Summary
La glande mammaire est une structure bilayered, comprenant des cellules épithéliales myoépitheliales et internes intérieures. Présenté est un protocole pour préparer les organoïdes à l’aide de la trypsinisation différentielle. Cette méthode efficace permet aux chercheurs de manipuler séparément ces deux types de cellules pour explorer les questions concernant leurs rôles dans la forme et la fonction des glandes mammaires.
Abstract
Les organoïdes offrent des structures tissulaires en trois dimensions auto-organisation qui récapitulent les processus physiologiques dans la commodité d’un plat. La glande mammaire trouble trouble murine est composée de deux compartiments cellulaires épithéliaux distincts, servant différentes fonctions : le compartiment myoépitheléial externe et contractile et le compartiment luminal interne et sécréoire. Ici, nous décrivons une méthode par laquelle les cellules comprenant ces compartiments sont isolées et ensuite combinées pour étudier leurs contributions individuelles de lignée à la morphogenèse et à la différenciation de glande mammaire. La méthode est simple et efficace et ne nécessite pas de technologies de séparation sophistiquées telles que le tri des cellules activées par fluorescence. Au lieu de cela, nous récoltons et digérons enzymatiquement le tissu, ensemencent l’épithélium sur les plats de culture de tissu adhérents, puis employons la trypsinisation différentielle pour séparer le myoepithelial des cellules luminales avec la pureté de 90%. Les cellules sont ensuite plaquées dans une matrice extracellulaire où elles s’organisent en organoïdes bilayered, tridimensionnels (3D) qui peuvent être différenciés pour produire du lait après 10 jours dans la culture. Pour tester les effets des mutations génétiques, les cellules peuvent être récoltées à partir de modèles de souris de type sauvage ou génétiquement modifiés, ou elles peuvent être manipulées génétiquement avant la culture 3D. Cette technique peut être utilisée pour générer des organoïdes en mosaïque qui permettent l’étude de la fonction génique spécifiquement dans le compartiment luminal ou myoépélien.
Introduction
La glande mammaire (MG) est une structure épithéliale tubulaire ressemblant à un arbre encastrée dans un stroma riche en adipocytes. L’épithélium canalaire bilayered comprend une couche externe basale de cellules contractiles et myoépithelial (MyoECs) et une couche interne de cellules épithéliales luminales et sécrétrices (LEC), encerclant un lumen central1. Pendant la lactation lorsque les MyoEC externes se contractent pour presser le lait des LEC alvéolaires intérieurs, le MG subit de nombreux changements qui sont sous le contrôle de facteurs de croissance (p. ex., EGF et FGF) et d’hormones (p. ex. progestérone, insuline et prolactine). Ces changements provoquent la différenciation des structures spécialisées, les alvéoles, qui synthétisent et sécrètent du lait pendant la lactation1. L’épithélia mammaire peut être manipulée expérimentalement à l’aide de techniques dans lesquelles soit des fragments épithéliaux de tissu, des cellules, ou même une seule cellule basale sont transplantés dans des coussinets de graisse mammaire hôte, précoléarisés du parenchyme mammaire endogène, et a permis de se développer pour reconstituer un arbre épithélial completentier,3,,4,5. La transplantation est une technique puissante, mais elle prend beaucoup de temps et impossible si une mutation entraîne une létalité embryonnaire précoce (avant E14) qui empêche le sauvetage de l’anlage mammaire transplantable. En outre, les chercheurs souhaitent fréquemment faire des recherches sur les rôles des deux compartiments différents, qui sont dérivés de cellules progénitrices restreintes à la lignée. Bien que la technologie Cre-lox permette une manipulation génétique différentielle des MyoEC et des LEC, il s’agit également d’une entreprise longue et coûteuse. Ainsi, depuis les années 1950, les chercheurs ont utilisé des organoïdes mammaires in vitro comme un moyen relativement facile et efficace de répondre aux questions concernant la structure et la fonction des tissus mammaires6,,7.
Dans les premiers protocoles décrivant l’isolement et la culture des cellules épithéliales mammaires primaires, les chercheurs ont constaté qu’une matrice de membrane de sous-sol (BME), composée d’un caillot de plasma et d’extrait d’embryon de poulet, était nécessaire pour des fragments de MG cultivés sur un plat6. Dans les décennies suivantes, des matrices extracellulaires (ECMs, collagène, et la matrice de protéines gelées sécrétées par les cellules de sarcome murine Engelbreth-Holm-Swarm) ont été développées pour faciliter la culture 3D et mieux imiter l’environnement in vivo7,8,9,10. Cellules de culturing dans des matrices 3D indiquées par de multiples critères (morphologie, expression génique, et réactivité hormonale) qu’un tel microenvironnement de meilleurs modèles dans les processus physiologiquesvivo 9,10,11,12. La recherche utilisant les cellules murines primaires a identifié des facteurs de croissance et des morphogènes clés nécessaires pour l’entretien prolongé et la différenciation des organoïdes13. Ces études ont préparé le terrain pour le protocole présenté ici, et pour la culture des cellules mammaires humaines comme organoïdes 3D, qui est maintenant un outil clinique moderne, permettant la découverte de médicaments et le dépistage des médicaments sur les échantillons de patients14. Dans l’ensemble, le culturing organoïde met en évidence les capacités d’auto-organisation des cellules primaires et leurs contributions à la morphogenèse et à la différenciation.
