Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

अंतर ट्राइप्सिनाइजेशन द्वारा मोज़ेक मैमेरी ऑर्गेनॉइड की पीढ़ी

Published: March 11, 2020 doi: 10.3791/60742
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Molecular, Cell and Developmental Biology, University of California, Santa Cruz

Summary

मैममैरी ग्रंथि एक द्विस्तरीय संरचना है, जिसमें बाहरी मायोपिथेलियल और आंतरिक चमकदार एपिथेलियल कोशिकाएं शामिल हैं। प्रस्तुत अंतर ट्राइप्सिनाइजेशन का उपयोग करऑर्गेनॉइड तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल है। यह कुशल विधि शोधकर्ताओं को मैमेरी ग्रंथि और कार्य में अपनी भूमिकाओं से संबंधित प्रश्नों का पता लगाने के लिए इन दो सेल प्रकारों में अलग से हेरफेर करने की अनुमति देती है।

Abstract

ऑर्गेनॉइड आत्म-आयोजन, त्रि-आयामी ऊतक संरचनाएं प्रदान करते हैं जो एक डिश की सुविधा में शारीरिक प्रक्रियाओं को फिर से तैयार करते हैं। मूत्र मैमरी ग्रंथि दो अलग-अलग एपिथेलियल सेल डिब्बों से बना है, जो विभिन्न कार्यों की सेवा करता है: बाहरी, अनुबंधित मायोपिथेलियल डिब्बे और आंतरिक, गुप्त चमकदार डिब्बे। यहां, हम एक विधि का वर्णन करते हैं जिसके द्वारा इन डिब्बों को शामिल करने वाली कोशिकाओं को अलग-थलग कर दिया जाता है और फिर स्तन ग्रंथि मॉर्फोजेनेसिस और भेदभाव के लिए उनके व्यक्तिगत वंश योगदान की जांच करने के लिए संयुक्त किया जाता है। विधि सरल और कुशल है और फ्लोरेसेंस सक्रिय सेल छंटाई जैसी परिष्कृत पृथक्करण प्रौद्योगिकियों की आवश्यकता नहीं है। इसके बजाय, हम ऊतक को काटते हैं और एंजाइमैटिक रूप से पचाते हैं, अनुयायी ऊतक संस्कृति व्यंजनों पर एपिथेलियम को बीज देते हैं, और फिर ~ 90% शुद्धता के साथ चमकदार कोशिकाओं से मायोपिथेलियाल को अलग करने के लिए अंतर ट्राइप्सिनाइजेशन का उपयोग करते हैं। कोशिकाओं को तब एक बाह्युलर मैट्रिक्स में चढ़ाया जाता है जहां वे द्विस्तरीय, त्रि-आयामी (3 डी) ऑर्गेनोइड में व्यवस्थित होते हैं जिन्हें संस्कृति में 10 दिनों के बाद दूध का उत्पादन करने के लिए विभेदित किया जा सकता है। आनुवंशिक उत्परिवर्तन के प्रभावों का परीक्षण करने के लिए, कोशिकाओं को जंगली प्रकार या आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल से काटा जा सकता है, या उन्हें 3 डी संस्कृति से पहले आनुवंशिक रूप से हेरफेर किया जा सकता है। इस तकनीक का उपयोग मोज़ेक ऑर्गेनॉइड उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है जो विशेष रूप से चमकदार या मायोपिथेलियल डिब्बे में जीन कार्य की जांच की अनुमति देता है।

Introduction

मैमेरी ग्रंथि (एमजी) एक पेड़ की तरह, ट्यूबलर एपिथेलियल संरचना है जो एक आदिपोसाइट रिच स्ट्रोमा के भीतर एम्बेडेड है। बाइलेयरड डक्टल एपिथेलियम में संकुचन की एक बाहरी, बेसल परत, मायोपिथेलियल कोशिकाएं (मायोईसी) और ल्यूमिनल, गुप्त एपिथेलियल कोशिकाओं (एलईसी) की एक आंतरिक परत शामिल है, जो केंद्रीय लुमेन1को घेर रही है। स्तनपान के दौरान जब बाहरी मायोईसी आंतरिक अल्वेलर एलईसी से दूध निचोड़ने के लिए अनुबंध करते हैं, तो एमजी कई परिवर्तनों से गुजरता है जो विकास कारकों (जैसे, ईजीएफ और एफजीएफ) और हार्मोन (जैसे प्रोजेस्टेरोन, इंसुलिन और प्रोलैक्टिन) के नियंत्रण में हैं। ये परिवर्तन विशेष संरचनाओं, अल्वेली के भेदभाव का कारण बनते हैं, जो स्तनपानकेदौरान दूध का संश्लेषण और स्रावित करते हैं। मैमरियल एपिथेलिया को प्रयोगात्मक रूप से तकनीकों का उपयोग करके हेरफेर किया जा सकता है जिसमें या तो एपिथेलियल ऊतक के टुकड़े, कोशिकाएं, या यहां तक कि एक बेसल सेल को मेजबान मैमरियल फैट पैड में प्रत्यारोपित किया जाता है, जो एंडोजेनस मैमरियल पैरानचिमा से पहले से ही निकाला जाता है, और एक संपूर्ण, कार्यात्मक एपिथेलियल ट्री2,33,44,5का पुनर्गठन करने के लिए बाहर बढ़ने की अनुमति देता है।, प्रत्यारोपण एक शक्तिशाली तकनीक है, लेकिन यह समय लेने वाली और असंभव है यदि प्रारंभिक भ्रूणीय घातकता (E14 से पहले) में उत्परिवर्तन का परिणाम है जो प्रत्यारोपण योग्य स्तन एंलेज के बचाव को रोकता है। इसके अलावा, जांचकर्ता अक्सर दो अलग-अलग डिब्बों की भूमिकाओं पर शोध करना चाहते हैं, जो वंश-प्रतिबंधित जनक कोशिकाओं से प्राप्त होते हैं। जबकि क्रे-लोक्स प्रौद्योगिकी मायोईसी और एलईसी के अंतर आनुवंशिक हेरफेर की अनुमति देती है, यह भी एक समय लेने वाली और महंगी उपक्रम है। इस प्रकार, 1 9 50 के दशक के बाद से, जांचकर्ताओं ने मैमरी ऊतक संरचना और कार्य6,,7से संबंधित प्रश्नों को संबोधित करने के अपेक्षाकृत आसान और कुशल तरीके के रूप में विट्रो मैमेरी ऑर्गेनॉइड में उपयोग किया है।

प्राथमिक स्तन एपिथेलियल कोशिकाओं के अलगाव और संस्कृति का वर्णन करते हुए प्रारंभिक प्रोटोकॉल में, जांचकर्ताओं ने पाया कि प्लाज्मा क्लॉट और चिकन भ्रूण निकालने से बना एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (बीएमई), एक डिश6पर उगाए गए एमजी के टुकड़ों के लिए आवश्यक था। अगले दशकों में, एंगेलब्रेथ-होल्म-वार्म मर्मूत्र सारकोमा कोशिकाओं द्वारा स्रावित एक्सट्रासेलुलर मैट्रिस (ईसीएमएस, कोलेजन, और जेलीनुमा प्रोटीन मैट्रिक्स) को 3 डी संस्कृति की सुविधा और वीवो पर्यावरण7,8,,99,10में बेहतर नकल करने के लिए विकसित किया गया था।, 3 डी मैट्रिस में कोशिकाओं को कई मानदंडों (आकृति विज्ञान, जीन अभिव्यक्ति और हार्मोन जवाबदेही) द्वारा प्रकट किया गया है कि वीवो शारीरिक प्रक्रियाओंमेंइस तरह के माइक्रोएनवायरमेंट बेहतर मॉडल9,10,,11,,12। प्राथमिक मूत्र कोशिकाओं का उपयोग कर अनुसंधान ने ऑर्गेनॉइड13के विस्तारित रखरखाव और भेदभाव के लिए आवश्यक प्रमुख विकास कारकों और मॉर्फोनजेन की पहचान की । इन अध्ययनों ने यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल के लिए मंच निर्धारित किया है, और मानव स्तन कोशिकाओं की संस्कृति के लिए 3 डी ऑर्गेनॉइड के रूप में, जो अब एक आधुनिक नैदानिक उपकरण है, जो रोगी नमूनों पर दवा की खोज और दवा परीक्षण के लिए अनुमति देता है14। कुल मिलाकर, ऑर्गेनोइड क्यूल्चरिंग प्राथमिक कोशिकाओं की आत्म-संगठन क्षमताओं और मॉर्फोजेनेसिस और भेदभाव में उनके योगदान पर प्रकाश डालती है।

