Summary
الغدة الثديية هي بنية ثنائية الطبقات ، تتألف من الخلايا الظهارية الداخلية والداخلية. قدم هو بروتوكول لإعداد organoids باستخدام التربسينات التفاضلية. تسمح هذه الطريقة الفعالة للباحثين بالتلاعب بشكل منفصل مع هذين النوعين من الخلايا لاستكشاف الأسئلة المتعلقة بأدوارهم في شكل الغدة الثديية ووظيفتها.
Abstract
تقدم الأرغن ذاتية التنظيم وهياكل الأنسجة ثلاثية الأبعاد التي تلخص العمليات الفسيولوجية في راحة الطبق. تتكون الغدة الثديية المورين من غرفتين منفصلتين للخلايا الظهارية متميزة ، تخدم وظائف مختلفة: المقصورة الخارجية ، الانحلال myoepithelial والمقصورة المضيئة الداخلية الإفرازية. هنا ، نصف طريقة يتم من خلالها عزل الخلايا التي تتألف من هذه الأجزاء ثم دمجها للتحقيق في مساهماتها الفردية في تكوين الغدة الثديية والتمايز. الطريقة بسيطة وفعالة ولا تتطلب تقنيات فصل متطورة مثل فرز الخلايا المنشطة الفلورية. بدلا من ذلك، نحن الحصاد وهضم الأنسجة أنزيمي، بذور ظهارة على أطباق زراعة الأنسجة المنضمة، ومن ثم استخدام التربسال التفاضلية لفصل myoepithelial من الخلايا المضيئة مع ~ 90٪ نقاء. ثم يتم طلاء الخلايا في مصفوفة خارج الخلية حيث تنظم في عضويات ثنائية الأبعاد (3D) يمكن تمييزها لإنتاج الحليب بعد 10 أيام في الثقافة. لاختبار آثار الطفرات الوراثية، يمكن حصاد الخلايا من النوع البري أو نماذج الماوس المعدلة وراثيا، أو يمكن التلاعب بها وراثيا قبل الثقافة ثلاثية الأبعاد. ويمكن استخدام هذه التقنية لتوليد الأورجادات الفسيفساء التي تسمح بالتحقيق في وظيفة الجينات على وجه التحديد في المقصورة المضيئة أو الميوبيلية.
Introduction
الغدة الثديية (MG) هي بنية ظهارية أنبوبية تشبه الشجرة وجزءاً لا يتجزأ من ستروما الغنية بالخلايا الشحمية. تتكون ظهارة القناة ثنائية الطبقات من طبقة خارجية وبازلية من الانقباض والخلايا العضلة المتوسطة (MyoECs) وطبقة داخلية من الخلايا الظهارية الظهارية الظهارية المضيئة (LECs) ، وتطويق تجويف مركزي1. أثناء الرضاعة عندما تعاقدت MyoECs الخارجية على ضغط الحليب من الليكل السنخيالداخلي ، يخضع MG للعديد من التغييرات التي تخضع لسيطرة عوامل النمو (مثل EGF و FGF) والهرمونات (مثل البروجسترون والأنسولين والبرولاكتين). هذه التغيرات تسبب التمايز من الهياكل المتخصصة، الحويصلات الهوائية، والتي توليف وإفراز الحليب أثناء الرضاعة1. يمكن التلاعب بظهارة الثدي بشكل تجريبي باستخدام التقنيات التي يتم فيها إما زرع شظايا الأنسجة الظهارية أو الخلايا أو حتى خلية القاعدية واحدة في منصات الدهون الثديية المضيفة ، وتطهيرها مسبقًا من parenchyma الثديية الذاتية ، والسماح لها بالنمو لإعادة تشكيل شجرة ظهارية وظيفية كاملة2،3،4،5. الزرع هو تقنية قوية، ولكن من الصعب أن تستغرق وقتا طويلا والمستحيل إذا طفرة النتائج في وقت مبكر من الفتك الجنينية (قبل E14) التي تمنع إنقاذ الانج الثديية القابلة للزرع. وعلاوة على ذلك، يرغب المحققون في كثير من الأحيان في البحث عن أدوار الجزأين المختلفين، المستمدين من خلايا السلف المقيدة بالنسب. في حين أن تكنولوجيا Cre-lox تسمح بالتلاعب الجيني التفاضلي لـ MyoECs و LECs ، فإن هذا أيضًا مهمة تستغرق وقتًا طويلاً ومكلفة. وهكذا ، منذ 1950s ، وقد استخدم المحققون في المختبر organoids الثديية كوسيلة سهلة نسبيا وفعالة لمعالجة المسائل المتعلقة بنية الأنسجة الثديية وظيفة6،7.
في البروتوكولات المبكرة التي تصف عزلة وثقافة الخلايا الظهارية الثديية الأولية ، وجد المحققون أن مصفوفة غشاء الطابق السفلي (BME) ، المكونة من جلطة بلازما واستخراج جنين الدجاج ، كانت مطلوبة لشظايا MG التي تزرع على طبق6. في العقود التالية ، تم تطوير المصفوفات خارج الخلية (ECMs ، الكولاجين ، ومصفوفة البروتين هلامي تفرزها خلايا ساركوما Murine Engelbreth-Holm-Swarm) لتسهيل الثقافة ثلاثية الأبعاد وتقليد أفضل في بيئة الجسم الحي7،8،9،10. الخلايا التهيئة في مصفوفات 3D كشفت عن معايير متعددة (مورفولوجيا، والتعبير الجيني، واستجابة الهرمونات) أن مثل هذه البيئة الدقيقة نماذج أفضل فيالعملياتالفسيولوجية الجسم 9،10،11،12. حددت الأبحاث باستخدام خلايا المورين الأولية عوامل النمو الرئيسية ومورفوجينات ضرورية للصيانة الموسعة والتمايز للorganoids13. وقد مهدت هذه الدراسات الطريق للبروتوكول المعروض هنا ، وثقافة خلايا الثدي البشرية وorganoids 3D ، والتي هي الآن أداة سريرية حديثة ، مما يسمح لاكتشاف المخدرات واختبار المخدرات على عينات المريض14. وعموما، يبرز الاستزراع اللواني العضوي قدرات التنظيم الذاتي للخلايا الأولية ومساهماتها في تكوين المورفوجينية والتمايز.
