107~109個のシリアル希釈を使用して、各希釈から 70 μL TG1 細胞 (~0.5 の OD600)に 10 μL 入力ファージを転送して感染を行います。37°Cで45分間インキュベートし、100μg/mLアンピシリンと2%(wt/vol)グルコースを含む3つの90mm 2YT寒天皿に感染したTG1細胞をプレートし、37°Cで一晩インキュベートします。一晩のプレートから、ファージ入力は次のように計算できます。
- さらなる選択のラウンドのためのライブラリ増幅と回復
- プレートあたり2YTの3 mLを追加し、滅菌セルスクレーパーで削り、50 mL円錐形チューブ内のすべての細胞を収集します。採取した細胞を無菌グリセロール(20%wt/vol最終濃度)と混合します。混合物のOD600を測定し、3〜5ストックアリコートを作ります。長期保存のため-80°Cで保管してください。
- ファージレスキューの場合、2%グルコースと100μg/mLアンピシリンを添加した2YT媒体の25mLを用いてファージミド含有TG1細菌混合物を~0.1のOD600に希釈します。培養細胞を37°Cおよび250rpmで〜0.5のOD600にした。
- 5 x 109 pfu/mL で CM13 ヘルパーファージを追加し、37 °C でインキュベートし、45 分間 250 rpm で細胞をスーパー化します。CM13ヘルパーファージは完全なファージ粒子のアセンブリのために必要なファージコートタンパク質を提供する。
- グルコースを除去するために10分間8,000 x gで培養を遠心分離する。100 μg/mL アンピシリンと 50 μg/mL カナマイシンを補充した 2YT メディアの 50 mL を使用して細胞を再サスペンドし、25 °C および 250 rpm で一晩インキュベートします。
- 9,000 x g、30分間の一晩培養から細胞を遠心分離し、新しいチューブに上清を移し、1/5容量PEG/NaCl溶液(20%wt/volポリエチレングリコール-6,000および2.5 M NaCl)を使用して上清中のファージを沈殿させます。穏やかに混ぜて、氷の上に1時間置きます。
- 12,000 x gを4°Cで遠心分離してファージ粒子を30分間回収し、1mLの1mLを用いてペレットを再懸濁し、懸濁液をマイクロ遠心管に移します。20,000 x gと 4 °C でチューブを 10 分間遠心分離し、残留細菌を除去します。
- 細菌ペレットを乱すことなく、新しいマイクロ遠心管に上清を移します。1:100希釈を使用して、269 nmおよび320 nmでの吸収を測定します。ファージの総数は、次の式23を使用して計算することができます。
- ファージライブラリは、短期使用の場合は4°C、長期保存の場合は-80°Cで25%グリセロールで保存してください。
- 3 ~ 6 ラウンドまたは必要なエンリッチメントが観察されるまで、選択のラウンドを繰り返します(結果セクションを参照)。リガンドに対する親和性と特異性を特徴付けるために、単一クローン(セクション4)をプレートして選択する(セクション5~7)。
4. 単一クローン分離
- 濃縮されたサブライブラリから個々のクローンを単離するには、ファージに感染したTG1細胞の10xシリアル希釈を調製する(ステップ3.5.2)。100 μg/mL アンピシリンと 2% (wt/vol) グルコースを含む 90 mm 2YT 寒天料理のプレートシリアル希釈と、一晩で 37 °C でインキュベートします。
- 一晩のプレートから、2YTメディアの250 μLに単一のコロニーを選び、無菌の深井戸プレートでウェルあたり100μg/mLアンピシリンを補充し、一晩で37°Cで成長させます。
- 一晩培養物から、100μLを100μg/mLアンピシリンで補充した新鮮な2YT媒体の500μLに接種します。
- 細胞を〜0.5のOD600に成長させ、5 x 109 pfu/mLでCM13ヘルパーファージを加え、37°Cでインキュベートし、45分間250rpmでインキュベートします。
- 100 μg/mL アンピシリンと 50 μg/mL カナマイシンを補充した 2YT メディアの 500 μL を追加します。25°Cでインキュベートし、250rpmで一晩インキュベートする。
- 3,000 x gの一晩培養物から深井戸プレートを10分間遠心分離します。
- ファージ粒子は、ELISAに使用して、リガンドに対して選択されたクローンの特異性を決定することができる。ビオチンまたは標的の構造ホモログは、陰性対照として用いることができる。
5. ELISAによるアンカーバインダー検証
- コーティングバッファー(100 mM炭酸バッファー、pH = 8.6)に100 μLの5μG/mLストレプトアビジンを用いたコート96ウェルELISAプレートを4°Cで一晩で行う。
- ELISAプレートを0.05%PBSTを使用して3倍洗浄し、1μMビオチン化ターゲットの100μLをターゲットウェルに加えます。コントロールウェルに100μLのビオチンまたはターゲットホモログを加えます。RTで1時間インキュベートします。
- プレートを5xに0.05%PBSTを用いて洗浄し、1×PBSに1%カゼインの300μLを加えて非特異的結合をブロックする。RTで1時間インキュベートします。
- ELISAプレートを0.05%-PBSTを使用して3倍洗浄し、精製ファージ上清を加えます。RTで1時間インキュベートします。