यहां प्रस्तुत संस्कृति मूत्र एपिथेलिया के लिए एक प्रोटोकॉल है जिसे दूध उत्पादक एसीनी में विभेदित किया जा सकता है। मायोईसी और एलईसी को अलग करने के लिए एक अंतर ट्राइप्सिनाइजेशन तकनीक का उपयोग किया जाता है जिसमें दो अलग-अलग एमजी सेल डिब्बे शामिल होते हैं। इन अलग सेल अंशों तो आनुवंशिक रूप से ओवरएक्सप्रेस या नॉकआउट जीन समारोह के लिए हेरफेर किया जा सकता है । क्योंकि वंश-आंतरिक, आत्म-संगठन मैममैरी एपिथेलियल कोशिकाओं की एक सहज संपत्ति है15,,16,,17,इन कोशिका अंशों को फिर से जोड़ना शोधकर्ताओं को बाइलेयर, मोज़ेक ऑर्गेनॉइड उत्पन्न करने की अनुमति देता है। हम उत्साहपूर्वक एडीपोस ऊतक को पचाने से शुरू करते हैं, और फिर 24 घंटे(चित्रा 1)के लिए ऊतक संस्कृति पकवान पर स्तन के टुकड़ों को इनक्यूबेटिंग करते हैं। ऊतक के टुकड़े पॉलीस्टीरिन व्यंजनों पर वेवो संगठन में उनके साथ बाइलेयर टुकड़ों के रूप में व्यवस्थित होते हैं: आंतरिक चमकदार परतों के आसपास बाहरी मायोपिथेलियल परत। यह सेलुलर संगठन ट्राइप्सिन-ईडीटीए (0.05%) द्वारा बाहरी मायोईक्स के अलगाव के लिए अनुमति देता है 3-6 मिन के लिए उपचार के बाद ट्राइप्सिन-EDTA (0.05%) उपचार जो शेष आंतरिक एलईसी(चित्रा 2)को अलग करता है। इस प्रकार, विभिन्न ट्राइप्सिन संवेदनशीलता वाले इन सेल प्रकारों को अलग-थलग कर दिया जाता है और बाद में ईसीएम(चित्रा 3)में मिश्रित और चढ़ाया जा सकता है। कोशिकाओं को द्विपक्षीय क्षेत्रबनाने के लिए स्व-संगठन से गुजरना पड़ता है, जिसमें आंतरिक एलईसी के आसपास के मायोईसी की बाहरी परत शामिल होती है। ल्यूमेन गठन तब होता है जब कोशिकाएं विकास कारकों के कॉकटेल वाले माध्यम में बढ़ती हैं (विकास मध्यम के लिए व्यंजनों को देखें)13। 5 दिनों के बाद, ऑर्गेनॉइड को अल्वेलोजेनेसिस मीडियम (व्यंजनों और चित्रा 3Fदेखें) पर स्विच करके दूध उत्पादक एसीनी में अंतर किया जा सकता है और एक और 5 दिनों के लिए इनक्यूबेट किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, ऑर्गेनॉइड का विस्तार और कम से कम 10 दिनों के लिए विकास माध्यम में शाखा जारी रहेगा। ऑर्गेनॉइड का विश्लेषण इम्यूनोफ्लोरेसेंस(चित्रा 3डी-एफ)का उपयोग करके किया जा सकता है या रिकवरी समाधान (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके ईसीएम से जारी किया जा सकता है और अन्य तरीकों (जैसे, इम्यूनोब्लास्ट, आरटी-क्यूपीसीआर) के माध्यम से विश्लेषण किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

यहां वर्णित सभी तरीकों को कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, सांताक्रूज की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. दिन 1: मैममैरी ग्रंथि पाचन

  1. परिपक्व मादा चूहों से 10-14 सप्ताह की उम्र से एमजी फसल के लिए तैयार करें।
    1. एक सेप्टिक शर्तों के तहत एक खुली बेंच पर कटाई करें।
    2. सर्जरी से पहले 20 मिनट के लिए 70% अल्कोहल में ऑटोक्लेव और भिगोने से सभी सर्जिकल आपूर्ति, कॉर्क बोर्ड और पिन को स्टरलाइज करें।
    3. सोडियम पेंटोबार्बिटल (0.06 मिलीग्राम/ग्राम शरीर के वजन की 2X एनेस्थेटिक खुराक) वाले जानवरों को 0.5 मिलीग्राम इंसुलिन सिरिंज के साथ इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से वितरित किया जाता है।
    4. एक पलटा प्रतिक्रिया के लिए जांच करने के लिए जानवर के उंगलियों को चुटकी देकर संज्ञाहरण के स्तर की निगरानी करें और जानवर को पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड करने के बाद ही प्रोटोकॉल शुरू करें।
    5. जानवर को अपनी पीठ पर रखें, अपने उपांगों को कॉर्कबोर्ड में पिन करें, और इथेनॉल के साथ अपने पेट और छाती को मिटा दें।
  2. एक माउस (यानी, 8 एमजी, फिगर 1ए)से #2, 3, 4 और 5 एमजी को फसल करने के लिए, दो पिछले पैरों के बीच मिडलाइन की पहचान करें और तेज कैंची से पेट की त्वचा पर एक छोटा सा चीरा (1 सेमी) बनाएं, फिर कट को गर्दन18तक बढ़ाएं।
  3. एक कपास झाड़ू का उपयोग कर त्वचा की रिहाई के लिए अनुमति देने के लिए पैरों और बाहों की ओर बाद में छोटे कटौती करके पालन करें । त्वचा को दूर खींचें और इसे एक तरफ नीचे लगाने से पहले तंग खिंचाव(चित्रा 1बी,चरण 1)18। उनके नीचे काटकर मिग्स निकालें, और #4 ग्रंथियों से लिम्फ नोड्स को हटा दें(चित्रा 1बी,चरण 2, 3)18। शरीर के दूसरी तरफ प्रक्रिया दोहराएं।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस के 50 मिलीग्राम में एमजी ऊतक लीजिए Dulbecco संशोधित ईगल मीडिया (DMEM)/पोषक तत्व मिश्रण F12 (F12) 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1X एंटीबायोटिक एंटीमाइकोटिक (एंटी एंटी)18के साथ पूरक ।
  5. एक 35 मिमी पकवान में या एक उस्तरा ब्लेड या ऊतक हेलिकॉप्टर का उपयोग कर एक सिरेमिक प्लेट पर ग्रंथियों काट। थाली हर पांच मैनुअल चॉप या ऊतक हेलिकॉप्टर पर हर दौर घुमाएं जब तक ऊतक टुकड़े आसानी से एक 1 mL माइक्रोपाइपेट टिप के माध्यम से फिट कर सकते है (~ ०.१ मिमी/टुकड़ा, चित्रा 1सी)।
  6. पाचन माध्यम में एमजी पचाने (तालिका 1देखें) एक 6 अच्छी तरह से कम आसंजन पकवान में 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर 14 घंटे के लिए।

2. 2 दिन: स्तन एपिथेलियल ऊतक के टुकड़ों का अलगाव

  1. पाचन के 14 घंटे के बाद, किसी भी शेष स्ट्रोमा या एडीपोज ऊतक को तोड़ने के लिए 1 mL माइक्रोपाइपेट का उपयोग करके पचाए गए ऊतक 10X को पाइपकर धीरे-धीरे मिलाएं, यह सुनिश्चित करना कि न तो बुलबुले और न ही अतिरिक्त यांत्रिक बल उत्पन्न होते हैं।
    नोट: यदि 14 घंटे के बाद अधूरा पाचन है, तो यह कतरनी डीएनए के संचय के कारण हो सकता है। इस मामले में, पाचन माध्यम के प्रति 2 मिलीग्राम प्रति 1 मिलीग्राम/mL deoxyribonuclease I (DNase I) के 1 μL जोड़ें । 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर एक और 30 मिन के लिए इनक्यूबेट।
  2. 15 मिलीग्राम ट्यूब में ऊतक एकत्र करें और ऊतक संस्कृति ग्रेड 1X डुल्बेकको के फॉस्फेट बफर्ड लवलाइन (डीपीबीएस) सीए2 + और एमजी2 +से मुक्त 2-3 मिलीग्राम के साथ पाचन के लिए उपयोग की जाने वाली अच्छी तरह से कुल्ला करें। 10 मिन के लिए 600 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
  3. लिपिड परत और मध्यम युक्त अधिनायक को खाली करें, और फिर डीपीबीएस के 5 mL में गोली को फिर से निलंबित करें और एक नई 15 मीटर ट्यूब पर स्विच करें। 10 मिन के लिए 600 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
  4. केंद्रीकरण के दौरान एक 50 मीटर ट्यूब में 70 माइक्रोन नायलॉन सेल छलनी रखें और 37 डिग्री सेल्सियस DMEM/F12 के 10 mL का उपयोग कर छलनी प्रीवेट करें।
  5. डीपीबीएस के 5 मिलील का उपयोग करके प्रोटोकॉल चरण 2.4 से ऊतक के टुकड़ों को फिर से निलंबित करें और स्ट्रोमल कोशिकाओं और एकल कोशिकाओं(चित्रा 1डी)को हटाने के लिए प्रीवेट 70 माइक्रोन नायलॉन सेल छलनी के माध्यम से निलंबन पारित करें।
  6. कोशिका छलनी पर ऊतक के टुकड़े ले लीजिए। 37 डिग्री सेल्सियस DMEM/F12(चित्रा 1डी)के 10 mL के साथ कुल्ला 4X ।
    सावधानी: अधूरा rinsing गैर एपिथेलियल कोशिकाओं के साथ दूषित संस्कृतियों में परिणाम होगा ।
  7. दस्ताने उंगलियों के साथ छलनी टैब पकड़ द्वारा ऊतक के टुकड़े जारी करें, एक 60 मिमी ऊतक संस्कृति पकवान पर छलनी उलटा और रखरखाव माध्यम के 1 mL aliquots गुजर (तालिका 1देखें) छलनी 4X(चित्रा 1ई)के नीचे के माध्यम से।
  8. ऊतक टुकड़ा अवशेष है, जो नग्न आंखों से दिखाई देगा के लिए छलनी की जांच करें, और रखरखाव माध्यम के 1 mL के साथ छलनी 1X और कुल्ला अगर किसी भी टुकड़े अभी भी छलनी का पालन कर रहे हैं । कुल्ला ऊतक के टुकड़े अब स्ट्रोमल कोशिकाओं से मुक्त होना चाहिए।
  9. एक उल्टे माइक्रोस्कोप (4X या 10X उद्देश्य, चित्रा 1एफ)के तहत प्रोटोकॉल चरण 2.9 से एमजी के टुकड़ों वाले 60 मिमी पकवान की जल्दी से जांच करें। आठ एमजी की एक विशिष्ट तैयारी ~ 500 टुकड़े पैदावार करती है। एकल कोशिकाओं या वसा बूंदों के लिए देखो और क्या वहां दूषित कोशिकाओं रहे हैं ।
    नोट: यदि कोशिकाओं को दूषित कर रहे हैं, एक 5 mL पिपेट का उपयोग कर और एक ताजा ७० μm छलनी के माध्यम से टुकड़ा फिर से छानने, प्रोटोकॉल कदम 2.6, 2.8-2.10 दोहराने के द्वारा मध्यम और टुकड़े इकट्ठा करके छानने का कदम दोहराएं ।
  10. इनक्यूबेट 24 घंटे 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर, ऊतक के टुकड़े का पालन करने और बाइलेयर टुकड़े उत्पन्न करने की अनुमति देता है(चित्रा 2ए)।
    नोट: यदि टुकड़े 24 घंटे से तय नहीं किया है, पालन जब तक इनक्यूबेट जारी है । यदि टुकड़े अच्छी तरह से पालन नहीं करते हैं, तो सेल डिब्बों का अलगाव काम नहीं करेगा। यदि शोधकर्ताआन के बारे में चिंतित हैं, तो ऊतक संस्कृति प्लेटों को खंड लगाव (जैसे, पॉली-एल-लाइसिन) को बढ़ावा देने के लिए इलाज किया जा सकता है।

