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Developmental Biology

Geração de Organóides Mammary mosaicos por Trypsinização Diferencial

Published: March 11, 2020 doi: 10.3791/60742

Summary

A glândula mamária é uma estrutura bicamada, composta por células epiteliais mioepiteleliais externas e internas. Apresentado é um protocolo para preparar organóides utilizando a tripspsinização diferencial. Este método eficiente permite que os pesquisadores manipulem separadamente esses dois tipos de células para explorar questões sobre seus papéis na forma e função da glândula mamária.

Abstract

Organóides oferecem estruturas de tecidos tridimensionais auto-organizadas que recapitulam processos fisiológicos na conveniência de um prato. A glândula mamária murina é composta por dois compartimentos de células epiteliais distintos, servindo funções diferentes: o compartimento mioepitelal externo e contraído e o compartimento luminal interno e secreto. Aqui, descrevemos um método pelo qual as células que compõem esses compartimentos são isoladas e, em seguida, combinadas para investigar suas contribuições individuais de linhagem para morfogemeee e diferenciação da glândula mamária. O método é simples e eficiente e não requer tecnologias sofisticadas de separação, como a triagem celular ativada por fluorescência. Em vez disso, colhemos e digerimos enzimáticamente o tecido, sedeo o epitélio em pratos de cultura de tecido aderente e, em seguida, usamos a tripsinização diferencial para separar o mioepitelial das células luminais com ~90% de pureza. As células são então banhadas em uma matriz extracelular onde se organizam em organóides bicamadas tridimensionais (3D) que podem ser diferenciadas para produzir leite após 10 dias na cultura. Para testar os efeitos das mutações genéticas, as células podem ser colhidas de modelos de camundongos selvagens ou geneticamente modificados, ou podem ser geneticamente manipuladas antes da cultura 3D. Esta técnica pode ser usada para gerar organóides de mosaico que permitem a investigação da função genética especificamente no compartimento luminal ou mioepitelélico.

Introduction

A glândula mamária (MG) é uma estrutura epitelia tubular em forma de árvore embutida dentro de um estroma rico em adrócitos. O epitélio ductal bicamada compreende uma camada externa, basal de contratura, células mioepitelélicas (MioECs) e uma camada interna de células epiteliais luminais e secretas (LECs), circundando um lúmen central1. Durante a lactação quando os MyoECs externos se contraem para espremer leite dos LECs alveolares internos, o MG sofre inúmeras alterações que estão o controle de fatores de crescimento (por exemplo, EGF e FGF) e hormônios (por exemplo, progesterona, insulina e prolactina). Essas alterações causam a diferenciação de estruturas especializadas, aveoli, que sintetizam e secretam o leite durante a lactação1. A epitelia mamária pode ser manipulada experimentalmente usando técnicas nas quais fragmentos de tecido epitelial, células ou mesmo uma única célula basal são transplantados em almofadas de gordura mamária hospedeira, pré-limpas de parênquima mamária endógena, e permitidas a crescer para reconstituir uma árvore epitelial completaefuncional 2,3,4,5. O transplante é uma técnica poderosa, mas é demorada e impossível se uma mutação resultar em letalidade embrionária precoce (antes do E14) que impede o resgate de anlaga mamária transplantável. Além disso, os pesquisadores frequentemente desejam pesquisar os papéis dos dois compartimentos diferentes, que são derivados de células progenitoras restritas à linhagem. Embora a tecnologia Cre-lox permita a manipulação genética diferencial de MyoECs e LECs, esta também é uma empresa demorada e cara. Assim, desde a década de 1950, os pesquisadores têm usado organóides mamários in vitro como uma maneira relativamente fácil e eficiente de abordar questões relativas à estrutura e função do tecido mamário6,7.

Nos protocolos iniciais que descrevem o isolamento e a cultura das células epiteliais mamárias primárias, os pesquisadores descobriram que uma matriz de membrana de porão (BME), composta por um coágulo de plasma e extrato de embrião de frango, era necessária para fragmentos de MG cultivados em um prato6. Nas décadas seguintes, matrizes extracelulares (ECMs, colágeno e matriz de proteínas geleias secretadas por células de sarcoma de murina Engelbreth-Holm-Swarm) foram desenvolvidas para facilitar a cultura 3D e imitar melhor o ambiente in vivo7,8,9,10. O cultivo de células em matrizes 3D revelou por múltiplos critérios (morfologia, expressão genética e resposta hormonal) que tal microambiente melhor modela em processos fisiológicos vivos9,,10,,11,12. Pesquisas utilizando células murinaprimárias identificaram fatores-chave de crescimento e morfogênios necessários para a manutenção prolongada e diferenciação dos organóides13. Esses estudos prepararam o cenário para o protocolo aqui apresentado, e para a cultura das células mamárias humanas como organóides 3D, que hoje é uma ferramenta clínica moderna, permitindo a descoberta de medicamentos e testes de drogas em amostras de pacientes14. No geral, a cultura organóide destaca as capacidades de auto-organização das células primárias e suas contribuições para a morfogênese e diferenciação.