عرض هنا هو بروتوكول لثقافة الظهارة المورين التي يمكن تمييزها في acini المنتجة للحليب. يتم استخدام تقنية التربسة التفاضلية لعزل MyoECs و LECs التي تضم مقصورتي خلية MG متميزتين. ويمكن بعد ذلك أن يتم التلاعب بكسور الخلايا المنفصلة هذه وراثياً إلى وظيفة جينية مفرطة أو ضربة قاضية. لأن النسب الجوهرية، والتنظيم الذاتي هو خاصية فطرية من الخلايا الظهارية الثديية15،16،17، وإعادة دمج هذه الكسور الخلية يسمح للباحثين لتوليد ثنائي الطبقات، والأجهزة الفسيفسائية. نبدأ بهضم الأنسجة الدهنية بشكل أنزيمي ، ثم احتضان شظايا الثديية على طبق زراعة الأنسجة لمدة 24 ساعة(الشكل 1). تستقر شظايا الأنسجة على أطباق البوليسترين كأجزاء ثنائية الطبقات مع تنظيمها في الجسم الحي: طبقة عضلة العين الخارجية المحيطة بالطبقات المضيئة الداخلية. هذه المنظمة الخلوية يسمح لعزل MyoECs الخارجي عن طريق التربسين EDTA (0.05٪) العلاج لمدة 3-6 دقيقة تليها الجولة الثانية من التربسين-EDTA (0.05%). العلاج الذي يفصل LECs الداخلية المتبقية(الشكل 2). وهكذا، يتم عزل هذه الأنواع من الخلايا مع حساسية التربسين مختلفة ويمكن لاحقا أن تكون مختلطة ومطلي في ECM(الشكل 3). وتخضع الخلايا للتنظيم الذاتي لتشكيل مجالات ثنائية الطبقات، تتألف من طبقة خارجية من MyoECs المحيطة بمراكز التجارة المنخفضة الداخلية. تشكيل لومن يحدث كما تنمو الخلايا في وسط يحتوي على مزيج من عوامل النمو (انظر وصفات للنمو المتوسط)13. بعد 5 أيام ، يمكن تمييز الأورجادات الاعضاء في acini المنتجة للحليب عن طريق التحول إلى Alveologenesis Medium (انظر الوصفات والشكل 3F)واحتضانها لمدة 5 أيام أخرى. بدلا من ذلك، سوف تستمر الorganoids للتوسع وفرع في النمو المتوسطة لمدة 10 أيام على الأقل. يمكن تحليل الأرغن باستخدام الفلورة المناعية(الشكل 3D-F)أو تحريرها من ECM باستخدام محلول الاسترداد (انظر جدول المواد)وتحليلها عبر طرق أخرى (على سبيل المثال، المناعة، RT-qPCR).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافقت اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) التابعة لجامعة كاليفورنيا، سانتا كروز، على جميع الأساليب الموصوفة هنا.
1. اليوم 1: هضم الغدة الثديية
- الاستعداد لحصاد MGs من الفئران الإناث ناضجة 10-14 أسبوعا من العمر.
- أداء الحصاد على مقعد مفتوح في ظل ظروف معقمة.
- قم بتعقيم جميع الإمدادات الجراحية وألواح الفلين والدبابيس عن طريق التعقيم والنقع في الكحول بنسبة 70٪ لمدة 20 دقيقة قبل الجراحة.
- تخدير الحيوانات مع بنتوباربيتال الصوديوم (جرعة مخدر 2X من 0.06 ملغ / غرام وزن الجسم) تسليمها عن طريق حقن داخل السربيتون مع حقنة الأنسولين 0.5 مل.
- مراقبة مستوى التخدير عن طريق قرص إصبع الحيوان للتحقق من استجابة منعكسة والبدء في البروتوكول فقط بعد تخدير الحيوان بالكامل.
- وضع الحيوان على ظهره، دبوس الزوائد إلى الفلين، ومسح أسفل بطنه وصدره مع الإيثانول.
- لحصاد #2 و3 و4 و5 MGs من فأر واحد (أي 8 MGs ، الشكل 1A)، حدد خط الوسط بين الساقين الخلفيتين وبعمل شق صغير (1 سم) على جلد البطن بمقص حاد ، ثم قم بتمديد القطع حتى الرقبة18.
- اتبع عن طريق إجراء تخفيضات صغيرة بشكل قطعي نحو الساقين والذراعين للسماح للإفراج عن الجلد باستخدام مسحة القطن. سحب الجلد بعيدا وتمتد عليه ضيق قبل تثبيته على جانب واحد(الشكل 1B،الخطوة 1)18. إزالة MGs عن طريق قطع تحتها، وإزالة الغدد الليمفاوية من الغدد #4(الشكل 1B،الخطوات 2، 3)18. كرر الإجراء على الجانب الآخر من الجسم.
- جمع الأنسجة MG في 50 مل من 4 درجة مئوية دولبيكو في تعديل النسر وسائل الإعلام (DMEM) / المغذيات خليط F12 (F12) تستكمل مع 5٪ مصل الأبقار الجنين (FBS) و 1X المضادات الحيوية المضادة للميكوتك (المضادة)18.
- فرم الغدد في طبق 35 ملم أو على لوحة خزفية باستخدام شفرة حلاقة أو مروحية الأنسجة. تدوير لوحة كل خمسة قطع يدوية أو كل جولة على المروحية الأنسجة حتى قطع الأنسجة يمكن أن يصلح من خلال تلميح ميكروبيبات 1 مل بكل سهولة (~ 0.1 ملم / جزء، الشكل 1C).
- هضم MGs في الهضم المتوسطة (انظر الجدول 1)لمدة 14 ساعة في طبق التصاق منخفض جدا 6 في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
2. اليوم 2: عزل شظايا الأنسجة الظهارية الثديية
- بعد 14 ساعة من الهضم، مزيج بلطف عن طريق الأنابيب الأنسجة المهضومة 10X باستخدام ميكروبيبة 1 مل لكسر أي الأنسجة الستروما أو الدهنية المتبقية، وضمان عدم إنشاء فقاعات ولا قوة ميكانيكية زائدة.
ملاحظة: إذا كان هناك هضم غير مكتمل بعد 14 ساعة، يمكن أن يكون هذا بسبب تراكم الحمض النووي القص. في هذه الحالة، إضافة 1 ميكرولتر من 1 ملغ /مل deoxyribonuclease الأول (DNase I) لكل 2 مل من الهضم المتوسطة. احتضان لمدة 30 دقيقة أخرى في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2. - جمع الأنسجة في أنبوب 15 مل وشطف جيدا تستخدم للهضم مع 2-3 مل من الأنسجة ثقافة الصف 1X دولبيكو الفوسفات العازلة المالحة (DPBS) خالية من كاليفورنيا2 + وملغ2 +. جهاز طرد مركزي عند 600 x g لمدة 10 دقيقة.
- إخلاء الفوق الذي يحتوي على طبقة الدهون والمتوسطة، ومن ثم إعادة تعليق بيليه في 5 مل من DPBS والتحول إلى أنبوب جديد 15 مل. جهاز طرد مركزي عند 600 x g لمدة 10 دقيقة.
- خلال المركزية مكان 70 ميكرومتر مصفاة خلية النايلون في أنبوب 50 مل وprewet مصفاة باستخدام 10 مل من 37 درجة مئوية DMEM/F12.
- إعادة تعليق شظايا الأنسجة من خطوة البروتوكول 2.4 باستخدام 5 مل من DPBS وتمرير التعليق من خلال مصفاة خلايا النايلون prewet 70 ميكرومتر لإزالة الخلايا المترالية والخلايا المفردة(الشكل 1D).
- جمع شظايا الأنسجة على مصفاة الخلية. شطف 4X مع 10 مل من 37 درجة مئوية DMEM/F12(الشكل 1D).
تنبيه: الإنارة غير الكامل سيؤدي إلى ثقافات ملوثة بخلايا غير ظهارية. - الافراج عن شظايا الأنسجة عن طريق عقد علامة التبويب مصفاة مع أصابع قفاز، عكس مصفاة أكثر من طبق زراعة الأنسجة 60 ملم وتمرير 1 مل aliquots من الصيانة المتوسطة (انظر الجدول 1)من خلال الجزء السفلي من مصفاة 4X(الشكل 1E).
- تحقق من مصفاة لبقايا شظايا الأنسجة، والتي سوف تكون مرئية بالعين المجردة، وشطف مصفاة 1X أكثر مع 1 مل من الصيانة المتوسطة إذا كان أي شظايا لا تزال التمسك مصفاة. يجب أن تكون شظايا الأنسجة المشطفة الآن خالية من الخلايا المترالية.
- افحص بسرعة الطبق 60 مم الذي يحتوي على شظايا MG من الخطوة 2.9 البروتوكول تحت المجهر المقلوب (4X أو 10X الهدف، الشكل 1F). إعداد نموذجي من ثمانية MGs تسفر ~ 500 شظايا. ابحث عن خلايا مفردة أو قطرات الدهون وما إذا كانت هناك خلايا ملوثة.
ملاحظة: إذا كانت هناك خلايا ملوثة، كرر خطوة الترشيح عن طريق جمع الوسط والشظايا من الطبق 60 ملم باستخدام ماصة 5 مل وتصفية الجزء مرة أخرى من خلال مصفاة جديدة 70 ميكرومتر، وتكرار الخطوات البروتوكول 2.6، 2.8-2.10. - احتضان 24 ساعة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2،مما يسمح لشظية الأنسجة إلى التمسك وتوليد شظايا ذات طبقات مزدوجة(الشكل 2A).
ملاحظة: إذا لم تستقر الأجزاء بمقدار 24 ساعة، استمر في احتضان هاوية حتى يتم الالتزام بها. إذا كانت الشظايا لا تلتزم بشكل جيد، فإن فصل مقصورات الخلية لن يعمل. إذا كان الباحثون قلقين بشأن الالتصاق ، يمكن علاج لوحات زراعة الأنسجة لتعزيز ارتباط الأجزاء (على سبيل المثال ، بولي -L-ليسين).
3. اليوم 3: التبصلات التفاضلية للخلايا الظهارية الزميوية والإنارية
- لفصل MyoECs من الـ LECs ، قم بتفريغ الوسائط من الطبق ، وشطف 1x مع 1 مل من DPBS وإضافة 1 مل من التربسين-EDTA الطازج (0.05٪) ، ومراقبة الهضم بعناية تحت المجهر المقلوب (10X أو 20X الهدف ، الشكل 2B ، C ، F). سوف مفرزة من طبقة MyoEC الخارجي تتطلب 3-6 دقيقة، اعتمادا على التربسين-EDTA (0.05٪) قوه.
ملاحظة: يرجى الاطلاع على الشكل 2 للحصول على صور تمثيلية تعرض هذه العملية. تحت إضاءة برايتفيلد ، تظهر MyoECs مدورة ولها مظهر أكثر إشراقًا بالمقارنة مع الـ LECs ، والتي تظل ملتصقة في الوسط وتظهر أكثر قتامة. - اجمع كسر MyoEC في أنبوب 15 مل يحتوي على 2 مل 10٪ FBS / DPBS. دون إزعاج LECs، بلطف شطف الطبق 60 ملم مع 2 مل من DPBS ومن ثم التخلص من DPBS(الشكل 2H-I).
ملاحظة: الاسترداد المعتاد لـ MyoECs ضمن نطاق (3.5 × 106-1.5 × 106)اعتماداً على حجم MGs. - لإزالة الكسر LEC، إضافة 1 مل من التربسين-EDTA (0.05%) إلى الطبق مرة أخرى واحتضان 7-15 دقيقة، ورصد بعناية لمنع الإفراط في الهضم. إخماد التربسين-EDTA (0.05%) على الطبق مع 2 مل من 10٪ FBS / DPBS. جمع الكسر LEC في أنبوب جديد 15 مل.
ملاحظة: الانتعاش المعتاد لـ LECs هو ضمن نطاق (2 × 106-4.2 × 106)اعتمادًا على حجم MGs. بشكل روتيني ، فإن نقاء كلا الكسور كما هو مُحس من قبل الكيمياء المناعية هو ~ 90٪19 (الشكل 2E). - الطرد المركزي كل كسر لمدة 5 دقيقة في 300 × ز لإزالة التربسين-EDTA (0.05٪). إعادة تعليق بيليه في 250 ميكرولتر من الصيانة المتوسطة والعد كل عدد الخلايا باستخدام مقياس الهيموكيتومتر أو عداد الخلية الآلي. وضع الخلايا على الجليد أثناء العد.
ملاحظة: إذا كان التلاعب الجيني لكسور الخلية مرغوبًا فيه ، يمكن زراعة الخلايا الأولية20على أطباق الالتصاق المنخفضة والإصابة بفيروس اللاتين20.
4. اليوم 3: دمج وتضمين كسور الخلية في مصفوفة خارج الخلية
ملاحظة: بمجرد أن يتم جمع كسور MyoEC و LEC وحسابها، يمكن دمجها. نسبة MyoEC / LEC النموذجية هي 1:3(الشكل 3A)19. يمكن إجراء دراسات مختلفة. على سبيل المثال، لإجراء دراسات الفسيفساء، يمكن توليد الكسور من نوع البرية (WT) والفئران متحولة (موت) والجمع بين (MyoEC / LEC: WT / WT; WT/Mut; موت/WT; Mut/Mut)21، أو يمكن الجمع بين الكسور باستخدام نسب مختلفة من MyoECs /LECs19.
- استناداً إلى عدد الخلايا، احسب عدد الآبار (8 غرفة بئر، انظر جدول المواد)التي تحتاج إلى إعداد لـ 12,000 خلية/بئر (على سبيل المثال 3,000 MyoECs:9,000 LECs).
- إنشاء طبقة أساسية للثقافة 3D عن طريق إضافة 90 ميكرولتر من 50٪ ECM (50٪ ECM/50٪ DMEM/F12، دون أحمر الفينول - انظر جدول المواد)إلى كل بئر. تأكد من عدم وجود فقاعات والمغلفة الآبار بالتساوي. لترسيخ الطبقة الأساسية، قم باحتضان الشرائح عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، 5% ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: يحتاج ECM إلى البقاء الجليد الباردة حتى هذه الخطوة، وإلا فإنه سوف البلمرة قبل الأوان ويؤدي إلى طلاء قاعدة متفاوتة والبلمرة. استخدام قاعدة ECM يعزز نمو organoid في مستوى واحد، مما يساعد على التقاط الصور. هذا يحصل أيضا أسرع نمو عضوي ويستخدم أقل ECM22. - أثناء البلمرة، وإعداد يمزج الخلية. بيليه وMyoEC وLEC كسور في 300 × ز لمدة 5 دقيقة وإعادة تعليق كل كسر الخلية في 10٪ ECM/90٪ متوسط النمو حتى كل بئر لديه 100 ميكرولتر (انظر الجدول 1 لكيفية جعل النمو المتوسط).
ملاحظة: لسهولة التحضير، نسخ الآبار باستخدام نفس خلطات الخلية. ويمكن الجمع بين هذه وإعدادها في أنبوب واحد (على سبيل المثال، يمكن إعداد أربعة آبار من نفس المزيج الخلية في 400 ميكرولتر من 10٪ ECM/90٪ متوسط النمو). - إضافة 100 ميكرولتر من كل مزيج الخلية في 10٪ ECM/90٪ متوسط النمو إلى كل بئر والسماح organoids لتسوية لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
- مرة واحدة وقد استقر الخلايا، إضافة بلطف 100 ميكرولتر من متوسط النمو عن طريق الأنابيب بلطف أسفل جدار غرفة كل بئر. احتضان الشرائح عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 (انظر الشكل 3A للتكوين الكلي لكل بئر).
ملاحظة: مثبط رو كيناز، R-spondin، وNrg1 هي العوامل التي تم تحديدها على أنها مهمة لثقافة طويلة الأجل من organoids نمت من كل من الخلايا الثديية المورين الأولية وخلايا سرطان الثدي البشري13،14. بالإضافة إلى ذلك ، فإن عوامل الخلايا الجذعية B27 و N2 تمديد الوقت الذي يمكن أن تكون الاعضاء المستزرعة. - خلايا الصور كل 24 ساعة لتتبع نموها وتجديد بلطف متوسط النمو كل 2-3 أيام باستخدام 100 ميكرولتر / جيد(الشكل 3B-E).
ملاحظة: استخدم الحذر الشديد عند تجديد الوسط. إمالة الشرائح الغرفة لجمع المتوسطة في زاوية واحدة من الآبار. إزالة ≤ 100 ميكرولتر من المتوسط وتجديد بعناية لترك طبقة ECM دون عائق. - إذا كان الباحثون مهتمين بالتحقيق في الرضاعة / الخلايا النزفية ، قم بالتبديل إلى Alveologenesis Medium (انظر الجدول 1)في اليوم 5 واستمر في تجديد الوسيط كل 2-3 أيام حتى اليوم 10(الشكل 3F)أو ما بعده عن طريق تمرير باستخدام حل الاسترداد (انظر جدول المواد)13.
ملاحظة: عند هذه النقطة، يمكن عزل الأرغن من ECM عن طريق احتضان 4 درجة مئوية في 400 ميكرولتر من محلول استرداد 4 درجات مئوية (انظر جدول المواد للحصول على معلومات البروتوكول والكاشف).
5. يوم 5 أو 10: تحديد وأجهزة المناعة
- إزالة المتوسطة بعناية عن طريق الأنابيب بلطف قبالة وسائل الإعلام (ماصة لمبة يعمل بشكل أفضل). شطف كل جيدا باستخدام 200 ميكرولتر من 1x الفوسفات دولبيكو المالحة العازلة (DPBS، انظر وصفات).
- إصلاح organoids باستخدام الباردة (4 درجة مئوية) 4٪ (ث / v) paraformaldehyde (PFA، انظر وصفات) لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
تنبيه: PFA خطرة. ارتداء معدات الحماية الشخصية (معطف المختبر والقفازات ونظارات السلامة). وينبغي أن يتم تنفيذ هذه الخطوة داخل غطاء الدخان.
ملاحظة: يتم حل ECM بواسطة العلاج PFA. إزالة ECM غير مكتملة يمكن أن يؤدي إلى تلطيخ الخلفية عندما يتم تحليل organoids بواسطة الفلور المناعي. - إزالة PFA 4٪ وإضافة 200 ميكرولتر من 0.2٪ (ث / v) الجليسين / DPBS (انظر الجدول 1)إلى كل بئر. احتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة أو 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها على سطح هزاز تعيين إلى وضع بطيء.
ملاحظة: يمكن تخزين الاعضاء لمدة 1-3 أيام في DPBS في 4 درجة مئوية قبل الخطوة التالية. - Permeabilize organoids باستخدام DPBS + 0.25٪ تريتون X-100 (PBST، انظر الجدول 1)لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- منع organoids باستخدام 5٪ مصل حمار (DS) (أو مصل آخر مطابق لأنواع من الأجسام المضادة الثانوية) في DPBS لمدة 1 ساعة على سطح هزاز.
ملاحظة: يمكن تنفيذ هذه الخطوة بين عشية وضحاها عند 4 درجة مئوية على سطح هزاز. - إعداد الأجسام المضادة الأولية في 1٪ DS / DPBS. استخدام 125-200 ميكرولتر لكل بئر. قم بتلطيخ المناعة عن طريق احتضان الأجسام الاعضاء في الجسم المضاد الأولي بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية على سطح هزاز.
6. اليوم 11: الفلور المناعي الكامل
- غسل كل 2X جيدا مع 200 ميكرولتر PBST لمدة 5 دقيقة. إضافة الأجسام المضادة الثانوية في 1٪ DS / DPBS باستخدام 125-200 ميكرولتر لكل بئر. احتضان في درجة حرارة الغرفة على سطح هزاز لمدة 45 دقيقة.
- غسل كل بئر 2X باستخدام 200 ميكرولتر PBST لكل بئر.
- الطخ النوى باستخدام صبغة الحمض النووي Hoechst في DPBS (1:2000 في DPBS) لمدة 5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة جميع السائل اليسار على البئر عن طريق شفط بلطف مع فراغ.
- قم بإزالة الغرف والطوقا بعناية ، ضع قطرة واحدة (~ 30 ميكرولتر) من الوسائط المتصاعدة (انظر جدول المواد)على كل بئر وقسيمة تغطية ، مع الحرص على إزالة الفقاعات. السماح للشريحة لتجف في مساحة مظلمة لمدة 1-2 أيام. ختم مع طلاء الأظافر واضحة. صورة organoids على المجهر البؤري(الشكل 3E-F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يصف البروتوكول المعروض هنا طريقة للتحقيق في مساهمات نسب محددة للخلايا الظهارية الثديية من خلال الاستفادة من الأجهزة الفسيفسائية. للحصول على خلايا المورين الأولية للorganoids ، يجب أولاً عزل ظهارة الغدة الثديية عن ستروما الغنية الدهنية المحيطة(الشكل 1). هذه العملية موصوفة بإيجاز هنا وأيضا ً موصوفة في دراسة نشرت سابقاً18. للحصول على ما يكفي من الخلايا، فمن المستحسن أن تتم إزالة #2 و 3 و 4 و 5 MGs(الشكل 1A). خطوة هامة مفتاح لعزل السكان النقي من الخلايا الظهارية هو إزالة الغدد الليمفاوية من #4 MGs ، والتي هي غنية في الخلايا المناعية التي من شأنها أن تلوث إعداد(الشكل 1A ، B). تم مفروم MGs لتوليد شظايا ~ 0.1 ملم في الحجم(الشكل 1B). ثم تم هضم شظايا الأنسجة بشكل أنزيمي ، وهي عملية تحدث في وجود الكولاجين ، للإفراج عن ظهارة من ستروما ، وفي غياب التربسين ، لمنع هضم البروتينات مثل الكادهيرين التي تحافظ على اتصالات الخلية. ثم تم طرد الأنسجة المهضومة لإزالة الدهون وتصفيتها من خلال مصفاة الخلية وغسلها(الشكل 1C). تم إطلاق الشظايا الظهارية ، التمسك بالمصفاة ، عن طريق قلب الفلتر وغسل الغشاء ، مما نقل الشظايا الظهارية إلى طبق البوليسترين(الشكل 1D). ظهرت هذه الشظايا كهياكل صغيرة متفرعة(الشكل 1E).
تم احتضان الشظايا الظهارية المنقى لمدة 24 ساعة. استقروا على الطبق وتمسكوا ، وتشكيل مسطحة ، مثل الهياكل فطيرة مع طبقة خارجية من MyoECs تطويق الـ LECs الداخلية(الشكل 2A -B). يوضح الشكل 2C حافة مثل هذا الهيكل الشبيهة بالفطائر من نوع الحيوان البري. فصل علاج التربسين بشكل تفاضلي MyoECs ، والتي انفصلت أولاً وظهرت كخلايا ساطعة مقربة تحيط بجوهر الـ LECs التكعيبية المتبقية(الشكل 2C ، F). تم رصد مفرزة MyoECs بعناية باستخدام المجهر الساطع وحدثت في غضون 3-6 دقيقة. وبمجرد جمع مراكز المتعددة المجالات، تم فصل الـ LECs في وقت لاحق من خلال علاج تريبسين ثاني أطول من 7-15 دقيقة. الوقت اللازم لمفرزة الخلية يعتمد على تركيز التربسين ونضارة. كان النقاء العام لمقصورات الخلايا اثنين ~ 90٪، كما هو مُقنع من خلال عد الخلايا التي كانت KRT14-positive و E-Cadherin (CDH1)-سالبة في كسر MyoEC والخلايا التي كانت KRT14-negative وE-Cadherin-positive في كسر LEC(الشكل 2D-E)19. اكتشفنا أن بعض MyoECs تمت إزالتها من الجزء العلوي من هيكل مثل فطيرة وكذلك من الحواف الخارجية. وقد لوحظ ذلك باستخدام شظايا الأنسجة التي تم جمعها من الفئران المسماة بعلامة بازلية فلورية لا يمكن اختزالها (Cytokeratin 14 (KRT14)-CreERT1؛ R26RYFP/+) وحقن مع 75 ملغ / كغ تاموكسيفين 5 أيام قبل الحصاد. في الشكل 2F, G مفرزة MyoECs من حول حواف هيكل فطيرة هو واضح بسهولة. حدث هذا في غضون أول 2 دقيقة من علاج التربسين(الشكل 2F). بالإضافة إلى ذلك ، لوحظت خلايا YFP-KRT14 الإيجابية فوق الهيكل ، حيث تم تقريبها بعد علاج التربسين وتمت إزالتها بواسطة خطوة الشطف / المجموعة(الشكل 2G). النواة غير المسمى من LECs(الشكل 2H)، والتي تحتوي على عدد قليل أو معدومة من الخلايا الإيجابية YFP-KRT14 ،(الشكل 2I)انفصلت في وقت لاحق في الجولة الثانية من علاج التربسين.
تم جمع كسور MyoEC وLEC ودمجها ودمجها في 10٪ من ECM مطلية على قاعدة ECM بنسبة 50٪. هذا سمح لدقة بصرية أفضل من organoids التي نمت في المقام الأول على طول الطبقة الأساسية(الشكل 3A). بعد 24 ساعة ، تم تجميع الخلايا في هياكل مجمعة تفتقر إلى حد كبير إلى تجويف(الشكل 3B). بعد 48 ساعة، تشكلت organoids الوليدة كما لومنات المركزية مجوفة وظهرت كمساحة داخلية أخف وزنا(الشكل 3C). بعد 10 أيام ، كانت الأرغن كبيرة ، هياكل متفرعة مع lumens متطورة. تم إصلاح الأجهزة الاعضاء الفسيفساء المتولدة من MyoECs التي تم حصادها من فئران النوع البري والـ LECs التي تم حصادها من فئران ACTb-EGFP في الموقع ، وملطخة بجسم مضاد ضد العلامة القاعدية ألفا السلسة للعضلات actin (SMA) ، وملطخة بوصمة الحمض النووي Hoechst لإظهار النوى. في الأرقام، تعرض طرق العرض العلوية ومقطع مجموعات مختلفة من الصور التي تم جمعها ككومة Z وإعادة بنائها في عرض ثلاثي الأبعاد(الشكل 3D). يكشف المنظر العلوي عن مورفولوجيا الاعضاء المتفرعة(الشكل 3E'). يعرض عرض القسم البنية الظهارية ذات الطبقات المزدوجة والتجويف المفتوح لهذه الأجزاء(الشكل 3E''). ويمكن أيضا أن تكون هذه organoids متمايزة في اليوم 5 باستخدام الفيولوجينيسيس المتوسطة واحتضانها لمدة 5 أيام إضافية(الشكل 3F). نمت الاعضاء أكبر، وكان المزيد من الفروع، وتحتوي على الحليب. تم إنشاء organoids المتباينة كما هو موضح أعلاه ومناعة ملطخة بجسم مضاد موجه ضد علامة الحليب ، بروتين حمضي مصل اللبن (WAP ، الشكل 3F). الواب هو بروتين قابل للذوبان يفرز في الحليب. وقد فُقد الكثير من هذا السائل عندما كانت الخلايا ثابتة وملطخة بالمناعة في الموقع. لذلك ، في طرق العرض العلوية ومقطعية ، يكون تلطيخ WAP مرئيًا داخل الخلايا داخل الخلايا وخارج الخلية في الحليب الذي كان محاصرًا على سطح الخلية أثناء التثبيت(الشكل 3F)، على الرغم من أنه في عرض القسم يبدو أن عضوية صغيرة تحتوي على حليب سائل(الشكل 3F'' تراكب محاصر).
الشكل 1: عزل الأجزاء الثديية. (أ)وصفت التخطيطي من 5 MGs الماوس مع MGs غير المسمى، وموانع يقترن (B)صور من MGs الماوس مع #4 MG محاصر ومكبرة لإظهار كيفية تحديد العقدة الليمفاوية لإزالة. (C)صورة من MGs المفروم في 6 لوحة التصاق منخفضة جيدا مع مسطرة تبين حجم قطع الأنسجة (~ 0.1 ملم لكل منهما). (D-E) خطوات بروتوكول توضيح التخطيط2.7-2.9. (D)تمت تصفية شظايا MG من خلال مصفاة 70 ميكرومتر وشطف 4X. (E)ثم تم عكس مصفاة أكثر من 60 ملم طبق زراعة أنسجة البوليسترين وأفرج عن شظايا في الطبق. (واو)صورة تظهر شظايا الأنسجة المصفاة التي تم جمعها على طبق 60 ملم خالية من ستروما. تشير الأسهم إلى أصغر الأجزاء التي يتم جمعها على مصفاة 70 ميكرومتر. مقياس شريط = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التبوارق. (أ)صورة برايتفيلد تظهر جزء من الأنسجة ملتصقة على طبق البوليسترين، وتشكيل هيكل يشبه الفطائر. (B-C) فصلت الخطوة الأولى من التربس التفاضلية MyoECs التي تظهر بوضوح كخلايا ساطعة ومدورة بعد 3 دقيقة (D) صور الفلورسنت المناعية لـ MyoECs (أسفل) و LECs (أعلى) باستخدام علامة الخلية Cytokeratin 14 (KRT14) لـ MyoECs ، وE-Cadherin (CDH1) علامة الخلية لـ LECs. (E)تم استخدام تعبير KRT14 و CDH1 لتحديد مقدار العائد والنقاء لكسور الخلايا المثقبية بشكل تفاضلي. (F-I). تمثيل الطور التباين والفلورية (YFP) صور شظايا الأنسجة من سيتوكراتين 14 (KRT14)-CreERT1; R26RYFP/+ MGs. تم حقن الفئران مع 75 ملغ / كغ تاموكسيفين 5 أيام قبل الحصاد. (واو)فصل MyoECs (السهام) خلال التربسين-EDTA الأولي (0.05%) 2 دقيقة بعد الحضانة. (G)رش من KRT14-YFP-MyoECs (السهام) على رأس فطيرة من LECs غير المسمى. (H)صورة برايتفيلد من LECs بعد التربس الأولي ومفرزة MyoEC. (I)بعد مفرزة MyoEC، KRT14-YFP-MyoECs لم تعد مرئية كما هو موضح في غياب التعبير YFP. أشرطة المقياس = 30 ميكرومتر (A، brightfield) 100 ميكرومتر (F، brightfield)، 50 ميكرومتر (G، الفلورسينس)، 100 ميكرومتر (H، I). يتم تعديل الألواح A-E من هذا الرقم من Macias et al.19. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الثقافة الأوروية ثلاثية الأبعاد. (أ)التمثيل التخطيطي للخلايا المفردة المضمنة في 10٪ ECM/90٪ متوسط النمو ونمت على 50٪ ECM/50٪ طبقة أساس DMEM (خطوة بروتوكول 4.5). (B-C) الرسوم التوضيحية والصور على النقيض من المرحلة التي تظهر قدرات التنظيم الذاتي السريع للorganoids الثديية الناتجة عن مثقبات مثقبة ومدمجة MyoECs و LECs في 24 ساعة(B)و 48 ساعة(C). الصور التي تم جمعها باستخدام مجهر واسع النطاق الرقمي(D)تمثيل تخطيطي يوضح أعلى (يسار) أو المقطع (اليمين) وجهات النظر المستخدمة في E-F لإظهار الأجزاء المعقمة من المناعة. (E)التمثيل التخطيطي لبئر واحد من شريحة غرفة بئر 8 تحتوي على organoids الثديية نمت لمدة 5-10 أيام في النمو المتوسط. (E'E") عرض أعلى(E') وعرض القسم(E") من organoids المناعة في اليوم 10 من النمو. يتم وضع علامة MyoECs مع العضلات الأكتين السلس (SMA) في أرجواني اللون الزائف. الـ LECs هي من فئران ACTb-EGFP وتظهر باللون الأخضر الزائف. النوى كانت ملطخة بصبغة هويشت (واو)التمثيل التخطيطي لبئر واحد من شريحة غرفة بئر 8 تحتوي على organoids الثديية نمت لمدة 5 أيام في النمو المتوسط و 5 أيام في الفيولوجينيسيس المتوسطة. (F'F"). عرض أعلى(F') وعرض القسم(F") من organoids المناعة في اليوم 10 من النمو. الـ(ميو) غير معلّمة. يتم عرض الـ LECs من فئران ACTb-EGFP باللون الأخضر الزائف. يظهر بروتين الحليب، بروتين مصل اللبن الحمضية (WAP)، باللون الأصفر الزائف اللون في الـ LECs وطلاء التجويفات داخل اللومنات اللورجافيدات. النوى كانت ملطخة بصبغة هويشت الصور التي تم جمعها باستخدام المجهر البؤري القرص الغزل وإعادة بنائها في 3D باستخدام Imaris(E'، E') أو القسم السفلي ~ 30 شرائح(F'، F"). أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر (C)، 20 ميكرومتر (E)، 40 ميكرومتر (F). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| 10 مل | الهضم المتوسطة | |
| المبلغ | كاشف | تلاحظ |
| 9.45 مل | DMEM/F12 | |
| 100 ميكرولتر | مضاد المضادات الحيوية -الأميكتيك (100X) | |
| 0.04 جم | فئة 3 الكولاجين | |
| 0.04 جم | فئة 2 Dispase | |
| 50 ميكرولتر | الجنتاميسين | التركيز النهائي: 500 ميكروغرام |
| 2.5 مل | مصل الأبقار الجنين | التركيز النهائي: 5% (v/v) |
| تمر من خلال مرشح 0.22μm | ||
| 50 مل | متوسطة الصيانة | |
| المبلغ | كاشف | تلاحظ |
| 49.47 مل | DMEM/F12 | |
| 0.5 مل | مضاد المضادات الحيوية -الأميكتيك (100X) | |
| 2.5 مل | مصل الأبقار الجنين | التركيز النهائي: 5% (v/v) |
| 25 ميكرولتر | الانسولين | التركيز النهائي: 250 ميكروغرام |
| 5 ميكرولتر | EGF | التركيز النهائي: 500 نانوغرام |
| 10 مل | متوسط النمو | |
| المبلغ | كاشف | تلاحظ |
| 9.6455 مل | DMEM/F12، لا الفينول الأحمر | |
| 100 ميكرولتر | N-2 الملحق (100x) | |
| 200 ميكرولتر | ملحق B27 بدون فيتامين A (50x) | |
| 10 ميكرولتر | Nrg1 | الأسهم: 100μg/mL |
| 42.5 ميكرولتر | R-spondin | المخزون: 10 ميكروغرام/مل |
| 1 ميكرولتر | مثبط رو Y-27632 | المخزون: 10 ميكرومتر |
| 1 ميكرولتر | EGF | المخزون: 0.1 ميكروغرام/ميكرولتر |
| 10 مل | الفيولوجينيسيس متوسطة | |
| المبلغ | كاشف | تلاحظ |
| 9.6355 مل | DMEM/F12، لا الفينول الأحمر | |
| 100 ميكرولتر | N-2 الملحق (100x) | |
| 200 ميكرولتر | ملحق B27 بدون فيتامين A (50x) | |
| 10 ميكرولتر | Nrg1 | الأسهم: 100μg/mL |
| 42.5 ميكرولتر | R-spondin | المخزون: 10 ميكروغرام/مل |
| 1 ميكرولتر | مثبط رو Y-27632 | المخزون: 10 ميكرومتر |
| 5 ميكرولتر | أوفين الغدة النخامية برولاكتين | التركيز النهائي: 1 ميكروغرام/مل |
| 1 ميكرولتر | ديكساميثازون | التركيز النهائي: 5 ميكروغرام/مل |
| 5 ميكرولتر | الانسولين | التركيز النهائي: 5 ميكروغرام/مل |
| 1 لتر | 10X DPBS | |
| المبلغ | كاشف | تلاحظ |
| 80 جم | NaCl | |
| 2 غرام | KCl | |
| 14.4 جم | NaH2PO4 | |
| 2.4 غرام | KH2PO4 | |
| 1 لتر | di H2O | |
| ملء إلى 800 مل قبل إضافة الكواشف الجافة وتذوب. ملء وحدة التخزين إلى 1 L. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4. الأوتوكلاف لتعقيم. | ||
| 1 لتر | 1X DPBS | |
| المبلغ | كاشف | تلاحظ |
| 100 مل | 10X PBS | |
| 900 مل | di H2O | |
| 1 لتر | PBST | |
| المبلغ | كاشف | تلاحظ |
| 100 مل | 10X PBS | |
| 2.5 مل | تريتون X-100 | |
| 250 مل | 4% بارافورمالديهايد | |
| المبلغ | كاشف | تلاحظ |
| 10 غرام | بارافورمالدهيد | |
| 200 مل | di H20 | يجب أن يكون الماء عند 60 درجة مئوية |
| 25 مل | 10X DPBS | |
| 50 ميكرولتر | 10 ن هيدروكسيد الصوديوم | |
| تمر من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر لتعقيم وضمان درجة الحموضة هو 7.4 | ||
| 10 مل | 1% مصل الحمير | |
| المبلغ | كاشف | تلاحظ |
| 100 ميكرولتر | مصل حمار معقم مصفى | |
| 9.9 مل | 1X DPBS | |
| 10 مل | 0.2% الجليسين | |
| المبلغ | كاشف | تلاحظ |
| 0.02 جم | الجليسين | |
| 10 مل | 1X DPBS | |
الجدول 1: وصفات الحل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا ، يتم تقديم طريقة بالتفصيل كيف يمكن للباحثين توليد الثقافات الاعضاء 3D باستخدام خلايا MG الأولية. الفرق بين هذا والبروتوكولات الأخرى هو أننا بالتفصيل طريقة لفصل اثنين، متميزة مقصورات الخلية MG: MyoECs القاعدية الخارجية وLECs الداخلية. تستخدم طريقتنا تريبسين-EDTA من خطوتين (0.05%) العلاج الذي نسميه التربسينة التفاضلية19. يسمح هذا الإجراء للباحثين بعزل MyoECs و LECs دون استخدام قياس التدفق الخلوي المتطور وبالتالي يمكن استخدامه لدراسة MGs التي يتم حصادها من مجموعة واسعة من أنواع الثدييات التي قد لا تحتوي على المؤشرات الحيوية ذات الخصائص المحددة المطلوبة لنظام مراقبة الأصول الميدانية. القدرة على فصل اثنين من الخلايا الفرعية تمكن الباحثين من تعديل وراثيا الخلايا المعزولة بشكل مستقل أو إعادة دمج الخلايا من الحيوانات التي تؤوي الطفرات الوراثية أو التسميات، وبالتالي توليد organoids الفسيفساء في ثقافة 3D. ومن القيود المفروضة على البروتوكول الحالي أن المقصورة السترومالية غير مدرجة في ظروف الاستزراع. ومع ذلك ، يتم تطوير أساليب جديدة لمكونات الاستزراع السترومالي مع organoids التي تم إنشاؤها من الخلايا الأولية أو خطوط الخلايا إلى خلاصة أفضل في vivo ECM23،24،25،26، ويمكن تكييف هذه الأساليب لهذا البروتوكول. بالإضافة إلى ذلك ، من المهم ملاحظة أنه في حين أن هذا البروتوكول يحقق إثراء كبير ًا لكسور MyoEC و LEC (~ 90٪ تنقية) ، فإن الكسور لا تمثل أنساب الخلايا النقية.
ويعتمد نجاح هذا البروتوكول على عدد من الخطوات الرئيسية. أولا، من المهم أن بلطف ولكن بدقة هضم الأنسجة MG. والإفراط في هضم الأنسجة يؤدي إلى موت الخلايا وانخفاض انتعاش الخلايا الظهارية. وسيؤدي الهضم غير الكامل إلى تلوث الخلايا الدهنية والدهنية، مما يتعارض مع التحليلات اللاحقة (على سبيل المثال، الفلورة المناعية، وتحليل البروتين، وقياسات مرنا). ثانيا، من المهم شطف تماما أنسجة MG لإزالة الخلايا الملوثة في خطوة البروتوكول 2.8. في البروتوكول الخطوة 2.9، يتم تحرير شظايا الأنسجة MG في طبق 60 ملم. يجب على الباحثين مراقبة الشظايا التي تم إطلاقها على الفور ، قبل أن تلتزم بالطبق. إذا لوحظت قطرات الدهون أو الخلايا المفردة، يجب تكرار الخطوات البروتوكولية 2.6 و2.8-2.11. للقيام بذلك ، يتم جمع شظايا الوسط والأنسجة من الطبق ، ووضعها في مصفاة جديدة 70 ميكرومتر ، وغسلها 4X مع 37 درجة مئوية DMEM / F12 ثم يطلق في طبق جديد 60 ملم. ثالثاً، من الضروري مشاهدة أول تريبسين-EDTA (0.05%) حضانة عن كثب لأن MyoECs يمكن فصل في غضون 3 دقيقة الأولى، ولكن ها يمكن أيضا أن تلتزم لمدة تصل إلى 6 دقيقة. كانت هناك حالات عندما التربسين EDTA (0.05٪) كان دون المستوى الأمثل ، والحضانة شرع لمدة 10 دقيقة مع تنقية ناجحة من MyoECs. ومع ذلك ، > 10 دقيقة من التربس نتج عنها في وقت واحد جمع MyoECs و الـ LECs. من المهم أيضا أن يبقى الطبق دون عائق خلال الحضانة الأولى. خلاف ذلك ، يمكن أن يحدث تلوث كسر MyoEC مع LECs. والعكس صحيح أيضا؛ وينبغي أن يكون هناك عدد من الـ إذا لم يتم فصل MyoECs تماما من الطبق، فإنها تلوث الكسر LEC. إذا كان الباحثون يستخدمون الفئران المراسل ة التي تسمي MyoECs أو LECs حصريًا ، فمن الأسهل تصور الانفصال تحت مجهر فلوري(الشكل 2F-I). وأخيراً، إذا كان الباحثون يخططون لتحديد الأجهزة الاعضاء لتحليلات الفلورسينس المناعي، فإن درجة الحموضة (7.4) ودرجة الحرارة (4 درجات مئوية) من PFA 4٪ مهم لنجاح انفصال ECM. إذا تم جمع الأجهزة الاعضاء لإجراء تحليلات أخرى (على سبيل المثال، قياسات البروتين والحمض النووي الريبي)، فمن المهم أن يكون محلول الاسترداد عند 4 درجات مئوية. إذا لم يتم حل ECM ، يمكن تمديد الحضانة مع محلول الاسترداد بمقدار 10 دقيقة (أي 30 دقيقة حضانة إجمالية). ومع ذلك ، فإن فترات الحضانة الأطول ستؤدي إلى فقدان الهيكل ثلاثي الأبعاد وموت الخلايا. يحدد بروتوكول الاسترداد (المدرج في جدول المواد)استخدام نصائح واسعة. هذا مهم للحفاظ على بنية 3D من organoids وكذلك سلامة الخلايا.
وبالإضافة إلى هذه الخطوات الرئيسية الأربع، هناك عاملان يؤثران على نجاح البروتوكول. أولاً، يمكن الحد من نمو الأعضاء بسبب الطفرات الوراثية التي تقلل من انتشار الخلايا وبالتالي تقلل من نمو الأعضاء في ECM. إذا تم الحصول على عدد قليل من الأجهزة الاعضاء ، فإن خطوة التثبيت اللاحقة تؤدي في كثير من الأحيان إلى فقدانها. لمعالجة هذا، يجب زيادة عدد الخلايا المضمنة في ECM مع الاحتفاظ بنسبة MyoECs:LECs (الخطوات البروتوكول4.1-4.2). ثانياً، بمجرد نقل الخلايا إلى إدارة المحتوى في شرق أفريقيا، من المهم مراقبة نموها يومياً وتوخي الحذر بشأن تجديد وسائل الإعلام (كل يومين أو ثلاثة أيام). يحدد هذا البروتوكول الكواشف الحرة الحمراء الفينول للحصول على تصور أفضل، ولكن يتم تحقيق نفس النجاح والنمو باستخدام الكواشف الإيجابية الحمراء الفينول. وينبغي أن يتم تنفيذ الأيام التي يحدث فيها التجديد المتوسط قبل التثبيت (الخطوة 4.6 بروتوكول) بعناية فائقة للحد من فقدان الخلايا. الطبقة العليا 10٪ ECM هو حساسة. ولذلك ينبغي أن يؤديها السُبُل أو التجديد المتوسط بواسطة سائل الأنابيب أسفل جدران الغرفة لتقليل الاضطرابات الميكانيكية.
التمايز من organoids في أشيني المنتجة للحليب يتطلب العلاج مع ملاحق التمايز: الهيدروكورتيزون أو ديكساميثازون, الأنسولين, والبرولاكتين. في هذا البروتوكول، ينصح ديكساميثازون. وبالإضافة إلى ذلك، في حين البرولاكتين هو متاح تجاريا، تم الحصول على البرولاكتين المستخدمة في هذا البروتوكول من البرنامج الوطني للهرمون والببتيد. مرة أخرى ، من المهم جدا ترك organoids دون عائق عند تغيير متوسط الفيولوجينيس. التمايز يتطلب 5 أيام كحد أدنى. يمكن تمديد هذا آخر 3-5 أيام، ولكن الطبقة الأساسية من ECM تتحلل بعد 10-12 يوما. يتم تعبئة organoids المتباينة مع الحليب والتجويفات تبدو أكثر قتامة.
هذه هي تقنية فعالة التي يمكن استخدامها لمعالجة المقصورة محددة، ومساهمات النسب إلى تكوين المورفوجينية الثديية والتمايز. مع هذه التقنية، يمكن للباحثين توليد organoids الفسيفساء التي تتألف من MyoECs المتلاعبة وراثيا تفاضليا وLECs21، أو MyoECs وLECs التي تم الحصول عليها من الفئران التي تؤوي طفرات جينية مختلفة. وهذا يسمح للباحثين لفهم أفضل لمساهمات الأجزاء الخلية الخاصة بالنسب في تكوين الأعضاء واكتساب وظائف متخصصة مثل إنتاج الحليب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
نشكر بن أبرامز على المساعدة التقنية والدعم الأساسي من معهد جامعة كاليفورنيا في سانتا كروز لبيولوجيا الخلايا الجذعية (IBSC). نشكر سوزان ستروم وبيل ساكستون لاستخدام Solamere الغزل القرص المجهر كونكورسي. تم دعم هذا العمل جزئيًا من خلال المنح المقدمة إلى UCSC من معهد هوارد هيوز الطبي من خلال زمالات جيمس جيليام للدراسة المتقدمة (S.R.) ، من المعاهد القومية للصحة (NIH GM058903) لمبادرة تحقيق أقصى قدر من تنمية الطلاب (H.M. ومن المؤسسة الوطنية للعلوم للحصول على زمالة أبحاث الدراسات العليا (O.C. DGE 1339067) ومنحة (A18-0370) من لجنة تنسيق أبحاث السرطان في جامعة كاليفورنيا (LH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352096 | |
| 24 well ultra-low attachment plate (Corning) | Fisher Scientific | CLS3473-24EA | |
| 35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353001 | |
| 50 ml High-Clarity polypropylene conical tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352098 | |
| 60 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353004 | |
| 70 µM nylon cell strainer (Corning) | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Pen/Strep also works |
| B27 supplement without vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| B6 ACTb-EGFP mice | The Jackson Laboratory | 003291 | |
| BD Insulin syringe 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| Class 2 Dispase (Roche) | Millipore Sigma | 4942078001 | |
| Class 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004206 | |
| Corning Cell Recovery solution | Fisher Scientific | 354253 | Follow the guidelines for use – Extraction of Three-Dimensional Structures from Corning Matrigel Matrix |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment 6-well | Fisher Scientific | CLS3471 | |
| Dexamethasone | Millipore Sigma | D4902-25MG | |
| DMEM/F12, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11039-021 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington Biochemical | LS002007 | |
| Donkey anti-Goat 647 | Thermo Fisher Scientific | A21447 | Use at 1:500, Lot: 1608641, stock 2 mg/mL, RRID:AB_2535864 |
| Donkey anti-Mouse 647 | Jackson ImmunoResearch | 715-606-150 | Use at 1:1000, Lot: 140554, stock 1.4 mg/mL |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Thermo Fisher Scientific | 11330-057 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-250 | Without Mg2+/Ca2+ |
| EGF | Fisher Scientific | AF-100-15-100ug | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068–085 | 100% US Origin, premium grade, Lot: 059B18 |
| Fluoromount-G (Southern Biotech) | Fisher Scientific | 0100-01 | Referred to as mounting media in text |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Goat anti-WAP | Santa Cruz Biotech | SC-14832 | Use at 1:250, Lot: J1011, stock 200 µg/mL, RRID:AB_677601 |
| Hoechst 33342 | AnaSpec | AS-83218 | Use 1:2000, stock is 20mM |
| Insulin | Millipore Sigma | I6634-100mg | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| KRT14–CreERtam | The Jackson Laboratory | 5107 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR); Phenol Red-Free; 10 mL | Fisher Scientific | CB-40230C | Lot: 8204010, stock concentration 8.9 mg/mL |
| MillexGV Filter Unit 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGV033RS | |
| Millicell EZ SLIDE 8-well glass, sterile | Millipore Sigma | PEZGS0816 | These chamber slides are great for gasket removal but other brands can work well (e.g. Lab Tek II). |
| Mouse anti-SMA | Millipore Sigma | A2547 | Use at 1:500, Lot: 128M4881V, stock 5.2 mg/mL, RRID:AB_476701 |
| N-2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S671-3 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | S468-500 | |
| Nrg1 | R&D | 5898-NR-050 | |
| Ovine Pituitary Prolactin | National Hormone and Peptide Program | Purchased from Dr. Parlow at Harbor-UCLA Research and Education Institute | |
| Paraformaldahyde | Millipore Sigma | PX0055-3 | |
| Pentobarbital | Millipore Sigma | P3761 | |
| R26R-EYFP | The Jackson Laboratory | 6148 | |
| Rho inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| R-spondin | Peprotech | 120-38 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | x100-500ML | Laboratory grade |
| Trypsin EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 |
References
- Macias, H., Hinck, L. Mammary gland development. Wiley Interdisciplinary Reviews in Developmental Biology. 1 (4), 533-557 (2012).
- Daniel, C. W., De Ome, K. B., Young, J. T., Blair, P. B., Faulkin, L. J. Jr The in vivo life span of normal and preneoplastic mouse mammary glands: a serial transplantation study. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 61 (1), 53-60 (1968).
- Ip, M. M., Asch, B. B. Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. , Kluwer Academic/Plenum Publishers. (2000).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
- Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
- Lasfargues, E. Y. Cultivation and behavior in vitro of the normal mammary epithelium of the adult mouse. II. Observations on the secretory activity. Experimental Cell Research. 13 (3), 553-562 (1957).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Orkin, R. W., et al. A murine tumor producing a matrix of basement membrane. Journal of Experimental Medicine. 145 (1), 204-220 (1977).
- Lee, E. Y., Parry, G., Bissell, M. J. Modulation of secreted proteins of mouse mammary epithelial cells by the collagenous substrata. Journal of Cell Biology. 98 (1), 146-155 (1984).
- Lee, E. Y., Lee, W. H., Kaetzel, C. S., Parry, G., Bissell, M. J. Interaction of mouse mammary epithelial cells with collagen substrata: regulation of casein gene expression and secretion. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 82 (5), 1419-1423 (1985).
- Bissell, M. J., Barcellos-Hoff, M. H. The influence of extracellular matrix on gene expression: is structure the message? Journal of Cell Science. 8 (Suppl), 327-343 (1987).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Jarde, T., et al. Wnt and Neuregulin1/ErbB signalling extends 3D culture of hormone responsive mammary organoids. Nature Commununications. 7, 13207 (2016).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Daniel, C. W., Strickland, P., Friedmann, Y. Expression and functional role of E- and P-cadherins in mouse mammary ductal morphogenesis and growth. Developmental Biology. 169 (2), 511-519 (1995).
- Runswick, S. K., O'Hare, M. J., Jones, L., Streuli, C. H., Garrod, D. R. Desmosomal adhesion regulates epithelial morphogenesis and cell positioning. Nature Cell Biology. 3 (9), 823-830 (2001).
- Chanson, L., et al. Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 108 (8), 3264-3269 (2011).
- Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. Journal of Visualized Experiments. (106), e53179 (2015).
- Macias, H., et al. SLIT/ROBO1 signaling suppresses mammary branching morphogenesis by limiting basal cell number. Developmental Cell. 20 (6), 827-840 (2011).
- Welm, B. E., Dijkgraaf, G. J., Bledau, A. S., Welm, A. L., Werb, Z. Lentiviral transduction of mammary stem cells for analysis of gene function during development and cancer. Cell Stem Cell. 2 (1), 90-102 (2008).
- Smith, P., et al. VANGL2 regulates luminal epithelial organization and cell turnover in the mammary gland. Scientific Reports. 9 (1), 7079 (2019).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
- Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology. PLoS One. 6 (9), e25661 (2011).
- Labarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture. Journal of Visualized Experiments. (71), e50011 (2013).
- Marlow, R., Dontu, G. Modeling the breast cancer bone metastatic niche in complex three-dimensional cocultures. Methods in Molecular Biology. 1293, 213-220 (2015).
- Koledova, Z., Lu, P. A 3D Fibroblast-Epithelium Co-culture Model for Understanding Microenvironmental Role in Branching Morphogenesis of the Mammary Gland. Methods in Molecular Biology. 1501, 217-231 (2017).