Présenté ici est un protocole à la culture épithélia murine qui peut être différencié en acini producteur de lait. Une technique de trypsinisation différentielle est utilisée pour isoler les MyoEC et les LEC qui composent les deux compartiments cellulaires MG distincts. Ces fractions de cellules séparées peuvent alors être manipulées génétiquement pour surexprimer ou renverser la fonction du gène. Parce que la lignée intrinsèque, l’auto-organisation est une propriété innée de cellules épithéliales mammaires15,16,17, recombiner ces fractions cellulaires permet aux chercheurs de générer bilayered, organoïdes mosaïques. Nous commençons par digérer enzymatiquement le tissu adipeux, puis incuber les fragments mammaires sur un plat de culture tissulaire pour 24 h (figure 1). Les fragments de tissu s’installent sur les plats en polystyrène comme fragments bilayered avec leur organisation in vivo : couche myoepithelial externe entourant les couches lumineuses intérieures. Cette organisation cellulaire permet l’isolement des MyoECs externes par trypsin-EDTA (0,05 %) traitement pour 3-6 min suivi d’un deuxième tour de trypsin-EDTA (0,05%) traitement qui détache les LEC intérieurs restants(figure 2). Ainsi, ces types de cellules avec une sensibilité différente à la trypsine sont isolés et peuvent ensuite être mélangés et plaqués dans ECM(figure 3). Les cellules subissent l’auto-organisation pour former des sphères bilayered, comprenant une couche externe de MyoECs entourant les LEC intérieurs. La formation de Lumen se produit pendant que les cellules se développent dans un milieu contenant un cocktail de facteurs de croissance (voir recettes pour le milieu de croissance)13. Après 5 jours, les organoïdes peuvent être différenciés en acini producteurs de lait en passant à Alveologenesis Medium (voir recettes et figure 3F) et incubés pendant encore 5 jours. Alternativement, les organoïdes continueront à se développer et se brancheront dans Growth Medium pendant au moins 10 jours. Les organoïdes peuvent être analysés à l’aide d’immunofluorescence(figure 3D-F)ou libérés de l’ECM à l’aide d’une solution de récupération (voir tableau des matériaux)et analysés par d’autres méthodes (p. ex., immunoblot, RT-qPCR).
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Protocol
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de Californie à Santa Cruz.
1. Jour 1 : Digestion des glandes mammaires
- Préparez-vous à récolter les GM de souris femelles matures de 10 à 14 semaines.
- Effectuer la récolte sur un banc ouvert dans des conditions aseptiques.
- Stériliser tous les fournitures chirurgicales, les planches à liège et les broches en autoclaving et en trempant dans 70% d’alcool pendant 20 minutes avant la chirurgie.
- Anesthésiez les animaux atteints de pentobarbital de sodium (dose anesthésique 2X de 0,06 mg/g de poids corporel) administrés par injection intraperitonéale avec une seringue à insuline de 0,5 mL.
- Surveillez le niveau d’anesthésie en pinçant les tocoups de l’animal pour vérifier une réponse réflexe et commencer le protocole seulement après que l’animal est entièrement anesthésié.
- Placez l’animal sur le dos, épinglez ses appendices sur le carton de liège et essuyez son abdomen et sa poitrine avec de l’éthanol.
- Pour récolter les #2, 3, 4 et 5 MG d’une souris (c.-à-d., 8 MG, figure 1A), identifier la ligne médiane entre les deux pattes postérieures et faire une petite incision (1 cm) sur la peau abdominale avec des ciseaux pointus, puis étendre la coupe jusqu’au cou18.
- Suivez en faisant de petites coupures latéralement vers les jambes et les bras pour permettre la libération de la peau à l’aide d’un coton-tige. Éloignez la peau et étirez-la serrée avant de l’épingler d’un côté(figure 1B, étape 1)18. Retirez les GM en coupant sous eux, et retirez les ganglions lymphatiques des glandes #4 (figure 1B, étapes 2, 3)18. Répétez la procédure de l’autre côté du corps.
- Recueillir le tissu MG dans 50 ml de 4 'C Dulbecco’s Modified Eagle’s Media (DMEM)/Nutrient Mixture F12 (F12) complété par 5% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1X Antibiotique-antimycotique (Anti-Anti)18.
- Hacher les glandes dans un plat de 35 mm ou sur une plaque en céramique à l’aide d’une lame de rasoir ou d’un hélico. Faites pivoter la plaque toutes les cinq côtelettes manuelles ou chaque tour sur l’hélico de tissu jusqu’à ce que les morceaux de tissu puissent s’adapter à une pointe de micropipette de 1 ml avec facilité (0,1 mm/fragment, figure 1C).
- Digest les GM dans Le milieu de la digestion (voir tableau 1) pendant 14 h dans un plat d’adhérence 6 puits à 37 oC, 5% de CO2.
2. Jour 2 : Isolement des fragments mammaires épithéliaux de tissu
- Après 14 h de digestion, mélanger délicatement en tuyautant le tissu digéré 10X à l’aide d’une micropipette de 1 ml pour décomposer tout tissu stroma ou adipeux restant, en veillant à ce que ni les bulles ni l’excès de force mécanique ne soient générés.
REMARQUE : S’il y a une digestion incomplète après 14 h, cela pourrait être dû à l’accumulation d’ADN cisaillement. Dans ce cas, ajouter 1 l de 1 mg/mL deoxyribonuclease I (DNase I) par 2 ml de Digestion Medium. Incuber pour un autre 30 min à 37 oC, 5% de CO2. - Recueillir les tissus dans un tube de 15 ml et rincer le puits utilisé pour la digestion avec 2-3 ml de culture tissulaire grade 1X Dulbecco Phosphate Buffered Saline (DPBS) exempt de Ca2 et Mg2 . Centrifugeuse à 600 x g pour 10 min.
- Évacuer le supernatant contenant la couche lipidique et le milieu, puis réutilisez la pastille dans 5 ml de DPBS et passez à un nouveau tube de 15 ml. Centrifugeuse à 600 x g pour 10 min.
- Pendant la centrifugation, placez une passoire à cellules en nylon de 70 m dans un tube de 50 ml et prélasse la passoire à l’aide de 10 ml de DMEM/F12 de 37 oC.
- Résuspendez des fragments de tissu de l’étape du protocole 2.4 utilisant 5 ml de DPBS et passez la suspension par une passoire de cellules en nylon de 70 m pour enlever les cellules stromales et les cellules mononiques(figure 1D).
- Recueillir les fragments de tissu sur la passoire cellulaire. Rincer 4X avec 10 ml de DMEM/F12 de 37 oC(figure 1D).
CAUTION : Le rinçage incomplet entraînera des cultures contaminées par des cellules non épithéliales. - Relâchez les fragments de tissu en tenant l’onglet de pasoire avec les doigts gantés, en inversant la passoire sur un plat de culture tissulaire de 60 mm et en passant 1 mL d’aliquots de maintenance moyenne (voir tableau 1) à travers le fond de la pasoire 4X (figure 1E).
