Summary
Brystkjertelen er en bilayered struktur, bestående av ytre myoepitelog indre luminal epitelceller. Presentert er en protokoll for å forberede organoider ved hjelp av differensial trypsinisering. Denne effektive metoden gjør det mulig for forskere å separat manipulere disse to celletypene for å utforske spørsmål om deres roller i brystkjertelform og funksjon.
Abstract
Organoider tilbyr selvorganiserende, tredimensjonale vevsstrukturer som rekapitulerer fysiologiske prosesser i bekvemmeligheten av en tallerken. Murine brystkjertelen består av to forskjellige epitelcellerom, som serverer forskjellige funksjoner: det ytre, kontraktile myoepithelialrommet og det indre, sekretoriske armaturrommet. Her beskriver vi en metode der cellene som består av disse rommene er isolert og deretter kombinert for å undersøke deres individuelle avstamningbidrag til brystkjertelen morfoogenese og differensiering. Metoden er enkel og effektiv og krever ikke sofistikertseparasjonsteknologier som fluorescensaktivert cellesortering. I stedet høster vi og enzymatically fordøye vevet, frø epitelet på tilhengervev sover, og deretter bruke differensial trypsinization å skille myoepithelial fra luminal celler med ~ 90% renhet. Cellene blir deretter belagt i en ekstracellulær matrise hvor de organiserer seg i bilayered, tredimensjonale (3D) organoider som kan differensieres for å produsere melk etter 10 dager i kultur. For å teste effekten av genetiske mutasjoner, celler kan høstes fra vill type eller genmodifiserte musemodeller, eller de kan genetisk manipuleres før 3D kultur. Denne teknikken kan brukes til å generere mosaikkorganoider som tillater undersøkelse av genfunksjon spesielt i luminal eller myoepithelial rommet.
Introduction
Brystkjertelen (MG) er en trelignende, rørformet epitelstruktur innebygd i en adipocyte rik stroma. Det tolagsductal epitelet består av et ytre, basallag av kontraktile, myoepitelceller (MyoECs) og et indre lag av luminale, sekretoriske epitelceller (LECer), som omkranser en sentral lumen1. Under amming når de ytre MyoECs kontrakt for å presse melk fra indre alveolære LECer, MG gjennomgår mange endringer som er under kontroll av vekstfaktorer (f.eks EGF og FGF) og hormoner (f.eks progesteron, insulin, og prolaktin). Disse endringene forårsaker differensiering av spesialiserte strukturer, alveoler, som syntetiserer og utskiller melk under amming1. Mammary epitelkan bli eksperimentelt manipulert ved hjelp av teknikker der enten epitelvev fragmenter, celler, eller til og med en enkelt basal celle er transplantert inn i verten pattedyr fett pads, precleared av endogene bryst parenchyma, og lov til å vokse ut for å rekonstituere en hel, funksjonell epithelial treet2,3,4,5.5 Transplantasjon er en kraftig teknikk, men det er tidkrevende og umulig hvis en mutasjon resulterer i tidlig embryonal dødelighet (før E14) som forhindrer redning av transplanterbare pattedyranlage. Videre ønsker etterforskerne ofte å undersøke rollene til de to forskjellige rommene, som er avledet fra avstamningsbegrensede stamceller. Mens Cre-lox-teknologi tillater differensial genetisk manipulering av MyoECs og LECer, er dette også et tidkrevende og dyrt foretak. Dermed, siden 1950-tallet, har forskerne brukt in vitro mammary organoider som en relativt enkel og effektiv måte å løse spørsmål om brystvevstruktur og funksjon6,7.
I tidlige protokoller som beskriver isolasjon og kultur av primære pattedyr epitelceller, fant forskerne at en kjeller membran matrise (BME), bestående av en plasmablodpropp og kylling embryo ekstrakt, var nødvendig for MG fragmenter dyrket på en tallerken6. I de følgende tiårene ble ekstracellulære matriser (EcMs, kollagen og gelélignende proteinmatrise utskilt av Engelbreth-Holm-Swarm murine sarkomceller) utviklet for å lette 3D-kulturen og bedre etterligne in vivo-miljøet7,8,9,10. Culturing celler i 3D matriser avslørt av flere kriterier (morfologi, genuttrykk, og hormon respons) at et slikt mikromiljø bedre modeller i vivo fysiologiske prosesser9,,10,11,12. Forskning ved hjelp av primære murine celler identifisert viktige vekstfaktorer og morfogener nødvendig for utvidet vedlikehold og differensiering av organoider13. Disse studiene har satt scenen for protokollen presentert her, og for kulturen av menneskelige brystceller som 3D organoider, som nå er et moderne klinisk verktøy, slik at for narkotika oppdagelse og narkotikatesting på pasientprøver14. Samlet sett fremhever organoid kuling selvorganisasjonens kapasiteter av primærceller og deres bidrag til morfogenese og differensiering.
Presentert her er en protokoll til kultur murine epitel som kan differensieres til melkeproduserende acini. En differensialtrypsiniseringsteknikk brukes til å isolere MyoECs og LECer som utgjør de to forskjellige MG-cellerommene. Disse separerte cellefraksjonene kan deretter manipuleres genetisk til overexpress eller knockdown genfunksjon. Fordi avstamning-iboende, selv-organisasjon er en medfødt egenskap av pattedyr epitelceller15,16,17, rekombinere disse celle fraksjoner tillater forskere å generere bilayered, mosaikk organoider. Vi begynner med enzymatically fordøye fettvevet, og deretter inkubere brystfragmentene på en vevkulturrett i 24 timer (Figur 1). Vevsfragmentene legger seg på polystyrenretter som bilayered fragmenter med sin in vivo organisasjon: ytre myoepithelial lag rundt indre luminale lag. Denne mobilorganisasjonen gjør det mulig å isolere de ytre MyoECs ved å trypsin-EDTA (0,05%) behandling i 3-6 min etterfulgt av en andre runde med trypsin-EDTA (0,05%) behandling som løsner de resterende indre LECene (figur 2). Dermed isoleres disse celletypene med forskjellig trypsinfølsomhet og kan deretter blandes og lagres i ECM (figur 3). Cellene gjennomgår selvorganisering for å danne tolagskuler, bestående av et ytre lag av MyoECs rundt indre LECer. Lumen formasjon oppstår som cellene vokser i et medium som inneholder en cocktail av vekstfaktorer (se oppskrifter for VekstMedium)13. Etter 5 dager kan organoider differensieres til melkeproduserende acini ved å bytte til Alveologenesis Medium (se oppskrifter og figur 3F)og inkuberes i ytterligere 5 dager. Alternativt vil organoider fortsette å ekspandere og gren i Vekstmedium i minst 10 dager. Organoider kan analyseres ved hjelp av immunfluorescens (Figur 3D-F) eller frigjøres fra ECM ved hjelp av en gjenopprettingsløsning (se materialtabellen) og analyseres via andre metoder (f.eks. immunblot, RT-qPCR).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder beskrevet her har blitt godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of California, Santa Cruz.