3. 3 दिन: मायोपिथेलियल और ल्यूमिनल एपिथेलियल कोशिकाओं का अंतर प्रयास

  1. LECs से MyoECs अलग करने के लिए, डिश से मीडिया खाली, DPBS के 1 mL के साथ 1x कुल्ला और ताजा ट्रिप्सिन-EDTA (०.०५%), के 1 mL जोड़ने के लिए, और ध्यान से एक उल्टे माइक्रोस्कोप (10X या 20X उद्देश्य, चित्रा 2बी, सी, एफ)के तहत पाचन की निगरानी । बाहरी मायोईसी परत की टुकड़ी को ट्राइप्सिन-ईडीटीए (0.05%) के आधार पर 3-6 मिन की आवश्यकता होगी शक्ति.
    नोट: कृपया इस प्रक्रिया को दिखाने वाले प्रतिनिधि छवियों के लिए चित्रा 2 देखें। ब्राइटफील्ड रोशनी के तहत, मायोईसी गोल दिखाई देते हैं और एलईसी की तुलना में एक उज्जवल उपस्थिति होती है, जो केंद्र में पालन होती रहती है और गहरे दिखाई देती है।
  2. 2 mL 10% FBS/DPBS युक्त एक 15 mL ट्यूब में MyoEC अंश ले लीजिए । एलईसी को परेशान किए बिना, धीरे-धीरे डीपीबीएस के 2 एमएल के साथ 60 मिमी पकवान को कुल्ला करें और फिर डीपीबीएस(चित्रा 2एच-आई)का निपटान करें।
    नोट: मायोईक्स के लिए सामान्य वसूली एमजीएस के आकार के आधार पर (3.5 x 106-1.5 x 106)की एक सीमा के भीतर है।
  3. एलईसी अंश को हटाने के लिए, ट्रिप्सिन-ईडीटीए (0.05%) का 1 एमएल जोड़ें पकवान के लिए फिर से और इनक्यूबेट 7-15 मिनट, अतिच को रोकने के लिए ध्यान से निगरानी। ट्राइप्सिन-EDTA (0.05%) 10% FBS/DPBS के 2 mL के साथ पकवान पर । एक नया 15 mL ट्यूब में एलईसी अंश ले लीजिए।
    नोट: एलईसी के लिए सामान्य वसूली एक सीमा के भीतर है (2 x 106-4.2 x 106)MGs के आकार के आधार पर नियमित रूप से, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा सैयद दोनों अंशों की शुद्धता ~ 90%19 (चित्रा 2ई)है।
  4. ट्राइप्सिन-ईडीटीए (0.05%) को हटाने के लिए 300 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए प्रत्येक अंश को सेंट्रलाइज करें। रखरखाव माध्यम के 250 μL में गोली को फिर से निलंबित करें और एक हीमोसाइटोमीटर या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके प्रत्येक सेल आबादी की गणना करें। गिनती करते समय कोशिकाओं को बर्फ पर रखें।
    नोट: यदि कोशिका अंशों में आनुवंशिक हेरफेर वांछित है, तो प्राथमिक कोशिकाओं को कम आसंजन व्यंजनों पर उगाया जा सकता है और लेंटिवायरस20से संक्रमित किया जा सकता है।

4. 3 दिन: एक बाह्युशिकीय मैट्रिक्स में सेल अंशों का संयोजन और एम्बेड करना

नोट: एक बार MyoEC और एलईसी अंश एकत्र किए गए हैं और गिने गए हैं, तो उन्हें संयुक्त किया जा सकता है। ठेठ मायोईसी/एलईसी अनुपात 1:3(चित्रा 3ए)19है । अलग-अलग अध्ययन किए जा सकते हैं। उदाहरण के लिए, मोज़ेक अध्ययन करने के लिए, अंश जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) और उत्परिवर्ती (म्यूट) चूहों और संयुक्त (MyoEC/LEC: WT/WT) से उत्पन्न किया जा सकता है; WT/Mut; म्यूट/डब्ल्यूटी; म्यूट/म्यूट)21या अंशों को मायोईसी/एलईसी19के विभिन्न अनुपातों का उपयोग करके जोड़ा जा सकता है ।

  1. सेल की गिनती के आधार पर, कुओं की संख्या की गणना (8 अच्छी तरह से कक्ष, सामग्री की तालिकादेखें) जिसे 12,000 कोशिकाओं/अच्छी तरह से (जैसे 3,000 मायोईसी: 9,000 एलईसी) के लिए तैयार करने की आवश्यकता है।
  2. 50% ईसीएम (50% ईसीएम/50% DMEM/F12, बिना फिनॉल लाल के - सामग्री की तालिकादेखें) प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़कर 3 डी संस्कृति के लिए आधार परत स्थापित करें। सुनिश्चित करें कि कोई बुलबुले नहीं हैं और कुओं को समान रूप से लेपित किया जाता है। बेस लेयर को जमना, स्लाइड्स को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 को 30 मिन के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: ईसीएम को इस कदम तक बर्फ-ठंडी रहने की जरूरत है, अन्यथा यह समय से पहले बहुलीकरण करेगा और असमान आधार कोटिंग और बहुलीकरण का कारण बनेगा। एक आधार ईसीएम का उपयोग एक ही विमान में ऑर्गेनॉइड विकास को बढ़ाता है, जो छवि कैप्चर को एड्स करता है। यह तेजी से ऑर्गेनोइड विकास भी प्राप्त करता है और कम ईसीएम22का उपयोग करता है ।
  3. पॉलीमराइजेशन के दौरान, सेल मिक्स तैयार करें। 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर मायोईसी और एलईसी अंशों को गोली दें और प्रत्येक सेल अंश को 10% ईसीएम/90% ग्रोथ मीडियम में फिर से निलंबित करें ताकि प्रत्येक कुएं में 100 माइक्रोन हो (विकास मध्यम बनाने के लिए तालिका 1 देखें)।
    नोट: तैयारी में आसानी के लिए, एक ही सेल घोला जा सकता है का उपयोग कर कुओं को दोहराने । इन्हें एक ट्यूब में संयुक्त और तैयार किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, एक ही सेल मिश्रण के चार कुओं को 10% ईसीएम/90% ग्रोथ मीडियम के 400 माइक्रोन में तैयार किया जा सकता है)।
  4. प्रत्येक सेल मिश्रण के 100 माइक्रोन को 10% ईसीएम/90% ग्रोथ मीडियम में 10% ईसीएम/90% ग्रोथ मीडियम में जोड़ें और ऑर्गेनॉइड को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर 20 मिन के लिए व्यवस्थित करने की अनुमति दें ।
  5. एक बार कोशिकाओं के बस जाने के बाद, धीरे-धीरे प्रत्येक कुएं के कक्ष की दीवार को धीरे से नीचे करके विकास माध्यम के 100 माइक्रोन जोड़ें। स्लाइड्स में 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 (देखें चित्रा 3ए प्रत्येक कुएं की कुल संरचना के लिए)।
    नोट: Rho Kinase अवरोधक, आर स्पॉन्डिन, और एनआरजी 1 कारक है कि दोनों प्राथमिक murine मैममैरी कोशिकाओं और मानव स्तन कैंसर कोशिकाओं13,,14से उगाया ऑर्गेनॉइड की दीर्घकालिक संस्कृति के लिए महत्वपूर्ण के रूप में पहचान की गई है । इसके अलावा, स्टेम सेल कारक B27 और N2 समय है कि ऑर्गेनॉइड सुसंस्कृत किया जा सकता है बढ़ा ।
  6. छवि कोशिकाओं को हर 24 घंटे उनके विकास को ट्रैक करने के लिए और धीरे से १०० μL/well(चित्रा 3बी-ई)का उपयोग कर हर 2-3 दिनों में विकास माध्यम नवीनीकृत ।
    नोट: माध्यम नवीनीकरण करते समय अत्यधिक देखभाल का उपयोग करें। कुओं के एक कोने में माध्यम इकट्ठा करने के लिए कक्ष स्लाइड झुकाओ। मध्यम के 100 माइक्रोन निकालें और ईसीएम परत को अबाधित छोड़ने के लिए देखभाल के साथ भरें।
  7. यदि शोधकर्ता स्तनपान/अल्वेलोजेनेसिस की जांच करने में रुचि रखते हैं, तो 5 दिन में अल्वेलोजेनेसिस मीडियम (टेबल 1देखें) पर स्विच करें और वसूली समाधान का उपयोग करके हर 2-3 दिनों में मध्यम को नवीनीकृत करना जारी रखें(चित्रा 3एफ)या उससे आगे वसूली समाधान का उपयोग करके पासिंग से (सामग्री की तालिकादेखें)13।
    नोट: इस बिंदु पर, ऑर्गेनॉइड को 4 डिग्री सेल्सियस रिकवरी समाधान के 400 माइक्रोन में 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटिंग करके ईसीएम से अलग किया जा सकता है (प्रोटोकॉल और अभिकर्मक जानकारी के लिए सामग्री की तालिका देखें)।