Apresentado aqui é um protocolo para a epiteria murina cultural que pode ser diferenciada em acini produtor de leite. Uma técnica diferencial de trypsinização é usada para isolar os MyoECs e LECs que compõem os dois compartimentos celulares MG distintos. Essas frações de células separadas podem então ser geneticamente manipuladas para superexpressá-la ou derrubar a função genética. Como a linhagem intrínseca, a auto-organização é uma propriedade inata das células epiteliais mamárias15,,16,17, recombinando essas frações celulares permite que os pesquisadores gerem organóides bicamadas e mosaicos. Começamos digerindo enzimticamente o tecido adiposo e, em seguida, incubando os fragmentos de mamária em um prato de cultura de tecido por 24 h (Figura 1). Os fragmentos de tecido se instalam em pratos de poliestireno como fragmentos bicamadas com sua organização in vivo: camada mioepitelial externa em torno de camadas luminais internas. Esta organização celular permite o isolamento dos MyoECs externos por trypsin-EDTA (0,05%) tratamento para 3-6 min seguido de uma segunda rodada de trypsin-EDTA (0,05%) tratamento que destaca os LECs internos restantes(Figura 2). Assim, esses tipos de células com sensibilidade à tripsina diferente são isolados e podem, posteriormente, ser misturados e banhados em ECM (Figura 3). As células passam por auto-organização para formar esferas bicamadas, compreendendo uma camada externa de MyoECs em torno de LECs internos. A formação de lúmen ocorre à medida que as células crescem em um meio contendo um coquetel de fatores de crescimento (ver receitas para o Meio de Crescimento)13. Após 5 dias, os organóides podem ser diferenciados em acini produtores de leite, mudando para Alveologenesis Medium (ver receitas e Figura 3F) e incubados por mais 5 dias. Como alternativa, os organóides continuarão a expandir-se e ramificar-se no Meio de Crescimento por pelo menos 10 dias. Os organóides podem ser analisados utilizando imunofluorescência(Figura 3D-F) ou liberados do ECM utilizando uma solução de recuperação (ver Tabela de Materiais) e analisados por outros métodos (por exemplo, imunoblot, RT-qPCR).

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Protocol

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Califórnia, Santa Cruz.

1. Dia 1: Digestão da glândula mamária

  1. Prepare-se para colher os GMs de camundongos maduros de 10 a 14 semanas de idade.
    1. Realize a colheita em um banco aberto condições assépticas.
    2. Esterilize todos os suprimentos cirúrgicos, placas de cortiça e pinos por autoclaving e imersão em 70% de álcool por 20 min antes da cirurgia.
    3. Anestesiar animais com pentobarbital de sódio (dose anestéstica 2X de 0,06 mg/g de peso corporal) entregue através de injeção intraperitoneal com uma seringa de insulina de 0,5 mL.
    4. Monitore o nível de anestesia apertando os dedos do animal para verificar se há uma resposta reflexo e inicie o protocolo somente após o animal ser totalmente anestesiado.
    5. Coloque o animal de costas, fixe seus apêndices no quadro de cortiça, e limpe seu abdômen e peito com etanol.
  2. Para colher o #2, 3, 4 e 5 MGs de um rato (ou seja, 8 MGs, Figura 1A), identifique a linha média entre as duas pernas traseiras e faça uma pequena incisão (1 cm) na pele abdominal com uma tesoura afiada, depois estenda o corte até o pescoço18.
  3. Siga fazendo pequenos cortes lateralmente em direção às pernas e braços para permitir a liberação da pele usando um cotonete. Puxe a pele para longe e estique-a bem antes de fixá-la em um lado (Figura 1B, passo 1)18. Remova os GMs cortando-os e remova os linfonodos das glândulas #4(Figura 1B, passos 2, 3)18. Repita o procedimento do outro lado do corpo.
  4. Coletar o tecido MG em 50 mL de 4 °C De Mídia de Águia Modificada (DMEM)/Mistura de Nutrientes F12 (F12) suplementada com 5% de soro bovino fetal (FBS) e 1X antibiótico-antimicótico (anti-anti-anti)18.
  5. Pique as glândulas em um prato de 35 mm ou em uma placa de cerâmica usando uma lâmina de barbear ou um helicóptero de tecido. Gire a placa a cada cinco costeletas manuais ou cada rodada no helicóptero de tecido até que os pedaços de tecido possam caber através de uma ponta de micropipete de 1 mL com facilidade (~0,1 mm/fragmento, Figura 1C).
  6. Digerir os GMs no meio de digestão (ver Tabela 1) para 14 horas em um prato de adesão 6 bem baixo a 37 °C, 5% CO2.

2. Dia 2: Isolamento de fragmentos de tecido epitelial mamário

  1. Após 14 h de digestão, misture suavemente o tecido digerido 10X usando uma micropipeta de 1 mL para quebrar qualquer estroma restante ou tecido adiposo, garantindo que nem bolhas nem força mecânica em excesso sejam geradas.
    NOTA: Se houver digestão incompleta após 14 h, isso pode ser devido ao acúmulo de DNA de cisalhamento. Neste caso, adicione 1 μL de 1 mg/mL dedesoxribonuclease I (DNase I) por 2 mL de Digestion Medium. Incubar por mais 30 min a 37 °C, 5% CO2.
  2. Coletar tecido em um tubo de 15 mL e enxaguar o poço utilizado para digestão com 2-3 mL de cultura tecidual grau 1X Salino tamponado de fosfato de Dulbecco livre de Ca2+ e Mg2+. Centrífuga a 600 x g por 10 min.
  3. Evacuar o sobrenadante contendo a camada lipídica e o meio, e depois resuspender a pelota em 5 mL de DPBS e mudar para um novo tubo de 15 mL. Centrífuga a 600 x g por 10 min.
  4. Durante a centrifugação coloque um filtro de células de nylon de 70 μm em um tubo de 50 mL e predefina o coador usando 10 mL de 37 °C DMEM/F12.
  5. Resuspender fragmentos de tecido da etapa 2.4 do protocolo usando 5 mL de DPBS e passar a suspensão através de um coador de células de nylon de 70 μm para remover células estrômicas e células únicas(Figura 1D).
  6. Colete os fragmentos de tecido no filtro celular. Enxágüe 4X com 10 mL de 37 °C DMEM/F12(Figura 1D).
    ATENÇÃO: A lavagem incompleta resultará em culturas contaminadas com células não epiteliais.
  7. Solte os fragmentos de tecido segurando a aba do coador com dedos enluvados, invertendo o coador sobre um prato de cultura de tecido de 60 mm e passando alíquotas de 1 mL de Meio de Manutenção (ver Tabela 1) através da parte inferior do coador 4X(Figura 1E).
  8. Verifique o filtro para remanescentes de fragmentos de tecido, que serão visíveis a olho nu, e enxágue o filtro 1X mais com 1 mL de Meio de Manutenção se algum fragmento ainda estiver aderindo ao coador. Os fragmentos de tecido enxaguado devem agora estar livres de células estrômicas.
  9. Examine rapidamente o prato de 60 mm contendo os fragmentos mg da etapa 2.9 do protocolo um microscópio invertido (objetivo 4X ou 10X, Figura 1F). Uma preparação típica de oito MGs produz ~500 fragmentos. Procure por células individuais ou gotículas de gordura e se há células contaminantes.
    NOTA: Se houver células contaminantes, repita a etapa de filtragem coletando o prato médio e fragmentado da antena de 60 mm usando uma pipeta de 5 mL e filtrando o fragmento novamente através de um filtro de 70 μm fresco, repetindo as etapas do protocolo 2.6, 2.8-2.10.
  10. Incubar 24 h a 37 °C, 5% CO2, permitindo que o fragmento de tecido adere e gere fragmentos bicamadas(Figura 2A).
    NOTA: Se os fragmentos não tiverem sido instalados até 24 h, continue a incubar até que sejam aderidos. Se os fragmentos não aderirem bem, a separação dos compartimentos das células não funcionará. Se os pesquisadores estão preocupados com a adesão, as placas de cultura de tecido podem ser tratadas para promover o apego ao fragmento (por exemplo, poli-L-lisina).