1. Dag 1: Fordøyelsen av brystkjertelen
- Forbered deg på å høste MGs fra modne hunnmus 10-14 uker.
- Utfør høstingen på en åpen benk under aseptiske forhold.
- Steriliser alle kirurgiske forsyninger, korkplater og pinner ved autoklaving og soaking i 70% alkohol i 20 minutter før operasjonen.
- Bedøvelse av dyr med natriumpentobarbital (2X bedøvelsesdose på 0,06 mg/g kroppsvekt) som leveres via intraperitoneal injeksjon med en 0,5 ml insulinsprøyte.
- Overvåk nivået av anestesi ved å klemme dyrets tær for å se etter en refleksrespons og starte protokollen først etter at dyret er fullstendig bedøvet.
- Plasser dyret på ryggen, fest vedleggene til korkebrettet, og tørk ned magen og brystet med etanol.
- For å høste #2, 3, 4 og 5 MGs fra en mus (dvs. 8 MGs, figur 1A),identifisere midtlinjen mellom de to bakbenene og lage et lite snitt (1 cm) på bukhuden med skarp saks, og trekk deretter kuttet opp til halsen18.
- Følg med å gjøre små kutt lateralt mot bena og armene for å tillate frigjøring av huden ved hjelp av en bomullspinne. Trekk huden bort og strekk den stramt før du fester den ned på den ene siden (Figur 1B, trinn 1)18. Fjern MGs ved å kutte under dem, og fjern lymfeknuter fra #4 kjertler (Figur 1B, trinn 2, 3)18. Gjenta prosedyren på den andre siden av kroppen.
- Samle MG vev i 50 ml av 4 °C Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM)/Nutrient Mixture F12 (F12) supplert med 5% føtal storfe serum (FBS) og 1X Antimycotic (Anti-Anti)18.
- Hakk kjertlene i en 35 mm tallerken eller på en keramisk plate ved hjelp av et barberblad eller vevshelikopter. Drei platen hver femte manuelle koteletter eller hver runde på vevshelikopteret til vevsbitene kan passe gjennom en 1 ml mikropipettespiss med letthet (~ 0,1 mm /fragment, figur 1C).
- Fordøye MGs i fordøyelsesmedium (se tabell 1) i 14 timer i en 6 brønnlav vedhemhesjonsfat ved 37 °C, 5 % CO2.
2. Dag 2: Isolering av pattedyr epitelvev fragmenter
- Etter 14 timer fordøyelse, bland forsiktig ved å røre det fordøyde vevet 10X ved hjelp av en 1 ml mikropipette for å bryte ned gjenværende stroma eller fettvev, slik at verken bobler eller overflødig mekanisk kraft genereres.
MERK: Hvis det er ufullstendig fordøyelse etter 14 timer, kan dette skyldes akkumulering av bemerkelsesverdig DNA. I dette tilfellet, tilsett 1 μL av 1 mg / ml deoxyribonuclease I (DNase I) per 2 ml fordøyelsesmedium. Inkuber i ytterligere 30 min ved 37 °C, 5% CO2. - Samle vev i et 15 ml rør og skyll brønnen som brukes til fordøyelse n2-og mg2+. Sentrifuge på 600 x g i 10 min.
- Evakuer supernatanten som inneholder lipidlaget og mediet, og suspender deretter pelleten i 5 ml DPBS og bytt til et nytt 15 ml rør. Sentrifuge på 600 x g i 10 min.
- Under sentrifugering plassere en 70 μm nylon celle sil i en 50 ml rør og prewet silen ved hjelp av 10 ml av 37 °C DMEM/F12.
- Resuspender vevfragmenter fra protokolltrinn 2.4 ved hjelp av 5 ml DPBS og send suspensjonen gjennom en prewet 70 μm nyloncellesil for å fjerne sstromalceller og enkeltceller (figur 1D).
- Samle vevfragmenter på cellesilen. Skyll 4X med 10 ml dmem/f12 (bilde 1D).
FORSIKTIG: Ufullstendig snerking vil resultere i kulturer forurenset med ikke-epitelceller. - Slipp vevsfragmentene ved å holde siltfanen med hansker, snu silen over en 60 mm vevskulturrett og passere 1 ml aliquots av vedlikeholdsmedium (se tabell 1) gjennom bunnen av silen 4X (figur 1E).
- Kontroller silen for vevfragmentrester, som vil være synlig av det blotte øye, og skyll silen 1X mer med 1 ml vedlikeholdsmedium hvis noen fragmenter fortsatt overholder silen. De skyllede vevsfragmentene skal nå være fri for stromale celler.
- Undersøk raskt 60 mm parabolen som inneholder MG-fragmentene fra protokolltrinn 2.9 under et omvendt mikroskop (4X eller 10X mål, figur 1F). En typisk forberedelse av åtte MGs gir ~ 500 fragmenter. Se etter enkeltceller eller fettdråper og om det er forurensende celler.
MERK: Hvis det er forurensende celler, gjenta filtreringstrinnet ved å samle opp mediet og fragmentene fra 60 mm parabolen ved hjelp av en 5 ml pipette og filtrere fragmentet igjen gjennom en frisk 70 μm sil, gjentaprotokolltrinn 2.6, 2.8-2.10. - Inkuber 24 timer ved 37 °C, 5 % CO2, slik at vevsfragmentet kan feste seg og generere tolagsfragmenter (figur 2A).
MERK:Hvis fragmentene ikke har avgjort med 24 timer, fortsetter du å inkubere til de blir holdt. Hvis fragmentene ikke holder seg godt, vil separasjonen av cellerommene ikke fungere. Hvis forskerne er bekymret for vedheshet, kan vevskulturplatene behandles for å fremme fragmentvedlegg (f.eks. poly-L-lysin).