5. दिन 5 या 10: फिक्सिंग और इम्यूनोस्टेनिंग ऑर्गेनॉइड

  1. मीडिया से धीरे-धीरे पाइपिंग करके माध्यम को ध्यान से हटा दें (एक बल्ब पिपेट सबसे अच्छा काम करता है)। 1x Dulbecco के फॉस्फेट बफर्ड लवण (DPBS, व्यंजनों को देखें) के 200 μL का उपयोग करके प्रत्येक अच्छी तरह से कुल्ला।
  2. कमरे के तापमान पर 10 न्यूनतम के लिए ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) 4% (w/v) पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए, देखें व्यंजनों) का उपयोग करके ऑर्गेनॉइड को ठीक करें।
    सावधानी: पीएफए खतरनाक है। व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (प्रयोगशाला कोट, दस्ताने, और सुरक्षा चश्मा) पहनें। यह कदम एक धूम हुड के अंदर किया जाना चाहिए।
    नोट: पीएफए उपचार से ईसीएम भंग हो जाता है। जब ऑर्गेनॉइड का विश्लेषण इम्यूनोफ्लोरेसे किया जाता है तो अधूरा ईसीएम हटाने से पृष्ठभूमि धुंधला हो सकती है।
  3. 4% पीएफए निकालें और प्रत्येक अच्छी तरह से ०.२% (w/v) ग्लाइसिन/DPBS (तालिका 1देखें) के २०० μL जोड़ें । स्लाइड्स में कमरे के तापमान पर 30 मिन या 4 डिग्री सेल्सियस के लिए रात भर एक कमाल की सतह पर एक धीमी सेटिंग के लिए सेट ।
    नोट: ऑर्गेनॉइड को अगले चरण से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर डीपीबीएस में 1-3 दिनों के लिए संग्रहीत किया जा सकता है।
  4. कमरे के तापमान पर 10 न्यूनतम के लिए डीपीबीएस + 0.25% ट्राइटन एक्स-100 (पीएसटी, देखें टेबल 1)का उपयोग करके ऑर्गेनॉइड को परमीबिलाइज करें।
  5. एक कमाल की सतह पर 1 घंटे के लिए डीपीबीएस में 5% गधे सीरम (डीएस) (या माध्यमिक एंटीबॉडी की प्रजातियों से मेल खाते हुए अन्य सीरम) का उपयोग करके ऑर्गेनॉइड को ब्लॉक करें।
    नोट: यह कदम एक कमाल की सतह पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर किया जा सकता है।
  6. 1% डीएस/डीपीबीएस में प्राइमरी एंटीबॉडी तैयार करें। प्रत्येक कुएं के लिए 125-200 माइक्रोन का उपयोग करें। एक कमाल की सतह पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्राथमिक एंटीबॉडी में ऑर्गेनॉइड को इनक्यूबेटकरके द्वारा इम्यूनोस्टेनिंग करें।

6. दिन 11: पूर्ण प्रतिरक्षण

  1. प्रत्येक अच्छी तरह से 2X को 5 मिन के लिए 200 माइक्रोन पीएसटी के साथ धोएं। 1% डीएस/डीपीबीएस में माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें प्रत्येक कुएं के लिए 125-200 माइक्रोन का उपयोग करके। 45 मिन के लिए एक कमाल की सतह पर कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
  2. 200 माइक्रोनएलपीएसटी का उपयोग करके प्रत्येक अच्छी तरह से 2X धोएं।
  3. कमरे के तापमान पर 5 न्यूनतम के लिए DPBS (DPBS में 1:2,000) में Hoechst डीएनए रंग का उपयोग कर नाभिक दाग ।
  4. वैक्यूम के साथ धीरे-धीरे सक्शन करके कुएं पर छोड़े गए सभी तरल को हटा दें।
  5. ध्यान से कक्षों और गैसकेट को हटा दें, बुलबुले को हटाने के लिए ध्यान रखते हुए, प्रत्येक कुएं और कवरस्लिप पर बढ़ते मीडिया (सामग्री की तालिकादेखें) की एक बूंद (~ 30 माइक्रोन) रखें। स्लाइड को 1-2 दिनों के लिए अंधेरे स्थान में सूखने दें। स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ सील। इमेज कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर ऑर्गेनॉइड(चित्रा 3ई-एफ)।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल में मोज़ेक ऑर्गेनॉइड का उपयोग करके स्तन एपिथेलियल कोशिकाओं के विशिष्ट वंश योगदान की जांच करने के लिए एक विधि का वर्णन किया गया है। ऑर्गेनॉइड के लिए प्राथमिक मूत्र कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए, स्तन ग्रंथि एपिथेलियम को पहले आसपास के आदिपोसाइट रिच स्ट्रोमा(चित्रा 1)से अलग किया जाना चाहिए। इस प्रक्रिया को संक्षेप में यहां वर्णित किया गया है और यह भी एक पहले प्रकाशित अध्ययन18में वर्णित है । पर्याप्त कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए, यह सिफारिश की जाती है कि #2, 3, 4 और 5 एमजी को हटा दिया जाए(चित्र 1ए)। एपिथेलियल कोशिकाओं की शुद्ध आबादी को अलग करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम कुंजी #4 एमजीएस से लिम्फ नोड्स को हटाना है, जो प्रतिरक्षा कोशिकाओं में समृद्ध हैं जो तैयारी को दूषित कर देंगे(चित्रा 1ए, बी)। एमजी आकार में ~0.1 मिमी(चित्रा 1बी)के टुकड़े उत्पन्न करने के लिए कीमा बनाया हुआ था। ऊतक के टुकड़ों को तब एंजाइमेटिक रूप से पचाया गया था, कोलेजेनेज़ की उपस्थिति में होने वाली एक प्रक्रिया, स्ट्रोमा से एपिथेलिया जारी करने के लिए, और ट्राइप्सिन की अनुपस्थिति में, कोशिका-कोशिका संपर्कों को बनाए रखने वाले कैथेरिन जैसे प्रोटीन के पाचन को रोकने के लिए। पचाऊतक ऊतक तो लिपिड को हटाने के लिए केंद्रित किया गया था और एक सेल छलनी के माध्यम से फ़िल्टर और धोया(चित्रा 1सी)। एपिथेलियल टुकड़े, छलनी का पालन करते हुए, फिल्टर को उलटते हुए और झिल्ली को धोने के द्वारा जारी किए गए थे, जिसने एपिथेलियल टुकड़ों को पॉलीस्टीरिन डिश(चित्रा 1डी)पर स्थानांतरित कर दिया। ये टुकड़े छोटी, शाखाओं में बंटी संरचनाओं(चित्रा 1ई)के रूप में दिखाई दिए।