- ELISAプレートを0.05%PBSTを使用して10倍洗浄し、100μLわさびペルオキシダーゼ(HRP)-M13主要コートタンパク質抗体(カゼイン1%で1×PBSで1:10,000希釈)を加えます。RTで1時間インキュベートします。
- ELISAプレートを0.05%PBSTを使用して3x洗浄し、100μLテトラメチルベンジジン(TMB)基板を添加します。10分間、または目に見える色の変化が観察されるまでインキュベートします。1 M HCl の 100 μL を追加して反応を停止します。
- タンパク質の発現と精製については、標的に対して高い親和性と特異性を示すクローンを選択します(ディスカッションを参照)。
6. タンパク質発現、精製、ビオチニル化
- 前に報告したように19、サブクローンはセクション5からクローンを選択し、C末端Aviタグ付きおよびヒスタグ付きナノボディとして表現する。
- 大腸菌WK6細胞の周辺で選択されたナノボディを発現し(典型的には1L培養)、浸透ショックにより放出し、ニッケル-NTAカラムを用いて精製する(材料表参照)。
- 脱塩カラムを使用してバッファを交換する(5%グリセロールを持つ1 x PBS;材料表を参照)。
- さらなる使用のために、市販のキット(材料表を参照)を使用してナノボディをビオチン化します。
7. BLIによるアンカーバインダーの特性評価
- ストレプトアビジンバイオセンサー上に200 nMビオチン化アンカーバインダーを固定化することにより、選択したアンカーバインダーの結合親和性および動態を分析する(材料表参照)結合アッセイバッファー(1 x PBS(pH=7.4)、0.05%Tween 20、0.2%BSA、3%メタノール)。
- データ解析ソフトウェアを用いた定常解析によるアンカーバインダーリガンド相互作用の解離定数(KD)を計算する (材料表を参照)。得られたKD値は、通常、単一から2桁のマイクロモルの範囲である。
8. 二量体化バインダースクリーニング
注:「二量体化バインダー」のビオパンニングスクリーニングは、2つの重要なステップを除いて、アンカーバインダーのそれと似ています:1)二量体化バインダーは、選択されたビオチン化アンカーバインダーと負のアンカーバインダーリガンド錯体を使用して選択されます。および正の選択がそれぞれ行われ続けです。2)溶出工程中に、100mMトリエチルアミンを使用して、アンカーバインダー-リガンド標的複合体にのみ結合した陽性選択ファージを溶出する。100 mMトリメチルアミン溶液(pH = 11.5)は、タンパク質相互作用を破壊することによって陽性クローンを溶出するために使用されます。
- 選択範囲の開始
- 最小限の媒体で新たに成長した単一のTG1細胞コロニーを、37°Cで6mL 2YT、250rpmで~0.5のOD600に接種することにより、すべての選択を開始します。氷上の細胞をインキュベートする。
- 負に選択されたナノボディの除去
- ストレプトアビジン被覆磁気ビーズを400μL使用して「減算管」を準備し、ステップ3.2に従います。ただし、ビオチンで飽和させる代わりに、選択したビオチン化アンカーバインダーを使用して計算された完全結合容量を5倍追加し、ステップ8.3.3で使用する非結合ファージを保存します。
- 正に選択されたナノボディの選択
- 「減算チューブ」に使用されるストレプトアビジン被覆磁気ビーズの体積を1/2使用し、手順3.3.2~3.3.3に従って「捕捉管」を準備します。しかし、ビオチン化リガンドで飽和させる代わりに、選択したビオチン化アンカーバインダーを用いて計算された完全結合能を5倍添加する。
- 正の二量体化バインダー選択のためのアンカーバインダーリガンド複合体を形成するには、非ビオチン化リガンドの十分な濃度を追加する。これにより、ほとんどのストレプトアビジン結合アンカーバインダーがリガンド結合複合体を形成できるようになります。
- 「減算チューブ」から取られた非結合ファージを使用して、手順3.3.3から3.3.8に従います。
- 正に選択されたナノボディの溶出
- 100 mMトリエチルアミンの450 μLを添加し、10分間ローテーター上のRTでインキュベートすることにより、アンカーバインダーリガンド複合体に結合したファージを溶出する。
- 競争的に溶出したファージを収集し、手順3.4.1から3.4.2に従います。
- 二量体化バインダー選択のさらなるラウンド
- さらに選択を実行するには、手順 3.5 および 3.6 に従ってライブラリを増幅および回復します。3~6ラウンドまたは所望の濃縮が観察されるまで、選択のラウンドを繰り返します。ターゲットに対する親和性と特異性を特徴付けるために、単一のクローン(セクション4を参照)をプレートして選択します。
9. ELISAによる二量体化バインダー特性評価
- セクション4の手順に従って、ELISAを介して特性評価のために個々のクローンを分離します。
- 二量化バインダー候補の親和性をアンカーバインダーリガンド複合体に試験するために、100nMビオチン化アンカーバインダーの100μLを用いてELISAターゲットプレートをコーティングする。1時間インキュベーションした後、リガンドターゲットを1μM加えてアンカーバインダー-リガンド複合体を形成する。
- コントロールプレートは、ビオチン化アンカーバインダーを単独で使用してコーティングし、フリーアンカーバインダーに結合することもできるクローンをスクリーニングする必要があります。100 nMビオチン化アンカーバインダーの100 μLを追加し、RTで1時間インキュベートします。
- セクション5.3-5.7に従ってください。
10. BLIによる二量体化バインダー特性評価
- アンカーバインダー-リガンド複合体に対する二量体化バインダーの結合親和性および動態は、ストレプトアビジン(SA)バイオセンサ上のビオチン化二量体化バインダーを結合アッセイバッファーで固定化し、リガンドのシリアル希釈をあらかじめ平衡化した1μMアンカーバインダーでアッセイすることによって分析することができる。相互作用のKD、 konおよびkoffは、報告された方法19を使用して計算できます。
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Representative Results
CBDをターゲットとして109より高い多様性を有するコンビナトリアル・ナノーネライブラリーをスクリーニングすることにより、インビトロ選択とアンカーおよび二量体化バインダーの検証を記述する。アンカーおよび二量体化バインダーの両方の選択の連続ラウンド中にファージバイオパンニングの濃縮を評価することが重要である。図 5に示すように、4 ~ 6 ラウンドの選択後の典型的な濃縮結果は、サブライブラリ内の潜在的なヒットの比率が高いことを示すので、さらに選択する必要がない場合があります。
シングルクローンELISAは、アンカーおよび二量体化バインダーの相対結合親和性および選択性を分析するのに適しています。図6Aは、6発のビオパンニング後の代表的なアンカーバインダー選択結果である。高い(例えば、#87)または低い(例えば、#27)リガンド選択性を示すクローンは、比較することができる。高選択性クローンは、アンカーバインダー候補として選択する必要があります。同様に、図6Bは、4ラウンドのバイオパンニング後の二量体化バインダー選択結果を示す。我々は、典型的には、リガンドのみで固定化されたアンカーバインダー(例えば、#49)または(例えば、#80)を有するヘテロ二量体を形成したクローンを観察した。二量体化特異性を示す前者は、さらなる検証のために選択されるべきである。
アンカーバインダーELISAは、ビオチン化標的の使用に依存する。したがって、BLIを使用して、ラベルのないターゲットへのバインドをさらに確認する必要があります。BLIはまた、結合動力学の特性を可能にする。アンカーおよび二量体化バインダーの代表的なBLI結果をそれぞれ図7Aおよび7Bに示す。左パネルは、リガンド濃度依存結合を示し、CIDシステムの構築に適していることを示唆している。右側のパネルには、負のコントロールが表示されます。リガンドの存在下でのアンカーと二量体化バインダー相互作用の計算されたKDは、典型的には2桁ナノモルから2桁のマイクロモルに及んだ。それらは、リガンドと選択した組み合わせライブラリによって異なる場合があります。
分析サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を行い、アンカーと二量体化バインダーとの間のヘテロ二量体形成を確認した。アンカーと二量体化バインダーとCBDを混合した場合に二量体化ピークが認められた(図8A、赤線)。対照的に、CBDがない場合(図8A、青線)、または各バインダーがカラムに単独でロードされた場合には、二量体化ピークは検出されませんでした(図8B)。化学的架橋はCID複合体を安定化させるために使用され、架橋されたナノボディは、以前の溶出ピークに対応するわずかに増加したサイズを有する。
図1:化学的に誘導されたタンパク質二量体化のメカニズムこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:合成ナノーネ組み合わせライブラリーの生成の概略図このライブラリーは、普遍的なnanobody足場を用いて構築され、トリヌクレオチド突然変異誘発(TRIM)技術24によって3つの相補性決定領域(CDR)における各ランダム化位置にアミノ酸の設計された分布を組み込む。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:(A)アンカーおよび(B)二量体化バインダースクリーニングのフローチャート。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: COMBINES-CID の年表この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:アンカーバインダー選択のためのバイオパンニングの各ラウンドに続くファージ力料の濃縮。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:代表的なELISA結果は、正(+)および負(*)クローンを示す。(A)アンカーバインダー ELISA は、6 ラウンドの選択後に96個のランダムに選択されたクローンから生じる。(B)4ラウンド選択後に無作為に選択したクローンの96個の二量体化バインダーELISAの結果。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:BLIによるアンカーおよび二量体化バインダー運動分析(A) 標識のないCBD(左)とTHC(右)を用いたアンカーバインダーの分析。ビオチン化アンカーバインダーを、異なる濃度のCBDで滴定したスーパーストレプトアビジン(SSA)バイオセンサに固定化した。CBD結合(赤い曲線)の測定データは、グローバルに適合した(灰色の線)。(B)左、CBDの異なる濃度で平衡化されたアンカーバインダーに結合するSAバイオセンサ固定化二量体化バインダーのBLI分析。右、アンカーバインダー濃度を滴定し、CBDの不在下で固定化二量体化バインダーに結合した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図8:アンカーと二量体化バインダーとの間のヘテロ二量体化のSEC分析。(A)CBDの有無における二量体化およびアンカーバインダー(それぞれ5μM)を、分析前にRTで30分間100μMビス-N-スクシニミジル-(ペンタエチレングリコール)エステルで架橋した。タンパク質標準の溶出量は三角形でマークされています。(B)非架橋アンカーと二量体化バインダー(各30μM)を別々に注入した。AとBのクロマトグラムは異なるYスケールで示されている。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
バイオパンニングの異なるラウンドのための入力ファージライブラリの正しい濃度を選択することが重要です。通常、多様性を持つ ~1012~1013ファージ粒子の入力ライブラリから開始し、各ファージクローンの約 100 ~ 1,000 コピーをプルダウン アッセイで提示できます。結合アッセイ中のファージ濃度が高すぎるか低すぎると、非特異的結合または陽性クローンの喪失の可能性が高くなります。アンカーまたは二量体化バインダーの選択は、通常、3〜6ラウンドのバイオパンニングで構成され、出力ファージカウントは通常〜104から始まり、〜10 8〜109に増加する。このような濃縮を観察した後、ELISA検証用に単一のクローンを選択するのに適しています。バイオパンニングの追加ラウンドは、適切な低存在量陽性クローンを識別する可能性を減少させる可能性があります。
選択の成功を高めるためには、適切な負のコントロールと選択を設定することが重要です。例えば、リガンド標的の構造類似体の使用は、リガンド特異性の選択を容易にする。我々の研究では、非常に類似したアナログTHCは、アンカーおよび二量体化バインダー19のELISAおよびBLI検証におけるCBDの制御として使用された。二量体化バインダー選択において、アンカーバインダーが比較的低いリガンド結合親和性を有する場合、フリーおよびリガンド結合アンカー結合アンカーバインダーの両方を正選択の標的として提示することができる。したがって、負の選択中にフリーアンカーバインダーに結合するバインダーを完全に除去することが重要です。これは、フリーアンカーバインダーを使用して減算の複数のラウンドを実行することによって達成することができます。
私たちのプロトコルの制限は、ターゲット分子がアンカーバインダー選択のためにビオチン化される必要があり、ダイマー化選択に使用できるアンカーバインダーは1つまたは少数です。ビオチン化された標的の使用は、ビオチンと標的の間のリンカーに部分的に結合する結合剤を豊かにすることができる。したがって、BLIまたはその他の手法によってラベルのないターゲットを使用してヒットを検証することが重要です。二量体化バインダーの選択に単一または少数のアンカーバインダーを選択すると、適切な感度と特異性を持つCIDシステムを識別する可能性を減らすことができます。したがって、選択の多重化能力は、他の技術(例えば、「ライブラリー・バイ・ライブラリー」タンパク質相互作用スクリーニング25を可能にする単一分子相互作用シーケンシング(SMI-Seq)などと結合することによってさらなる改善を待つ。
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Disclosures
この研究に関する仮特許がワシントン大学によって出願されました。
Acknowledgments
この作品は、ワシントン大学イノベーション賞(L.G.へ)、米国国立衛生研究所(1R35GM128918からL.G.)からの助成金、ワシントン大学のスタートアップファンド(L.G.へ)によって支援されました。H.J.はワシントン研究財団の学部フェローシップの支援を受けています。K.W.はワシントン大学タンパク質デザイン研究所の学部フェローシップに支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Step Ultra TMB ELISA substrate solution | Thermo Fisher Scientific | 34029 | |
| Agar | Thermo Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit (3 kDa cutoff) | Millipore | UFC900324 | |
| Ampicillin | Thermo Fisher Scientific | BP1760-25 | |
| Bio-Rad Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000002 | |
| BirA biotin-protein ligase standard reaction kit | Avidity | BirA500 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| Casein | Sigma-Aldrich | C7078-1KG | |
| CM13 Helper phage | Antibody Design Labs | PH020L | |
| D-(+)-Glucose monohydrate | Alfa Aesar | A11090 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 11205D | |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | BP120-1 | |
| Fast DNA Ladder | New England Biolabs | N3238S | |
| FastDigest BglI | Thermo Fisher Scientific | FD0074 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | BP229-1 | |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg | GE Healthcare | 28989335 | |
| HiPrep 26/10 Desalting Column | GE Healthcare | 17508701 | |
| HisTrap-FF-1ml | GE Healthcare | 11000458 | |
| Imidazole | Alfa Aesar | 161-0718 | |
| IPTG | Thermo Fisher Scientific | 34060 | |
| Kanamycin | Thermo Fisher Scientific | BP906-5 | |
| M13 Major Coat Protein Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53004 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-500G | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Nunc 96-Well Polypropylene DeepWell Storage Plates | Thermo Fisher Scientific | 260251 | |
| Nunc MaxiSorp | Thermo Fisher Scientific | 44-2404-21 | |
| Octet RED96 | ForteBio | N/A | |
| pADL-23c Phagemid Vector | Antibody Design Labs | PD0111 | |
| PEG-6000 | Sigma-Aldrich | 81260-1KG | |
| Platinum SuperFi DNA Polymerase | Invitrogen | 12351010 | |
| PureLink PCR Purification Kit | Thermo Fisher Scientific | K310001 | |
| QIAprep Spin M13 Kit | Qiagen | 27704 | |
| Recovery Medium | Lucigen | 80026-1 | |
| SpectraMax Plus 384 | Molecular Devices | N/A | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389-1KG | |
| Super Streptavidin (SSA) Biosensors | ForteBio | 18-5057 | |
| Superdex 75 increase 10/300 GL Column | GE Healthcare | 28-9909-44 | |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | 15224-025 | |
| TG1 Electrocompetent Cells | Lucigen | 60502-1 | |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich | 471283-100mL | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tryptone | Thermo Fisher Scientific | BP9726-5 | |
| Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Yeast Extract | Thermo Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Zeba Spin Desalting Column | Thermo Fisher Scientific | 89882 |
References
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