3. Dag 3: Differensial trypsinisering av myoepitelceller og luminale epitelceller
- For å skille MyoECs fra LECer, tøm mediet fra parabolen, skyll 1x med 1 ml DPBS og legg til 1 ml fersk trypsin-EDTA (0,05%), og overvåk forsiktig fordøyelsen under et omvendt mikroskop (10X eller 20X mål, figur 2B,C,F). Avløsning av det ytre MyoEC-laget vil kreve 3-6 min, avhengig av trypsin-EDTA (0,05%) Styrke.
MERK: Se figur 2 for representative bilder som viser denne prosessen. Under brightfield belysning, MyoECs vises avrundet og har et lysere utseende i forhold til LECs, som forblir festet i midten og vises mørkere. - Samle MyoEC-fraksjonen i et 15 ml rør som inneholder 2 ml 10 % FBS/DPBS. Uten å forstyrre LECene, skyll forsiktig 60 mm parabolen med 2 ml DPBS og kast deretter DPBS (Figur 2H-I).
MERK: Den vanlige restitusjonen for MyoECs er innenfor et område på (3,5 x 106-1,5 x 106)avhengig av størrelsen på MGs. - For å fjerne LEC-fraksjonen, legg til 1 ml trypsin-EDTA (0,05 %) til parabolen igjen og inkuber 7-15 min, overvåking nøye for å hindre overbesvær. Slukke trypsin-EDTA (0,05%) på fatet med 2 ml 10 % FBS/DPBS. Samle LEC-fraksjonen i et nytt 15 ml rør.
MERK: Den vanlige utvinningen for LECer er innenfor et område (2 x 106-4,2 x 106) avhengig av størrelsen på MGs. Rutinemessig er renheten til begge fraksjonene som analyse av immunohistokjemi ~ 90%19 (Figur 2E). - Sentrifuge hver brøkdel i 5 min ved 300 x g for å fjerne trypsin-EDTA (0,05 %). Resuspender pelleten i 250 μL vedlikeholdsmedium og tell hver cellepopulasjon ved hjelp av et hemocytometer eller automatisert celleteller. Plasser cellene på is mens du teller.
MERK: Hvis genetisk manipulering av cellefraksjonene er ønsket, kan primære celler dyrkes på lave vedhemningsretter og infisert med lentivirus20.
4. Dag 3: Kombinere og innebygge cellefraksjoner i en ekstracellulær matrise
MERK: Når MyoEC- og LEC-brøker er samlet inn og talt, kan de kombineres. Det typiske MyoEC/LEC-forholdet er 1:3 (Figur 3A)19. Ulike studier kan utføres. For eksempel, for å utføre mosaikkstudier, kan fraksjoner genereres fra villtype (WT) og muterte (Mut) mus og kombinert (MyoEC / LEC: WT / WT; WT/Mut; Mut/WT; Mut/Mut)21, eller brøker kan kombineres ved hjelp av forskjellige forhold mellom MyoECs/LECer19.
- Basert på celletellinger beregner du antall brønner (8 brønnkammer, se Materialtabell) som må være forberedt på 12 000 celler/brønn (f.eks. 3000 myoecer:9000 lecer).
- Etablere basislaget for 3D-kultur ved å legge til 90 μL av 50% ECM (50% ECM / 50% DMEM / F12, uten fenol rød - se Materialtabellen) til hver brønn. Sørg for at det ikke er noen bobler og brønnene er belagt jevnt. For å stivne bunnlaget, inkuber lysbildene ved 37 °C, 5% CO2 i 30 min.
MERK: ECM må holde seg iskald til dette trinnet, ellers vil det polymerisere for tidlig og føre til ujevn basebelegg og polymerisering. Ved hjelp av en base ECM forbedrer organoid vekst i et enkelt plan, som hjelpemidler bildefangst. Dette får også raskere organoid vekst og bruker mindre ECM22. - Under polymerisering, forberede celleblandinger. Pellet myoec og LEC fraksjoner på 300 x g i 5 min og resuspendhver celle fraksjon i 10% ECM /90% Vekst Medium så hver brønn har 100 μL (se tabell 1 for hvordan du gjør vekstmedium).
MERK: For enkel forberedelse, repliker brønner ved hjelp av de samme celleblandingene. Disse kan kombineres og tilberedes i ett rør (f.eks. fire brønner av samme celleblanding kan tilberedes i 400 μL på 10 % ECM/90 % vekstmedium). - Tilsett 100 μL av hver celleblanding i 10% ECM/90% Vekstmedium til hver brønn og la organoider bosette seg i 20 min ved 37 °C, 5% CO2.
- Når cellene har avgjort, tilsett forsiktig 100 μL vekstmedium ved forsiktig pipettering ned kammerveggen av hver brønn. Inkuber lysbildene ved 37 °C, 5 % CO2 (se figur 3A for den totale sammensetningen av hver brønn).
MERK: Rho Kinase-hemmeren, R-spondin og Nrg1 er faktorer som er identifisert som viktige for den langsiktige kulturen av organoider dyrket fra både primære murine brystceller og humane brystkreftceller13,14. I tillegg forlenger stamcellefaktorene B27 og N2 tiden som organoider kan dyrkes. - Bildeceller hver 24 h for å spore veksten og forny vekstmediet hver 2-3 dag ved hjelp av 100 μL /brønn(figur 3B-E).
MERK: Vær svært forsiktig når du fornyer mediet. Vipp kammeret lysbilder for å samle mediet på ett hjørne av brønnene. Fjern ≤100 μL av mediet og fyll på med forsiktighet for å la ECM-laget være uforstyrret. - Hvis forskerne er interessert i å undersøke laktasjon/alveologenesis, bytt til Alveologenesis Medium (se tabell 1) på dag 5 og fortsette å fornye mediet hver 2-3 dager til dag 10 (Figur 3F) eller utover ved å overføre ved hjelp av gjenopprettingsløsning (se Materialtabellen)13.
MERK: På dette tidspunktet kan organoider isoleres fra ECM ved å inkubere ved 4 °C i 400 μL av 4 °C utvinningsoppløsning (se materialtegntabell for protokoll- og reagensinfo).
5. Dag 5 eller 10: Feste og immunfarging organoider
- Fjern mediet forsiktig ved å forsiktig pipetting av mediet (en pære pipette fungerer best). Skyll hver brønn med 200 μL av 1x Dulbeccos Fosfat Bufret saltvann (DPBS, se oppskrifter).