शुद्ध एपिथेलियल टुकड़ों को 24 घंटे के लिए इनक्यूबेटेड किया गया था। वे पकवान पर नीचे बसे और पालन किया, फ्लैट, पैनकेक की तरह संरचनाओं के निर्माण MyoECs की एक बाहरी परत के साथ भीतरी LECs घेर(चित्रा 2ए-बी)। चित्रा 2सी एक जंगली प्रकार के जानवर से इस तरह के पैनकेक जैसी संरचना के किनारे को दर्शाता है। ट्राइप्सिन उपचार ने मायोईक्स को अलग किया, जो पहले अलग हुआ और उज्ज्वल, गोल कोशिकाओं के रूप में दिखाई दिया जो शेष क्यूबॉइडल एलईसी(चित्रा 2सी, एफ)के मूल को घेर लिया। मायोईक्स की टुकड़ी को ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके सावधानीपूर्वक निगरानी की गई थी और 3-6 मिनट के भीतर हुई थी। एक बार MECs एकत्र किए गए थे, LECs बाद में 7-15 min के एक दूसरे, अब ट्रिप्सिन उपचार के माध्यम से अलग किया गया । सेल टुकड़ी के लिए आवश्यक समय ट्राइप्सिन एकाग्रता और ताजगी पर निर्भर करता है। दो सेल डिब्बों की समग्र शुद्धता ~ 90% थी, जैसा कि कोशिकाओं की गिनती से परखे थे जो KRT14-सकारात्मक और ई-कैथेरिन (CDH1) थे- मायोईसी अंश और कोशिकाओं में नकारात्मक जो KRT14-नकारात्मक और ई-Cadherin-एलईसी अंश में सकारात्मक थे(चित्रा 2डी-ई)19। हमें पता चला कि कुछ मायोईसी को पैनकेक जैसी संरचना के ऊपर से हटा दिया गया था और साथ ही बाहरी किनारों से भी। यह एक प्रेरक, फ्लोरोसेंट बेसल मार्कर (Cytokeratin 14 (KRTkeratin) -CreERT1) के साथ लेबल चूहों से एकत्र ऊतक टुकड़ों का उपयोग करके मनाया गया था; R26RYFP/+) और फसल से 5 दिन पहले ७५ मिलीग्राम/किलो टैमोक्सिफेन के साथ इंजेक्शन । चित्रा 2एफ में, जी पैनकेक संरचना के किनारों के आसपास से MyoECs की टुकड़ी आसानी से स्पष्ट है। यह ट्राइप्सिन उपचार(चित्रा 2एफ)के पहले 2 मिनट के भीतर हुआ। इसके अलावा, संरचना के शीर्ष पर YFP-KRT14-सकारात्मक कोशिकाओं को देखा गया, जहां उन्होंने ट्राइप्सिन उपचार के बाद गोल किया और कुल्ला/संग्रह चरण(चित्रा 2जी)द्वारा हटा दिया गया । एलईसी(चित्रा 2एच)का अवेलेबल कोर, जिसमें कुछ या कोई वाईएफपी-KRT14-सकारात्मक कोशिकाएं शामिल थीं,(चित्रा 2I)बाद में ट्रिप्सिन उपचार के दूसरे दौर में अलग हो गईं।

मायोईसी और एलईसी अंशएकत्र किए गए, संयुक्त, और 10% ईसीएम में एम्बेडेड थे जो 50% ईसीएम आधार पर चढ़ाया गया था। यह ऑर्गेनॉइड के बेहतर ऑप्टिकल रिज़ॉल्यूशन के लिए अनुमति देता है जो मुख्य रूप से आधार परत(चित्रा 3ए)के साथ बढ़ता है। 24 घंटे के बाद, कोशिकाएं एकत्रित संरचनाओं में इकट्ठे हुईं, जिनमें काफी हद तक ल्यूमेन(चित्रा 3बी)का अभाव था। 48 घंटे के बाद, केंद्रीय ल्यूमेंस के रूप में गठित नवजात ऑर्गेनॉइड खोखले हो गए और एक हल्का आंतरिक स्थान(चित्रा 3सी)के रूप में दिखाई दिया। 10 दिनों के बाद, ऑर्गेनॉइड अच्छी तरह से विकसित ल्यूमेंस के साथ बड़ी, शाखाओं वाली संरचनाएं थीं। जंगली प्रकार के चूहों और एसीटीबी-ईजीएफपी चूहों से काटे गए मायोईसी से उत्पन्न मोज़ेक ऑर्गेनॉइड को सीटू में तय किया गया था, जो बेसल मार्कर अल्फा-चिकनी मांसपेशी ऐक्टिन (SMA) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोदाग किया गया था, और न्यूक्ली दिखाने के लिए होईसीएसटी डीएनए दाग से दाग ित किया गया था। आंकड़ों में, शीर्ष और अनुभाग दृश्य जेड-स्टैक के रूप में एकत्र की गई छवियों के विभिन्न सेट दिखाते हैं और 3 डी दृश्य(चित्र 3डी)में पुनर्निर्मित होते हैं। शीर्ष दृश्य ऑर्गेनॉइड(चित्रा 3ई' की शाखाओं में बंटी आकृति विज्ञान का पता चलताहै। सेक्शन व्यू इन ऑर्गेनोइड्स(चित्रा 3ई')के बाइलेयरएटेड एपिथेलियल स्ट्रक्चर और ओपन ल्यूमेन को दिखाता है। इन ऑर्गेनॉइड को अल्वेलोजेनेसिस मीडियम का उपयोग करके 5 दिन में भी अंतर किया जा सकता है और अतिरिक्त 5 दिनों(चित्रा 3एफ)के लिए इनक्यूबेटेड किया जा सकता है। ऑर्गेनॉइड बड़ा हो गया, अधिक शाखाएं थीं, और दूध निहित था। विभेदित ऑर्गेनॉइड को ऊपर वर्णित और दूध मार्कर, मट्टी अम्लीय प्रोटीन (WAP, चित्रा 3एफ)के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोदाग के रूप में उत्पन्न किया गया था। WAP एक घुलनशील प्रोटीन दूध में स्रावित है । इस तरल के अधिकांश खो गया था जब कोशिकाओं को तय किया गया था और सीटू में इम्यूनोदाग । इसलिए, शीर्ष और अनुभाग विचारों में, WAP धुंधला कोशिकाओं को स्रावित करने में इंट्रासेलर रूप से दिखाई देता है और दूध में बाह्य रूप से दिखाई देता है जो निर्धारण के दौरान कोशिका की सतह पर फंस गया था(चित्रा 3एफ),हालांकि अनुभाग दृश्य में एक छोटा ऑर्गेनोइड तरल दूध(चित्रा 3एफ' बॉक्स्ड ओवरले) होता है।

Figure 1
चित्रा 1: मैमारी टुकड़ा अलगाव । (क)अवेलेबल, कॉन्ट्रालेटरल जोड़ी एमजीएस के साथ माउस के 5 एमजी की योजनाबद्ध लेबल।(B)माउस एमजीएस की छवियां एमजी बॉक्स्ड #4 के साथ और यह दिखाने के लिए बढ़ाया गया है कि हटाने के लिए लिम्फ नोड की पहचान कैसे की जाए । (ग)एक शासक के साथ एक 6 अच्छी तरह से कम आसंजन प्लेट में कटा हुआ MGs की छवि ऊतक टुकड़ों के आकार दिखा (~ 0.1 मिमी प्रत्येक) । (डी-ई) योजनाबद्ध चित्रण प्रोटोकॉल कदम 2.7-2.9। (D)एमजी के टुकड़ों को 70 माइक्रोन छलनी के माध्यम से फ़िल्टर किया गया और 4X को धोया गया। (ई)छलनी तो एक ६० मिमी पॉलीस्टीरिन ऊतक संस्कृति पकवान और टुकड़े पकवान में जारी किए गए थे पर उलटा किया गया । (एफ)छवि एक 60 मिमी पकवान है कि स्ट्रोमा से मुक्त कर रहे हैं पर एकत्र फ़िल्टर ऊतक टुकड़े दिखा। तीर 70 माइक्रोन छलनी पर एकत्र किए जाने वाले छोटे टुकड़ों की ओर इशारा करते हैं। स्केल बार = 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: अंतर तिप्सिनाइजेशन। (A)ब्राइटफील्ड छवि जिसमें पॉलीस्टीरिन डिश पर टिश्यू के टुकड़े का पालन किया गया है, जो पैनकेक जैसी संरचना बनाता है। (बी-सी) पहला अंतर प्रयास कदम मायोईक्स को अलग करता है जो 3 मिन के बाद उज्ज्वल, गोल कोशिकाओं के रूप में स्पष्ट रूप से दिखाई देता है।(डी)मायोईसी (नीचे) और एलईसी (शीर्ष) की इम्यूनोफ्लोरोसेंट छवियां मायोईसी के लिए साइटोकेराटिन 14 (KRT14) सेल मार्कर का उपयोग करके, और एलईसी के लिए ई-कैथेरिन (सीडीएच1) सेल मार्कर। (ई)KRT14 और CDH1 की अभिव्यक्ति का उपयोग विभेदित ट्राइप्सिनाइज्ड सेल अंशों की उपज और शुद्धता की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया गया था। (एफ-I)। प्रतिनिधि चरण-विपरीत और फ्लोरेसेंस (वाईएफपी) साइटोकेराटिन 14 (KRT14) -क्रेएर्ट1 से ऊतक के टुकड़ों की छवियां; R26RYFP/+ MGs. चूहों को फसल से 5 दिन पहले ७५ मिलीग्राम/किलो टैमोक्सिफेन के साथ इंजेक्ट किया गया था । (एफ)प्रारंभिक ट्राइप्सिन-ईडीटीए (0.05%) के दौरान मायोईसी (तीर) को अलग करना इन्क्यूबेशन के बाद 2 मिन। (जी)अवेलेबल एलईसी के पैनकेक के शीर्ष पर KRT14-YFP-MyoECs (तीर) का छिड़काव । (एच)प्रारंभिक ट्रिपसिनाइजेशन और मायोईसी टुकड़ी के बाद एलईसी की ब्राइटफील्ड छवि। (I)मायोईसी टुकड़ी के बाद, KRT14-YFP-MyoECs अब वाईएफपी अभिव्यक्ति के अभाव से दिखाए गए जैसा दिखाई नहीं देता है। स्केल बार = 30 माइक्रोन (ए, ब्राइटफील्ड) 100 माइक्रोन (एफ, ब्राइटफील्ड), 50 माइक्रोन (जी, फ्लोरेसेंस), 100 माइक्रोन (एच, आई)। इस आंकड़े के पैनल ए-ई Macias एट अल19से संशोधित कर रहे हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: त्रि-आयामी ऑर्गेनोइड संस्कृति। (A)10% ईसीएम/90% ग्रोथ मीडियम में एम्बेडेड सिंगल सेलका योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व और 50% ईसीएम/50% डीएमईएम बेस लेयर (प्रोटोकॉल स्टेप 4.5) पर उगाया जाता है। (बी-सी) चित्र और चरण-विपरीत छवियां जिनमें विभेदात्मक रूप से ट्राइप्सिनाइज्ड से उत्पन्न मैमेरी ऑर्गेनॉइड की तेजी से आत्म-आयोजन क्षमताओं को दर्शाया गया है और 24 घंटे(बी)और 48 एच(सी)में मायोईसी और एलईसी को फिर से जोड़ दिया गया है। इम्यूनोस्टेन्ड ऑर्गेनॉइड दिखाने के लिए ई-एफ में उपयोग किए जाने वाले शीर्ष (बाएं) या अनुभाग (दाएं) विचारों को दर्शाते हुए डिजिटल वाइडफील्ड माइक्रोस्कोप(डी)योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व का उपयोग करके एकत्र की गई छवियां। (ई)विकास माध्यम में 5-10 दिनों के लिए बड़े हुए मैमेरी ऑर्गेनॉइड युक्त 8 अच्छी तरह से कक्ष स्लाइड के एक कुएं का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (ई'-ई") विकास के 10 दिन में इम्यूनोदाग ऑर्गेनॉइड के टॉप व्यू(ई'और सेक्शन व्यू(ई")। मायोईसी को छद्म रंग के मजेंटा में चिकनी ऐक्टिन मांसपेशी (एसएमए) के साथ चिह्नित किया जाता है। एलईसी एसीटीबी-ईजीएफपी चूहों से हैं और छद्म रंग हरे रंग में दिखाए जाते हैं। नाभिक Hoechst रंग के साथ दाग थे । (एफ)8 अच्छी तरह से कक्ष स्लाइड के एक कुएं का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व जिसमें मैमेरी ऑर्गेनॉइड होते हैं जो विकास मध्यम में 5 दिनों के लिए और अल्वेलोजेनेसिस मीडियम में 5 दिनों के लिए उगाए जाते हैं । (एफ-एफ")। विकास के 10 दिन में इम्यूनोदाग ऑर्गेनॉइड का टॉप व्यू(एफ')और सेक्शन व्यू(एफ)। मायोईसी अचिह्नित हैं। एसीटीबी-ईजीएफपी चूहों से एलईसी छद्म रंग हरे रंग में दिखाए जाते हैं। दूध प्रोटीन, मट्ठअम्लक प्रोटीन (WAP), LECs में छद्म रंग पीले रंग में दिखाया गया है और ऑर्गेनोइड्स ल्यूमेंस के अंदर कोटिंग । नाभिक Hoechst रंग के साथ दाग थे । एक कताई डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एकत्र की गई छवियां और 3 डी में इमारिस(ई', ई'या नीचे अनुभाग ~ 30 स्लाइस(एफ', एफ"का उपयोग करके पुनर्निर्मित की गई हैं। स्केल बार = 100 माइक्रोन (सी), 20 माइक्रोन (ई), 40 माइक्रोन (एफ)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