3. Dia 3: Trippsinização diferencial de células epiteliais mioepitelélicas e luminais

  1. Para separar myoECs dos LECs, esvazie a mídia do prato, enxágue 1x com 1 mL de DPBS e adicione 1 mL de tripsina-EDTA fresca (0,05%), e monitore cuidadosamente a digestão um microscópio invertido (objetivo 10X ou 20X, Figura 2B,C,F). O desprendimento da camada myoec externa exigirá 3-6 min, dependendo da tripsina-EDTA (0,05%) Força.
    NOTA: Consulte a Figura 2 para obter imagens representativas que mostrem esse processo. iluminação brightfield, os MyoECs aparecem arredondados e têm uma aparência mais brilhante em comparação com os LECs, que permanecem aderidos no centro e parecem mais escuros.
  2. Coletar a fração MyoEC em um tubo de 15 mL contendo 2 mL 10% FBS/DPBS. Sem perturbar os LECs, enxágue suavemente o prato de 60 mm com 2 mL de DPBS e depois descarte o DPBS(Figura 2H-I).
    NOTA: A recuperação usual para MyoECs está dentro de uma faixa de (3,5 x 106-1,5 x 106) dependendo do tamanho dos MGs.
  3. Para remover a fração LEC, adicione 1 mL de trypsin-EDTA (0,05%) para o prato novamente e incubar 7-15 min, monitorando cuidadosamente para evitar a superdigestão. Saciar o trypsin-EDTA (0,05%) no prato com 2 mL de 10% FBS/DPBS. Coletar a fração LEC em um novo tubo de 15 mL.
    NOTA: A recuperação usual dos LECs está dentro de um intervalo (2 x 106-4,2 x 106) dependendo do tamanho dos GMs. Rotineiramente, a pureza de ambas as frações assimétricas é ~90%19 (Figura 2E).
  4. Centrifugagem de cada fração por 5 min a 300 x g para remover a tripsina-EDTA (0,05%). Resuspender a pelota em 250 μL de Meio de Manutenção e contar cada população celular usando um hemocytometro ou contador de células automatizado. Coloque as células no gelo enquanto conta.
    NOTA: Se a manipulação genética das frações celulares for desejada, as células primárias podem ser cultivadas em pratos de baixa adesão e infectadas com lentivírus20.

4. Dia 3: Combinar e incorporar frações celulares em uma matriz extracelular

NOTA: Uma vez que as frações MyoEC e LEC tenham sido coletadas e contadas, elas podem ser combinadas. A relação típico MyoEC/LEC é 1:3 (Figura 3A)19. Diferentes estudos podem ser realizados. Por exemplo, para realizar estudos de mosaico, as frações podem ser geradas a partir de ratos do tipo selvagem (WT) e mut (Mut) e combinadas (MyoEC/LEC: WT/WT; WT/Mut; Mut/WT; Mut/Mut)21, ou frações podem ser combinadas usando diferentes proporções de MyoECs/LECs19.

  1. Com base na contagem celular, calcule o número de poços (8 câmaras de poços, ver Tabela de Materiais) que precisam ser preparados para 12.000 células/poço (por exemplo, 3.000 MyoECs:9.000 LECs).
  2. Estabeleça a camada base para a cultura 3D adicionando 90 μL de 50% de ECM (50% ECM/50% DMEM/F12, sem fenol vermelho - ver a Tabela de Materiais) a cada poço. Certifique-se de que não há bolhas e os poços são revestidos uniformemente. Para solidificar a camada de base, incubar as lâminas a 37 °C, 5% CO2 por 30 min.
    NOTA: O ECM precisa permanecer frio até esta etapa, caso contrário, polimerizará prematuramente e levará a revestimento de base desigual e polimerização. O uso de um ECM base aumenta o crescimento organóide em um único plano, o que auxilia na captura de imagens. Isso também obtém crescimento organóide mais rápido e usa menos ECM22.
  3. Durante a polimerização, prepare as misturas celulares. Pelotas as frações MyoEC e LEC a 300 x g por 5 min e resuspender cada fração celular em 10% ECM /90% De Crescimento Médio para que cada poço tenha 100 μL (ver Tabela 1 para como fazer O Meio de Crescimento).
    NOTA: Para facilitar a preparação, replique poços usando as mesmas misturas celulares. Estes podem ser combinados e preparados em um tubo (por exemplo, quatro poços da mesma mistura celular podem ser preparados em 400 μL de 10% de ECM/90% de crescimento médio).
  4. Adicione 100 μL de cada mistura celular em 10% de ECM/90% de crescimento Médio para cada poço e permita que os organóides se contentem com 20 min a 37 °C, 5% CO2.
  5. Uma vez que as células tenham se acomodado, adicione suavemente 100 μL de Meio de Crescimento, encanando suavemente a parede da câmara de cada poço. Incubar os slides a 37 °C, 5% CO2 (ver Figura 3A para a composição total de cada poço).
    NOTA: O inibidor de Rho Kinase, R-spondin e Nrg1 são fatores que foram identificados como importantes para a cultura de longo prazo de organóides cultivados a partir de células mamárias primárias de murina e células de câncer de mama humanas13,14. Além disso, os fatores de células-tronco B27 e N2 ampliam o tempo que os organóides podem ser cultivados.
  6. Células de imagem a cada 24 h para acompanhar seu crescimento e renovar suavemente o Meio de Crescimento a cada 2-3 dias usando 100 μL/poço(Figura 3B-E).
    NOTA: Tenha extrema cuidado ao renovar o meio. Incline os slides da câmara para coletar o meio em um canto dos poços. Remova ≤100 μL do meio e reabasteca com o cuidado de deixar a camada de ECM intacta.
  7. Se os pesquisadores estiverem interessados em investigar a lactação/alveologênese, mude para Alveologenesis Medium (ver Tabela 1) no dia 5 e continue a renovar o meio a cada 2-3 dias até o dia 10 (Figura 3F) ou além de passar por meio de solução de recuperação (ver tabela de materiais)13.
    NOTA: Neste ponto, os organóides podem ser isolados do ECM incubando a 4 °C em 400 μL de solução de recuperação de 4 °C (ver Tabela de Materiais para informações de protocolo e reagente).

5. Dia 5 ou 10: Fixação e imunocoloração organóides

  1. Remova o meio cuidadosamente, encanando suavemente a mídia (uma pipeta de bulbo funciona melhor). Enxágüe cada poço usando 200 μL de 1x de Salino Tampão de Fosfato de Dulbecco (DPBS, veja receitas).
  2. Fixar os organóides usando frio (4 °C) 4% (c/v) paraformaldeído (PFA, ver receitas) por 10 min à temperatura ambiente.
    ATENÇÃO: PfA é perigoso. Use equipamentos de proteção individual (jaleco, luvas e óculos de segurança). Esta etapa deve ser realizada dentro de uma capa de fumaça.
    NOTA: O ECM é dissolvido pelo tratamento PFA. A remoção incompleta do ECM pode levar à coloração do fundo quando os organóides são analisados pela imunofluorescência.
  3. Remova o PFA de 4% e adicione 200 μL de 0,2% (c/v) de glicina/DPBS (ver Tabela 1) a cada poço. Incubar os slides à temperatura ambiente durante 30 min ou 4 °C durante a noite em uma superfície de balanço definida para um ajuste lento.
    NOTA: Os organóides podem ser armazenados por 1-3 dias em DPBS a 4 °C antes do próximo passo.
  4. Permeabilizar os organóides usando DPBS + 0,25% Triton X-100 (PBST, ver Tabela 1) por 10 min à temperatura ambiente.
  5. Bloqueie os organóides usando soro de burro de 5% (DS) (ou outro soro que corresponda às espécies do anticorpo secundário) em DPBS por 1 h em uma superfície de balanço.
    NOTA: Esta etapa pode ser realizada durante a noite a 4 °C em uma superfície de balanço.
  6. Prepare anticorpos primários em 1% de DS/DPBS. Use 125-200 μL para cada poço. Realize a imunocoloração incubando os organóides em anticorpos primários durante a noite a 4 °C em uma superfície de balanço.

6. Dia 11: Imunofluorescência completa

  1. Lave cada poço 2X com 200 μL PBST por 5 min. Adicione anticorpo secundário em 1% DS/DPBS usando 125-200 μL para cada poço. Incubar à temperatura ambiente em uma superfície de balanço por 45 min.
  2. Lave cada poço 2X usando 200 μL PBST por poço.
  3. Manche os núcleos usando dine de DNA hoechst em DPBS (1:2.000 em DPBS) por 5 minutos à temperatura ambiente.
  4. Remova todo o líquido deixado no poço, aspirando suavemente com um vácuo.
  5. Remova cuidadosamente as câmaras e a junta, coloque uma gota (~30 μL) de mídia de montagem (ver Tabela de Materiais)em cada poço e deslizamento de cobertura, tomando cuidado para remover bolhas. Deixe o escorregador secar em um espaço escuro por 1-2 dias. Vedação com esmalte claro. Imagem dos organóides em um microscópio confocal(Figura 3E-F).

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Representative Results

O protocolo aqui apresentado descreve um método para investigar contribuições específicas de linhagem de células epiteliais mamárias, fazendo uso de organóides de mosaico. Para obter células murinas primárias para organóides, o epitélio da glândula mamária deve primeiro ser isolado do estroma rico em adifrócito circundante(Figura 1). Este processo é descrito brevemente aqui e também é descrito em um estudo publicado anteriormente18. Para obter células suficientes, recomenda-se que #2, 3, 4 e 5 MGs sejam removidos (Figura 1A). Um passo importante para isolar uma população pura de células epiteliais é a remoção dos linfonodos dos #4 MGs, que são ricos em células imunes que contaminarão a preparação (Figura 1A,B). Os GMs foram picados para gerar fragmentos ~0,1 mm de tamanho(Figura 1B). Os fragmentos teciduais foram então digeridos enzimticamente, processo que ocorre na presença de colagemnase, para liberar epiteria do estroma, e na ausência de tripsina, para evitar a digestão de proteínas como cadherinas que mantêm contatos celulares. O tecido digerido foi então centrifugado para remover lipídios e filtrado através de um coador de células e lavado (Figura 1C). Fragmentos epiteliais, aderindo ao coador, foram liberados invertendo o filtro e lavando a membrana, que transferiu os fragmentos epiteliais para um prato de poliestireno(Figura 1D). Esses fragmentos apareceram como estruturas pequenas e ramificadas (Figura 1E).

Os fragmentos epiteliais purificados foram incubados por 24 h. Eles se estabeleceram no prato e aderiram, formando estruturas planas, semelhantes a panquecas, com uma camada externa de MyoECs circundando LECs interiores(Figura 2A-B). A Figura 2C mostra a borda de uma estrutura semelhante a uma panqueca de um animal selvagem. O tratamento da tripsina destacou diferencialmente os MyoECs, que se destacaram primeiro e apareceram como células brilhantes e arredondadas que circundavam o núcleo dos LECs cuboidais restantes(Figura 2C,F). O desprendimento dos MyoECs foi cuidadosamente monitorado usando microscopia de campo brilhante e ocorreu dentro de 3-6 minutos. Uma vez que os MECs foram coletados, os LECs foram posteriormente destacados através de um segundo tratamento de tripspsina mais longo de 7-15 min. O tempo necessário para o desprendimento celular depende da concentração de tripsina e frescor. A pureza geral dos dois compartimentos celulares foi de ~90%, conforme a contagem de células que foram KRT14-positivo e E-Cadherin (CDH1)-negativo na fração MyoEC e células que foram KRT14-negativo e E-Cadherin-positivo na fração LEC (Figura 2D-E)19. Descobrimos que alguns dos MyoECs foram removidos do topo da estrutura semelhante a panqueca, bem como das bordas externas. Isso foi observado pelo uso de fragmentos de tecido coletados de camundongos rotulados com um marcador basal indutor fluorescente (Citoqueratina 14 (KRT14)-CreERT1; R26RYFP/+) e injetado com tamoxifen de 75 mg/kg 5 dias antes da colheita. Na Figura 2F,G o desprendimento de MyoECs ao redor das bordas da estrutura panqueca é facilmente aparente. Isso ocorreu nos primeiros 2 minutos de tratamento com tripsina (Figura 2F). Além disso, foram observadas células yfp-KRT14 positivas no topo da estrutura, onde arredondaram após o tratamento da tripsina e foram removidas pela etapa de lavagem/coleta(Figura 2G). O núcleo não rotulado dos LECs(Figura 2H),que continha poucas ou nenhuma células yfp-KRT14-positivas,(Figura 2I) posteriormente se desprendeu na segunda rodada de tratamento com tripsina.

As frações MyoEC e LEC foram coletadas, combinadas e incorporadas em 10% de ECM banhadas em uma base de ECM de 50%. Isso permitiu uma melhor resolução óptica dos organóides que cresceram principalmente ao longo da camada base(Figura 3A). Após 24 h, as células se reuniram em estruturas agregadas que em grande parte careciam de um lúmen(Figura 3B). Depois de 48 h, organóides nascentes formaram-se como os lúmens centrais ocos e apareceram como um espaço interno mais leve(Figura 3C). Após 10 dias, os organóides eram grandes estruturas ramificadas com lúmens bem desenvolvidos. Organóides de mosaico gerados a partir de MyoECs colhidos de camundongos do tipo selvagem e LECs colhidos de camundongos ACTb-EGFP foram fixados in situ, imunosmanchados com um anticorpo contra o marcador basal alfa-liso actina muscular (SMA), e manchados com a mancha de DNA hoechst para mostrar os núcleos. Nas figuras, as visualizações superior e de seção mostram diferentes conjuntos de imagens coletadas como uma pilha Z e reconstruídas em uma visão 3D(Figura 3D). A visão superior revela a morfologia ramificada dos organóides(Figura 3E). A visualização da seção mostra a estrutura epitelial bicamada e o lúmen aberto desses organóides(Figura 3E''). Esses organóides também podem ser diferenciados no dia 5 usando alveologênese média e incubados por mais 5 dias(Figura 3F). Os organóides cresceram, tiveram mais ramos e continham leite. Organóides diferenciados foram gerados conforme descrito acima e imunosmaçados com um anticorpo direcionado contra o marcador de leite, proteína ácida de soro de leite (WAP, Figura 3F). WAP é uma proteína solúvel secretada em leite. Grande parte desse líquido foi perdido quando as células foram fixadas e imunosmanchadas in situ. Portanto, nas vistas superior escaneadas e seccional, a coloração de WAP é visível intracelularmente em células secretantes e extracelularmente no leite que ficou preso na superfície celular durante a fixação(Figura 3F),embora na seção vista um pequeno organóide pareça conter leite líquido(Figura 3F'' sobreposição em caixa).

Figure 1
Figura 1: Isolamento do fragmento mamário. (A) Esquemático rotulado dos 5 MGs de um rato com GMs não rotulados e contralaterais emparelhados. (B) Imagens de MGs do mouse com o #4 MG encaixotados e ampliados para mostrar como identificar o linfonodo para remoção. (C) Imagem de MGs picados em uma placa de adesão de 6 bem baixos com uma régua mostrando o tamanho das peças de tecido (~0,1 mm cada). (D-E) Esquema ilustrando as etapas do protocolo 2.7-2.9. (D) Os fragmentos de MG foram filtrados através de um coador de 70 μm e enxaguados 4X. (E) O coador foi então invertido sobre um prato de cultura de tecido de poliestireno de 60 mm e fragmentos foram liberados no prato. (F) Imagem mostrando os fragmentos de tecido filtrados coletados em um prato de 60 mm que estão livres de estroma. As setas apontam para os menores fragmentos que são coletados no filtro de 70 μm. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Trippsinização diferencial. (A)Imagem brightfield mostrando um fragmento de tecido aderido em um prato de poliestireno, formando uma estrutura semelhante a uma panqueca. (B-C) O primeiro passo diferencial de trypsinização destacou MyoECs que são claramente visíveis como células brilhantes e arredondadas após 3 min.(D) Imagens imunofluorescentes de MyoECs (inferior) e LECs (superior) usando o marcador celular Cytokeratin 14 (KRT14) para MyoECs, e marcador de célula E-Cadherin (CDH1) para LECs. (E) A expressão de KRT14 e CDH1 foi utilizada para quantificar o rendimento e a pureza das frações celulares diferencialmente tripsinizadas. (F-I). Imagens representativas de contraste de fase e fluorescência (YFP) de fragmentos de tecido de Citoqueratina 14 (KRT14)-CreERT1; R26RYFP/+ MGs. Os camundongos foram injetados com tamoxifen de 75 mg/kg 5 dias antes da colheita. (F) Desacopladomys (setas) durante a tripspsina inicial-EDTA (0,05%) 2 min após a incubação. (G) Um polvilho de KRT14-YFP-MyoECs (setas) em cima de uma panqueca de LECs não rotulados. (H) Imagem brightfield de LECs após a tentativa inicial e o desprendimento do MyoEC. (I) Após o desprendimento do MyoEC, os KRT14-YFP-MyoECs não são mais visíveis como mostrado pela ausência de expressão YFP. Barras de escala = 30 μm (A, brightfield) 100 μm (F, brightfield), 50 μm (G, fluorescência), 100 μm (H,I). Os painéis A-E desta figura são modificados a partir de Macias et al.19. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Cultura organóide tridimensional. (A) Representação esquemmática de células individuais incorporadas em 10% de ECM/90% de crescimento Médio e cultivadas em uma camada base DMEM de 50% de ECM/50% (etapa de protocolo 4.5). (B-C) Ilustrações e imagens de contraste de fase mostrando as rápidas capacidades auto-organizadas dos organóides mammary gerados a partir de MyoECs e LECs trisinizadas e recombinadas às 24 h (B) e 48 h (C). Imagens coletadas usando um microscópio digital widefield(D) Representação esquemática ilustrando as visões superior (esquerda) ou seção (direita) usadas em E-F para mostrar organóides imunosmacuantes. (E) Representação esquemmática de um único poço de um slide de câmara de 8 poços contendo organóides mamamários cultivados durante 5-10 dias no Growth Medium. (E'-E") Vista superior(E)e visualização de seção(E") de organóides imunosmacuantes no dia 10 de crescimento. MyoECs são marcados com músculo actina liso (SMA) em magenta pseudocolor. Os LECs são de ratos ACTb-EGFP e são mostrados em verde pseudocolor. Os núcleos foram manchados com o tintura de Hoechst. (F) Representação esquemmática de um único poço de um slide de câmara de 8 poços contendo organóides mamamários cultivados por 5 dias em Meio de Crescimento e 5 dias no Meio Alveologênese. (F'-F). Vista superior(F') e visão de seção(F") de organóides imunosmacuantes no dia 10 de crescimento. Os MyoECs não estão marcados. Os LECs de ratos ACTb-EGFP são mostrados em verde pseudocolor. A proteína do leite, proteína ácida de soro de leite (WAP), é mostrada em amarelo pseudocolor nos LECs e revestindo o interior dos lúmens organóides. Os núcleos foram manchados com o tintura de Hoechst. Imagens coletadas usando um microscópio confocal de disco giratório e reconstruídas em 3D usando Imaris(E', E') ou seção inferior ~30 fatias(F', F"). Barras de escala = 100 μm (C), 20 μm (E), 40 μm (F). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

10 mL Meio de digestão
Quantidade Reagente Notas
9,45 mL DMEM/F12
100 μL Antibiótico-antimicótico (100X)
0,04 g Colagenase Classe 3
0,04 g Dispase classe 2
50 μL Gentamicina Concentração Final: 500 μg
2,5 mL Soro bovino fetal Concentração final: 5% (v/v)
Passe pelo filtro de 0,22μm
50 mL Meio de manutenção
Quantidade Reagente Notas
49,47 mL DMEM/F12
0,5 mL Antibiótico-antimicótico (100X)
2,5 mL Soro bovino fetal Concentração final: 5% (v/v)
25 μL Insulina Concentração final: 250 μg
5 μL Feg Concentração final: 500 ng
10 mL Meio de Crescimento
Quantidade Reagente Notas
9,6455 mL DMEM/F12, sem fenol vermelho
100 μL Suplemento N-2 (100x)
200 μL Suplemento B27 sem vitamina A (50x)
10 μL Nrg1 Estoque: 100μg/mL
42,5 μL R-spondin Estoque: 10 μg/mL
1 μL Inibidor de Rho Y-27632 Estoque: 10 μM
1 μL Feg Estoque: 0,1 μg/μL
10 mL Meio Alveologênese
Quantidade Reagente Notas
9,6355 mL DMEM/F12, sem fenol vermelho
100 μL Suplemento N-2 (100x)
200 μL Suplemento B27 sem vitamina A (50x)
10 μL Nrg1 Estoque: 100μg/mL
42,5 μL R-spondin Estoque: 10 μg/mL
1 μL Inibidor de Rho Y-27632 Estoque: 10 μM
5 μL Prolactina pituitaria ovina Concentração final: 1 μg/mL
1 μL Dexametasona Concentração final: 5 μg/mL
5 μL Insulina Concentração final: 5 μg/mL
1 L 10X DPBS
Quantidade Reagente Notas
80 g Nacl
2 g Kcl
14,4 g Nah2PO4
2,4 g KH2PO4
1 L di H2O
Encha até 800 mL antes de adicionar reagentes secos e dissolver. Volume de enchimento a 1 L. Ajuste o pH para 7,4. Autoclave para esterilizar.
1 L 1X DPBS
Quantidade Reagente Notas
100 mL 10X PBS
900 mL di H2O
1 L PBST
Quantidade Reagente Notas
100 mL 10X PBS
2,5 mL Tritão X-100
250 mL 4% Paraformaldeído
Quantidade Reagente Notas
10 g Paraformaldeído
200 mL di H20 água deve estar a 60 °C
25 mL 10X DPBS
50 μL 10 N Hidróxido de sódio
Passe por um filtro de 0,45 μm para esterilizar e garantir que o pH seja de 7,4
10 mL 1 % Soro de Burro
Quantidade Reagente Notas
100 μL Soro de burro filtrado estéril
9,9 mL 1X DPBS
10 mL 0,2% glicina
Quantidade Reagente Notas
0,02 g Glicina
10 mL 1X DPBS

Tabela 1: Receitas de solução.

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Discussion

Aqui, um método é apresentado detalhando como os pesquisadores podem gerar culturas organóides 3D usando células MG primárias. A diferença entre este e outros protocolos é que detalhamos um método para separar os dois compartimentos de células MG distintos: os MyoECs basais externos e lecs internos. Nosso método emprega uma trypsin-EDTA de duas etapas (0,05%) tratamento que chamamos de trippsinização diferencial19. Este procedimento permite que os pesquisadores isolem MyoECs e LECs sem usar citometria de fluxo sofisticada e, portanto, podem ser usados para estudar GMs colhidos de uma grande variedade de espécies de mamíferos que podem não ter os biomarcadores bem caracterizados necessários para facs. A capacidade de segregar as duas subpopulações celulares permite que os pesquisadores modifiquem geneticamente as células isoladas independentemente ou recombinem células de animais que abrigam mutações genéticas ou rótulos, e assim gerar organóides de mosaico na cultura 3D. Uma limitação do protocolo atual é que o compartimento estroma não está incluído nas condições de cultivo. No entanto, novos métodos estão sendo desenvolvidos para cocultura de componentes estrômicos com organóides gerados a partir de células primárias ou linhas celulares para melhor recapitular in vivo ECM23,24,25,26, e esses métodos podem ser adaptados a este protocolo. Além disso, é importante notar que, embora este protocolo atinja um grande enriquecimento das frações MyoEC e LEC (~90% de purificação), as frações não representam linhagens celulares puras.

O sucesso deste protocolo depende de uma série de passos-chave. Em primeiro lugar, é importante digerir suavemente, mas completamente o tecido MG. A superdigestão do tecido levará à morte celular e à menor recuperação das células epiteliais. A digestão incompleta resultará em contaminação de células estromal e adiposas, que interferirão em análises posteriores (por exemplo, imunofluorescência, análise de proteínas e mRNA). Em segundo lugar, é importante enxaguar completamente o tecido MG para remover células contaminantes na etapa de protocolo 2.8. Na etapa de protocolo 2.9, os fragmentos de tecido MG são liberados em um prato de 60 mm. Os pesquisadores devem monitorar os fragmentos liberados imediatamente, antes de aderirem ao prato. Se forem observadas gotículas de gordura ou células únicas, as etapas de protocolo 2.6 e 2.8-2.11 devem ser repetidas. Para isso, os fragmentos médios e teciduais são coletados do prato, colocados em um novo filtro de 70 μm, lavados 4X com 37 °C DMEM/F12 e depois liberados em um novo prato de 60 mm. Em terceiro lugar, é essencial observar o primeiro trypsin-EDTA (0,05%) incubação de perto porque os MyoECs podem se desprender dentro dos primeiros 3 minutos, mas eles também podem aderir por até 6 minutos. Houve casos em que o trypsin-EDTA (0,05%) foi subideal, e a incubação prosseguiu por 10 min com purificação bem sucedida de MyoECs. No entanto, >10 min de trypsinização resultou na coleta simultânea de MyoECs e LECs. Também é importante que o prato permaneça intacto durante a primeira incubação. Caso contrário, pode ocorrer contaminação da fração MyoEC com LECs. O inverso também é verdadeiro; se myoECs não são completamente separados do prato, eles vão contaminar a fração LEC. Se os pesquisadores estão usando camundongos de repórter que rotulam MyoECs ou LECs exclusivamente, é mais fácil visualizar a separação um microscópio de fluorescência(Figura 2F-I). Finalmente, se os pesquisadores planejam fixar organóides para análises de imunofluorescência, o pH (7,4) e a temperatura (4 °C) do PFA de 4% são importantes para o sucesso da dissociação do ECM. Se os organóides forem coletados para outras análises (por exemplo, medidas proteicas e mRNA), é importante que a solução de recuperação esteja em 4 °C. Se o ECM não estiver se dissolvendo, a incubação com a solução de recuperação pode ser estendida por 10 min (ou seja, 30 min de incubação total). No entanto, períodos de incubação mais longos levarão à perda da estrutura 3D e à morte celular. O protocolo de recuperação (listado na Tabela de Materiais)especifica o uso de pontas de furo largo. Isso é importante para manter a estrutura 3D dos organóides, bem como a integridade das células.

Além desses quatro passos-chave, há dois fatores que influenciam o sucesso do protocolo. Em primeiro lugar, o crescimento organóide pode ser limitado por mutações genéticas que reduzem a proliferação celular e, portanto, reduzem o crescimento organóide no ECM. Se apenas alguns organóides forem obtidos, a etapa de fixação subseqüente resulta frequentemente em sua perda. Para lidar com isso, o número de células incorporadas no ECM deve ser aumentado mantendo a razão de MyoECs:LECs (etapas de protocolo 4.1-4.2). Em segundo lugar, uma vez que as células são transferidas para um ECM é importante observar seu crescimento diariamente e estar atento à renovação da mídia (a cada 2-3 dias). Este protocolo especifica reagentes livres de fenol vermelho para melhor visualização, mas o mesmo sucesso e crescimento é alcançado usando reagentes positivos vermelhos fenol. Os dias em que ocorre renovação média antes da fixação (etapa protocolar 4.6) devem ser realizados com extremo cuidado para reduzir a perda celular. A camada superior de 10% de ECM é delicada; portanto, as lavadas ou renovação média devem ser realizadas por fluido pipetting pelas paredes da câmara para minimizar distúrbios mecânicos.

A diferenciação dos organóides no acini produtor de leite requer tratamento com suplementos de diferenciação: hidrocortisona ou dexametasona, insulina e prolactina. Neste protocolo, recomenda-se dexametasona. Além disso, enquanto a prolactina está comercialmente disponível, a prolactina utilizada neste protocolo foi obtida a partir do Programa Nacional de Hormônios e Peptídeos. Novamente, é muito importante deixar os organóides intactos ao mudar o Meio Alveologênese. A diferenciação requer um mínimo de 5 dias. Isso pode ser estendido por mais 3-5 dias, mas a camada base do ECM se degrada após 10-12 dias. Organóides diferenciados são preenchidos com leite e seus lúmens parecem mais escuros.

Esta é uma técnica eficiente que pode ser usada para abordar contribuições específicas de linhagem para morfogageno e diferenciação mamária. Com essa técnica, os pesquisadores podem gerar organóides de mosaico que compreendem mioECs e LECs21geneticamente manipulados, ou MyoECs e LECs obtidos de camundongos que abrigam diferentes mutações genéticas. Isso permite aos pesquisadores entender melhor as contribuições de compartimentos celulares específicos da linhagem para a morfogênese dos órgãos e a aquisição de funções especializadas, como a produção de leite.

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Disclosures

Os autores não têm nada para revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a Ben Abrams pela assistência técnica e apoio do Instituto de Biologia de Células-Tronco da Universidade da Califórnia, Santa Cruz (UCSC). Agradecemos a Susan Strome e Bill Saxton pelo uso de seu Microscópio Confocal do Disco Giratório Solamere. Este trabalho foi apoiado em parte por subsídios à UCSC do Howard Hughes Medical Institute através do James H. Gilliam Fellowships for Advanced Study program (S.R.), do NIH (NIH GM058903) para a iniciativa de maximizar o desenvolvimento estudantil (H.M.) e de a Fundação Nacional de Ciência para uma bolsa de pós-graduação em pesquisa (O.C. DGE 1339067) e por uma bolsa (A18-0370) do Comitê Coordenador de Pesquisa de Câncer da UC (LH).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube (BD Falcon) Fisher Scientific 352096
24 well ultra-low attachment plate (Corning) Fisher Scientific CLS3473-24EA
35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) Fisher Scientific 353001
50 ml High-Clarity polypropylene conical tube (BD Falcon) Fisher Scientific 352098
60 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) Fisher Scientific 353004
70 µM nylon cell strainer (Corning) Fisher Scientific 08-771-2
Antibiotic-Antimycotic (100X) Thermo Fisher Scientific 15240062 Pen/Strep also works
B27 supplement without vitamin A (50x) Thermo Fisher Scientific 12587010
B6 ACTb-EGFP mice The Jackson Laboratory 003291
BD Insulin syringe 0.5 mL Thermo Fisher Scientific 14-826-79
Class 2 Dispase (Roche) Millipore Sigma 4942078001
Class 3 Collagenase Worthington Biochemical LS004206
Corning Cell Recovery solution Fisher Scientific 354253 Follow the guidelines for use – Extraction of Three-Dimensional Structures
from Corning Matrigel Matrix
Corning Costar Ultra-Low Attachment 6-well Fisher Scientific CLS3471
Dexamethasone Millipore Sigma D4902-25MG
DMEM/F12, no phenol red Thermo Fisher Scientific 11039-021
DNase (Deoxyribonuclease I) Worthington Biochemical LS002007
Donkey anti-Goat 647 Thermo Fisher Scientific A21447 Use at 1:500, Lot: 1608641, stock 2 mg/mL, RRID:AB_2535864
Donkey anti-Mouse 647 Jackson ImmunoResearch 715-606-150 Use at 1:1000, Lot: 140554, stock 1.4 mg/mL
Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) Thermo Fisher Scientific 11330-057
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Thermo Fisher Scientific 14190-250 Without Mg2+/Ca2+
EGF Fisher Scientific AF-100-15-100ug
Fetal Bovine Serum VWR 97068–085 100% US Origin, premium grade, Lot: 059B18
Fluoromount-G (Southern Biotech) Fisher Scientific 0100-01 Referred to as mounting media in text
Gentamicin Thermo Fisher Scientific 15710064
Glycine Fisher Scientific BP381-5
Goat anti-WAP Santa Cruz Biotech SC-14832 Use at 1:250, Lot: J1011, stock 200 µg/mL, RRID:AB_677601
Hoechst 33342 AnaSpec AS-83218 Use 1:2000, stock is 20mM
Insulin Millipore Sigma I6634-100mg
KCl Fisher Scientific P217-500
KH2PO4 Fisher Scientific P285-500
KRT14–CreERtam The Jackson Laboratory 5107
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR); Phenol Red-Free; 10 mL Fisher Scientific CB-40230C Lot: 8204010, stock concentration 8.9 mg/mL
MillexGV Filter Unit 0.22 µm Millipore Sigma SLGV033RS
Millicell EZ SLIDE 8-well glass, sterile Millipore Sigma PEZGS0816 These chamber slides are great for gasket removal but other brands can work well (e.g. Lab Tek II).
Mouse anti-SMA Millipore Sigma A2547 Use at 1:500, Lot: 128M4881V, stock 5.2 mg/mL, RRID:AB_476701
N-2 Supplement (100x) Thermo Fisher Scientific 17502048
NaCl Fisher Scientific S671-3
NaH2PO4 Fisher Scientific S468-500
Nrg1 R&D 5898-NR-050
Ovine Pituitary Prolactin National Hormone and Peptide Program Purchased from Dr. Parlow at Harbor-UCLA Research and Education Institute
Paraformaldahyde Millipore Sigma PX0055-3
Pentobarbital Millipore Sigma P3761
R26R-EYFP The Jackson Laboratory 6148
Rho inhibitor Y-27632 Tocris 1254
R-spondin Peprotech 120-38
Sodium Hydroxide Fisher Scientific S318-500
Sterile Filtered Donkey Serum Equitech-Bio Inc. SD30-0500
Sterile Filtered Donkey Serum Equitech-Bio Inc. SD30-0500
Triton X-100 Millipore Sigma x100-500ML Laboratory grade
Trypsin EDTA 0.05% Thermo Fisher Scientific 25300-062

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References

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Rubio, S., Cazares, O., Macias, H., Hinck, L. Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization. J. Vis. Exp. (157), e60742, doi:10.3791/60742 (2020).

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