- Fest organoidene med kulde (4 °C) 4 % (w/v) paraformaldehyd (PFA, se oppskrifter) i 10 minutter ved romtemperatur.
FORSIKTIG: PFA er farlig. Bruk personlig verneutstyr (laboratoriefrakk, hansker og vernebriller). Dette trinnet skal utføres inne i en røykhette.
MERK: ECM oppløses av PFA-behandlingen. Ufullstendig ECM fjerning kan føre til bakgrunnsfarging når organoider analyseres av immunofluorescens. - Fjern 4 % PFA og tilsett 200 μL på 0,2 % (w/v) glycin/DPBS (se tabell 1) til hver brønn. Inkuber lysbildene ved romtemperatur i 30 min eller 4 °C over natten på en gyngeoverflate satt til en langsom innstilling.
MERK: Organoidene kan oppbevares i 1-3 dager i DPBS ved 4 °C før neste trinn. - Permeabilize organoider ved hjelp av DPBS + 0,25% Triton X-100 (PBST, se tabell 1) i 10 min ved romtemperatur.
- Blokker organoidene ved hjelp av 5% eselserum (DS) (eller annet serum som matcher arten av det sekundære antistoffet) i DPBS i 1 h på en gyngeoverflate.
MERK: Dette trinnet kan utføres over natten ved 4 °C på en gyngeoverflate. - Forbered primære antistoffer i 1 % DS/DPBS. Bruk 125-200 μL for hver brønn. Utfør immunfarging ved å inkubere organoidene i primærantistoff over natten ved 4 °C på en gyngeoverflate.
6. Dag 11: Komplett immunfluorescens
- Vask hver brønn 2X med 200 μL PBST i 5 min. Tilsett sekundært antistoff i 1 % DS/DPBS ved bruk av 125-200 μL for hver brønn. Inkuber ved romtemperatur på en gyngeflate i 45 min.
- Vask hver brønn 2X ved hjelp av 200 μL PBST per brønn.
- Beis kjernene ved hjelp av Hoechst DNA farge i DPBS (1:2,000 i DPBS) i 5 min ved romtemperatur.
- Fjern all væske som er igjen på brønnen ved å suge forsiktig med et vakuum.
- Fjern forsiktig kamrene og pakningen, plasser en dråpe (~ 30 μL) monteringsmidler (se materialtabellen) på hver brønn og dekkslip, pass på å fjerne bobler. La lysbildet tørke i et mørkt rom i 1-2 dager. Forsegling med klar neglelakk. Bilde organoider på et konfokalmikroskop (Figur 3E-F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen som presenteres her beskriver en metode for å undersøke spesifikke avstamningbidrag av pattedyrepitelceller ved å gjøre bruk av mosaikkorganoider. For å oppnå primære murineceller for organoider, må brystkjertelepitelet først isoleres fra den omkringliggende adipocytterrike stroma (Figur 1). Denne prosessen er beskrevet kort her og er også beskrevet i en tidligere publisert studie18. For å få nok celler anbefales det at #2, 3, 4 og 5 MGs fjernes (figur 1A). Et viktig skritt for å isolere en ren populasjon av epitelceller er fjerning av lymfeknuter fra #4 MGs, som er rike på immunceller som vil forurense preparatet (figur 1A,B). MG-ene ble hakket for å generere fragmenter ~0,1 mm i størrelse (figur 1B). Vevsfragmentene ble deretter enzymatically fordøyd, en prosess som forekommer i nærvær av kollagennase, for å frigjøre epitel fra stroma, og i fravær av trypsin, for å forhindre fordøyelsen av proteiner som kadheriner som opprettholder cellecellekontakter. Det fordøyde vevet ble deretter sentrifugert for å fjerne lipider og filtrert gjennom en cellesil og vasket (Figur 1C). Epitelfragmentene, som fulgte silen, ble utgitt ved å invertere filteret og vaske membranen, som overførte epitelfragmentene til en polystyrenfat (figur 1D). Disse fragmentene dukket opp som små, forgrenede strukturer (Figur 1E).
De rensede epitelfragmentene ble inkubert i 24 timer. De slo seg ned på parabolen og holdt seg, danner flate, pannekakelignende strukturer med et ytre lag av MyoECs omkranser indre LECs(Figur 2A-B). Figur 2C viser kanten av en slik pannekakelignende struktur fra et vilt type dyr. Trypsin behandling differensielt løsrevet MyoECs, som løsnet først og dukket opp som lyse, avrundede celler som omkranset kjernen av gjenværende cuboidal LECs (Figur 2C, F). Avløsning av MyoECs ble nøye overvåket ved hjelp av brightfield mikroskopi og skjedde innen 3-6 min. Når MECs ble samlet inn, ble LECer senere løsrevet gjennom et sekund, lengre trypsinbehandling på 7-15 min. Tiden som kreves for celleavløsning avhenger av trypsinkonsentrasjonen og friskheten. Den generelle renheten til de to cellerommene var ~90%, som det ble sagt ved å telle celler som var KRT14-positive og E-Cadherin (CDH1)-negative i MyoEC-fraksjonen og cellene som var KRT14-negative og E-Cadherin-positive i LEC-fraksjonen (Figur 2D-E)19. Vi oppdaget at noen av MyoECs ble fjernet fra toppen av pannekake-lignende struktur samt fra ytterkantene. Dette ble observert ved hjelp av vevfragmenter samlet inn fra mus merket med en indusibel, fluorescerende basal markør (Cytokeratin 14 (KRT14)-CreERT1; R26RYFP/+) og injeksjonsmed 75 mg/kg tamoxifen 5 dager før innhøsting. I figur 2F, G er løsningen av MyoECs fra rundt kantene på pannekakestrukturen lett tydelig. Dette skjedde innen de første 2 minuttene av trypsinbehandling (figur 2F). I tillegg ble YFP-KRT14-positive celler observert på toppen av strukturen, hvor de rundet opp etter trypsinbehandling og ble fjernet av skylle-/innsamlingstrinnet (figur 2G). Den umerkede kjernen av LECer (Figur 2H), som inneholdt få eller ingen YFP-KRT14-positive celler, (Figur 2I) deretter løsrevet i den andre runden med trypsinbehandling.
MyoEC- og LEC-brøkerne ble samlet inn, kombinert og innebygd i 10 % ECM-belagt på en 50 % ECM-base. Dette tillot bedre optisk oppløsning av organoider som vokste hovedsakelig langs basislaget (Figur 3A). Etter 24 timer ble cellene satt sammen i aggregerte strukturer som i stor grad manglet en lumen (figur 3B). Etter 48 timer ble nascent organoider dannet som de sentrale lumen uthult og dukket opp som et lettere indre rom(figur 3C). Etter 10 dager var organoidene store, forgrenede strukturer med velutviklede lumen. Mosaikkorganoider generert fra MyoECs høstet fra villtype mus og LECer høstet fra ACTb-EGFP mus ble løst i situ, immunisert med et antistoff mot basal markør alfa-glatt muskel actin (SMA), og farget med Hoechst DNA flekk for å vise kjernene. I tallene viser topp- og seksjonsvisningene forskjellige sett med bilder samlet inn som en Z-stack og rekonstruert til en 3D-visning (figur 3D). Toppvisningen avslører organoidenes forgrenede morfologi (figur 3E'). Seksjonsvisningen viser den bilayered epitelstrukturen og åpen lumen av disse organoidene (Figur 3E''). Disse organoidene kan også differensieres på dag 5 ved hjelp av Alveologenesis Medium og inkuberes i ytterligere 5 dager (Figur 3F). Organoidene vokste seg større, hadde flere grener og inneholdt melk. Differensierte organoider ble generert som beskrevet ovenfor og immunisert med et antistoff rettet mot melkemarkøren, mysesurprotein (WAP, figur 3F). WAP er et løselig protein utskilt i melk. Mye av denne væsken gikk tapt da cellene ble faste og immunisert in situ. Derfor, i topp- og seksjonsvisninger, er WAP-farging synlig intracellulært i utskilleceller og ekstracellulært i melk som ble fanget på celleoverflaten under fiksering (Figur 3F), men i avsnittsvisning ser en liten organoid ut til å inneholde flytende melk (Figur 3F'' boksoverlegg).
Figur 1: Isolasjon av mammaryfragment. (A) Merket skjematisk av en mus s 5 MGs med umerkede, kontralaterale parm. (B) Bilder av mus MGs med #4 MG bokset og forstørret for å vise hvordan du identifiserer lymfeknuten for fjerning. (C) Bilde av hakkede MGs i en 6 brønnlav vedheshetplate med en linjal som viser størrelsen på vevsbitene (~ 0,1 mm hver). - Jeg har ikke noe åsi. Skjematisk illustrerer protokolltrinn 2.7-2.9. (D) MG fragmenter ble filtrert gjennom en 70 μm sil og skyllet 4X. (E) Silen ble deretter invertert over en 60 mm polystyren vev kultur parabolen og fragmenter ble sluppet ut i parabolen. (F) Bilde som viser de filtrerte vevsfragmentene samlet på en 60 mm tallerken som er fri for stroma. Pilene peker på de minste fragmentene som samles på 70 μm-silen. Skala bar = 100 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Differensial trypsinisering. (A) Brightfield bilde som viser et vev fragment festet på en polystyren parabolen, danner en pannekake-lignende struktur. - Jeg har ikke noe åsi. Det første differensialtrypsiniseringstrinnet frittliggende MyoECs som er tydelig synlige som lyse, avrundede celler etter 3 min. (D) Immunfluorescerende bilder av MyoECs (nederst) og LECer (øverst) ved hjelp av Cytokeratin 14 (KRT14) cellemarkør for MyoECs, og E-Cadherin (CDH1) cellemarkør for LECer. (E) Uttrykket av KRT14 og CDH1 ble brukt til å kvantifisere utbyttet og renheten til de differensierte cellefraksjonene. (F-I). Representative fasekontrast- og fluorescensbilder (YFP) bilder av vevfragmenter fra Cytokeratin 14 (KRT14)-CreERT1; R26RYFP/+ MGs. Mus ble injisert med 75 mg/kg tamoxifen 5 dager før innhøsting. (F) Koble fra MyoECs (piler) under den første trypsin-EDTA (0,05%) 2 min etter inkubasjon. (G) En sprinkling av KRT14-YFP-MyoECs (piler) på toppen av en pannekake av umerkede LECer. (H) Brightfield bilde av LECer etter første trypsinisering og MyoEC løsrivelse. (I) Etter myoec-avløsning er KRT14-YFP-MyoECs ikke lenger synlige som vist ved fravær av YFP-uttrykk. Skala stenger = 30 μm (A, brightfield) 100 μm (F, brightfield), 50 μm (G, fluorescens), 100 μm (H,I). Paneler A-E av dette tallet er endret fra Macias et al.19. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Tredimensjonal organoid kultur. (A) Skjematisk representasjon av enkeltceller innebygd i 10% ECM /90% Vekst Medium og vokst på en 50% ECM/50% DMEM basislag (protokoll trinn 4.5). - Jeg har ikke noe åsi. Illustrasjoner og fasekontrastbilder som viser den raske selvorganiserende kapasiteten til brystorganoider generert fra differensialt trypsiniserte og recombined MyoECs og LECer ved 24 h (B) og 48 h (C). Bilder samlet inn ved hjelp av et digitalt widefield-mikroskop (D) Skjematisk representasjon som illustrerer de øverste (venstre) eller seksjonsvisningene (høyre) som brukes i E-F for å vise immunfargede organoider. (E) Skjematisk representasjon av en enkelt brønn av en 8 brønn kammer lysbilde som inneholder pattedyr organoider dyrket i 5-10 dager i Growth Medium. - Jeg har ikke noe åsi. Toppvisning (E') og seksjonsvisning (E") av immunoflekkede organoider på dag 10 av vekst. MyoECs er merket med glatt actin muskel (SMA) i pseudocolor magenta. LeCene er fra ACTb-EGFP mus og er vist i pseudocolor grønn. Nuclei ble farget med Hoechst dye. (F) Skjematisk representasjon av en enkelt brønn av en 8 brønn kammer lysbilde som inneholder pattedyr organoider dyrket i 5 dager i Vekst Medium og 5 dager i Alveologenesis Medium. (F'-F"). Toppvisning (F') og seksjonsvisning (F") av immunofargede organoider på dag 10 av vekst. MyoECs er umerket. LeCer fra ACTb-EGFP mus er vist i pseudocolor grønn. Melkeproteinet, mysesurproteinet (WAP), er vist i pseudocolor gul i LECer og belegg innsiden av organoidenes lumen. Nuclei ble farget med Hoechst dye. Bilder samlet inn ved hjelp av et roterende diskkonfokalmikroskop og rekonstruert i 3D ved hjelp av Imaris (E', E') eller nedre del ~ 30 skiver (F', F"). Skala stenger = 100 μm (C), 20 μm (E), 40 μm (F). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| 10 ml | Fordøyelsen Medium | |
| Beløpet | Reagens | Notater |
| 9,45 ml | DMEM/F12 (andre er i 1998) | |
| 100 μL | Antimykotisk antimykotisk (100x) | |
| 0,04 g | Klasse 3 Collagenase | |
| 0,04 g | Klasse 2 Dispase | |
| 50 μL (50 μL) | Gentamicin | Endelig konsentrasjon: 500 μg |
| 2,5 ml | Fosterstorfe Serum | Endelig konsentrasjon: 5% (v/v) |
| Passere gjennom 0,22 μm filter | ||
| 50 ml | Vedlikehold Medium | |
| Beløpet | Reagens | Notater |
| 49,47 ml | DMEM/F12 (andre er i 1998) | |
| 0,5 ml | Antimykotisk antimykotisk (100x) | |
| 2,5 ml | Fosterstorfe Serum | Endelig konsentrasjon: 5% (v/v) |
| 25 μL (25 μL) | Insulin | Endelig konsentrasjon: 250 μg |
| 5 μL (5 μL) | EGF (andre er i seg selv | Endelig konsentrasjon: 500 ng |
| 10 ml | Vekst Medium | |
| Beløpet | Reagens | Notater |
| 9.6455 ml | DMEM/F12, ingen fenolrød | |
| 100 μL | N-2 Tillegg (100x) | |
| 200 μL (200 μL) | B27 supplement uten vitamin A (50x) | |
| 10 μL (10 μL) | Nrg1 (andre er i norge) | Lager: 100μg/ml |
| 42,5 μL | R-spondin (andre er i seg selv) | Lager: 10 μg/ml |
| 1 μL (1 μL) | Rho-hemmer Y-27632 | Lager: 10 μM |
| 1 μL (1 μL) | EGF (andre er i seg selv | Lager: 0,1 μg/μL |
| 10 ml | Alveologenesis Medium | |
| Beløpet | Reagens | Notater |
| 9.6355 ml | DMEM/F12, ingen fenolrød | |
| 100 μL | N-2 Tillegg (100x) | |
| 200 μL (200 μL) | B27 supplement uten vitamin A (50x) | |
| 10 μL (10 μL) | Nrg1 (andre er i norge) | Lager: 100μg/ml |
| 42,5 μL | R-spondin (andre er i seg selv) | Lager: 10 μg/ml |
| 1 μL (1 μL) | Rho-hemmer Y-27632 | Lager: 10 μM |
| 5 μL (5 μL) | Ovine Pituitary Prolaktin | Endelig konsentrasjon: 1 μg/ml |
| 1 μL (1 μL) | Deksametason | Endelig konsentrasjon: 5 μg/ml |
| 5 μL (5 μL) | Insulin | Endelig konsentrasjon: 5 μg/ml |
| 1 L (andre kan) | 10X DPBS (andre kan være på | |
| Beløpet | Reagens | Notater |
| 80 g | Nacl | |
| 2 g (andre) | KCl (andre er) | |
| 14.4 g | NaH2PO4 (andre kan være på stedet) | |
| 2,4 g | Kh2po4 (andre kan være på denne siden) | |
| 1 L (andre kan) | di H2O (andre er i seg selv) | |
| Fyll til 800 ml før du legger til tørre reagenser og oppløs. Fyll volumet til 1 L. Juster pH til 7,4. Autoklav for å sterilisere. | ||
| 1 L (andre kan) | 1X DPBS (andre kan være på | |
| Beløpet | Reagens | Notater |
| 100 ml | 10X PBS | |
| 900 ml | di H2O (andre er i seg selv) | |
| 1 L (andre kan) | Pbst (andre kan være på | |
| Beløpet | Reagens | Notater |
| 100 ml | 10X PBS | |
| 2,5 ml | Triton X-100 | |
| 250 ml | 4% Paraformaldehyd | |
| Beløpet | Reagens | Notater |
| 10 g | Paraformaldehyd | |
| 200 ml | Di H20 (andre er i seg selv) | vann må være ved 60 °C |
| 25 ml | 10X DPBS (andre kan være på | |
| 50 μL (50 μL) | 10 N Natriumhydroksid | |
| Pass gjennom et 0,45 μm filter for å sterilisere og forsikre pH er 7,4 | ||
| 10 ml | 1 % esel serum | |
| Beløpet | Reagens | Notater |
| 100 μL | Sterilt filtrert esel serum | |
| 9,9 ml | 1X DPBS (andre kan være på | |
| 10 ml | 0,2% glycin | |
| Beløpet | Reagens | Notater |
| 0,02 g | Glysin | |
| 10 ml | 1X DPBS (andre kan være på | |
Tabell 1: Løsningsoppskrifter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her presenteres en metode som beskriver hvordan forskere kan generere 3D organoid kulturer ved hjelp av primære MG-celler. Forskjellen mellom dette og andre protokoller er at vi beskriver en metode for å skille de to, distinkte MG-cellerommene: de ytre basal myoecs og indre LECer. Vår metode benytter en to-trinns trypsin-EDTA (0,05%) behandling som vi kaller differensial trypsinization19. Denne prosedyren gjør det mulig for forskere å isolere MyoECs og LECer uten å bruke sofistikert flyt cytometri og dermed kan brukes til å studere MGs høstet fra et bredt utvalg av pattedyr arter som kanskje ikke har godt karakterisert biomarkører som kreves for FACS. Evnen til å skille de to celleunderpopulasjonene gjør det mulig for forskere å genetisk modifisere de isolerte cellene uavhengig eller kombinere celler fra dyr som huser genetiske mutasjoner eller etiketter, og dermed generere mosaikkorganoider i 3D-kulturen. En begrensning av den nåværende protokollen er at stromal rommet ikke er inkludert i kuling forholdene. Imidlertid utvikles nye metoder til kokulturstromale komponenter med organoider generert fra enten primære celler eller cellelinjer for å bedre rekapitulere i vivo ECM23,24,25,26, og disse metodene kan tilpasses denne protokollen. I tillegg er det viktig å merke seg at selv om denne protokollen oppnår en stor berikelse av MyoEC- og LEC-fraksjonene (~ 90% rensing), representerer fraksjonene ikke rene cellelinjer.
Suksessen til denne protokollen er avhengig av en rekke viktige trinn. Først er det viktig å forsiktig, men grundig fordøye MG-vevet. Overbesvær av vevet vil føre til celledød og lavere gjenoppretting av epitelceller. Ufullstendig fordøyelse vil resultere i stromal og fettcellekontaminering, noe som vil forstyrre senere analyser (f.eks. immunfluorescens, proteinanalyse og mRNA-målinger). For det andre er det viktig å skylle MG-vevet grundig for å fjerne forurensende celler i protokolltrinn 2.8. I protokolltrinn 2.9 slippes MG-vevsfragmentene ut i en 60 mm tallerken. Forskere bør overvåke de frigjorte fragmentene umiddelbart, før de holder seg til parabolen. Hvis fettdråper eller enkeltceller observeres, må protokolltrinn 2.6 og 2.8-2.11 gjentas. For å gjøre dette samles medium- og vevsfragmentene fra parabolen, plasseres i en ny 70 μm sil, vaskes 4X med 37 °C DMEM/F12 og slippes deretter ut i en ny 60 mm tallerken. For det tredje er det viktig å se den første trypsin-EDTA (0,05%) inkubasjon en tett fordi MyoECs kan løsne innen de første 3 minuttene, men de kan også holde seg i opptil 6 min. Det har vært tilfeller når trypsin-EDTA (0,05%) var suboptimal, og inkubasjon en fortsettet i 10 min med vellykket rensing av MyoECs. > 10 min trypsinisering resulterte imidlertid i samtidig samling av MyoECer og LECer. Det er også viktig at parabolen forblir uforstyrret under den første inkubasjonen. Ellers kan kontaminering av MyoEC-fraksjonen med LECer forekomme. Det motsatte er også sant; hvis MyoECs ikke er helt løsrevet fra parabolen, vil de forurense LEC-fraksjonen. Hvis forskere bruker reportermus som merker MyoECs eller LECer utelukkende, er det lettere å visualisere separasjonen under et fluorescensmikroskop (Figur 2F-I). Til slutt, hvis forskerne planlegger å fikse organoider for immunfluorescensanalyser, er pH (7.4) og temperatur (4 °C) av 4% PFA viktig for vellykket dissosiasjon av ECM. Hvis organoidene samles inn til andre analyser (f.eks. protein- og mRNA-målinger), er det viktig at gjenopprettingsløsningen er ved 4 °C. Hvis ECM ikke oppløses, kan inkubasjon med gjenopprettingsoppløsningen forlenges med 10 min (dvs. 30 min total inkubasjon). Lengre inkubasjonsperioder vil imidlertid føre til tap av 3D-struktur og celledød. Gjenopprettingsprotokollen (oppført i materialtabellen) angir bruken av brede tips. Dette er viktig for å opprettholde 3D-strukturen til organoidene, samt integriteten til cellene.
I tillegg til disse fire viktige trinnene, er det to faktorer som påvirker protokollens suksess. For det første kan organoidvekst begrenses av genetiske mutasjoner som reduserer cellespredning og reduserer derfor organoidvekst i ECM. Hvis bare noen få organoider oppnås, resulterer det påfølgende fikseringstrinnet ofte i tapet. For å løse dette, bør antall celler innebygd i ECM økes samtidig som forholdet mellom MyoECs:LECer (protokolltrinn 4.1-4.2). For det andre, når cellene overføres til en ECM er det viktig å se deres vekst daglig og være årvåken om mediefornyelse (hver 2-3 dager). Denne protokollen spesifiserer fenol røde gratis reagenser for bedre visualisering, men den samme suksessen og veksten oppnås ved hjelp av fenolrøde positive reagenser. Dagene når middels fornyelse oppstår før fiksering (protokolltrinn 4.6) bør utføres med ekstrem forsiktighet for å redusere celletap. Det 10% ECM topplaget er delikat; derfor bør vask eller middels fornyelse utføres ved å pipevæske ned i kammerveggene for å minimere mekaniske forstyrrelser.
Differensiering av organoider til melkeproduserende acini krever behandling med differensieringkosttilskudd: hydrokortison eller deksametason, insulin og prolaktin. I denne protokollen anbefales deksametason. I tillegg, mens prolaktin er kommersielt tilgjengelig, ble prolaktinen som brukes i denne protokollen hentet fra National Hormone and Peptid Program. Igjen er det svært viktig å la organoidene være uforstyrret når du endrer Alveologenesis Medium. Differensiering krever minst 5 dager. Dette kan forlenges ytterligere 3-5 dager, men basislaget av ECM forringes etter 10-12 dager. Differensierte organoider er fylt med melk og deres lumen ser mørkere ut.
Dette er en effektiv teknikk som kan brukes til å håndtere kupéspesifikke, avstamningbidrag til pattedyrepitelmorfoogenese og differensiering. Med denne teknikken kan forskere generere mosaikkorganoider som består av differensialt genetisk manipulerte MyoECs og LECer21, eller MyoECs og LECer hentet fra mus som huser forskjellige genetiske mutasjoner. Dette gjør det mulig for forskere å bedre forstå bidragene fra avstamningsspesifikke cellerom til orgelmorfose og oppkjøp av spesialiserte funksjoner som melkeproduksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Ben Abrams for teknisk assistanse og kjernestøtte fra University of California, Santa Cruz (UCSC) Institute for biologien til stamceller (IBSC). Vi takker Susan Strome og Bill Saxton for bruken av deres Solamere Spinning Disk Confocal Microscope. Dette arbeidet ble delvis støttet av tilskudd til UCSC fra Howard Hughes Medical Institute gjennom James H. Gilliam Fellowships for Advanced Study program (S.R.), fra NIH (NIH GM058903) for initiativet for å maksimere studentutvikling (H.M.) og fra fra National Science Foundation for et stipendiatstipend (O.C. DGE 1339067) og ved et stipend (A18-0370) fra UC-Cancer Research Coordinating Committee (LH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352096 | |
| 24 well ultra-low attachment plate (Corning) | Fisher Scientific | CLS3473-24EA | |
| 35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353001 | |
| 50 ml High-Clarity polypropylene conical tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352098 | |
| 60 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353004 | |
| 70 µM nylon cell strainer (Corning) | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Pen/Strep also works |
| B27 supplement without vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| B6 ACTb-EGFP mice | The Jackson Laboratory | 003291 | |
| BD Insulin syringe 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| Class 2 Dispase (Roche) | Millipore Sigma | 4942078001 | |
| Class 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004206 | |
| Corning Cell Recovery solution | Fisher Scientific | 354253 | Follow the guidelines for use – Extraction of Three-Dimensional Structures from Corning Matrigel Matrix |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment 6-well | Fisher Scientific | CLS3471 | |
| Dexamethasone | Millipore Sigma | D4902-25MG | |
| DMEM/F12, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11039-021 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington Biochemical | LS002007 | |
| Donkey anti-Goat 647 | Thermo Fisher Scientific | A21447 | Use at 1:500, Lot: 1608641, stock 2 mg/mL, RRID:AB_2535864 |
| Donkey anti-Mouse 647 | Jackson ImmunoResearch | 715-606-150 | Use at 1:1000, Lot: 140554, stock 1.4 mg/mL |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Thermo Fisher Scientific | 11330-057 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-250 | Without Mg2+/Ca2+ |
| EGF | Fisher Scientific | AF-100-15-100ug | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068–085 | 100% US Origin, premium grade, Lot: 059B18 |
| Fluoromount-G (Southern Biotech) | Fisher Scientific | 0100-01 | Referred to as mounting media in text |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Goat anti-WAP | Santa Cruz Biotech | SC-14832 | Use at 1:250, Lot: J1011, stock 200 µg/mL, RRID:AB_677601 |
| Hoechst 33342 | AnaSpec | AS-83218 | Use 1:2000, stock is 20mM |
| Insulin | Millipore Sigma | I6634-100mg | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| KRT14–CreERtam | The Jackson Laboratory | 5107 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR); Phenol Red-Free; 10 mL | Fisher Scientific | CB-40230C | Lot: 8204010, stock concentration 8.9 mg/mL |
| MillexGV Filter Unit 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGV033RS | |
| Millicell EZ SLIDE 8-well glass, sterile | Millipore Sigma | PEZGS0816 | These chamber slides are great for gasket removal but other brands can work well (e.g. Lab Tek II). |
| Mouse anti-SMA | Millipore Sigma | A2547 | Use at 1:500, Lot: 128M4881V, stock 5.2 mg/mL, RRID:AB_476701 |
| N-2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S671-3 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | S468-500 | |
| Nrg1 | R&D | 5898-NR-050 | |
| Ovine Pituitary Prolactin | National Hormone and Peptide Program | Purchased from Dr. Parlow at Harbor-UCLA Research and Education Institute | |
| Paraformaldahyde | Millipore Sigma | PX0055-3 | |
| Pentobarbital | Millipore Sigma | P3761 | |
| R26R-EYFP | The Jackson Laboratory | 6148 | |
| Rho inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| R-spondin | Peprotech | 120-38 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | x100-500ML | Laboratory grade |
| Trypsin EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 |
References
- Macias, H., Hinck, L. Mammary gland development. Wiley Interdisciplinary Reviews in Developmental Biology. 1 (4), 533-557 (2012).
- Daniel, C. W., De Ome, K. B., Young, J. T., Blair, P. B., Faulkin, L. J. Jr The in vivo life span of normal and preneoplastic mouse mammary glands: a serial transplantation study. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 61 (1), 53-60 (1968).
- Ip, M. M., Asch, B. B. Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. , Kluwer Academic/Plenum Publishers. (2000).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
- Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
- Lasfargues, E. Y. Cultivation and behavior in vitro of the normal mammary epithelium of the adult mouse. II. Observations on the secretory activity. Experimental Cell Research. 13 (3), 553-562 (1957).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Orkin, R. W., et al. A murine tumor producing a matrix of basement membrane. Journal of Experimental Medicine. 145 (1), 204-220 (1977).
- Lee, E. Y., Parry, G., Bissell, M. J. Modulation of secreted proteins of mouse mammary epithelial cells by the collagenous substrata. Journal of Cell Biology. 98 (1), 146-155 (1984).
- Lee, E. Y., Lee, W. H., Kaetzel, C. S., Parry, G., Bissell, M. J. Interaction of mouse mammary epithelial cells with collagen substrata: regulation of casein gene expression and secretion. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 82 (5), 1419-1423 (1985).
- Bissell, M. J., Barcellos-Hoff, M. H. The influence of extracellular matrix on gene expression: is structure the message? Journal of Cell Science. 8 (Suppl), 327-343 (1987).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Jarde, T., et al. Wnt and Neuregulin1/ErbB signalling extends 3D culture of hormone responsive mammary organoids. Nature Commununications. 7, 13207 (2016).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Daniel, C. W., Strickland, P., Friedmann, Y. Expression and functional role of E- and P-cadherins in mouse mammary ductal morphogenesis and growth. Developmental Biology. 169 (2), 511-519 (1995).
- Runswick, S. K., O'Hare, M. J., Jones, L., Streuli, C. H., Garrod, D. R. Desmosomal adhesion regulates epithelial morphogenesis and cell positioning. Nature Cell Biology. 3 (9), 823-830 (2001).
- Chanson, L., et al. Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 108 (8), 3264-3269 (2011).
- Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. Journal of Visualized Experiments. (106), e53179 (2015).
- Macias, H., et al. SLIT/ROBO1 signaling suppresses mammary branching morphogenesis by limiting basal cell number. Developmental Cell. 20 (6), 827-840 (2011).
- Welm, B. E., Dijkgraaf, G. J., Bledau, A. S., Welm, A. L., Werb, Z. Lentiviral transduction of mammary stem cells for analysis of gene function during development and cancer. Cell Stem Cell. 2 (1), 90-102 (2008).
- Smith, P., et al. VANGL2 regulates luminal epithelial organization and cell turnover in the mammary gland. Scientific Reports. 9 (1), 7079 (2019).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
- Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology. PLoS One. 6 (9), e25661 (2011).
- Labarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture. Journal of Visualized Experiments. (71), e50011 (2013).
- Marlow, R., Dontu, G. Modeling the breast cancer bone metastatic niche in complex three-dimensional cocultures. Methods in Molecular Biology. 1293, 213-220 (2015).
- Koledova, Z., Lu, P. A 3D Fibroblast-Epithelium Co-culture Model for Understanding Microenvironmental Role in Branching Morphogenesis of the Mammary Gland. Methods in Molecular Biology. 1501, 217-231 (2017).