10 करोड़ पाचन माध्यम
राशि अभिकर्मक नोट्स
9.45 करोड़ डीएमईएम/F12
100 माइक्रोन एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक (100X)
0.04 ग्राम कक्षा 3 कोलेजेनेस
0.04 ग्राम कक्षा 2 डिसपे
50 माइक्रोन जेंटेमिसिन अंतिम एकाग्रता: 500 μg
2.5 लाख भ्रूण गोजातीय सीरम अंतिम एकाग्रता: 5% (v/v)
0.22μm फिल्टर के माध्यम से गुजरती हैं
50 करोड़ रखरखाव माध्यम
राशि अभिकर्मक नोट्स
49.47 लाख डीएमईएम/F12
0.5 लाख एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक (100X)
2.5 लाख भ्रूण गोजातीय सीरम अंतिम एकाग्रता: 5% (v/v)
25 माइक्रोन इंसुलिन अंतिम एकाग्रता: 250 μg
5 माइक्रोन Egf अंतिम एकाग्रता: 500 एनजी
10 करोड़ विकास का माध्यम
राशि अभिकर्मक नोट्स
9.6455 मीटर DMEM/F12, कोई फिनॉल लाल
100 माइक्रोन एन-2 पूरक (100x)
200 माइक्रोन विटामिन ए के बिना B27 पूरक (50x)
10 माइक्रोन एनआरजी1 स्टॉक: 100μg/mL
42.5 माइक्रोन आर-स्पॉन्डिन स्टॉक: 10 μg/mL
1 μL Rho अवरोधक Y-27632 स्टॉक: 10 माइक्रोन
1 μL Egf स्टॉक: 0.1 μg/μL
10 करोड़ अल्वेलोजेनेसिस मीडियम
राशि अभिकर्मक नोट्स
9.6355 मीटर DMEM/F12, कोई फिनॉल लाल
100 माइक्रोन एन-2 पूरक (100x)
200 माइक्रोन विटामिन ए के बिना B27 पूरक (50x)
10 माइक्रोन एनआरजी1 स्टॉक: 100μg/mL
42.5 माइक्रोन आर-स्पॉन्डिन स्टॉक: 10 μg/mL
1 μL Rho अवरोधक Y-27632 स्टॉक: 10 माइक्रोन
5 माइक्रोन ओवाइन पिटीटरी प्रोलैक्टिन अंतिम एकाग्रता: 1 μg/mL
1 μL डेक्क्सेथासोन अंतिम एकाग्रता: 5 μg/mL
5 माइक्रोन इंसुलिन अंतिम एकाग्रता: 5 μg/mL
1 एल 10X डीपीबीएस
राशि अभिकर्मक नोट्स
80 ग्राम Nacl
2 ग्राम केसीएल
14.4 ग्राम NaH2PO4
2.4 ग्राम KH2PO4
1 एल di H2O
ड्राई रिएजेंट्स जोड़ने और घुलने से पहले 800 मीटर तक भरें। वॉल्यूम को भरें 1 एल पीएच को 7.4 पर एडजस्ट करें। नसबंदी करने के लिए ऑटोक्लेव।
1 एल 1X डीपीबीएस
राशि अभिकर्मक नोट्स
100 करोड़ 10X पीबीएस
900 मीटर di H2O
1 एल पीएसटी
राशि अभिकर्मक नोट्स
100 करोड़ 10X पीबीएस
2.5 लाख ट्राइटन एक्स-100
250 मीटर 4% पैराफॉर्मलडिहाइड
राशि अभिकर्मक नोट्स
10 ग्राम पैराफॉर्मलडिहाइड
200 मीटर डि एच20 पानी 60 डिग्री सेल्सियस पर होना चाहिए
25 करोड़ 10X डीपीबीएस
50 माइक्रोन 10 एन सोडियम हाइड्रोक्साइड
नसबंदी और पीएच को आश्वस्त करने के लिए 0.45 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से पास 7.4 है
10 करोड़ 1% गधा सीरम
राशि अभिकर्मक नोट्स
100 माइक्रोन बाँझ फ़िल्टर गधा सीरम
9.9 लाख 1X डीपीबीएस
10 करोड़ 0.2% ग्लाइसिन
राशि अभिकर्मक नोट्स
0.02 ग्राम ग्लाइसिन
10 करोड़ 1X डीपीबीएस

तालिका 1: समाधान व्यंजनों।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यहां, एक विधि का ब्यौरा प्रस्तुत किया जाता है कि शोधकर्ता प्राथमिक एमजी कोशिकाओं का उपयोग करके 3डी ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों को कैसे उत्पन्न कर सकते हैं। इस और अन्य प्रोटोकॉल के बीच अंतर यह है कि हम दो, अलग एमजी सेल डिब्बों को अलग करने के लिए एक विधि का विस्तार करते हैं: बाहरी बेसल मायोईसी और आंतरिक एलईसी। हमारी विधि एक दो कदम ट्रिप्सिन-EDTA (0.05%) ट्रीटमेंट ्सिएहम कॉल डिफरेंशियल ट्राइप्सिनाइजेशन19. यह प्रक्रिया शोधकर्ताओं को परिष्कृत प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग किए बिना मायोईसी और एलईसी को अलग करने की अनुमति देती है और इस प्रकार स्तनधारी प्रजातियों की एक विस्तृत विविधता से काटे गए एमजी का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है जिसमें FACS के लिए आवश्यक अच्छी तरह से विशेषता वाले बायोमार्कर नहीं हो सकते हैं। दो सेल उपआबादी को अलग करने की क्षमता शोधकर्ताओं को आनुवंशिक रूप से अलग कोशिकाओं को स्वतंत्र रूप से संशोधित करने या आनुवंशिक उत्परिवर्तन या लेबल शरण जानवरों से कोशिकाओं को फिर से गठबंधन करने में सक्षम बनाता है, और इस प्रकार 3 डी संस्कृति में मोज़ेक ऑर्गेनॉइड उत्पन्न करता है । वर्तमान प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है कि स्ट्रोमल डिब्बे को सतवर्तन स्थितियों में शामिल नहीं किया गया है। हालांकि, वीवो ईसीएम23,,24,25,,26में बेहतर रीकैपिडुलेट करने के लिए प्राथमिक कोशिकाओं या सेल लाइनों से उत्पन्न ऑर्गेनॉइड के साथ सहसंस्कृति स्ट्रोमल घटकों के लिए नए तरीकों को विकसित किया जा रहा है, और इन तरीकों को इस प्रोटोकॉल के अनुकूल बनाया जा सकता है।, इसके अलावा, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि जबकि यह प्रोटोकॉल मायोईसी और एलईसी अंशों (~ 90% शुद्धि) का एक बड़ा संवर्धन प्राप्त करता है, अंश शुद्ध कोशिका वंश का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं।