- Vérifiez la passoire pour les restes de fragments de tissu, qui seront visibles à l’œil nu, et rincez la passoire 1X plus avec 1 mL de milieu d’entretien si des fragments adhèrent encore à la passoire. Les fragments de tissus rincés doivent maintenant être exempts de cellules stromales.
- Examinez rapidement le plat de 60 mm contenant les fragments de MG de l’étape 2.9 du protocole sous un microscope inversé (objectif 4X ou 10X, figure 1F). Une préparation typique de huit MG donne 500 fragments. Recherchez des cellules simples ou des gouttelettes de graisse et s’il y a des cellules contaminantes.
REMARQUE : S’il y a des cellules contaminantes, répétez l’étape de filtration en recueillant le milieu et les fragments du plat de 60 mm à l’aide d’une pipette de 5 ml et en filtrant à nouveau le fragment à travers une souche fraîche de 70 m, en répétant les étapes du protocole 2,6, 2,8-2,10. - Incuber 24 h à 37 oC, 5% de CO2, permettant au fragment de tissu d’adhérer et de générer des fragments bicouches(figure 2A).
REMARQUE : Si les fragments ne se sont pas installés à 24 h, continuez à incuber jusqu’à ce qu’ils soient respectés. Si les fragments n’adhèrent pas bien, la séparation des compartiments cellulaires ne fonctionnera pas. Si les chercheurs sont préoccupés par l’adhérence, les plaques de culture tissulaire peuvent être traitées pour favoriser l’attachement des fragments (p. ex., poly-L-lysine).
3. Jour 3 : Trypsinisation différentielle des cellules épithéliales myoépitheliales et luminales
- Pour séparer les MyoEC des LEC, videz les supports du plat, rincez 1x avec 1 ml de DPBS et ajoutez 1 ml de trypsin frais-EDTA (0,05 %), et surveillez attentivement la digestion sous un microscope inversé (objectif 10X ou 20X, figure 2B,C,F). Le détachement de la couche MyoEC externe nécessitera 3-6 min, selon trypsin-EDTA (0,05%) Force.
REMARQUE : Veuillez consulter la figure 2 pour les images représentatives montrant ce processus. Sous l’éclairage de champ lumineux, les MyoECs semblent arrondis et ont une apparence plus lumineuse par rapport aux LEC, qui restent adhérés au centre et semblent plus foncés. - Recueillir la fraction MyoEC dans un tube de 15 mL contenant 2 mL 10% FBS/DPBS. Sans déranger les LEC, rincez doucement le plat de 60 mm avec 2 ml de DPBS, puis éliminez le DPBS(figure 2H-I).
REMARQUE: La récupération habituelle pour les MyoECs est dans une fourchette de (3,5 x 106-1,5 x 106) selon la taille des MGs. - Pour enlever la fraction LEC, ajouter 1 ml de trypsin-EDTA (0,05 %) à nouveau au plat et incuber 7-15 min, la surveillance soigneusement pour prévenir la surdigestion. Étécher la trypsine-EDTA (0,05%) sur le plat avec 2 ml de FBS/DPBS à 10%. Recueillir la fraction LEC dans un nouveau tube de 15 ml.
REMARQUE : La récupération habituelle des LEC se situe dans une fourchette (2 x 106-4,2 x 106) selon la taille des GM. Systématiquement, la pureté des deux fractions comme l’analyse l’immunohistochimie est de 90 %19 (figure 2E). - Centrifugeuse chaque fraction pendant 5 min à 300 x g pour enlever la trypsine-EDTA (0,05%). Réutilisez la granule dans 250 l de maintenance moyenne et comptez chaque population cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur cellulaire automatisé. Placer les cellules sur la glace tout en comptant.
REMARQUE : Si la manipulation génétique des fractions cellulaires est désirée, les cellules primaires peuvent être cultivées sur des plats d’adhérence basse et infectées par le lentivirus20.
4. Jour 3 : Combiner et intégrer des fractions cellulaires dans une matrice extracellulaire
REMARQUE : Une fois que les fractions MyoEC et LEC ont été collectées et comptées, elles peuvent être combinées. Le ratio MyoEC/LEC typique est de 1:3 (figure 3A)19. Différentes études peuvent être réalisées. Par exemple, pour effectuer des études en mosaïque, des fractions peuvent être générées à partir de souris de type sauvage (WT) et mutantes (Mut) et combinées (MyoEC/LEC : WT/WT; WT/Mut; Mut/WT; Mut/Mut)21, ou fractions peuvent être combinés en utilisant différents ratios de MyoECs/LECs19.
- En fonction du nombre de cellules, calculez le nombre de puits (8 puits de chambre, voir Tableau des matériaux) qui doivent être préparés pour 12 000 cellules/puits (p. ex. 3 000 MyoEC : 9 000 LEC).
- Établir la couche de base de la culture 3D en ajoutant 90 L de 50% ECM (50% ECM/50% DMEM/F12, sans phénol rouge - voir le tableau des matériaux) à chacun puits. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles et que les puits sont enduits uniformément. Pour solidifier la couche de base, incuber les diapositives à 37 oC, 5% de CO2 pendant 30 min.
REMARQUE : L’ECM doit rester glacé jusqu’à cette étape, sinon elle polymérisera prématurément et conduira à un revêtement de base et à une polymérisation inégales. L’utilisation d’un ECM de base améliore la croissance organoïde dans un seul plan, ce qui facilite la capture d’image. Cela permet également une croissance organoïde plus rapide et utilise moins ECM22. - Pendant la polymérisation, préparer les mélanges cellulaires. Pelletez les fractions MyoEC et LEC à 300 x g pendant 5 min et réutilisez chaque fraction cellulaire dans 10% ECM/90% Medium croissance de sorte que chaque puits a 100 ll (voir le tableau 1 pour la façon de faire la croissance moyenne).
REMARQUE : Pour faciliter la préparation, répliquez les puits à l’aide des mêmes mélanges cellulaires. Ceux-ci peuvent être combinés et préparés dans un tube (p. ex., quatre puits d’un même mélange cellulaire peuvent être préparés en 400 L de 10% ECM/90% Croissance Moyenne). - Ajouter 100 l de chaque mélange cellulaire dans 10% ECM/90% Croissance Moyenne à chaque puits et permettre aux organoïdes de se contenter de 20 min à 37 oC, 5% de CO2.
- Une fois que les cellules se sont installées, ajoutez délicatement 100 L de Medium de croissance en détraquant doucement la paroi de la chambre de chaque puits. Incuber les diapositives à 37 oC, 5% de CO2 (voir la figure 3A pour la composition totale de chaque puits).
REMARQUE : L’inhibiteur de Rho Kinase, R-spondin, et Nrg1 sont des facteurs qui ont été identifiés comme importants pour la culture à long terme des organoïdes cultivés à partir des cellules mammaires murines primaires et des cellules cancéreuses humaines du sein13,14. En outre, les facteurs de cellules souches B27 et N2 prolongent le temps que les organoïdes peuvent être cultivés. - Cellules d’image tous les 24 h pour suivre leur croissance et renouveler doucement le milieu de croissance tous les 2-3 jours en utilisant 100 L/puits(figure 3B-E).
REMARQUE : Utilisez un soin extrême lors du renouvellement du médium. Inclinez les toboggans de chambre pour recueillir le milieu à un coin des puits. Retirez 100 l’eau du milieu et réapprovisionnez-le avec soin pour laisser la couche ECM intacte. - Si les chercheurs sont intéressés à étudier la lactation/alvéoloogenèse, passez à Alveologenesis Medium (voir tableau 1) le jour 5 et continuez à renouveler le milieu tous les 2-3 jours jusqu’au jour 10(figure 3F) ou au-delà en passant en utilisant la solution de récupération (voir le tableau des matériaux)13.
REMARQUE : À ce stade, les organoïdes peuvent être isolés de l’ECM en incuber à 4 oC dans la solution de récupération de 4 'L de 4 'C (voir tableau des matériaux pour le protocole et les informations de réactif).
5. Jour 5 ou 10 : Correction et immunostachation des organoïdes
- Retirez soigneusement le milieu en dépisant doucement les supports (une pipette à ampoule fonctionne mieux). Rincez chaque puits à l’aide de 200 L de saline tamponnée au phosphate de 1x Dulbecco (DPBS, voir recettes).
- Fixer les organoïdes à l’aide de paraformaldéhyde (PFA) à froid (4 oC) (w/v) pendant 10 min à température ambiante.
CAUTION: PFA est dangereux. Portez de l’équipement de protection individuelle (manteau de laboratoire, gants et lunettes de sécurité). Cette étape doit être effectuée à l’intérieur d’une hotte à fumée.
REMARQUE : L’ECM est dissoute par le traitement PFA. L’ablation incomplète d’ECM peut mener à la coloration de fond quand les organoïdes sont analysés par immunofluorescence. - Retirez le PFA de 4 % et ajoutez 200 L de 0,2 % (w/v) glycine/DPBS (voir tableau 1) à chaque puits. Incuber les toboggans à température ambiante pendant 30 min ou 4 oC pendant la nuit sur une surface rocheuse réglée à un réglage lent.
REMARQUE : Les organoïdes peuvent être entreposés pendant 1 à 3 jours dans le DPBS à 4 oC avant l’étape suivante. - Perméabiliser les organoïdes à l’aide de DPBS - 0,25% Triton X-100 (PBST, voir tableau 1) pendant 10 min à température ambiante.
- Bloquer les organoïdes à l’aide de sérum d’âne (DS) (ou tout autre sérum correspondant à l’espèce de l’anticorps secondaire) dans DPBS pendant 1 h sur une surface rocheuse.
REMARQUE : Cette étape peut être effectuée toute la nuit à 4 oC sur une surface rocheuse. - Préparer les anticorps primaires dans 1% DS/DPBS. Utilisez 125-200 L pour chaque puits. Effectuez l’immunostaining en incuber les organoïdes dans l’anticorps primaire pendant la nuit à 4 oC sur une surface rocheuse.
6. Jour 11 : Immunofluorescence complète
- Laver chaque puits 2X avec 200 T PBST pendant 5 min. Ajouter l’anticorps secondaire dans 1% DS/DPBS en utilisant 125-200 L pour chaque puits. Incuber à température ambiante sur une surface rocheuse pendant 45 min.
- Laver chaque puits 2X à l’aide de 200 T PBST par puits.
- Tacher les noyaux à l’aide de colorant à ADN Hoechst dans DPBS (1:2,000 en DPBS) pendant 5 minutes à température ambiante.
- Retirer tout le liquide laissé sur le puits en s’aspirant doucement avec un aspirateur.
- Retirez soigneusement les chambres et le joint, placez une goutte (30 l) de supports de montage (voir tableau des matériaux) sur chaque puits et couvre-porte, en prenant soin d’enlever les bulles. Laisser sécher lame dans un espace sombre pendant 1-2 jours. Sceller avec du vernis à ongles clair. Imagez les organoïdes sur un microscope confocal (figure 3E-F).
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Representative Results
Le protocole présenté ici décrit une méthode pour étudier les contributions spécifiques de lignée des cellules épithéliales mammaires en faisant usage des organoïdes de mosaïque. Pour obtenir les cellules murines primaires pour les organoïdes, l’épithélium de la glande mammaire doit d’abord être isolé du stroma riche en adipocytes environnant(figure 1). Ce processus est décrit brièvement ici et est également décrit dans une étude précédemment publiée18. Pour obtenir suffisamment de cellules, il est recommandé d’enlever #2, 3, 4 et 5 MG(figure 1A). Une étape importante clé pour isoler une population pure de cellules épithéliales est l’ablation des ganglions lymphatiques des #4 MG, qui sont riches en cellules immunitaires qui contamineront la préparation(figure 1A,B). Les MG ont été hachés pour générer des fragments de 0,1 mm de taille(figure 1B). Les fragments de tissu ont ensuite été digérés enzymatiquement, un processus se produisant en présence de collagène, pour libérer l’épithélia du stroma, et en l’absence de trypsine, pour empêcher la digestion des protéines telles que les cadherines qui maintiennent des contacts cellule-cellule. Le tissu digéré a ensuite été centrifugé pour enlever les lipides et filtré à travers une passoire cellulaire et lavé(figure 1C). Des fragments épithéliaux, adhérant à la passoire, ont été libérés en inversant le filtre et en lavant la membrane, qui a transféré les fragments épithéliaux sur un plat en polystyrène(figure 1D). Ces fragments sont apparus comme de petites structures ramifiées(figure 1E).
Les fragments épithéliaux purifiés ont été incubés pendant 24 h. Ils se sont installés sur le plat et ont adhéré, formant des structures plates ressemblant à des crêpes avec une couche extérieure de MyoECs encerclant les LEC intérieurs(figure 2A-B). La figure 2C montre le bord d’une telle structure ressemblant à une crêpe d’un animal de type sauvage. Le traitement de trypsine a détaché différemment les MyoEC, qui se sont détachés en premier et sont apparus comme des cellules brillantes et arrondies qui encerclaient le noyau des LEC cuboïdales restants(figure 2C,F). Le détachement des MyoECs a fait l’objet d’un suivi minutieux à l’aide d’une microscopie à champ lumineux et s’est produit dans un délai de 3 à 6 min. Une fois que les MEC ont été recueillis, les CNE ont par la suite été détachés au moyen d’un deuxième traitement plus long de la trypsine de 7 à 15 min. Le temps requis pour le détachement cellulaire dépend de la concentration et de la fraîcheur de la trypsine. La pureté globale des deux compartiments cellulaires était de 90 %, comme en a expliqué le comptage des cellules KRT14-positives et E-Cadherin (CDH1)-négative dans la fraction MyoEC et les cellules qui étaient KRT14-négatives et E-Cadherin-positive dans la fraction LEC(figure 2D-E)19. Nous avons découvert que certains des MyoECs ont été retirés du haut de la structure en forme de crêpe ainsi que des bords extérieurs. Ceci a été observé en utilisant des fragments de tissu recueillis auprès de souris étiquetées avec un marqueur basal fluorescent inductible (Cytokeratin 14 (KRT14)-CreERT1; R26RYFP/MD) et injecté avec 75 mg/kg de tamoxifène 5 jours avant la récolte. Dans la figure 2F,G, le détachement de MyoECs des bords de la structure des crêpes est évident. Cela s’est produit dans les 2 premières minutes de traitement de la trypsine(figure 2F). En outre, des cellules positives YFP-KRT14 ont été observées au-dessus de la structure, où elles ont arrondi après le traitement de la trypsine et ont été enlevées par l’étape de rinçage/collecte(figure 2G). Le noyau non étiqueté des LEC(figure 2H), qui contenait peu ou pas de cellules YFP-KRT14-positives, (figure 2I) s’est ensuite détachée dans la deuxième ronde de traitement de la trypsine.
Les fractions MyoEC et LEC ont été collectées, combinées et intégrées dans 10 % d’ECM plaquées sur une base ECM de 50 %. Cela a permis une meilleure résolution optique des organoïdes qui ont grandi principalement le long de la couche de base(figure 3A). Après 24 h, les cellules assemblées en structures agrégées qui manquaient en grande partie d’un lumen(figure 3B). Après 48 h, les organoïdes naissants se sont formés comme les lumens centraux creusés et sont apparus comme un espace interne plus léger (figure 3C). Après 10 jours, les organoïdes étaient de grandes structures ramifiées avec des lumens bien développés. Les organoïdes en mosaïque générés par les MyoECs récoltés à partir de souris de type sauvage et de LEC récoltés chez les souris ACTb-EGFP ont été fixés in situ, immunostained avec un anticorps contre l’actine de muscle alpha-lisse de marqueur basal (SMA), et taché avec la tache d’ADN hoechst pour montrer les noyaux. Dans les chiffres, les vues en haut et en section montrent différents ensembles d’images recueillies sous forme de Z-stack et reconstruites en vue 3D (figure 3D). La vue supérieure révèle la morphologie ramifiée des organoïdes(figure 3E'). La vue de section montre la structure épithéliale bilayered et lumen ouverts de ces organoïdes(figure 3E'). Ces organoïdes peuvent également être différenciés au jour 5 à l’aide d’Alveologenesis Medium et incubés pendant 5 jours supplémentaires(figure 3F). Les organoïdes grandissaient, avaient plus de branches et contenaient du lait. Des organoïdes différenciés ont été générés comme décrit ci-dessus et immunostachés avec un anticorps dirigé contre le marqueur de lait, protéine acide de lactosérum (WAP, figure 3F). WAP est une protéine soluble sécrétée dans le lait. Une grande partie de ce liquide a été perdue lorsque les cellules ont été fixées et immunostachées in situ. Par conséquent, dans les vues supérieures et section, la coloration DE WAP est visible intracellulairement dans les cellules sécrétantes et extracellulairement dans le lait qui a été emprisonné à la surface de la cellule pendant la fixation(figure 3F), bien que dans la vue de section un petit organoïde semble contenir du lait liquide(figure 3F'' superposition en boîte).
Figure 1 : Isolement des fragments mammaires. (A) Schéma étiqueté des 5 MG d’une souris avec des MG appariés non étiquetés et contralatéraux. (B) Images de MG de souris avec le #4 MG en boîte et amplifié pour montrer comment identifier le ganglion lymphatique pour l’enlèvement. (C) Image des MG hachés dans une plaque d’adhérence de 6 puits avec une règle montrant la taille des morceaux de tissu (0,1 mm chacun). (D-E) Schématifiant les étapes du protocole 2.7-2.9. (D) les fragments de MG ont été filtrés à travers une passoire de 70 m et rincés 4X. (E) La passoire a ensuite été inversée sur un plat de culture de tissu en polystyrène de 60 mm et des fragments ont été libérés dans le plat. (F) Image montrant les fragments de tissu filtré recueillis sur un plat de 60 mm qui sont exempts de stroma. Les flèches indiquent les plus petits fragments qui sont recueillis sur la passoire de 70 m. Barre d’échelle de 100 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Trypsinisation différentielle. (A) Image Brightfield montrant un fragment de tissu adhéré sur un plat de polystyrène, formant une structure de crêpe-comme. (B-C) La première étape de trypsinisation différentielle a détaché des MyoEC qui sont clairement visibles sous forme de cellules brillantes et arrondies après 3 min. (D) Images immunofluorescentes de MyoECs (en bas) et de LEC (en haut) utilisant le marqueur cellulaire Cytokeratin 14 (KRT14) pour myoECs, et le marqueur cellulaire E-Cadherin (CDH1) pour les LEC. (E) L’expression de KRT14 et CDH1 a été utilisée pour quantifier le rendement et la pureté des fractions cellulaires différentiellement trypsinized. (F-I). Images représentatives de phase-contraste et de fluorescence (YFP) de fragments de tissus de Cytokeratin 14 (KRT14)-CreERT1; R26RYFP/MD MGs. Les souris ont été injectées avec 75 mg/kg de tamoxifène 5 jours avant la récolte. (F) Détacher les MyoECs (flèches) lors de la trypsine initiale-EDTA (0,05%) 2 min après l’incubation. (G) Un saupoudrage de KRT14-YFP-MyoECs (flèches) sur le dessus d’une crêpe de LEC non étiquetés. (H) Image Brightfield des LEC après la trypsinisation initiale et le détachement de MyoEC. (I) Après le détachement de MyoEC, les KRT14-YFP-MyoECs ne sont plus visibles comme le montre l’absence d’expression YFP. Barres d’échelle de 30 m (A, champ lumineux) de 100 m (F, champ lumineux), 50 m (G, fluorescence), 100 m (H,I). Les panneaux A-E de ce chiffre sont modifiés à partir de Macias et al.19. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Culture organoïde tridimensionnelle. (A) Représentation schématique de cellules individuelles intégrées dans 10% ECM/90% Croissance Moyenne et cultivée sur une couche de base ECM/50% 50% (étape du protocole 4.5). (B-C) Illustrations et images de phase-contraste montrant les capacités rapides d’auto-organisation des organoïdes mammaires générés à partir de MyoEC et LEC différentielment trypsinisés et recombinés à 24 h (B) et 48 h (C). Images recueillies à l’aide d’un microscope à champ large numérique (D) Représentation schématique illustrant le haut (gauche) ou la section (à droite) vues utilisées dans E-F pour montrer des organoïdes immunostains. (E) Représentation schématique d’un seul puits d’une diapositive de chambre de 8 puits contenant des organoïdes mammaires cultivés pendant 5-10 jours dans Le milieu de croissance. (E'-E") Vue supérieure (E') et vue de section (E)des organoïdes immunostained au jour 10 de la croissance. Les MyoECs sont marqués avec le muscle lisse d’actine (SMA) dans le magenta pseudocolor. Les LEC sont des souris ACTb-EGFP et sont montrés en vert pseudocolore. Les noyaux étaient tachés de colorant Hoechst. (F) Représentation schématique d’un seul puits d’une diapositive de chambre de 8 puits contenant des organoïdes mammaires cultivés pendant 5 jours dans Le milieu de croissance et 5 jours dans Le milieu d’Alveologenesis. (F'-F"). Vue supérieure (F') et vue de section (F)des organoïdes immunostained au jour 10 de la croissance. Les MyoECs ne sont pas marqués. Les LEC des souris ACTb-EGFP sont montrés en vert pseudocolor. La protéine de lait, protéine acide de lactosérum (WAP), est montrée dans le jaune pseudocolor dans les LECs et enrobant l’intérieur des lumens des organoïdes. Les noyaux étaient tachés de colorant Hoechst. Images collectées à l’aide d’un microscope confocal de disque tournant et reconstruites en 3D àl’aide d’Imaris (E', E') ou de la section inférieure de 30 tranches(F', F). Barres d’échelle de 100 m (C), 20 m (E), 40 m (F). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| 10 ml | Moyen de digestion | |
| Montant | Réactif | Notes |
| 9,45 ml | DMEM/F12 | |
| 100 l | Antibiotique-antimycotique (100X) | |
| 0,04 g | Classe 3 Collagenase | |
| 0,04 g | Classe 2 Dispase | |
| 50 l | Gentamicine | Concentration finale : 500 g |
| 2,5 ml | Sérum bovin foetal | Concentration finale: 5% (v/v) |
| Passer par le filtre de 0,22 m | ||
| 50 mL | Moyen d’entretien | |
| Montant | Réactif | Notes |
| 49,47 ml | DMEM/F12 | |
| 0,5 mL | Antibiotique-antimycotique (100X) | |
| 2,5 ml | Sérum bovin foetal | Concentration finale: 5% (v/v) |
| 25 ll | Insuline | Concentration finale : 250 g |
| 5 ll | Fem | Concentration finale: 500 ng |
| 10 ml | Moyenne de croissance | |
| Montant | Réactif | Notes |
| 9.6455 mL | DMEM/F12, pas de phénol rouge | |
| 100 l | Supplément N-2 (100x) | |
| 200 l | Supplément B27 sans vitamine A (50x) | |
| 10 l | Nrg1 (Nrg1) | Stock: 100g/mL |
| 42,5 l | R-spondin | En stock: 10 g/mL |
| 1 l | Inhibiteur rhéo Y-27632 | Stock: 10 m |
| 1 l | Fem | Stock: 0.1 'g/'L |
| 10 ml | Alveologenesis Moyen | |
| Montant | Réactif | Notes |
| 9.6355 mL | DMEM/F12, pas de phénol rouge | |
| 100 l | Supplément N-2 (100x) | |
| 200 l | Supplément B27 sans vitamine A (50x) | |
| 10 l | Nrg1 (Nrg1) | Stock: 100g/mL |
| 42,5 l | R-spondin | En stock: 10 g/mL |
| 1 l | Inhibiteur rhéo Y-27632 | Stock: 10 m |
| 5 ll | Prolactine pituitaire Ovine | Concentration finale : 1 g/mL |
| 1 l | Dexaméthasone | Concentration finale : 5 g/mL |
| 5 ll | Insuline | Concentration finale : 5 g/mL |
| 1 L | 10X DPBS | |
| Montant | Réactif | Notes |
| 80 g | Nacl | |
| 2 g | Kcl | |
| 14,4 g | NaH2PO4 | |
| 2,4 g | KH2PO4 | |
| 1 L | di H2O | |
| Remplir à 800 ml avant d’ajouter des réactifs secs et dissoudre. Remplir le volume à 1 L. Ajuster le pH à 7,4. Autoclave pour stériliser. | ||
| 1 L | 1X DPBS | |
| Montant | Réactif | Notes |
| 100 ml | PBS 10X | |
| 900 ml | di H2O | |
| 1 L | PBST (en) | |
| Montant | Réactif | Notes |
| 100 ml | PBS 10X | |
| 2,5 ml | Triton X-100 | |
| 250 ml | 4% De paraformaldéhyde | |
| Montant | Réactif | Notes |
| 10 g | Paraformaldéhyde | |
| 200 mL | di H20 | l’eau doit être à 60 oC |
| 25 ml | 10X DPBS | |
| 50 l | 10 N Hydroxide de sodium | |
| Passer à travers un filtre de 0,45 m pour stériliser et assurer pH est de 7,4 | ||
| 10 ml | 1 % de sérum d’âne | |
| Montant | Réactif | Notes |
| 100 l | Sérum d’âne filtré stérile | |
| 9,9 ml | 1X DPBS | |
| 10 ml | 0,2% Glycine | |
| Montant | Réactif | Notes |
| 0,02 g | Glycine | |
| 10 ml | 1X DPBS | |
Tableau 1 : Recettes de solutions.
