Summary
在这里，我们描述了一种简单易懂的策略，用于在正式固定石蜡嵌入肿瘤组织部分中可视化、量化和映射免疫细胞。该方法将现有的成像和数字分析技术与扩展成像检测的多路复用能力和多参数分析相结合。
Abstract
肿瘤微环境（TME）的免疫环境是癌症进展和治疗反应的决定性因素。具体来说，TME中免疫细胞的密度和位置具有重要的诊断和预后值。TME 的多光分析使我们对调节肿瘤启动和进展的众多细胞和分子网络有了指数化的认识。但是，这些技术不提供有关单元格的空间组织或细胞-细胞交互的信息。需要经济实惠、易于操作且易于执行的复用技术，该技术允许在组织部分中空间解析免疫细胞，以补充单一基于细胞的高通量技术。在这里，我们描述了一种策略，该策略集成了串行成像、顺序标记和图像对齐，以生成整个组织部分的虚拟多参数幻灯片。随后，使用用户定义的协议自动分析虚拟幻灯片，这些协议支持识别、量化和映射感兴趣的细胞群。在这种情况下，使用分析模块组织对齐、作者和 HISTOmap 进行图像分析。我们举了一个例子，我们成功地将这一策略应用于一个临床标本，最大限度地利用从有限组织样本获得的信息，并在整个组织部分提供 TME 的无偏见视图。
Introduction
癌症的发展是恶性细胞和TME之间相互相互作用的多步骤过程的结果。除了肿瘤细胞，TME由非恶性细胞、基质细胞、免疫细胞群和细胞外基质（ECM）1组成。1肿瘤组织不同细胞和结构成分的空间组织，以及肿瘤与邻近非癌细胞之间的动态交换，最终调节肿瘤进展和对治疗的反应22、3、4。3,4研究表明，癌症的免疫反应是暂时调节的5，6。6不同的免疫细胞群渗入肿瘤病变和邻近组织，表现出独特的空间分布模式，与不同功能（例如，亲肿瘤与抗肿瘤）相关的激活和分化状态各不相同。这些不同的免疫种群及其参数与肿瘤和基质腔室共同进化。
允许单细胞多组学分析的技术的出现，使我们对调节致癌性和肿瘤进展的众多细胞和分子网络有了指数化的认识。然而，大多数基于单细胞的高通量分析工具需要组织中断和单细胞分离，导致细胞的空间组织和细胞-细胞相互作用7的信息丢失。由于 TME 中特定免疫细胞的位置和排列具有诊断和预后值，因此允许空间分辨率的技术是单细胞免疫分析技术的重要补充。
传统上，免疫组织化学 （IHC） 和多路免疫荧光 （mIF） 等成像技术仅限于少量可同时可视化的生物标志物。这种限制阻碍了对肿瘤渗透免疫细胞的时空动力学的研究，这些细胞通常由几个球形标记定义。成像和分析工具的最新进展扩大了多路复用的可能性。新的基于抗体的标签技术，如组织细胞学和成像质量细胞测量，已经用于空间分离多达12和32生物标志物，分别为88，9。9质谱成像是一种不需要贴标的技术，它有可能在单个组织第10、11,11节中同时成像数千个生物标志物。虽然这些技术已经显示出在解剖癌症组织免疫环境的巨大潜力，他们使用高度复杂和昂贵的设备和软件，并且不容易接触到大多数研究人员。
另外，传统的IHC和mIF的复用能力已经扩大，通过串行成像，连续轮标签，和光谱成像7,127，12，13，14，15，16。,13,14,15,16这些技术从相同或从串行组织部分生成多个图像，这些部分可以使用图像分析软件合并到虚拟多参数幻灯片中。因此，可同时可视化和分析的标记数量会增加。
在这里，我们提出了一种策略，使用商用试剂、经济实惠的显微镜设备和用户友好的软件合理设计组织多路复用测定（图1）。该方法集成了串行成像、顺序多路复用标记、整个组织成像和组织对齐，可生成虚拟多参数幻灯片，可用于组织部分免疫细胞的自动定量和映射。使用此策略，我们创建了一个虚拟幻灯片，包括 11 个生物标志物以及两个常用的组织学污渍：血红素和欧辛 （H&E） 和双红色 （PSR）。在不同的组织隔间中识别、定位和量化了多个免疫细胞群，并使用组织热图解决了其空间分布问题。此策略可最大化从有限的临床标本中获得的信息，适用于正式固定石蜡嵌入 （FFPE） 存档的组织样本，包括整个组织、核心针活检和组织微阵列。我们建议使用这种方法作为设计TME中免疫细胞群的定制检测的有用指南。
Protocol
从被切除的乙型肝炎病毒（HBV）相关的人类肝细胞癌的三个连续FFPE部分从蒙特利尔大学中心获得，从肝细胞细胞癌临床数据库和生物标本储存库（HBP生物库）。参与此组织库的患者提供了知情同意。这项研究得到机构道德操守委员会（第09.237号议定书）的批准，并根据《赫尔辛基宣言》进行。
1. 赫马托西林和欧辛（H&E）染色协议
注：H&E 染色由蒙特利尔大学中心中心（CRCHUM）的分子病理学核心设施使用 Shandon 多程序机器人滑动染色器使用以下程序进行。
- 对于去石蜡化，用二甲苯替代，将浸化幻灯片 3x，每次 2.5 分钟。
注意：二甲苯替代品是易燃的，皮肤刺激物，如果吸入有害。 - 对于补液，将滑水浸入 100% 乙醇 3x 中，每次 2.5 分钟。在双蒸馏水（ddH2O）中洗涤1分钟以补充水分。
- 在血氧林中孵育1分钟。在 ddH2O 中，每洗 3x 1 分钟。
- 用 eosin 孵育 5 s。用95%乙醇清洗30s。用100%乙醇洗涤2x1分钟。
注意：乙醇是易燃的，刺激眼睛。欧辛是一种刺激眼睛的人。 - 对于脱水，在二甲苯替代品中，每次浸入3倍，每次1.5分钟。手动安装幻灯片。
注： 执行协议的这一部分的估计时间为 30 分钟。
2. FFPE 部分的多路免疫荧光染色方案
注：本议定书改编自罗伯逊等人17。
- 去水化和补液
注：在IHC或mIF对FFPE部分进行抗体介导标记之前，应去除石蜡。未能有效地去除石蜡会导致染色不理想。- 将 4 μm FFPE 组织部分滑入玻璃滑架。在烟罩下，将幻灯片浸入包含 37°C 预暖二甲苯的 Coplin 罐子中，浸泡 10 分钟。
注意：二甲苯是易燃的，皮肤刺激，吸入有害。 - 每 2 分钟手动搅拌幻灯片 10 秒，在新鲜二甲苯中重复 1x，再搅拌 5 分钟。
- 在化学罩中，按顺序将滑道浸入以下每个溶液中 5 分钟：1） 二甲苯：乙醇（1：1 v/v）;2） 100%乙醇;3） 70%乙醇;4） 50%乙醇;5） 30%乙醇;6） 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）。
注： 将幻灯片保存在 PBS 中，直到准备好执行抗原检索。始终保持脱蜡部分水合。干燥会导致非特异性抗体结合，因此导致背景染色高。
- 将 4 μm FFPE 组织部分滑入玻璃滑架。在烟罩下，将幻灯片浸入包含 37°C 预暖二甲苯的 Coplin 罐子中，浸泡 10 分钟。
- 热诱导抗原检索
注：抗原可以在正式固定时被掩盖，防止抗体结合，从而进行可视化。使用抗原解构缓冲液和程序部分重建表象的原生构象，从而恢复抗体识别。抗原检索缓冲液的类型和持续时间应针对特定的测定条件（例如，靶向、抗体、组织等）进行优化。- 将脱蜡幻灯片浸入包含抗原检索溶液的 Coplin 罐子中（材料表中的配方）。
- 将封闭的 Coplin 罐放入带自来水的电压力锅中。水位不应超过罐子高度的一半，以便水不会与抗原回收溶液混合。
- 关闭炊具的盖子和压力阀。选择高压 10 分钟并开始。完成后，拔下炊具，释放压力，打开盖子，并将罐子放在炊具内30分钟，让滑片冷却。
- 阻止非特定绑定
- 将带幻灯片的机架传输到充满 PBS 的 Coplin 罐子。用PBS 2x 冲洗出抗原检索缓冲液，每次冲洗 5 分钟。
- 用PAP笔包围组织部分，形成疏水屏障。将幻灯片浸入含有 0.1 M 甘氨酸的 COPlin 罐子中。在室温 （RT） 下孵育 15 分钟。
注：甘氨酸饱和抗原检索过程中产生的醛组。这些组可以结合原生和次要抗体，更具体地说。 - 用PBS洗2x5分钟冲洗甘氨酸溶液。将滑板放入湿度室，并添加足够的阻塞溶液，以覆盖所有组织部分。避免溢出疏水屏障。在RT孵育30分钟。
注： 阻塞解决方案的配方可以在材料表中找到。阻断溶液应包含一种蛋白质（例如BSA），以阻止非特异性结合位点。它还可以加入像Triton X-100或Tween 20这样的洗涤剂，减少抗体和组织靶点之间的疏水性相互作用，从而使抗原识别更具选择性。从组织来自的物种中添加10%的总血清会阻断Fc受体，从而减少非特异性抗体结合。最后，从二次抗体的培养物种中加入10%的血清，将最大限度地减少继发抗体对组织部分的直接非特异性附着。
- 免疫荧光标签
- 用 PBS-Tween 冲洗 （0.1% v/v） 2x，每次 5 分钟，并将滑轨放回湿度室。
- 在阻塞溶液中加入重新悬浮的原抗体的混合物。在4°C孵育过夜。本研究使用的主要和次要抗体列在材料表中。
注：原抗体的混合物应含有不同物种或同一物种的抗体，但含有不同的等号。有关本研究中使用的初级二次抗体对的列表，请参阅表 2。所用所有抗体的详细信息见材料表和表2。 - 用 PBS-Tween 冲洗 （0.1% v/v） 3x 5 分钟，并将滑轨放回湿度室。在黑暗中，加入二次抗体的混合物，在RT孵育1小时。
注：当主要抗体来自不同物种时，应选择二次抗体，以便每个抗体只与一种主要抗体结合，而不是相互结合。这通常是通过使用在同一物种中产生的二次抗体来实现的，只要该物种不同于产生主要抗体的物种。如果主要抗体在同一物种中升高，但同类型不同，则应使用等等型特异性二次抗体。 - 用 PBS-Tween 冲洗 （0.1% v/v） 3x，每次 5 分钟。用 ddH2O 冲洗，去除多余的液体，然后用 DAPI 安装在安装介质中。使用的卷取决于节的大小。通常 40 μL 足以覆盖常规显微镜幻灯片的表面。
- 将盖滑到该部分，轻轻挤出多余的安装介质，避免气泡形成。让幻灯片在黑暗中在 RT 处干燥 20 分钟，并在 4°C 下储存，直到准备好采集。
- 使用整个幻灯片扫描仪获取所有通道的图像（参见材料表）。
注：抗体被验证使用人类肝细胞癌组织作为积极的控制。对于每个原抗体，三个串行部分分别沾染了原抗体、等同型控制或仅阻塞溶液，在染色协议的其余部分没有变化。对获得的图像进行了比较，以确定染色的特异性。当与原抗体孵育的部分的信号具有预期模式且易于与背景区分时，染色被认为是具体的。在等型中提供高背景信号或标记组织成分且没有主要抗体部分的主要抗体被认为是非特异性。完成协议的这一部分的估计时间是 2 天。所需的控制包括：（1） 等体型控制，以建立主要抗体对背景信号的非特异性结合的贡献。一个部分被染色的方式与其他样本组织相同，只不过它与原抗体的等值和来源相同的抗体孵育，但针对组织部分所缺少的目标特异性。如果没有适当的等体对照抗体，则可以由主要抗体升高的同一物种的总IgG取代;（2） 无主要抗体控制（即阴性控制），以确定染色的特异性，并估计二次抗体的非特异性结合对背景信号的贡献。在这种情况下，控制部分与其他部分的染色方式相同，但未添加主抗体;（3） 积极控制，以确定染色工作。在这种情况下，染色是在已知表达原抗体识别的标记的组织部分上进行的。
3. 皮罗-天狼星红色 （PSR）/快速绿色染色协议
注：这种染色的目标是在FFPE组织部分可视化纤维蛋白原蛋白I和III。该协议改编自塞格纳尼等人18世。所有步骤均在化学罩中执行。
- 执行与 FFPE 部分的多路免疫荧光染色方案类似的组织部分的去石蜡化和补液（第 2.1 节）。
注：如果要染色的部分以前用于免疫荧光标记，并且石蜡已经去除，则去石蜡补水步骤可用于去除安装介质。DAPI 不会使用此过程删除，但它不会明显干扰 PSR 染色。 - 将幻灯片浸入包含皮罗-天狼星红色/快速绿色溶液（材料表中的配方）的罐子中，在RT孵育30分钟（超过30分钟会导致肝细胞核的非特异性染色）。
- 以 ddH2O（5 次浸渍）快速清洗滑轨。然后，在乙醇中快速洗涤100%（5浸）。用二甲苯-100%乙醇（1：1 v/v）清洗30 s。用二甲苯清洗30 s。在二甲苯完全蒸发之前安装安装介质（参见材料表），这有助于安装。
注： 执行协议的这一部分的估计时间为 1 小时。
4. 从组织部分排泄抗体
注：为了在顺序标签测定中重复使用组织部分，需要完全去除原抗体和二级抗体。结合抗体被剥离，如先前描述的13。
将水浴预热至 56 °C。将部分放入装有剥离缓冲液的罐子内（材料表中的配方），关闭盖子，用石蜡薄膜胶带密封，以防止在晃动过程中泄漏。
- 将罐子放入水浴中，用搅拌孵育30分钟。
- 在 RT 中，在 ddH2O 中，每冲洗 4x 15 分钟，使用 PBS-Tween 冲洗（0.1% v/v）。
- 将部分水合在PBS-Tween或水中，直到准备好用第二轮原抗体重新探测该部分。
注： 执行协议的这一部分的估计时间为 2 小时。 - 验证抗体洗脱程序的效率。
注：在顺序标签测定中使用抗体洗脱协议之前，应验证去除原抗体和二级抗体的效率。- 执行具有给定原发性抗体对感兴趣的部分的染色和图像采集，如 FFPE 部分的多路免疫荧光染色协议（第 2.1-2.4.6 节）所示。
- 在图像采集时，执行第 4.1~4.3 节中所示的组织结合初级二次抗体复合物的洗脱。
- 用步骤 2.4.3 中使用的相同二次抗体和相同的条件孵育该部分。
- 执行 2.4.4~2.4.6 所示的洗涤、安装和图像采集步骤。
- 并排比较剥离前后采集的图像，以确定特定信号是否已消失。
注：抗体去除前后图像的比较将验证洗脱程序的效率。但是，在所有通道中看到背景信号增加以及 DAPI 的扩散是正常的。这限制了可以在同一组织部分执行的剥离轮次数。三轮剥离似乎是最大的。
5. 图像采集
- 使用整个幻灯片扫描仪生成图像。
- 使用 20x 0.75NA 目标镜头，分辨率为 0.3225 μm/像素。
6. 图像分析
注： 此处概述的方法引用当前示例。请参阅表1和文本以适应其他特定示例。
- 使用图像分析软件的 Tissualign 模块（此协议中的 VIS，请参阅材料表）执行组织对齐。
- 打开图像分析软件并单击组织对齐选项卡。
- 通过访问文件将要对齐的图像导入幻灯片托盘 |数据库并选择要对齐的第一个图像。返回组织对齐选项卡，并通过单击幻灯片托盘中的"加载"按钮加载图像。图像将显示在幻灯片托盘和工作区中。
注：只有感兴趣的堆栈才应加载到幻灯片托盘中。 - 重复步骤 6.1.2 对要对齐的顺序中的所有图像，逐个加载它们。将所有感兴趣的图像加载到幻灯片托盘上后，继续通过按功能区中的"工作流步骤"中的"下一步"来链接图像。
- 接下来，在第一个图像顶部拖放第二个图像。第一和第二个图像现在链接。重复此步骤，以便以有序的方式逐个对齐其他图像。第一个图像的名称将更改，表示它已链接到其他图像。同时，链接的图像将显示在幻灯片托盘右侧的工作区中。
- 此时，使用自动对齐、半自动对齐或手动对齐来对齐图像。最好先尝试自动对齐。要自动对齐，请按功能区中的工作流步骤（步骤 3）中的"下一步"按钮。
- 通过导航组织的不同位置并直观地验证不同图像中的相应结构是否以相同的方式排列在图像的两个维度中，查看自动对齐。
- 如果自动对齐的结果不令人满意，请使用引脚（每张图像至少使用三个针脚），指示链接图像中的同源组织特征。一旦引脚放置在链接图像中的同源位置，用户有两种选择：半自动对齐或手动对齐。对于半自动对齐，请单击基于色带中的当前定点自动对齐按钮。要手动对齐，请单击色带上"应用针脚"按钮。
- 对对齐结果满意时，单击工作流步骤中的"下一步"按钮，并将复合图像保存在数据库中。
注：在显示的分析中，对齐跨越 11 个标记的六张幻灯片以及 H&E 和 PSR 图像需要 15 分钟。
- 使用用户定义的协议分析协议包 1（APP 1，表 1）执行组织检测。
- 单击功能区中的"图像分析"选项卡，打开软件的图像分析模块。
- 通过访问文件导入复合（对齐）图像|数据库并选择感兴趣的图像，然后单击"图像分析"选项卡。
- 通过单击"打开 APP"图标并选择要使用的分析协议包 （APP） 来打开 APP 选择对话框。在这种情况下，选择APP 1进行组织检测。
- 打开 APP 1 后，通过前往选定的组织位置并单击"预览"按钮，确认 APP1 工作正常。如果结果令人满意，则转到下一步。
- 单击以运行 APP 1 并使用所选 APP 处理图像。
- 通过单击"文件/导出"完成分析时，导出数据（例如图像、测量值等）。
注：APP 1 创建一个感兴趣的区域 （ROI） 对组织 （ROI 组织） 进行划分并计算组织区域。 - 通过访问文件，使用新创建的 ROI 保存修改后的图像|保存。
注：在所述图像分析站中，使用 APP 1 检测组织并创建 ROI 需要 5 分钟。处理的组织面积为3.2厘米2厘米。
- 使用 APP 2（表 1）将组织分割到斯特罗马和帕伦奇马中。
注：APP 2 适用于预定义的 ROI 组织。APP 2 将组织分割成 ROIs 斯特罗马和帕伦奇马。- 单击功能区中的"图像分析"选项卡，打开图像分析模块。
- 通过访问文件导入包含 ROI 组织的图像|数据库并选择保存在步骤 6.2.7 中的图像。返回"图像分析"选项卡，并通过单击幻灯片托盘中的"加载"按钮加载图像。图像将显示在幻灯片托盘和工作区中。
- 使用 APP 选择对话框打开 APP 2，如 6.2.3 中。
- 通过在选定的视图字段中处理来预览 APP 2。如果结果令人满意，请单击"运行"按钮在完整映像上运行 APP 2。作为 APP 2 的输出，ROI 组织在 ROIs 斯特罗马和帕伦奇马及其各自区域中进行了细分。导出结果为 6.2.6。将修改后的图像保存为 6.2.7 中。
注：在分析站中，使用APP 2分段斯特罗马和帕伦奇马的组织需要4小时。处理的组织面积为3.2厘米2厘米。
- 使用用户定义的协议 APP 3（表 1）识别和量化 FoxP3hiCD4+ 单元。
注：APP 3 适用于预定义的 ROIs 斯特罗玛和帕伦奇马。- 打开图像分析模块并导入包含 ROIs 斯特罗玛和帕伦奇马的图像，如 6.3.1 和 6.3.2 所示。使用 APP 选择对话框打开 APP 3，如 6.2.3 中。
- 在 FoxP3高CD4+ 单元格中丰富的选定视场中预览 APP 3 处理。如果结果令人满意，则在完整映像上运行 APP 3。作为 APP 3 的输出，所有单独的 FoxP3hiCD4+ 对象都将被标记并存储其组织坐标。将确定 ROIs 斯特罗马和帕伦奇马中的 FoxP3hiCD4+ 物体的密度。导出结果，如 6.2.6。
- 对 FoxP3高CD4+ 标记对象执行组织热映射。
- 使用 APP 选择对话框（如 6.2.3 中）打开用户定义的协议 FoxP3hiCD4+ MAP。
注：FoxP3hiCD4+ MAP 使用 FoxP3高CD4+ 标记对象的坐标来生成密度热图。使用 APP 3 识别和计数 FoxP3hiCD4+ 标记的对象在描述的图像分析站中花了 25 分钟。处理的组织面积为3.2厘米2厘米。 - 通过按下"运行"按钮运行 FoxP3高CD4+ MAP。通过单击"文件" 导出组织热图|出口 |工作区。
注：使用 FoxP3高CD4+ MAP 映射 FoxP3hiCD4+ 标记对象，在描述的图像分析站中花了 5 分钟。
- 使用 APP 选择对话框（如 6.2.3 中）打开用户定义的协议 FoxP3hiCD4+ MAP。
- 识别并量化 CD8+、CD68+、MPO+、#SMA 和 CD34 + 对象，分别使用用户定义的协议 APP 4、APP5、APP6、APP7 和 APP 8（表 1），如第 6.4 节至 6.4.3.2 节中加载每个案例中感兴趣的 APP。
注：APAP 4 到 8 在预定义的 ROIs 斯特罗玛和帕伦奇马上工作。
Representative Results
TME 感兴趣的细胞群可视化、量化和映射策略概述
为了量化不同组织隔间 （TC） 中感兴趣的细胞群 （COI） 并描述其空间组织的特征，我们设计了一个工作流程，集成了经济实惠且易于使用的技术，并最大限度地利用可以从珍贵的 FFPE 临床标本获得的位置信息（图 1）。首先，连续整组织FFPE部分被染色，用于COI（例如免疫细胞）和TCs（例如，频闪与帕伦奇马）的可视化（图1，步骤1）。要染色的连续部分数应保持在最低水平，以便可视化解决研究问题所需的感兴趣细胞或组织特征。序列部分的数量越小，组织结构在连续部分上的相似性和一致性就越高。此外，复用功能可以通过剥离和复试技术来扩大荧光染色部分的再利用19。
完成染色步骤后，使用整个幻灯片扫描仪对图像进行数字化。从串行部分获取的图像以自动方式对齐并合并为虚拟多路复用幻灯片（图1，第 2 节）。接下来，使用用户定义的协议来定义组织的投资回报率（图1，步骤 3）。随后，ROI 组织被划分为定义为其他 ROI 的 TC。（图1，步骤4）。接下来，用户定义的协议在不同的 TC 中检测到和量化 COIn（图 1，步骤 5）。最后，根据COI的密度和组织坐标生成了COI的组织热图（图1，步骤6）。
图 1：TME 中可视化、量化和映射免疫细胞策略的原理图表示。（1） 串行整组织部分被染色，用于标记 COI 和 TC。染色的整个组织部分使用整个滑动扫描仪进行数字化。（2） 从串行部分获取的图像使用组织关系分析模块以自动方式链接、对齐和共同注册。通过单个图像的高精度对齐生成合成图像。（3） 用户定义的协议用于自动检测复合图像中组织相关像素 （TAP）。（4） 组织被分割成TC（例如，频闪和帕伦奇马）定义为ROIs。（5） 用户定义的协议用于不同 TC 中 COI 的自动检测和定量. （6） COI 的组织热图生成.请点击此处查看此图形的较大版本。
成像 COI 和 TC
与HBV相关的肝细胞癌受试者的三个连续FFPE整组织部分被染色在一轮或多轮染色中，如图2A所示。第一节被涂有H&E，以显示组织结构，细胞形态，并确定临床相关的参数，如恶性肿瘤类型，肿瘤等级，和免疫渗透的整体评估（图2C）。在连续第二节中，使用了两轮mIF来标记肝皮质和非皮质细胞（图2A）。在第一轮中，使用CD34染色内皮细胞对正常和肿瘤血管进行可视化。此外，上皮细胞（肝细胞和胆囊细胞）被识别使用细胞角蛋白8/18，和纤维化活性肝斯特拉特细胞被确定为α平滑肌肉活性阳性（+SMA+）细胞（图2C）。图像采集后，组织部分被剥离，并重新探测对巨噬细胞（CD68）和肌纤维细胞（dmin）的抗体。为了更好地描述肿瘤免疫渗透，相邻的串行III部分被染色使用两轮mIF细胞标记CD3，CD4，CD8，叉头盒P3（FoxP3）和骨髓过氧化物酶（MPO）。在所有情况下，DAPI 都被用作核反制剂。最后，第三节被沾染了PSR污渍，并反染了快速绿色，以可视化纤维蛋白原蛋白，并将组织分割成频闪和帕伦奇马（图2C）。
配备 20X 目标镜头的整个幻灯片扫描仪用于数字化染色部分并创建虚拟幻灯片。从三个串行部分（图2B）获取了六张图像，然后根据图1中的原理图表示，使用VIS软件对虚拟幻灯片进行了分析。
图像分析
图像分析包括五个步骤：1） 组织对齐;2）组织检测;3）组织分割;4） COIs 的自动量化;和5）组织热图。所有图像分析协议都是使用图像分析软件的作者模块开发的，在文本中称为 APP。
组织对齐
来自三个串行部分的六张虚拟幻灯片，跨越 11 个标记加上 H&E 和 PSR 污渍，被加载到图像分析软件的 Tissualign 模块中。接下来，图像以自动方式链接、对齐和共同注册，生成 11plex 加上 H&E 和 PSR 虚拟复合图像，其中包含各个图像的所有层（图 2A+C）。对齐在来自相邻串行部分的图像中是准确的，显示相应的组织结构在对齐时以同源方式定位和排列（图2C和图S1A）。此外，对于来自同一部分的图像，在单个单元格级别进行对齐是精确的（图S1B）。自动对齐的时间取决于要对齐的图像的数量、大小、复杂性和相似性。上述六张虚拟幻灯片的对齐工作在我们的 VIS 站中花了 15 分钟。
图 2：序列组织部分的染色和图像对齐。（A） 在三个序列部分进行的染色摘要，用于可视化 COI 和 TC。括号中的数字表示图像指定。对于第二节和第三节，组织被剥离，并重新使用第二组抗体重新探测。（B） 组织对齐前后六个单个整组织图像的概述（分别左和右）。比例尺 = 3，500 μm. （C） 对齐图像的缩放视图。比例尺 = 80 μm。请点击这里查看此图形的较大版本。
组织检测
一旦图像被链接和对齐，我们试图识别TAP（图3A）。为了设计一个APP来自动检测TAP（APP 1，表1），我们利用了两个属性，将TAP与与组织无关的像素区分开来。首先，DAPI 信号（蓝色带）仅限于仅位于组织中的核，这意味着所有 DAPI+ 像素都是 TAP 的子集。其次，与与组织无关的像素相比，TAP在绿色和黄色波段的自荧光信号较高。因此，我们开发了用于组织检测的APP 1（表1），它使用简单的阈值技术检测基于这些通道中基线信号的TAP。设置蓝色、绿色和黄色波段的阈值，以便 TAP 的背景强度值高于阈值，而与组织无关的像素的值低于阈值。用于组织检测的APP 1应用于图像 IIA，该图像包含蓝色、绿色和黄色通道中的图层（图 3A）。作为 APP 1 的输出，在 TAP 顶部放置了一个明亮的绿色蒙版，并划定了称为"组织"的 ROI（输出，图 3A）。此外，组织区域被确定为定量输出变量。由于 APP 1 未将不与组织关联的像素合并到 ROI 组织中，因此它们被排除在基于此 ROI 的后续分析中（图 3A）。如图3A所示，APP 1在识别TAP的精度。
TCs 的组织结构分割和划分
接下来，我们通过将组织分割成频闪和帕伦奇马来定义 ROI 组织内的不同隔间。我们使用PSR染色图像（IIIC，图2C），其中频闪可以定义为与纤维蛋白原蛋白（红带）沉积相关的区域，将帕伦奇马定义为纤维蛋白原蛋白不存在的区域，以及快速绿色反染色染料占上风（绿色带）（图3B）。我们创建了APP 2（表1），以数字方式划分TCs斯特罗姆和帕伦奇马。此 APP 适用于预定义的 ROI 组织（输出，图 3A），并使用具有代表性的频闪和帕伦奇马区域来训练集成在图像分析模块中的分类器工具。经过训练的分类器将像素分配给一个频闪或帕伦奇马标签（分别为鲑鱼和绿色，图 3B）。在像素分类后，APP 2 执行旨在定义 ROIs 斯特罗马和帕伦奇马的形态学操作（图 3B和表 1）。如图3B所示，APP 2在对像素进行分类和生成相应的RO时的性能。此外，APP 2 量化了频闪和帕伦奇马的区域。最后，即使分割使用 PSR 染色部分完成，轮廓的频闪和帕伦奇马区域也可以传输到与 PSR 图像对齐的任何图像。
图3：自动组织检测/分段和生成各自的RO。（A） 图像 IIA 用于识别 TAP（左图、刻度柱 = 6，000 μm）。使用 APP 1 （表 1） 为 TAP 分配了一个明亮的绿色掩膜，从而产生名为组织（输出 1）的 ROI。右，内部显示显示 APP 1 在检测 TAP 时的精确性。刻度杆 = 350 μm. （B） ROI 组织 （输出 1） 使用 APP 2 分割成频闪和帕伦奇马。左图显示了分为 ROI 频闪（鲑鱼）和 ROI 帕伦奇马（绿色）的 ROI 组织视图。刻度柱 = 4，500 μm。在右侧，ROI 组织、原始 PSR 染色（图像 IIIC）和 ROIs 频闪和帕伦奇马的内部放大视图。刻度柱 = 250 μm。请点击此处查看此图形的较大版本。
COIs 的自动定量
接下来，我们继续识别、定位和量化ROIs斯特罗马和帕伦奇马中的COIs。创建 AAP 3 到 8 （表 1） 用于分别定位和计数以下 COI： CD4_FoxP3+、CD8+、CD68+、MPO+、[SMA]和 CD34+ 单元。APP 3 旨在定位和计数 CD4_FoxP3+ 细胞（图像 IIIA，图 2C），作为调节 T 细胞 （Tregs） 的替代标记。该协议检测核转录因子FoxP3（红带）和DNA标记染料DAPI（蓝带）的信号的共定位。鉴于最近激活的T细胞向上调节FoxP3，以丰富Tregs，我们设置阈值，只为预选明亮的FoxP3+细胞（FoxP3高）。接下来，在所有预选的 DAPI_FoxP3高单元格中，只有那些被明亮的环形 CD4 信号（绿色带）包围的单元格被标记并计为 FoxP3hiCD4+ 单元格（粉红色标签，图 4A）。FOXP3hiCD4+ 细胞在ROIs斯特罗马和帕伦奇马的密度被确定为APP 3的定量输出变量（图4A）。
同样，AP 4 到 6 专为检测 CD8+、CD68+ 和 MPO+ 单元而设计。这些 AP 具有相同的基准设计，用于检测和量化 COIs。具体来说，COIs根据特定细胞群生物标志物的信号强度进行识别，然后执行几个后处理形态步骤来划定单个细胞（表1）。单个细胞或 COIs 被标记、计数及其组织坐标进行登记。AP4 到 6 还确定 ROIs 斯特罗马和帕伦奇马中的 COIs 密度（图 4B+D）。
我们的DAPI染色质量不足以将核分割集成到AAP 3到6中，因此我们无法确保所有单独标记的对象都是单个细胞。因此，我们以标记对象/mm2的计数表示单元格的密度（图 4）。然而，在AAP 3到6的后处理步骤中，细胞聚合被成功地分离成单个细胞，广泛的视觉检查表明，大多数标记的对象对应于单个细胞。
为了检测[SMA]和CD34+区域，我们分别开发了ApP 7和8（表1）。两种AAP都根据阈值检测特定信号，并确定ROIs斯特罗马和帕伦奇马的正面积百分比（图4E+F）。
生成虚拟多路复用幻灯片的最有趣的可能性之一是分析共本地化表达式。我们生成 APP 10 来检测 βSMA 和 desmin 之间的共定位，两个标记由肝脏中的肌纤维细胞共同表达。APP 10 使用阈值查找对 μSMA、desmin 和 #SMA 加上 desmin 的像素正数（表 1）。作为定量输出变量，APP 10 确定 _SMA+ 区域、desmin+ 区域以及这两个标记的共地表达式区域（图S3）。
图4：在TC频闪和帕伦奇马中识别和量化COIs。（A=F）分别使用协议3、4、5、6、7和8在ROIs Stroma和Parenchyma中自动检测和量化CD4_FoxP3+、CD8+、CD68+、MPO+、[SMA]和CD34+COI（表1）。左侧显示的是原始图像、中间处理过的图像，右侧是量化。对于图 4A°D，刻度柱 = 40 μm。对于图 4E和F，刻度条 = 350 μm。请单击此处查看此图形的较大版本。
作为量化TCs Stroma和Parenchyma中COI的替代方案，我们确定了1至4号不同恶性结节（图5A、H和HI）中免疫细胞的密度。如图5A所示，手动划定了每个结核的投资回报率。独特的组织免疫特征，每个结核的特点，进一步揭示了TME的内在异质性。
组织热图
如上所述，AP3 到 8 存储每个单独标记的对象的组织坐标。此功能允许自动生成组织图，其中给定细胞群的高密度区域显示为热点（红色），而密度相对较低的区域显示为冷点（深蓝色）。中间密度值根据图 5所示的颜色比例分配颜色。组织热图由APD生成，将图像划分为直径为 50 μm 的圆圈，并根据圆内给定 COI 的相对密度分配颜色。如图5 Figure 5B+G所示，TME中不同COIs的定位模式和强度分布差异很大。此外，在单个结核水平上，组织区域中不同种群的排列是独一无二的（图S2A+C）。为了提供此技术的力量示例，并可视化同一结核中不同种群的热点的空间组织，手动提取单个细胞类型的热点并将其映射到结核 2 的轮廓（图 S2、图 D和图 E）。
图 5：TME 中 COI 的组织热图。（A） 皮罗西鲁斯红色染色显示结核位置 1、 2、 3 和 4。（B=G）分别为 CD4_FoxP3+、CD8+、CD68+、MPO+、CD34+和 #SMA® COI 的组织热图。深蓝色表示相对低密度，红色表示相对高密度。根据显示的颜色比例分配中间密度值的颜色。（H和I） 结节 1、2 和 3 + 4 中分别按细胞类型和每个结核组织的 COI 量化。请点击此处查看此图形的较大版本。
补充图S1：组织对齐的验证。（A） 在第二节（输入1）上完成的 CD34 染色（红色）用于生成绿色 CD34 掩膜（输出 1）。绿色蒙版（输出 1）覆盖在对齐的串行部分 I（输入 2）的 H&E 图像上。合并图像显示了血管结构的完美对应性。刻度柱 = 50 μm。（B） 显示 DAPI、CD4 和 FoxP3（输入 1） 合并的图像 IIIA 用于生成 CD4_FoxP3+ 单元的标签（在洋红色中输出 1）。输出 1 标签被传输到对齐的图像 IIIB（输入 2），并在合并图像中显示对 FoxP3/DAPI 和 CD4/CD3 之间的完美对应性。刻度柱 = 15 μm。请点击此处查看此图形的较大版本。
补充图 S2：组织热图的缩放视图。（A=C）用于 CD4_FoxP3+、CD8+、CD68+和 MPO+ 结核 1⁄4 中的 MPO+ 细胞的组织热图。结核 1、2 和 3 + 4 中的刻度棒分别表示 1，500 μm、700 μm 和 500 μm。（D） 结核 2 轮廓，带黑色实线。（E） 在结核 2 中提取 CD4_FoxP3+、CD8+、CD68+ 和 MPO+ 细胞的热点，并将其映射到D中定义的结核 2 轮廓上。请点击此处查看此图形的较大版本。
补充图 S3：共本地化分析。（A） 左侧和中间分别为绿色和去民标签为红色的 @SMA 标签的图像。右侧为 #SMA/desmin 双正区域，为黄色。（B） 量化 αSMA+ 区域、德明 + 区域和 #SMA/desmin 双正区域。刻度柱 = 150 μm。请点击此处查看此图形的较大版本。
| 应用程序 | 目的 | 分类 | 分类 | 后处理步骤 | 输出变量 |
| 方法 | 特征 | ||||
| （像素值） | |||||
| 1 | 组织检测 | 阈 值 | 通道 DAPI （150） | o 标签具有 3 个通道的均同地化高于阈值的对象 | o ROI 组织 |
| 通道 FITC/A488 （120） | o 关闭正对象 5 像素 | o 组织区域 | |||
| 通道 TRITC/A568 （40） | o 创建 ROI 组织 | ||||
| 2 | 组织分割 | 决策林 | RGB-R 中位数 | o 填充孔 | o ROI 斯特罗马 |
| RGB-G 中位数 | o 创建 ROI 斯特罗马 | o 斯特罗马地区 | |||
| RGB-B 中位数 | o 创造投资回报率 帕伦奇马 | o ROI 帕伦奇马 | |||
| IHS-S 中位数 | o 帕伦奇马地区 | ||||
| H&E Eosin 中值 | |||||
| 3 | 定位和量化 CD4+ FoxP3+ 细胞 | 阈 值 | 通道 DAPI （>600） | o 标签对象与 DAPI 和 Cy5/A647 的共定位，周围有 FITC/A488 信号 | o ROIs斯特罗马和帕伦奇马的CD4_FoxP3+细胞的计数和密度 |
| 通道 FITC/A488 多路平滑 （>850） | o 清除小于 7 μm2的对象 | o 单个 CD4_FoxP3+ 单元的坐标 | |||
| 通道 Cy5/A647（>800） | |||||
| 4 | 定位和量化 CD8+ 细胞 | 阈 值 | 通道 DAPI （<1200） | o 清除小于 15 μm2的正对象 | o ROIs斯特罗马和帕伦奇马的CD8+细胞计数和密度 |
| 通道 Cy5/A647 中位数 （>80） | o 关闭正对象 2 像素 | o 单个细胞的坐标 | |||
| o 分离对象 | |||||
| 5 | 定位和量化 CD68+ 细胞 | 阈 值 | 通道 FITC/A488 （>200） | o 清除小于 20 μm2的正对象 | o 在 ROIs 斯特罗马和帕伦奇马的 CD68+ 细胞计数和密度 |
| o 分化正对象 3 像素 | o 单个 CD68+ 细胞的坐标 | ||||
| o 分离对象 | |||||
| 6 | 定位和量化 MPO+ 单元格 | 阈 值 | 通道 DAPI （>400） | o 清除小于 5 μm2的对象 | o 在 ROIs 斯特罗马和帕伦奇马中 MPO+ 细胞的计数和密度。 |
| 通道 TRITC/A568 （900-4000） | o 分馏 3 像素正对象 | o 单个 MPO+ 单元格的坐标。 | |||
| o 分离对象 | |||||
| 7 | 定位和量化 [SMA] 区域 | 阈 值 | 通道 TRITC/CF568 （>1050） | o 清除小于 25 μm2的正对象 | o RIS斯特罗马和帕伦奇马地区 [SMA] 区域的计数和密度 |
| o 分馏 3 像素正对象 | o 坐标 [SMA] 像素 | ||||
| 8 | 定位和量化 CD34+ 区域 | 阈 值 | 通道 DAPI （<5000） | o 清除小于 25 μm2的正对象 | o 在 ROIs 斯特罗马和帕伦奇马的 CD34+ 区域计数和密度 |
| 通道 Cy5/A647 中位数 （>120） | o 分馏 3 像素正对象 | o CD34+ 像素的坐标 | |||
| 9 | 为给定细胞群创建组织热图 | 对象热图 | 对象热图 | o 热图 | |
| 绘图半径 50 μm | --- | ||||
| 10 | 量化 _SMA 和 Desmin 之间的共定位 | 阈 值 | 通道 TRITC （CF568） （>1050） | o 标记具有高于 TRITC 阈值的对象 （CF568） | o 量化 _SMA 和 Desmin 的共本地化表达 |
| 通道 Cy5 （A647） （>1000） | o 标记具有高于 Cy5 阈值的对象 （A647） | ||||
| o 标记具有 TRITC （CF568） 和 Cy5 （A647） 以上阈值共同本地化的对象 | |||||
| o 清除小于 25 μm2的正对象 |
表1：用于设计用于图像分析的杀伤人员地雷的一般参数。此表中指定的参数根据此分析中使用的图像（例如背景、伪影等）的独特特征进行调整，可能不适用于其他图像。由于提到的后处理步骤是为本研究分析的特定图像定义的，因此有意不详细。用户应自定义要分析的图像的 AP。
| 部分/染色 | 原抗体 | 二次抗体 |
| 第二节/第1节 染色 | 小鼠 IgG2a 抗人类 _SMA 鼠标 IgG1 抗人类 CD34 兔子抗人类细胞角蛋白 8/18 |
山羊防鼠IgG2a CF568 大鼠防鼠IgG1 A647 驴抗兔A488 |
| 第二节/第二节染色 | 兔子抗人类德敏 鼠标抗人类 CD68 |
驴抗兔A647 驴抗老鼠 DyLight 755 |
| 第三节/第1节 | 鼠标抗人类CD4 兔子抗人类狐狸P3 山羊抗人类MPO |
驴反鼠A488 驴抗兔A647 驴抗山羊A568 |
| 第三节/第二节染色 | 兔子抗人类CD3 鼠标抗人类 CD8 |
驴抗老鼠 DyLight 755 驴抗兔A647 |
表2：mIF的初级二次抗体对。
Discussion
简单、方便且易于执行的复用技术，允许组织部分免疫细胞的空间分辨率，以绘制癌症和其他免疫性疾病的免疫景观图。在这里，我们描述了一个策略，它集成了广泛可用的标签和数字分析技术，以扩展成像测定的多路复用能力和多维评估12，13，17，19。12,13,17,19不同标记的三个串行部分的染色，以及通过剥离和重新探测技术重复使用部分，使我们能够可视化除 H&E 和 PSR 污渍之外的 11 个参数。使用组织对齐模块，以自动方式对齐这些部分的六幅图像。对于来自同一部分的图像，在单个单元级别进行对齐，对于来自相邻部分的图像，对齐高度一致。虚拟多路复用使我们能够确定一个节中可视化的标记如何与另一个连续部分中可视化的标记在空间上关联。虽然一些染色标记了 COIs，但其他标记了 TC，使我们能够量化不同 TC 中的 COIn。使用软件工具自动量化COI大大简化了图像的处理，加快了图像的处理。此外，数字分析应用于整个组织部分，而不是选定的视场，导致TME的无偏表示。此外，由于COI的组织坐标已经登记，因此可以生成组织热图。
此协议中有几个领域可能需要进行故障排除。首先，抗原检索不良会影响mIF的质量，因此抗原检索缓冲液的类型和持续时间应针对所使用的特定测定/生物标记条件进行优化。其次，使用的阻断溶液的类型应适应原发抗体和二级抗体的组织/抗原/种类。在我们手中，从组织来自阻塞的Fc受体的物种中加入10%的总血清，从而减少非特异性抗体结合。从培养的物种中加入10%的血清，将最大限度地减少继发抗体对组织部分的直接非特异性附着。第三，必须验证使用适当的正和负对照的初级和二级抗体的特异性。第四，某些通道的自荧光增加，在原抗体剥离时DAPI的扩散也很常见。为了解决增强的自荧光问题，我们使用的是特定信号的强度值至少是背景的5倍的初级/二次抗体对。最后，一些高亲和力抗体不能用常规剥离程序来洗脱。在这种情况下，我们建议在最后一轮的标签中使用此类抗体。用户可能必须尝试不同的染色序列，以找到感兴趣的抗体的最佳配置。在进行第二轮或第三轮贴标之前，应确认剥离效率。
这一策略的主要局限性和挑战是找到适合感兴趣的标记的初级和二次荧光抗体的正确组合。寻找不同物种或不同等值类型可同时使用的主要抗体受商业上可用物的限制。大多数滑扫描仪都配备了灯具和滤镜，允许成像最多五个通道，而正确的种类和右荧光的二次抗体并不总是可用的。我们使用串行染色和顺序标记部分克服了这些限制。可能需要测试几种抗体组合，以得出感兴趣的标记的最佳组合。另一个限制是 DAPI 染色的质量，因为剥离和重新探测可能并不总是允许执行核分割。
组织对齐模块需要最少的培训，无需用户编程技能。从理论上讲，该软件允许对无限数量的图像进行对齐。但是，精确对齐取决于各节的相关性，其中更紧密、组织学上一致的部分可以更准确地对齐。我们使用 VIS 的作者模块生成 AP。创建 ASP 需要图像分析的基本知识，但在使用任何其他图像分析软件时也是如此。与其他图像分析软件相比，VIS 的独特优势包括使用不同方法（例如 IF、组织化学、IHC）准备的部分图像自动对齐。这允许使用虚拟多路复用对多个感兴趣的标记进行共本地化研究。此外，ApP 的灵活且用户友好的设计允许用户特定的自定义。与通过目视检查进行手动计数相比，自动定量和映射以及处理整个组织部分的可能性可节省时间并减少偏差。
此策略是癌症和自身免疫背景下组织免疫学非常有用的研究工具，但临床使用仍未经过验证。通过额外的标准化和验证，它将来可用于多种应用（例如，绘制癌症的免疫环境图，以预测和监测对免疫治疗剂的反应）。它也可以适应不同的炎症条件（例如，炎症性肠病），将病理评估与预后生物标志物相结合。
该协议的主要关键步骤是标签的效率/特异性以及设计 AP 用于预期用途或生物标志物的鲁棒性。因此，通过目视检查进行定期验证至关重要，尤其是在设计新 APP 时。在同一部分上高效使用多轮剥离和重新探测或不同类型的污渍是关键成分，可以是组织或截面特定的。在进行大批量分析之前，验证此类流程的效率至关重要。
总之，我们提供一种策略，使从有价值的临床组织样本中获得的数量和空间信息最大化。实施这种方法所需的资源、设备和知识是可广泛获取的。我们建议使用这种方法作为规划旨在识别、量化和绘制 TME 中免疫细胞种群的检测的有用指南。
Disclosures
提交人声明没有利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢研究参与者。我们感谢HBP生物库协调员路易丝·卢梭（LouiseRousseau）对组织样本和所有相关临床信息的恢复。我们感谢CRCHUM的分子病理学和细胞成像核心设施，以及维西奥普harm的迈克尔·佩尔施，以获得出色的技术援助。供资：这项研究得到了加拿大肝脏基金会、魁北克省艾滋病和传染病网络和加拿大丙型肝炎网络（加拿大艾滋病毒/C）的资助支持。CanHepC由加拿大卫生研究所（NHC-142832）和加拿大公共卫生局的一项联合倡议供资。M.F.M.从蒙特利尔大学、加布里埃尔·马奎斯大学和FRQS获得研究金。T.F. 获得CIHR和CanHepC的博士奖学金。S.T.在蒙特利尔大学肝胆和胰腺肿瘤外科担任罗杰-戴斯-格罗西尔斯讲座。
作者贡献：M.F.M.设计、执行实验和分析数据。T.F.设计了实验。A.C-B.提供技术指导。G.S.对研究对象进行了所有病理评估，并对所有病理方面提供了投入。L.M. 执行 H&E 染色、优化和进行图像采集。M.N.A. 执行 PSR 染色，并提供宝贵的技术投入。N.B. 对图像分析做出了贡献。S.T. 是 HBP 生物库的主要研究员，负责监督生物库的整体运行。他还就项目的各个方面及其临床影响提供了宝贵的投入。M.F.M，T.F.和N.H.S.构思和设计了这项研究。N.H.S.监督这项工作并获得了资金。M.F.M.，T.F.，A.C-B和N.H.S.写了手稿。所有作者审阅并批准了手稿。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antigen Retrieval Solution: Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% v/v Tween 20, pH 6.0) | |||
| Blocking Solution: 1 % BSA, 10 % filtered human serum, 10 % filtered donkey serum, 0.1 % Tween 20, and 0.3% Triton in PBS | |||
| Bovine serum albumin (BSA) | Multicell | 800-095-EG | |
| Coplin jars (EASYDIP SLIDE STAINING SYSTEM) | Newcomersupply | 5300KIT | |
| Cover slides | Fisherbrand | 12-545E 22*50 | |
| Direct Red 80 | Sigma Aldrich | 365548 | |
| Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Ethanol 100% | |||
| Electric pressure cooker | Salton | ||
| Eosin | Leica Biosystems | 3801600 | CAUTION, eye irritation |
| Fast Green FCF | Sigma Aldrich | F7252 | CAUTION, harmful by inhalation, ingestion and skin absortion |
| FFPE section (4μm) slides | |||
| Glycine 0,1 M in PBS | |||
| Hematoxylin Stain Solution, Gil 1. Formulation, Regular Strength | Ricca Chemical Company | 3535-32 | |
| Holder (EasyDip Staining Jar Holder) | Newcomersupply | 5300RK | |
| Human Serum | Gemini | 22210 | |
| Humidity chamber | Millipore Sigma | Z670138-1EA | |
| Pap pen | abcam | ab2601 | |
| PBS | |||
| PBS-Tween 20 (0.1% v/v) | |||
| Permount Mounting Media | Fisher Chemical | SP15-500 | |
| Picric Acid 1.3 % | Sigma Aldrich | P6744 | CAUTION, skin and eye irritation |
| Picro-Sirius Red/Fast Green solution: Fast Green 0.1 % w/v + Sirius Red 0.2 % w/v in 1,3 % picric acid solution | |||
| Primary Antibody Anti-αSMA | Mouse IgG2a 1A4 | Sigma A2547 | Dilution 1/100 |
| Primary Antibody Anti-CD34 | Mouse IgG1 HPCA1/763 | Novus Biologicals NBP2-44568 | Dilution 1/250 |
| Primary Antibody Anti-Cytokeratin 8/18 | Rabbit EP17/EP30 | Agilent IR09461-2 | Ready to use |
| Primary Antibody Anti-CD68 | Mouse KP1 | Abcam ab955 | Dilution 1/200 |
| Primary Antibody Anti-Desmin | Rabbit Polyclonal | Invitrogen PA5-16705 | Dilution 1/200 |
| Primary Antibody Anti-CD4 | Mouse N1UG0 | Affymetrix 14-2444 | Dilution 1/250 |
| Primary Antibody Anti-FoxP3 | Rabbit 1054C | R & D MAB8214 | Dilution 1/100 |
| Primary Antibody Anti-MPO | Goat Polyclonal | R & D Systems AF3667 | Dilution 1/250 |
| Primary Antibody Anti-CD3 | Rabbit SP7 | Abcam ab16669 | Dilution 1/200 |
| Primary Antibody Anti-CD8 | Mouse C8/144B | Invitrogen 14-0085-80 | Dilution 1/200 |
| Secondary Antibody Donkey anti-mouse A488 | Polyclonal | Invitrogen A-21202 | Dilution 1/500 |
| Secondary Antibody Donkey anti-Rabbit A488 | Polyclonal | Invitrogen A-21206 | Dilution 1/500 |
| Secondary Antibody Donkey anti-goat A568 | Polyclonal | Invitrogen A-11057 | Dilution 1/500 |
| Secondary Antibody Donkey anti-rabbit A647 | Polyclonal | Invitrogen A-31573 | Dilution 1/500 |
| Secondary Antibody Rat anti-mouse IgG1 A647 | RMG1-1 | Biolegend 406618 | Dilution 1/500 |
| Secondary Antibody Goat anti-mouse IgG2a CF568 | Polyclonal | Sigma Aldrich SAB4600315 | Dilution 1/500 |
| Secondary Antibody Donkey anti-mouse DyLight 755 | Polyclonal | Invitrogen SA5-10171 | Dilution 1/500 |
| Secondary Antibody Donkey anti-rabbit DyLight 755 | Polyclonal | Invitrogen SA5-10043 | Dilution 1/500 |
| SDS | BioShop | SDS001,500 | CAUTION, oral skin and eye toxicity |
| Shandon multi-program robotic slide stainer | LabX | 11384903 | |
| Shandon Xylene Substitute, | Thermo Fisher Scientific | CA89413-336 | CAUTION, Flammable, skin and eye irritation, Harmful when inhaled |
| Shaking water bath | |||
| SlowFade Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | S36938 | |
| Sodium Citrate Dihydrate | Millipore Sigma | 1545801 | CAUTION, eye irritation |
| Stripping Buffer: mix 20 ml 10% w/v SDS with 12.5 ml 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8), and 67.5 ml ultra-pure water. Under a fume hood, add 800 uL of 2-mercapto ethanol (114,4 mM final concentration) | |||
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-50ML | |
| Tris-HCl | BioShop | 77-86-1 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| VIS Software | Visiopharm | ||
| Whole slide scanner Olympus BX61VS | Olympus | Microscope: Olympus Slide Scanner BX61VS, 5 slides scanner, motorized stage, autofocus. Camera: Lightsource: Xcite-120. Filters: BrightLine® Sedat filter set (# LED-DA/FI/TR/Cy5-4X4M-B-000, Semrock) | |
| Xylene | Sigma Aldrich | 214736-4L | CAUTION, Flammable, skin and eye irritation, Harmful when inhaled |
| Xylene : Ethanol solution (1:1 v/v) | |||
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | CAUTION, harmful by ingestion, inhalation, fatal if sking absortion. Eye irritation. Use fume hood |
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