इस प्रोटोकॉल की सफलता कई महत्वपूर्ण चरणों पर निर्भर करती है। सबसे पहले, एमजी ऊतक को धीरे-धीरे लेकिन अच्छी तरह से पचाने के लिए महत्वपूर्ण है। ऊतक के अधिक पाचन से कोशिका मृत्यु होगी और एपिथेलियल कोशिकाओं की कम वसूली होगी। अधूरे पाचन के परिणामस्वरूप स्ट्रोमल और एडीपोज सेल संदूषण होगा, जो बाद के विश्लेषणों (जैसे, इम्यूनोफ्लोरेसेंस, प्रोटीन विश्लेषण और एमआरएनए माप) में हस्तक्षेप करेगा। दूसरा, प्रोटोकॉल चरण 2.8 में दूषित कोशिकाओं को हटाने के लिए एमजी ऊतक को अच्छी तरह से कुल्ला करना महत्वपूर्ण है। प्रोटोकॉल चरण 2.9 में, एमजी ऊतक के टुकड़े 60 मिमी पकवान में जारी किए जाते हैं। शोधकर्ताओं को जारी टुकड़ों की तुरंत निगरानी करनी चाहिए, इससे पहले कि वे पकवान का पालन करें । यदि वसा की बूंदों या एकल कोशिकाओं को देखा जाता है, तो प्रोटोकॉल चरण 2.6 और 2.8-2.11 दोहराया जाना चाहिए। ऐसा करने के लिए, मध्यम और ऊतक के टुकड़े पकवान से एकत्र किए जाते हैं, एक नए ७० μm छलनी में रखा जाता है, ३७ डिग्री सेल्सियस DMEM/F12 के साथ 4X धोया और फिर एक नया ६० मिमी पकवान में जारी किया । तीसरा, पहले ट्रिप्सिन-ईडीटीए (0.05%) ऊष्मायन बारीकी से क्योंकि मायोईसीएस पहले 3 मिनट के भीतर अलग कर सकते हैं, लेकिन वे 6 मिनट तक का पालन भी कर सकते हैं। ऐसे उदाहरण सामने आए हैं जब ट्राइप्सिन-ईडीटीए (0.05%) उप-इष्टतम था, और ऊष्मायन मायोईसी के सफल शुद्धिकरण के साथ 10 सीन के लिए आगे बढ़ा। हालांकि, और 10 मिन ऑफ ट्रिप्सिनाइजेशन के परिणामस्वरूप मायोईसी और एलईसी का एक साथ संग्रह हुआ। यह भी महत्वपूर्ण है कि पकवान पहले ऊष्मायन के दौरान अशान्त रहते हैं। अन्यथा, एलईसी के साथ मायोईसी अंश का संदूषण हो सकता है। रिवर्स भी सच है; यदि मायोईक पकवान से पूरी तरह से अलग नहीं हैं, तो वे एलईसी अंश को दूषित कर देंगे। यदि शोधकर्ता रिपोर्टर चूहों का उपयोग कर रहे हैं जो विशेष रूप से MyoECs या LECs लेबल करते हैं, तो फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप(चित्रा 2एफ-I)के तहत अलगाव की कल्पना करना आसान है। अंत में, यदि शोधकर्ता प्रतिकार विश्लेषण के लिए ऑर्गेनॉइड को ठीक करने की योजना बनाते हैं, तो 4% पीएफए का पीएच (7.4) और तापमान (4 डिग्री सेल्सियस) ईसीएम के सफल विसोजन के लिए महत्वपूर्ण है। यदि ऑर्गेनॉइड अन्य विश्लेषणों (जैसे, प्रोटीन और एमआरएनए मापन) के लिए एकत्र किए जाते हैं, तो यह महत्वपूर्ण है कि वसूली समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर हो। यदि ईसीएम भंग नहीं हो रहा है, तो वसूली समाधान के साथ ऊष्मायन को 10 मिन (यानी, 30 मिन कुल ऊष्मायन) द्वारा बढ़ाया जा सकता है। हालांकि, लंबे समय तक ऊष्मायन अवधि 3 डी संरचना और सेल मृत्यु का नुकसान होगा। वसूली प्रोटोकॉल (सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध) व्यापक बोर युक्तियों के उपयोग को निर्दिष्ट करता है। यह ऑर्गनॉइड की 3डी संरचना के साथ-साथ कोशिकाओं की अखंडता को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है।

इन चार प्रमुख चरणों के अलावा, दो कारक हैं जो प्रोटोकॉल की सफलता को प्रभावित करते हैं। सबसे पहले, ऑर्गेनॉइड ग्रोथ को जेनेटिक म्यूटेशन द्वारा सीमित किया जा सकता है जो सेल प्रसार को कम करते हैं और इसलिए ईसीएम में ऑर्गनॉइड ग्रोथ को कम करते हैं । यदि केवल कुछ ऑर्गेनोइड प्राप्त किए जाते हैं, तो बाद के निर्धारण चरण के परिणामस्वरूप अक्सर उनका नुकसान होता है। इसके समाधान के लिए, मायोईसी के अनुपात को बनाए रखते हुए ईसीएम के भीतर एम्बेडेड कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि की जानी चाहिए: एलईसी (प्रोटोकॉल चरण 4.1-4.2)। दूसरा, एक बार कोशिकाओं को ईसीएम में स्थानांतरित कर दिया जाता है तो उनके विकास को दैनिक देखना और मीडिया नवीकरण (हर 2-3 दिनों) के बारे में सतर्क रहना महत्वपूर्ण है। यह प्रोटोकॉल बेहतर दृश्य के लिए फेनोल रेड फ्री रिएजेंट्स को निर्दिष्ट करता है, लेकिन फिनॉल रेड पॉजिटिव रिएजेंट्स का उपयोग करके एक ही सफलता और विकास हासिल किया जाता है। वे दिन जब मध्यम नवीकरण निर्धारण से पहले होता है (प्रोटोकॉल चरण 4.6) सेल हानि को कम करने के लिए अत्यधिक देखभाल के साथ किया जाना चाहिए। 10% ईसीएम शीर्ष परत नाजुक है; इसलिए यांत्रिक गड़बड़ी को कम करने के लिए कक्ष की दीवारों के नीचे तरल पदार्थ को पाइपकर द्वारा धोता या मध्यम नवीकरण किया जाना चाहिए।

दूध उत्पादक एसीनी में ऑर्गेनॉइड के भेदभाव के लिए भेदभाव की खुराक के साथ उपचार की आवश्यकता होती है: हाइड्रोकॉर्टिसोन या डेक्स्टेथेसोन, इंसुलिन और प्रोलैक्टिन। इस प्रोटोकॉल में, डेक्सेथासोन की सिफारिश की जाती है। इसके अलावा, जबकि प्रोलैक्टिन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है, इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया प्रोलैक्टिन राष्ट्रीय हार्मोन और पेप्टाइड कार्यक्रम से प्राप्त किया गया था । फिर, अल्वेलोजेनेसिस मीडियम को बदलते समय ऑर्गेनॉइड को अव्यवस्थित छोड़ना बहुत महत्वपूर्ण है। भेदभाव के लिए कम से कम 5 दिनों की आवश्यकता होती है। इसे 3-5 दिन और बढ़ाया जा सकता है, लेकिन ईसीएम की बेस लेयर 10-12 दिनों के बाद कम हो जाती है। विभेदित ऑर्गेनॉइड दूध से भरे होते हैं और उनके ल्यूमेंस गहरे दिखाई देते हैं।