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Discussion
Ici, une méthode est présentée détaillant comment les chercheurs peuvent générer des cultures organoïdes 3D à l’aide de cellules MG primaires. La différence entre ceci et d’autres protocoles est que nous détaillons une méthode pour séparer les deux compartiments cellulaires MG distincts : les MyoEC basiques externes et les LEC intérieurs. Notre méthode utilise une trypsine en deux étapes-EDTA (0,05 %) traitement que nous appelons la trypsinisation différentielle19. Cette procédure permet aux chercheurs d’isoler les MyoEC et les LEC sans utiliser de cytométrie sophistiquée et peut donc être utilisé pour étudier les GM récoltés à partir d’une grande variété d’espèces de mammifères qui peuvent ne pas avoir les biomarqueurs bien caractérisés nécessaires pour les FACS. La capacité de séparer les deux sous-populations cellulaires permet aux chercheurs de modifier génétiquement les cellules isolées indépendamment ou de recombiner les cellules d’animaux hébergeant des mutations génétiques ou des étiquettes, et donc de générer des organoïdes en mosaïque dans la culture 3D. Une limitation du protocole actuel est que le compartiment stromal n’est pas inclus dans les conditions de culture. Cependant, de nouvelles méthodes sont en cours de développement pour coculturer des composants stromiques avec des organoïdes générés à partir de cellules primaires ou de lignées cellulaires pour mieux récapituler in vivo ECM23,24,25,26, et ces méthodes peuvent être adaptées à ce protocole. En outre, il est important de noter que si ce protocole réalise un grand enrichissement des fractions MyoEC et LEC (90% de purification), les fractions ne représentent pas les lignées cellulaires pures.
Le succès de ce protocole repose sur un certain nombre d’étapes clés. Tout d’abord, il est important de digérer doucement mais soigneusement le tissu MG. La surdigestion du tissu conduira à la mort cellulaire et à une récupération plus faible des cellules épithéliales. Une digestion incomplète entraînera une contamination des cellules stromales et adipeuses, ce qui interfèrera avec les analyses ultérieures (p. ex., immunofluorescence, analyse des protéines et mesures de l’ARNm). Deuxièmement, il est important de bien rincer le tissu MG pour enlever les cellules contaminantes dans l’étape du protocole 2.8. Dans l’étape du protocole 2.9, les fragments de tissu MG sont libérés dans un plat de 60 mm. Les chercheurs doivent surveiller immédiatement les fragments libérés, avant qu’ils n’adhèrent au plat. Si des gouttelettes de graisse ou des cellules simples sont observées, les étapes du protocole 2.6 et 2.8-2.11 doivent être répétées. Pour ce faire, les fragments de médium et de tissu sont prélevés sur le plat, placés dans une nouvelle passoire de 70 m, lavés 4X avec 37 'C DMEM/F12, puis relâchés dans un nouveau plat de 60 mm. Troisièmement, il est essentiel de regarder la première trypsin-EDTA (0,05%) incubation de près parce que les MyoECs peuvent se détacher dans les 3 premières minutes, mais ils peuvent également adhérer jusqu’à 6 min. Il y a eu des cas où la trypsin-EDTA (0,05 %) était sous-optimale, et l’incubation a continué pendant 10 min avec la purification réussie des MyoECs. Cependant, la 10 min de trypsinisation a donné lieu à la collecte simultanée des MyoEC et des LEC. Il est également important que le plat reste intact lors de la première incubation. Dans le cas contraire, la contamination de la fraction MyoEC avec les LEC peut se produire. L’inverse est également vrai; si les MyoEC ne sont pas complètement détachés du plat, ils contamineront la fraction LEC. Si les chercheurs utilisent des souris reporter qui étiquetent les MyoEC ou les LEC exclusivement, il est plus facile de visualiser la séparation sous un microscope à fluorescence(figure 2F-I). Enfin, si les chercheurs prévoient de fixer des organoïdes pour des analyses d’immunofluorescence, le pH (7,4) et la température (4 oC) de la PFA de 4% est important pour la dissociation réussie de l’ECM. Si les organoïdes sont recueillis pour d’autres analyses (p. ex., mesures des protéines et de l’ARNm), il est important que la solution de récupération soit à 4 oC. Si l’ECM ne se dissout pas, l’incubation avec la solution de récupération peut être prolongée de 10 min (c.-à-d. 30 min d’incubation totale). Cependant, des périodes d’incubation plus longues entraîneront la perte de la structure 3D et la mort cellulaire. Le protocole de récupération (inscrit dans le tableau des matériaux)spécifie l’utilisation de pointes à larges forages. Ceci est important pour maintenir la structure 3D des organoïdes ainsi que l’intégrité des cellules.
En plus de ces quatre étapes clés, il y a deux facteurs qui influencent le succès du protocole. Tout d’abord, la croissance organoïde peut être limitée par des mutations génétiques qui réduisent la prolifération cellulaire et donc réduire la croissance organoïde dans ECM. Si seulement quelques organoïdes sont obtenus, l’étape de fixation suivante entraîne souvent leur perte. Pour remédier à cette situation, le nombre de cellules intégrées dans l’ECM devrait être augmenté tout en conservant le ratio de MyoEC:LEC (étapes du protocole 4.1-4.2). Deuxièmement, une fois que les cellules sont transférées dans un ECM, il est important de surveiller leur croissance quotidienne et d’être vigilant sur le renouvellement des médias (tous les 2-3 jours). Ce protocole spécifie les réactifs rouges de phénol pour une meilleure visualisation, mais le même succès et la même croissance sont atteints à l’aide de réactifs positifs rouges phénol. Les jours où le renouvellement moyen se produit avant la fixation (étape du protocole 4.6) doivent être exécutés avec un soin extrême pour réduire la perte de cellules. La couche supérieure ECM à 10% est délicate; par conséquent, les lavages ou le renouvellement moyen devraient être effectués par le fluide de tuyauterie sur les murs de la chambre pour minimiser les perturbations mécaniques.
La différenciation des organoïdes en acini producteurs de lait nécessite un traitement avec des suppléments de différenciation : hydrocortisone ou dexaméthasone, insuline et prolactine. Dans ce protocole, la dexaméthasone est recommandée. En outre, alors que la prolactine est disponible dans le commerce, la prolactine utilisée dans ce protocole a été obtenue à partir du Programme national d’hormones et de peptide. Encore une fois, il est très important de laisser les organoïdes intacts lors du changement du milieu d’alvéologenèse. La différenciation nécessite un minimum de 5 jours. Cela peut être prolongé encore 3-5 jours, mais la couche de base de ECM se dégrade après 10-12 jours. Les organoïdes différenciés sont remplis de lait et leurs lumens semblent plus foncés.
Il s’agit d’une technique efficace qui peut être utilisée pour traiter les contributions spécifiques au compartiment et à la lignée à la morphogénèse épithéliale mammaire et à la différenciation. Grâce à cette technique, les chercheurs peuvent générer des organoïdes en mosaïque comprenant des MyoEC et des LEC21, ou myoEC et LEC provenant de souris hébergeant différentes mutations génétiques. Cela permet aux chercheurs de mieux comprendre les contributions des compartiments cellulaires spécifiques à la lignée à la morphogénèse des organes et l’acquisition de fonctions spécialisées telles que la production laitière.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions Ben Abrams pour l’assistance technique et le soutien de base de l’Université de Californie, Santa Cruz (UCSC) Institute for the Biology of Stem Cells (IBSC). Nous remercions Susan Strome et Bill Saxton pour l’utilisation de leur Solamere Spinning Disk Confocal Microscope. Ce travail a été soutenu en partie par des subventions de l’UCSC de l’Institut médical Howard Hughes par l’entremise du programme de bourses James H. Gilliam pour l’étude avancée (S.R.), des NIH (NIH GM058903) pour l’initiative visant à maximiser le perfectionnement des étudiants (H.M.) et de la National Science Foundation for a graduate research fellowship (O.C. DGE 1339067) et une subvention (A18-0370) du Comité de coordination de la recherche sur le cancer de l’UC (LH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352096 | |
| 24 well ultra-low attachment plate (Corning) | Fisher Scientific | CLS3473-24EA | |
| 35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353001 | |
| 50 ml High-Clarity polypropylene conical tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352098 | |
| 60 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353004 | |
| 70 µM nylon cell strainer (Corning) | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Pen/Strep also works |
| B27 supplement without vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| B6 ACTb-EGFP mice | The Jackson Laboratory | 003291 | |
| BD Insulin syringe 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| Class 2 Dispase (Roche) | Millipore Sigma | 4942078001 | |
| Class 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004206 | |
| Corning Cell Recovery solution | Fisher Scientific | 354253 | Follow the guidelines for use – Extraction of Three-Dimensional Structures from Corning Matrigel Matrix |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment 6-well | Fisher Scientific | CLS3471 | |
| Dexamethasone | Millipore Sigma | D4902-25MG | |
| DMEM/F12, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11039-021 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington Biochemical | LS002007 | |
| Donkey anti-Goat 647 | Thermo Fisher Scientific | A21447 | Use at 1:500, Lot: 1608641, stock 2 mg/mL, RRID:AB_2535864 |
| Donkey anti-Mouse 647 | Jackson ImmunoResearch | 715-606-150 | Use at 1:1000, Lot: 140554, stock 1.4 mg/mL |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Thermo Fisher Scientific | 11330-057 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-250 | Without Mg2+/Ca2+ |
| EGF | Fisher Scientific | AF-100-15-100ug | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068–085 | 100% US Origin, premium grade, Lot: 059B18 |
| Fluoromount-G (Southern Biotech) | Fisher Scientific | 0100-01 | Referred to as mounting media in text |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Goat anti-WAP | Santa Cruz Biotech | SC-14832 | Use at 1:250, Lot: J1011, stock 200 µg/mL, RRID:AB_677601 |
| Hoechst 33342 | AnaSpec | AS-83218 | Use 1:2000, stock is 20mM |
| Insulin | Millipore Sigma | I6634-100mg | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| KRT14–CreERtam | The Jackson Laboratory | 5107 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR); Phenol Red-Free; 10 mL | Fisher Scientific | CB-40230C | Lot: 8204010, stock concentration 8.9 mg/mL |
| MillexGV Filter Unit 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGV033RS | |
| Millicell EZ SLIDE 8-well glass, sterile | Millipore Sigma | PEZGS0816 | These chamber slides are great for gasket removal but other brands can work well (e.g. Lab Tek II). |
| Mouse anti-SMA | Millipore Sigma | A2547 | Use at 1:500, Lot: 128M4881V, stock 5.2 mg/mL, RRID:AB_476701 |
| N-2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S671-3 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | S468-500 | |
| Nrg1 | R&D | 5898-NR-050 | |
| Ovine Pituitary Prolactin | National Hormone and Peptide Program | Purchased from Dr. Parlow at Harbor-UCLA Research and Education Institute | |
| Paraformaldahyde | Millipore Sigma | PX0055-3 | |
| Pentobarbital | Millipore Sigma | P3761 | |
| R26R-EYFP | The Jackson Laboratory | 6148 | |
| Rho inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| R-spondin | Peprotech | 120-38 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | x100-500ML | Laboratory grade |
| Trypsin EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 |
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