यह एक कुशल तकनीक है जिसका उपयोग स्तन एपिथेलियल मॉर्फोजेनेसिस और भेदभाव के लिए डिब्बे-विशिष्ट, वंश योगदान को संबोधित करने के लिए किया जा सकता है। इस तकनीक के साथ, शोधकर्ता मोज़ेक ऑर्गेनॉइड उत्पन्न कर सकते हैं जिसमें अलग-अलग आनुवंशिक रूप से छेड़छाड़ किए गए मायोईसी और एलईसी21,या मायोईसी और एलईसी विभिन्न आनुवंशिक उत्परिवर्तनों को शरण देने वाले चूहों से प्राप्त करसकते हैं। यह शोधकर्ताओं को अंग मॉर्फोजेनेसिस और दुग्ध उत्पादन जैसे विशेष कार्यों के अधिग्रहण के लिए वंश-विशिष्ट सेल डिब्बों के योगदान को बेहतर ढंग से समझने की अनुमति देता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, सांताक्रूज़ (UCSC) स्टेम सेल (IBSC) के जीव विज्ञान के लिए संस्थान से तकनीकी सहायता और कोर समर्थन के लिए बेन Abrams शुक्रिया अदा करते हैं । हम सुसान स्ट्रोम और बिल सैक्सटन को उनके सोलमात्र स्पिनिंग डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के उपयोग के लिए धन्यवाद देते हैं। इस काम को छात्र विकास (एचएम) को अधिकतम करने की पहल के लिए एनआईएच (एनआईएच GM058903) से जेम्स एच गिलम फैलोशिप फॉर एडवांस्ड स्टडी प्रोग्राम (एसआर) के माध्यम से हावर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट से यूसीएससी को अनुदान द्वारा समर्थन दिया गया था । एक स्नातक अनुसंधान फैलोशिप के लिए राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (O.C. DGE १३३९०६७) और यूसी-कैंसर अनुसंधान समन्वय समिति (एलएच) से एक अनुदान (A18-0370) द्वारा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube (BD Falcon) Fisher Scientific 352096
24 well ultra-low attachment plate (Corning) Fisher Scientific CLS3473-24EA
35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) Fisher Scientific 353001
50 ml High-Clarity polypropylene conical tube (BD Falcon) Fisher Scientific 352098
60 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) Fisher Scientific 353004
70 µM nylon cell strainer (Corning) Fisher Scientific 08-771-2
Antibiotic-Antimycotic (100X) Thermo Fisher Scientific 15240062 Pen/Strep also works
B27 supplement without vitamin A (50x) Thermo Fisher Scientific 12587010
B6 ACTb-EGFP mice The Jackson Laboratory 003291
BD Insulin syringe 0.5 mL Thermo Fisher Scientific 14-826-79
Class 2 Dispase (Roche) Millipore Sigma 4942078001
Class 3 Collagenase Worthington Biochemical LS004206
Corning Cell Recovery solution Fisher Scientific 354253 Follow the guidelines for use – Extraction of Three-Dimensional Structures
from Corning Matrigel Matrix
Corning Costar Ultra-Low Attachment 6-well Fisher Scientific CLS3471
Dexamethasone Millipore Sigma D4902-25MG
DMEM/F12, no phenol red Thermo Fisher Scientific 11039-021
DNase (Deoxyribonuclease I) Worthington Biochemical LS002007
Donkey anti-Goat 647 Thermo Fisher Scientific A21447 Use at 1:500, Lot: 1608641, stock 2 mg/mL, RRID:AB_2535864
Donkey anti-Mouse 647 Jackson ImmunoResearch 715-606-150 Use at 1:1000, Lot: 140554, stock 1.4 mg/mL
Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) Thermo Fisher Scientific 11330-057
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Thermo Fisher Scientific 14190-250 Without Mg2+/Ca2+
EGF Fisher Scientific AF-100-15-100ug
Fetal Bovine Serum VWR 97068–085 100% US Origin, premium grade, Lot: 059B18
Fluoromount-G (Southern Biotech) Fisher Scientific 0100-01 Referred to as mounting media in text
Gentamicin Thermo Fisher Scientific 15710064
Glycine Fisher Scientific BP381-5
Goat anti-WAP Santa Cruz Biotech SC-14832 Use at 1:250, Lot: J1011, stock 200 µg/mL, RRID:AB_677601
Hoechst 33342 AnaSpec AS-83218 Use 1:2000, stock is 20mM
Insulin Millipore Sigma I6634-100mg
KCl Fisher Scientific P217-500
KH2PO4 Fisher Scientific P285-500
KRT14–CreERtam The Jackson Laboratory 5107
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR); Phenol Red-Free; 10 mL Fisher Scientific CB-40230C Lot: 8204010, stock concentration 8.9 mg/mL
MillexGV Filter Unit 0.22 µm Millipore Sigma SLGV033RS
Millicell EZ SLIDE 8-well glass, sterile Millipore Sigma PEZGS0816 These chamber slides are great for gasket removal but other brands can work well (e.g. Lab Tek II).
Mouse anti-SMA Millipore Sigma A2547 Use at 1:500, Lot: 128M4881V, stock 5.2 mg/mL, RRID:AB_476701
N-2 Supplement (100x) Thermo Fisher Scientific 17502048
NaCl Fisher Scientific S671-3
NaH2PO4 Fisher Scientific S468-500
Nrg1 R&D 5898-NR-050
Ovine Pituitary Prolactin National Hormone and Peptide Program Purchased from Dr. Parlow at Harbor-UCLA Research and Education Institute
Paraformaldahyde Millipore Sigma PX0055-3
Pentobarbital Millipore Sigma P3761
R26R-EYFP The Jackson Laboratory 6148
Rho inhibitor Y-27632 Tocris 1254
R-spondin Peprotech 120-38
Sodium Hydroxide Fisher Scientific S318-500
Sterile Filtered Donkey Serum Equitech-Bio Inc. SD30-0500
Sterile Filtered Donkey Serum Equitech-Bio Inc. SD30-0500
Triton X-100 Millipore Sigma x100-500ML Laboratory grade
Trypsin EDTA 0.05% Thermo Fisher Scientific 25300-062

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Macias, H., Hinck, L. Mammary gland development. Wiley Interdisciplinary Reviews in Developmental Biology. 1 (4), 533-557 (2012).
  2. Daniel, C. W., De Ome, K. B., Young, J. T., Blair, P. B., Faulkin, L. J. Jr The in vivo life span of normal and preneoplastic mouse mammary glands: a serial transplantation study. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 61 (1), 53-60 (1968).
  3. Ip, M. M., Asch, B. B. Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. , Kluwer Academic/Plenum Publishers. (2000).
  4. Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
  5. Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
  6. Lasfargues, E. Y. Cultivation and behavior in vitro of the normal mammary epithelium of the adult mouse. II. Observations on the secretory activity. Experimental Cell Research. 13 (3), 553-562 (1957).
  7. Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
  8. Orkin, R. W., et al. A murine tumor producing a matrix of basement membrane. Journal of Experimental Medicine. 145 (1), 204-220 (1977).
  9. Lee, E. Y., Parry, G., Bissell, M. J. Modulation of secreted proteins of mouse mammary epithelial cells by the collagenous substrata. Journal of Cell Biology. 98 (1), 146-155 (1984).
  10. Lee, E. Y., Lee, W. H., Kaetzel, C. S., Parry, G., Bissell, M. J. Interaction of mouse mammary epithelial cells with collagen substrata: regulation of casein gene expression and secretion. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 82 (5), 1419-1423 (1985).
  11. Bissell, M. J., Barcellos-Hoff, M. H. The influence of extracellular matrix on gene expression: is structure the message? Journal of Cell Science. 8 (Suppl), 327-343 (1987).
  12. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  13. Jarde, T., et al. Wnt and Neuregulin1/ErbB signalling extends 3D culture of hormone responsive mammary organoids. Nature Commununications. 7, 13207 (2016).
  14. Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  15. Daniel, C. W., Strickland, P., Friedmann, Y. Expression and functional role of E- and P-cadherins in mouse mammary ductal morphogenesis and growth. Developmental Biology. 169 (2), 511-519 (1995).
  16. Runswick, S. K., O'Hare, M. J., Jones, L., Streuli, C. H., Garrod, D. R. Desmosomal adhesion regulates epithelial morphogenesis and cell positioning. Nature Cell Biology. 3 (9), 823-830 (2001).
  17. Chanson, L., et al. Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 108 (8), 3264-3269 (2011).
  18. Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. Journal of Visualized Experiments. (106), e53179 (2015).
  19. Macias, H., et al. SLIT/ROBO1 signaling suppresses mammary branching morphogenesis by limiting basal cell number. Developmental Cell. 20 (6), 827-840 (2011).
  20. Welm, B. E., Dijkgraaf, G. J., Bledau, A. S., Welm, A. L., Werb, Z. Lentiviral transduction of mammary stem cells for analysis of gene function during development and cancer. Cell Stem Cell. 2 (1), 90-102 (2008).
  21. Smith, P., et al. VANGL2 regulates luminal epithelial organization and cell turnover in the mammary gland. Scientific Reports. 9 (1), 7079 (2019).
  22. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
  23. Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology. PLoS One. 6 (9), e25661 (2011).
  24. Labarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture. Journal of Visualized Experiments. (71), e50011 (2013).
  25. Marlow, R., Dontu, G. Modeling the breast cancer bone metastatic niche in complex three-dimensional cocultures. Methods in Molecular Biology. 1293, 213-220 (2015).
  26. Koledova, Z., Lu, P. A 3D Fibroblast-Epithelium Co-culture Model for Understanding Microenvironmental Role in Branching Morphogenesis of the Mammary Gland. Methods in Molecular Biology. 1501, 217-231 (2017).

Tags

विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 157 स्तन ऑर्गेनोइड ल्यूमिनल बेसल मायोपिथेलियल एपिथेलियल 3 डी संस्कृति
अंतर ट्राइप्सिनाइजेशन द्वारा मोज़ेक मैमेरी ऑर्गेनॉइड की पीढ़ी
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rubio, S., Cazares, O., Macias, H.,… More

Rubio, S., Cazares, O., Macias, H., Hinck, L. Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization. J. Vis. Exp. (157), e60742, doi:10.3791/60742 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter