Summary
Meme bezi, dış miyoepitelyal ve iç luminal epitel hücrelerinden oluşan çift katmanlı bir yapıdır. Sunulan diferansiyel trippsinizasyon kullanarak organoidler hazırlamak için bir protokoldür. Bu verimli yöntem araştırmacılar ayrı ayrı meme bezi formu ve fonksiyonu rollerini ile ilgili soruları keşfetmek için bu iki hücre türleri işlemek için izin verir.
Abstract
Organoidler, fizyolojik süreçleri bir yemeğin rahatlığıyla özetleyen kendi kendini organize eden, üç boyutlu doku yapıları sunar. Murine meme bezi farklı işlevlere hizmet veren iki farklı epitel hücre bölmesi oluşur: dış, kontraktil miyoepitelyal bölmesi ve iç, salgı luminal bölmesi. Burada, bu bölmelerden oluşan hücrelerin izole edildiği ve daha sonra meme bezi morfogenezine ve farklılaşmaya olan bireysel soy katkılarını araştırmak için biraraya geldiği bir yöntemi açıklıyoruz. Yöntem basit ve verimlidir ve floresan aktif hücre sıralama gibi gelişmiş ayırma teknolojileri gerektirmez. Bunun yerine, biz hasat ve enzimatik doku sindirmek, yapışık doku kültürü yemekleri üzerinde epitel tohum, ve sonra ~ 90% saflık ile luminal hücrelerden miyoepitel ayırmak için diferansiyel trippsinizasyon kullanın. Hücreler daha sonra kültürde 10 gün sonra süt üretmek için ayırt edilebilir çift katmanlı, üç boyutlu (3D) organoidler halinde organize bir hücre dışı matris plakalı. Genetik mutasyonların etkilerini test etmek için, hücreler vahşi tip veya genetiği değiştirilmiş fare modellerinden hasat edilebilir, ya da genetik olarak 3D kültürden önce manipüle edilebilir. Bu teknik, özellikle luminal veya miyoepitel bölmesi gen fonksiyonunun araştırılmasına olanak sağlayan mozaik organoidler oluşturmak için kullanılabilir.
Introduction
Meme bezi (MG) bir adiposit zengin stroma içinde gömülü bir ağaç gibi, tübüler epitel yapısıdır. İki katmanlı duktal epitel, kontraktilin dış, bazal tabakası, miyoepitel hücreleri (Myoecs) ve luminal, salgı epitel hücrelerinin (LECs) bir iç tabakası, merkezi bir lümen çevreleyen oluşur1. Emzirme sırasında dış MiyoECs iç alveoler LECs süt sıkmak için sözleşme, MG büyüme faktörleri (örneğin, EGF ve FGF) ve hormonlar (örneğin progesteron, insülin ve prolaktin kontrolü altında olan çok sayıda değişiklik uğrar, ve prolaktin). Bu değişiklikler, emzirme döneminde sütü sentezleyen ve salgılayan özel yapılar alveollerin farklılaşmasına neden olur1. Meme epitel deneysel ya epitel doku parçaları, hücreler, hatta tek bir bazal hücre konak meme yağ pedleri içine nakledilir teknikleri kullanılarak manipüle edilebilir, endojen meme parenkim precleared, ve bütün bir yeniden büyümeye izin, fonksiyonel epitel ağacı2,3,4,5. Transplantasyon güçlü bir tekniktir, ancak bir mutasyonun erken embriyonik öldürücülükle sonuçlanması (E14'ten önce) nakledilebilir meme nin kurtarılmasını önlerse zaman alıcı dır ve imkansızdır. Ayrıca, araştırmacılar sık sık soy kısıtlı ata hücreleri türetilmiştir iki farklı bölmeleri, rolleri araştırmak istiyorum. Cre-lox teknolojisi MyoEC'lerin ve LED'lerin diferansiyel genetik manipülasyonuna olanak sağlarken, bu aynı zamanda zaman alan ve pahalı bir girişimdir. Böylece, 1950'lerden bu yana, araştırmacılar meme dokusu yapısı ve fonksiyonu ile ilgili soruları ele almak için nispeten kolay ve verimli bir yol olarak in vitro meme organoidler kullandık6,7.
Birincil meme epitel hücrelerinin izolasyon ve kültürünü açıklayan erken protokollerde, araştırmacılar bir plazma pıhtısı ve tavuk embriyoekstresi oluşan bir bazal membran matris (BME), mg parçaları bir çanak yetiştirilen için gerekli olduğunu bulundu6. Takip eden yıllarda, hücre dışı matrisler (EcMs, kollajen, ve engelbreth-Holm-Swarm murine sarkomu hücreleri tarafından salgılanan jöle benzeri protein matris) 3D kültürü kolaylaştırmak ve daha iyi in vivo çevre7taklit geliştirilmiştir,8,9,10. Birden fazla kriter (morfoloji, gen ekspresyonu ve hormon duyarlılığı) tarafından ortaya 3D matrislerde culturing hücreleri böyle bir mikroortamda vivo fizyolojiksüreçlerdedaha iyi modeller 9,10,11,12. Birincil mindik hücreleri kullanılarak yapılan araştırmalarda, organoidlerin uzun süreli bakımı ve farklılaşması için gerekli olan temel büyüme faktörleri ve morfojenler saptandı13. Bu çalışmalar burada sunulan protokol için zemin hazırladık, ve 3D organoidler olarak insan meme hücrelerinin kültürü için, şimdi modern bir klinik araçtır, hasta örnekleri üzerinde ilaç keşif ve ilaç testi için izin14. Genel olarak, organoid culturing birincil hücrelerin kendi kendine organizasyon kapasiteleri ve morfogenez ve farklılaşma katkıları vurgulamaktadır.
Burada sunulan süt üreten acini içine ayırt edilebilir kültür murine epitel için bir protokoldür. İki farklı MG hücre bölmesini oluşturan MiyoEC'leri ve LEC'leri izole etmek için diferansiyel trippsinizasyon tekniği kullanılır. Bu ayrılmış hücre fraksiyonları daha sonra genetik olarak aşırı ifade veya nakavt gen fonksiyonu için manipüle edilebilir. Çünkü soy-içsel, kendi kendine organizasyon meme epitel hücrelerinin doğuştan gelen birözelliğidir 15,16,17, bu hücre fraksiyonları rekombinerek araştırmacılar çift katmanlı, mozaik organoidler oluşturmak için izin verir. Biz enzimatik yağ dokusu sindirerek başlar, ve daha sonra 24 saat için bir doku kültür çanak üzerinde meme parçaları kuluçka(Şekil 1). Doku parçaları polistiren tabaklar üzerinde iki katmanlı parçalar olarak in vivo organizasyon: iç luminal katmanları çevreleyen dış miyoepitelyal tabaka yerleşmek. Bu hücresel organizasyon, dış MiyoEC'lerin tripsin-EDTA (%0.05) ile izolasyonuna izin verir. tedavi 3-6 dk ve ardından ikinci bir tripsin-EDTA turu (%0.05) kalan iç LEC'leri ayıran tedavi (Şekil 2). Bu nedenle farklı tripsin duyarlılığı olan bu hücre tipleri izole edilir ve daha sonra ECM ile karıştırılarak kaplanabilir (Şekil 3). Hücreler, iç LEC'leri çevreleyen MiyoEC'lerin dış tabakasından oluşan iki katmanlı küreler oluşturmak için kendi kendini örgütlemeden geçerler. Lümen oluşumu hücreler büyüme faktörleri nin bir kokteyl içeren bir ortamda büyümek gibi oluşur (Büyüme Orta için tariflere bakın)13. 5 gün sonra, organoidler Alveologenesis Medium'a geçerek süt üreten acini'ye ayrılabilir (bkz. tarifler ve Şekil 3F)ve 5 gün daha kuluçkaya yatırılabilir. Alternatif olarak, organoidler en az 10 gün boyunca Büyüme Ortamı'nda genişlemeye ve dallanmaya devam edecektir. Organoidler immünororesans(Şekil 3D-F)kullanılarak analiz edilebilir veya ecm'den bir kurtarma solüsyonu kullanılarak serbest bırakılabilir (bkz. Malzeme Tablosu)ve diğer yöntemlerle analiz edilebilir (örn. immünoblot, RT-qPCR).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan tüm yöntemler California Üniversitesi, Santa Cruz Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Gün 1: Meme bezi sindirim
- 10-14 haftalık olgun dişi farelerden MG'leri hasat etmeye hazırlanın.
- Aseptik koşullar altında açık bir bankta hasat gerçekleştirin.
- Ameliyattan önce 20 dakika boyunca %70 alkol le otoklavlama ve ıslatma ile tüm cerrahi malzemeleri, mantar panoları ve pimleri sterilize edin.
- 0.5 mL insülin şırınga ile intraperitoneal enjeksiyon yoluyla verilen sodyum pentobarbital (0.06 mg/g vücut ağırlığı 2X anestezik doz) ile hayvanları anestezik.
- Refleks yanıtı kontrol etmek için hayvanın ayak parmaklarını çimdikleyerek anestezi seviyesini izleyin ve protokolü ancak hayvan tamamen anestezi edildikten sonra başlatın.
- Hayvanı sırtına yerleştirin, uzantılarını mantar tahtasına sabitle ve karnını ve göğsünü etanolle silin.
- Bir fareden (yani 8 MGs, Şekil 1A)#2 3, 4 ve 5 MG'yi hasat etmek için, iki arka bacak arasındaki orta çizgiyi belirleyin ve karın derisinde keskin makaslarla küçük bir kesi (1 cm) yapın, sonra kesiği boynuna kadar uzatın18.
- Bir pamuklu bez kullanarak cildin serbest bırakılması için izin vermek için bacaklar ve kollar doğru yanal küçük kesimler yaparak izleyin. Deriyi çekin ve bir tarafa sabitlemeden önce sıkı bir şekilde gerin(Şekil 1B, adım 1)18. Altlarını keserek MGs çıkarın ve #4 bezlerilenf düğümleri kaldırmak(Şekil 1B, adım 2, 3)18. Vücudun diğer tarafında prosedürü tekrarlayın.
- MG dokusunu 4 °C Dulbecco'nun Modifiye Kartal Medyasının (DMEM)/Besin Karışımı F12 (F12) 50 mL'lik kısmını %5 fetal sığır serumu (FBS) ve 1X Antibiyotik Antimikotik (Anti-Anti)18ile destekletamama .
- Bezleri 35 mm'lik bir tabakta veya seramik bir tabakta jilet veya doku helikopteri kullanarak doğrayın. Doku parçaları 1 mL mikropipet ucuna kolaylıkla sığabilecek olana kadar plakayı her beş manuel doğrayın veya doku helikopterinin her bir yuvarlarını kolayca (~0,1 mm/fragment, Şekil 1C)döndürün.
- Sindirim Ortamı'ndaki MG'leri sindirin (tablo 1'ebakınız) 37 °C,%5 CO2'de6 iyi düşük yapışma kabında 14 saat boyunca .
2. Gün 2: Meme epitel doku parçalarının izolasyonu
- 14 saat sindirimden sonra, sindirilmiş doku 10X'i 1 mL mikropipet kullanarak, kalan stroma veya yağ dokusunu parçalayarak, ne kabarcıkların ne de aşırı mekanik kuvvetin üretilmesini sağlayarak hafifçe karıştırın.
NOT: 14 saat sonra eksik sindirim varsa, bu yıkınan DNA birikimi nedeniyle olabilir. Bu durumda, Sindirim Ortamı 2 mL başına 1 mg/mL deoksiribononükle 1 (DNase I) ekleyin. 37 °C'de 30 dk daha kuluçka, %5 CO2. - 15 mL'lik bir tüpte doku ları toplayın ve sindirim için kullanılan 1X Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salini (DPBS) ca2+ ve Mg2+içermeyen 2-3 mL doku kültürü ile durulayın. 10 dk için 600 x g santrifüj.
- Lipid tabakası ve orta içeren supernatant boşaltın ve daha sonra DPBS 5 mL pelet resuspend ve yeni bir 15 mL tüp geçmek. 10 dk için 600 x g santrifüj.
- Santrifüj sırasında 50 mL'lik bir tüpe 70 m naylon hücreli süzgeç yerleştirin ve süzgeci 10 mL 37 °C DMEM/F12 kullanarak önceden ıslayın.
- 5 mL DPBS kullanarak protokol adım 2.4 doku parçalarını yeniden askıya alın ve stromal hücreleri ve tek hücreleri temizlemek için süspansiyonu önceden ıslak 70 μm naylon hücresüzden geçirin(Şekil 1D).
- Hücre süzgecindeki doku parçalarını toplayın. 10 mL 37 °C DMEM/F12(Şekil 1D)ile 4X durulayın.
DİkKAT: Eksik durulama, epitel olmayan hücrelerle kontamine olmuş kültürlere neden olur. - Süzgeç sekmesini eldivenli parmaklarla tutarak, süzgecin 60 mm'lik doku kültür çanağı üzerinde ters çevrilerek ve 1 mL aliquot'u Bakım Ortamı'ndan geçirerek doku parçalarını serbest bırakın (Bkz. Tablo 1) süzgeç 4X'in altından(Şekil 1E).
- Çıplak gözle görülebilecek doku parçası kalıntıları için süzgecin imasını kontrol edin ve süzgeci 1 mL Bakım Ortamı ile 1 x daha fazla durula. Durulanan doku parçaları artık stromal hücrelerden arındırılmış olmalıdır.
- Protokol adımı 2.9'dan MG parçalarını içeren 60 mm'lik kabı ters bir mikroskop altında (4X veya 10X objective, Şekil 1F)hızlı bir şekilde inceleyin. Sekiz MGs tipik bir hazırlık ~ 500 parçaları verir. Tek hücre veya yağ damlacıkları ve kirletici hücreler olup olmadığını arayın.
NOT: Kirlenen hücreler varsa, 60 mm'lik çanaktan orta ve parçaları 5 mL pipet kullanarak toplayarak ve parçayı 70 m'lik taze bir süzgeçten tekrar filtreleyerek 2.6, 2.8-2.10 protokol adımlarını tekrarlayarak filtrasyon adımını tekrarlayın. - 37 °C'de 24 saat kuluçka, %5 CO2, doku parçasının yapışmasını ve çift katmanlı parçalar üretmesini sağlar(Şekil 2A).
NOT:Parçalar 24 saate kadar yerleşmemişse, yapıştırılınana kadar kuluçkaya yatırmaya devam edin. Parçalar iyi yapışmazsa, hücre bölmelerinin ayrılması çalışmaz. Araştırmacılar yapışma konusunda endişeleriniz varsa, doku kültürü plakaları parça eki (örneğin, poli-L-lizin) teşvik etmek için tedavi edilebilir.
3. Gün 3: Miyoepitelyal ve luminal epitel hücrelerinin diferansiyel tripsinizasyonu
- MiyoEC'leri LED'lerden ayırmak için, ortamı yemekten boşaltın, 1 mL DPBS ile 1 x durulayın ve 1 mL taze tripsin-EDTA (%0,05) ekleyin ve ters bir mikroskop altında (10X veya 20X hedefi, Şekil 2B,C,F)altında sindirimi dikkatle izleyin. Dış MyoEC tabakasının ayrılması, tripsin-EDTA (%0.05) bağlı olarak 3-6 dakika gerektirir Gücü.
NOT: Bu işlemi gösteren temsili görüntüler için lütfen Şekil 2'ye bakın. Brightfield aydınlatma altında, MyoECs yuvarlak görünür ve LED'ler ile karşılaştırıldığında daha parlak bir görünüme sahip, hangi merkezinde bağlı kalır ve koyu görünür. - 2 mL %10 FBS/DPBS içeren 15 mL'lik bir tüpte MyoEC fraksiyonu toplayın. LED'leri rahatsız etmeden, 60 mm'lik kabı 2 mL DPBS ile hafifçe durulayın ve DPBS'yi atın(Şekil 2H-I).
NOT: MyoECs için olağan kurtarma (3.5 x 106-1.5 x 106) MGs boyutuna bağlı olarak bir aralık içindedir. - LEC fraksiyonu kaldırmak için 1 mL tripsin-EDTA (%0.05) ekleyin tekrar çanak ve kuluçka 7-15 dk, dikkatle aşırı hazımsızlığı önlemek için izleme. Tripsin-EDTA'yı söndürmek (%0.05) %10 FBS/DPBS 2 mL ile çanak üzerinde. Yeni bir 15 mL tüp LEC fraksiyonu toplamak.
NOT: LED'ler için olağan iyileşme bir aralık içindedir (2 x 106-4.2 x 106) MG'lerin boyutuna bağlı olarak. Rutin olarak, immünohistokimya tarafından titreyen her iki fraksiyonun saflığı ~%9019 'dur(Şekil 2E). - Tripsin-EDTA'yı (%0.05) çıkarmak için 300 x g'da 5 dk için her fraksiyonu santrifüj edin. 250 μL'lik Maintenance Medium'da peleti yeniden askıya alın ve her hücre popülasyonunu hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak sayın. Sayarken hücreleri buzüzerine yerleştirin.
NOT: Hücre fraksiyonlarının genetik manipülasyonu isteniyorsa, primer hücreler düşük yapışma yemeklerinde yetiştirilebilir ve lentivirus20ile enfekte edilebilir.
4. Gün 3: Hücre fraksiyonlarını hücre dışı bir matriste birleştirme ve yerleştirme
NOT: MyoEC ve LEC fraksiyonları toplandıktan ve sayıldıktan sonra birleştirilebilir. Tipik MyoEC/LEC oranı 1:3 'dür (Şekil 3A)19. Farklı çalışmalar yapılabilir. Örneğin, mozaik çalışmaları gerçekleştirmek için, kesirler yabani tip (WT) ve mutant (Mut) farelerden oluşturulabilir ve kombine edilebilir (MyoEC/LEC: WT/WT; WT/Mut; Mut/WT; Mut/Mut)21veya kesirler MiyoECs/LECs19farklı oranlarda kullanılarak kombine edilebilir.
- Hücre sayılarına göre, 12.000 hücre/kuyu için hazırlanması gereken kuyu sayısını (8 kuyu odası, bkz. Malzeme Tablosu)hesaplayın (örn. 3.000 MyoEC:9.000 LEC).
- Her kuyuya %50 ECM (%50 ECM/50 DMEM/F12) 90 μL ekleyerek 3D kültür için Table of Materialstaban katmanını kurun. Hiçbir kabarcıklar ve kuyular eşit olarak kaplanır olduğundan emin olun. Taban tabakasını sağlamlaştırmak için, slaytları 37 °C'de, %5 CO2'yi 30 dk'da kuluçkaya yatırın.
NOT: ECM'nin bu adıma kadar buz gibi kalması gerekir, aksi takdirde erken polimerize olur ve pürüzlü taban kaplamave polimerizasyona yol açar. Bir taban ECM kullanarak tek bir düzlemde organoid büyümesini artırır, hangi görüntü yakalama yardımcı olur. Bu da daha hızlı organoid büyüme elde eder ve daha az ECMkullanır 22. - Polimerizasyon sırasında hücre karışımlarını hazırlayın. Pelet MyoEC ve LEC fraksiyonları 300 x g için 5 dakika ve her hücre fraksiyonu askıya 10% ECM/90% Büyüme Orta böylece her iyi 100 μL (Büyüme Orta yapmak için nasıl Tablo 1 bakınız).
NOT: Hazırlık kolaylığı için, aynı hücre karışımları kullanarak kuyuçoğaltmak. Bunlar bir tüp halinde birleştirilebilir ve hazırlanabilir (örneğin, aynı hücre karışımının dört kuyusu 400 μL %10 ECM/90% Büyüme Ortamı'nda hazırlanabilir). - Her hücre karışımından 100 μL'yi %10 ECM/90% Büyüme Ortamı'na ekleyin ve organoidlerin 37 °C'de 20 dk, %5 CO2'yeyerleşmelerine izin verin.
- Hücreler yerleştikten sonra, her kuyunun hazne duvarını yavaşça borulayarak 100 μL'lik Büyüme Ortamı ekleyin. Slaytları 37 °C, %5 CO2'de kuluçkaya yatırın (her kuyunun toplam bileşimi için Şekil 3A'ya bakınız).
NOT: Rho Kiazaz inhibitörü, R-spondin ve Nrg1 hem primer meme hücreleri hem de insan meme kanseri hücrelerinden yetiştirilen organoidlerin uzun vadeli kültür için önemli olarak tespit edilmiştir faktörlerdir13,14. Buna ek olarak, kök hücre faktörleri B27 ve N2 organoidler kültürlü olabilir süresini uzatmak. - Görüntü hücreleri büyümelerini izlemek ve 100 μL/iyi kullanarak her 2-3 günde bir Büyüme Ortamını yavaşça yenilemek için her 24 saatte bir(Şekil 3B-E).
NOT: Ortamı yenilerken aşırı özen kullanın. Kuyuların bir köşesinde orta toplamak için oda slaytlar tilt. Ortamın ≤100 μL'sini çıkarın ve ECM tabakasını rahatsız edilmeden bırakmaya özenle doldurulun. - Araştırmacılar emzirme/alveologenez araştırmakla ilgileniyorsa,Figure 3F5. Table 1 Table of Materials
NOT: Bu noktada, organoidler 4 °C'de 400 μL'lik 4 °C'de kuluçkaya yatarak ECM'den izole edilebilirler (protokol ve reaktif bilgileri için Malzeme Tablosu'na bakınız).
5. Gün 5 veya 10: Sabitleme ve immünboyama organoidler
- Ortamı hafifçe boruyla çalarak dikkatlice çıkarın (ampul pipeti en iyi şekilde çalışır). 1x Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (DPBS, tariflere bakın) 200 μL'lik 200 μL'lik bir kısmını iyi durula.
- Organoidleri oda sıcaklığında 10 dakika soğuk (4 °C) 4% (w/v) paraformaldehit (PFA, bkz. tarifler) kullanarak düzeltin.
DİkKAT: PFA tehlikelidir. Kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, eldiven ve güvenlik gözlükleri) giyin. Bu adım bir duman başlık içinde yapılmalıdır.
NOT: ECM PFA tedavisi ile çözülür. Organoidler immünofloresan siniflar idardi edildiğinde eksik ECM çıkarılması arka plan boyamayol açabilir. - %4'lük PFA'yı çıkarın ve her kuyuya %0,2 (w/v) glisin/DPBS 200 μL ekleyin (tablo 1'ebakınız). Slaytları oda sıcaklığında bir gecede 30 dakika veya 4 °C'de sallanan bir yüzeye tüphaline koyun.
NOT: Organoidler bir sonraki adımdan önce 4 °C'de DPBS'de 1-3 gün saklanabilir. - DPBS + %0.25 Triton X-100 (PBST, bakınız Tablo 1)kullanarak organoidleri oda sıcaklığında 10 dakika geçirin.
- DPBS'de sallanan bir yüzeyde 1 saat boyunca %5 eşek serumu (DS) (veya ikincil antikor türüne uyan başka bir serum) kullanarak organoidleri engelleyin.
NOT: Bu adım bir gecede 4 °C'de sallanan bir yüzeyüzerinde yapılabilir. - Primer antikorları %1 DS/DPBS olarak hazırlayın. Her kuyu için 125-200 μL kullanın. Bir gecede 4 °C'de birincil antikordaki organoidleri sallanan bir yüzeyde kuluçkaya yatırarak immünoboyama yapın.
6. Gün 11: Komple immünofloresans
- Her 2X'i 5 dk boyunca 200 μL PBST ile yıkayın. Her kuyu için 125-200 μL kullanarak %1 DS/DPBS'de ikincil antikor ekleyin. 45 dakika boyunca sallanan bir yüzeyüzerinde oda sıcaklığında kuluçka.
- Her 200 μL PBST'yi iyi kullanarak her 2X iyi yıkayın.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca DPBS'de (DPBS'de 1:2.000) Hoechst DNA boyası kullanarak çekirdekleri lekelayın.
- Bir vakum ile hafifçe emerek kuyuda kalan tüm sıvıyı çıkarın.
- Odaları ve contayı dikkatlice çıkarın, kabarcıkları temizlemeye özen tayarak, her kuyuya ve kapak kaymasına bir damla montaj ortamı (~30°L) Table of Materialsyerleştirin. 1-2 gün boyunca karanlık bir alanda slayt kurumasını bekleyin. Açık oje ile mühür. Organoidleri konfokal mikroskop üzerinde görüntüleyin (Şekil 3E-F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada sunulan protokol, mozaik organoidlerden yararlanılarak meme epitel hücrelerinin belirli soy katkılarını araştırmak için kullanılan bir yöntemi açıklamaktadır. Organoidler için primer minros hücreleri elde etmek için, meme bezi epiteli öncelikle çevredeki adiposit bakımından zengin stromadan izole edilmelidir (Şekil 1). Bu süreç burada kısaca açıklanmıştır ve daha önce yayınlanmış bir çalışmada18açıklanmıştır. Yeterli hücre elde etmek için, #2, 3, 4 ve 5 MG'lerin çıkarılması önerilir (Şekil 1A). Epitel hücrelerinin saf bir popülasyon izole etmek için önemli bir adım anahtarı, preparat kontamine olacak bağışıklık hücreleri açısından zengin olan #4 MGs lenf düğümleri kaldırılmasıdır(Şekil 1A,B). MM'ler ~0,1 mm boyutunda parçalar oluşturmak için kıyılmıştı (Şekil 1B). Doku parçaları daha sonra enzimatik olarak sindirildi, kollajenaz varlığında meydana gelen bir süreç, stroma epitel serbest bırakmak için, ve tripsin yokluğunda, hücre-hücre temaskorumak kadherinler gibi proteinlerin sindirimini önlemek için. Sindirilmiş doku daha sonra lipidleri çıkarmak için santrifüj edildi ve bir hücre süzgeci nden süzülüp yıkandı (Şekil 1C). Süzgeçe bağlı olan epitel parçaları, filtrenin ters çevrilerek ve membranın yıkanarak serbest bırakıldığını ve epitel parçalarını polistiren bir tabağa aktarır (Şekil 1D). Bu parçalar küçük, dallı yapılar olarak ortaya çıktı (Şekil 1E).
Saflaştırılmış epitel parçaları 24 saat boyunca kuluçkaya yatırıldı. Onlar çanak üzerine yerleşmiş ve bağlı, miyocs iç LECs çevreleyen bir dış tabaka ile düz, gözleme benzeri yapılar oluşturan(Şekil 2A-B). Şekil 2C vahşi bir hayvan dan böyle bir gözleme benzeri yapının kenarını gösterir. Tripsin tedavisi, ilk olarak ayrılan ve kalan kübik LEC'lerin çekirdeğini çevreleyen parlak, yuvarlak hücreler olarak ortaya çıkan MyoEC'leri farklı olarak ayırdı (Şekil 2C,F). MyoEC'lerin ayrılması brightfield mikroskobu kullanılarak dikkatle izlendi ve 3-6 dakika içinde meydana geldi. MECs toplandıktan sonra, LECs daha sonra 7-15 dakika ikinci, daha uzun tripsin tedavisi ile ayrıldı. Hücre ayrılması için gereken süre tripsin konsantrasyonuna ve tazeliğine bağlıdır. MyoEC fraksiyonunda KRT14-pozitif ve E-Kadherin (CDH1)-negatif olan hücreleri ve LEC fraksiyonunda KRT14-negatif ve E-Kadherin pozitif olan hücreler sayılarak iki hücre bölmesinin genel saflığı ~%90 olarak tahmin edilmiştir (Şekil 2D-E)19. Bazı MyoEC'lerin gözleme benzeri yapının üstünden ve dış kenarlarından çıkarıldığını keşfettik. Bu durum indüklenebilir, floresan bazal belirteç (Cytokeratin 14 (KRT14)-CreERT1; R26RYFP/+) ve hasattan 5 gün önce 75 mg/kg tamoksifen enjekte edilir. Şekil 2F,G'de miyoec'lerin gözleme yapısının kenarlarından ayrılması kolayca görülmektedir. Bu, tripsin tedavisinin ilk 2 dk içinde meydana geldi (Şekil 2F). Buna ek olarak, YFP-KRT14-pozitif hücreler yapının üst kısmında gözlendi, burada tripsin tedavisinden sonra yuvarlandı ve durulama/toplama adımı ile çıkarıldılar (Şekil 2G). Az sayıda veya hiç YFP-KRT14-pozitif hücre içermeyen LEC'lerin etiketlenmemiş çekirdeği(Şekil 2H),(Şekil 2I) daha sonra tripsin tedavisinin ikinci turunda ayrılmıştır.
MyoEC ve LEC fraksiyonları toplandı, kombine edildi ve %10 ECM içine gömülü ve %50 ECM tabanına saplandı. Bu, öncelikle taban tabakası boyunca büyüyen organoidlerin daha iyi optik çözünürlüğü sağlar(Şekil 3A). 24 saat sonra hücreler büyük ölçüde lümenden yoksun bir birime yapıları halinde biraraya getirilmiştir (Şekil 3B). 48 saat sonra, merkezi lümenler oyuk olarak oluşan yeni doğan organoidler oyulmuş ve daha hafif bir iç mekan olarak ortaya çıktı (Şekil 3C). 10 gün sonra, organoidler iyi gelişmiş lümenler ile büyük, dallı yapılar vardı. Yabani tip farelerden hasat edilen MyoEC'lerden ve ACTb-EGFP farelerinden alınan LED'lerden elde edilen mozaik organoidler yerinde sabitlendi, bazal marker alfa-düz kas aktinine (SMA) karşı antikor ile immünosüle edildi ve çekirdekleri göstermek için Hoechst DNA lekesiyle boyandı. Şekillerde, üst ve bölüm görünümleri Z-yığını olarak toplanan ve 3B görünüme yeniden yapılandırılan farklı görüntü kümelerini gösterir(Şekil 3D). Üst görünüm organoidlerin dallı morfolojisini ortaya koymaktadır (Şekil 3E'). Bölüm görünümü, bu organoidlerin çift katmanlı epitel yapısını ve açık lülesini gösterir(Şekil 3E''). Bu organoidler alveologenez orta kullanılarak 5.Figure 3F Organoidler büyüdü, daha fazla dal vardı ve süt içeriyordu. Yukarıda açıklandığı gibi diferansiye organoidler üretilmiş ve süt belirteci, peynir altı suyu asidik proteine (WAP, Şekil 3F)karşı bir antikor ile immünosüle edilmiştir. WAP süte salgılanan çözünür bir proteindir. Bu sıvının büyük bir kısmı hücreler sabitlendiğinde ve immünosüller yerinde yken kaybedildi. Bu nedenle, üst ve kesit görünümlerinde, WAP boyama hücre içi hücre içi ve fiksasyon sırasında hücre yüzeyinde sıkışıp kalan sütte hücre dışı olarak görülebilir(Şekil 3F), kesit görünümünde küçük bir organoid sıvı süt içerdiği görülmektedir(Şekil 3F'' kutulu kaplama).
Şekil 1: Meme parçası izolasyonu. (A) Etiketli bir farenin 5 MGs şeması ile etiketlenmemiş, kontralateral eşleştirilmiş MGs. (B) #4 MG kutulu ve kaldırma lenf düğümü tanımlamak için nasıl büyütülmüş fare MGs görüntüleri. (C) Doğranmış MG'lerin, doku parçalarının boyutunu gösteren cetvelli 6 iyi düşük yapışma plakalı görüntüsü (her biri ~0,1 mm). (D-E) Şematik gösteren protokol adımları 2.7-2.9. (D) MG parçaları 70 μm'lik bir süzgeçten geçirilir ve 4X durulanır. (E) Süzgeç daha sonra 60 mm polistiren doku kültür çanak üzerinde ters ve parçaları çanak içine serbest bırakıldı. (F) Stroma içermeyen 60 mm'lik bir çanak üzerinde toplanan filtrelenmiş doku parçalarını gösteren görüntü. Oklar, 70 μm'lik süzgeçte toplanan en küçük parçaları işaret eder. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Diferansiyel trippsinizasyon. (A) Brightfield görüntü bir polistiren çanak üzerine yapıştırılmış bir doku parçası gösteren, bir gözleme gibi bir yapı oluşturan. (B-C) İlk diferansiyel trippsinizasyon adımı, MyoEC'ler için CytokeratinD14 (KRT14) hücre belirteci kullanarak MyoEC'lerin (alt) ve LEC'lerin (üst) immünfloresan görüntüleri 3 dakika sonra parlak, yuvarlak hücreler olarak açıkça görülebilen MiyoEC'leri ve LEC'ler için E-Kadherin (CDH1) belirteç hücresini kullanarak ayırdı. (E) KRT14 ve CDH1 ifadesi, farklı tripsifhücre fraksiyonlarının verimini ve saflığını ölçmek için kullanılmıştır. (F-I). Sitokeratin 14 (KRT14)-CreERT1 doku parçalarının temsili faz kontrastı ve floresan (YFP) görüntüleri; R26RYFP/+ MGs. Farelere hasattan 5 gün önce 75 mg/kg tamoksifen enjekte edildi. (F) İlk tripsin-EDTA sırasında MiyoEC'lerin (okların) ayrılması (%0,05) Kuluçkadan 2 dk sonra. (G) Etiketlenmemiş LED'lerden oluşan bir gözlemenin üzerine KRT14-YFP-MyoEC'lerin (oklar) serpilmesi. (H) İlk tripsinizasyon ve MyoEC ayrılmasından sonra LED'lerin Brightfield görüntüsü. (I) MyoEC müfrezesi sonrasında, KRT14-YFP-MyoEC'ler Artık YFP ifadesinin yokluğunda gösterildiği gibi görünmez. Ölçek çubukları = 30 μm (A, brightfield) 100 μm (F, brightfield), 50 μm (G, floresan), 100 μm (H,I). Bu rakamın A-E panelleri Macias ve ark.19'dandeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Üç boyutlu organoid kültür. (A) %10 ECM/90% Büyüme Ortamı'na gömülü ve %50 ECM/50% DMEM taban tabakasında yetiştirilen tek hücrelerin şematik gösterimi (protokol adımı 4.5). (B-C) Miyom ve LEC'lerin 24 h(B) ve 48 h(C)ile farklı olarak tripten üretilip yeniden biraraya getirilmiş meme organoidlerinin hızlı kendi kendini organize etme kapasitelerini gösteren çizimler ve faz-kontrast görüntüleri . İmmünosül organoidleri göstermek için E-F'de kullanılan üst (sol) veya bölüm (sağ) görünümlerini gösteren dijital geniş alan mikroskobu(D)şematik gösterimi kullanılarak toplanan görüntüler. (E) Büyüme Ortamı'nda 5-10 gün boyunca yetiştirilen meme organoidlerini içeren 8 kuyuluk bir kayanın tek bir kuyunun şematik gösterimi. (E'-E") BüyümeninE'10.E" MiyoECs psödocolor macenta düz aktin kas (SMA) ile işaretlenir. LED'ler ACTb-EGFP farelere ait olup psödorenk yeşil renkte gösterilmiştir. Çekirdekler Hoechst boyasıyla lekelenmişti. (F) Büyüme Orta 5 gün ve Alveologenesis Orta 5 gün için yetiştirilen meme organoidler içeren bir 8 kuyu luk slayt tek bir kuyu şematik gösterimi. (F'-F"). BüyümeninF'10.F" MiYOEC'ler işaretlenmemiş. ACTb-EGFP farelerinin LED'leri psödorenk yeşil renkte gösterilir. Süt proteini, peynir altı suyu asidik protein (WAP), LED'lerde psödorenk sarı gösterilir ve organoidlerin lümenlerinin iç kaplama. Çekirdekler Hoechst boyasıyla lekelenmişti. Dönen bir disk konfokal mikroskobu kullanılarak toplanan ve Imaris(E', E') veya alt kısım ~30 dilim(F', F" )kullanılarak 3boyutlu olarak yeniden yapılandırılan görüntüler. Ölçek çubukları = 100 μm (C), 20 μm (E), 40 μm (F). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| 10 mL | Sindirim Aracı | |
| Tutar | Reaktif | Notlar |
| 9,45 mL | DMEM/F12 | |
| 100 μL | Antibiyotik-Antimikotik (100X) | |
| 0,04 g | 3. Sınıf Kollajenaz | |
| 0,04 g | Sınıf 2 Dispase | |
| 50 μL | Gentamisin | Son Konsantrasyon: 500 μg |
| 2,5 mL | Fetal Büyükbaş Serum | Son konsantrasyon: %5 (v/v) |
| 0,22μm filtreden geçirin | ||
| 50 mL | Bakım Ortamı | |
| Tutar | Reaktif | Notlar |
| 49,47 mL | DMEM/F12 | |
| 0,5 mL | Antibiyotik-Antimikotik (100X) | |
| 2,5 mL | Fetal Büyükbaş Serum | Son konsantrasyon: %5 (v/v) |
| 25 μL | Insülin | Son konsantrasyon: 250 μg |
| 5 μL | Egf | Son konsantrasyon: 500 ng |
| 10 mL | Büyüme Orta | |
| Tutar | Reaktif | Notlar |
| 9.6455 mL | DMEM/F12, fenol kırmızısı yok | |
| 100 μL | N-2 Ek (100x) | |
| 200 μL | A vitamini olmadan B27 takviyesi (50x) | |
| 10 μL | Nrg1 | Stok: 100g/mL |
| 42,5 μL | R-spondin | Stok: 10 μg/mL |
| 1 μL | Rho inhibitörü Y-27632 | Stok: 10 μM |
| 1 μL | Egf | Stok: 0.1 μg/μL |
| 10 mL | Alveologenez Orta | |
| Tutar | Reaktif | Notlar |
| 9.6355 mL | DMEM/F12, fenol kırmızısı yok | |
| 100 μL | N-2 Ek (100x) | |
| 200 μL | A vitamini olmadan B27 takviyesi (50x) | |
| 10 μL | Nrg1 | Stok: 100g/mL |
| 42,5 μL | R-spondin | Stok: 10 μg/mL |
| 1 μL | Rho inhibitörü Y-27632 | Stok: 10 μM |
| 5 μL | Ovine Hipofiz Prolaktin | Son konsantrasyon: 1 μg/mL |
| 1 μL | Deksametazon | Son konsantrasyon: 5 μg/mL |
| 5 μL | Insülin | Son konsantrasyon: 5 μg/mL |
| 1 L | 10X DPBS | |
| Tutar | Reaktif | Notlar |
| 80 g | Nacl | |
| 2 g | Kartal | |
| 14.4 g | NaH2PO4 | |
| 2.4 g | KH2PO4 | |
| 1 L | di H2O | |
| Kuru reaktifleri eklemeden önce 800 mL'ye doldurun ve çözünün. Hacmi 1 L'ye doldurun. Otoklav sterilize etmek. | ||
| 1 L | 1X DPBS | |
| Tutar | Reaktif | Notlar |
| 100 mL | 10X PBS | |
| 900 mL | di H2O | |
| 1 L | PBST | |
| Tutar | Reaktif | Notlar |
| 100 mL | 10X PBS | |
| 2,5 mL | Triton X-100 | |
| 250 mL | %4 Paraformaldehit | |
| Tutar | Reaktif | Notlar |
| 10 g | Paraformaldehit | |
| 200 mL | di H20 | su 60 °C olmalıdır |
| 25 mL | 10X DPBS | |
| 50 μL | 10 N Sodyum Hidroksit | |
| Sterilize etmek ve pH'ın 7,4 olduğundan emin olmak için 0,45 μm'lik bir filtreden geçirin | ||
| 10 mL | 1 % Eşek Serumu | |
| Tutar | Reaktif | Notlar |
| 100 μL | Steril Filtreli Eşek Serumu | |
| 9,9 mL | 1X DPBS | |
| 10 mL | %0.2 Glisin | |
| Tutar | Reaktif | Notlar |
| 0,02 g | Glycine | |
| 10 mL | 1X DPBS | |
Tablo 1: Çözüm tarifleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, araştırmacıların birincil MG hücrelerini kullanarak 3D organoid kültürleri nasıl üretebildiğini anlatan bir yöntem sunulmuştur. Bu ve diğer protokoller arasındaki fark, iki ayrı MG hücre bölmesi ayırmak için bir yöntem detay olmasıdır: dış bazal MiyoECs ve iç LECs. Yöntemimiz iki aşamalı tripsin-EDTA (%0.05) kullanır diferansiyel tripsinizasyon dediğimiz tedavi19. Bu prosedür, araştırmacıların gelişmiş akış sitometrisi kullanmadan MiyoeC'leri ve LEC'leri izole etmesine olanak sağlar ve böylece FACS için gerekli olan iyi karakterize biyobelirteçlere sahip olmayan çok çeşitli memeli türlerinden hasat edilen MG'leri incelemek için kullanılabilir. İki hücrealt popülasyonlarını ayırma yeteneği, araştırmacıların izole edilmiş hücreleri genetik olarak bağımsız olarak değiştirmelerine veya genetik mutasyonlar veya etiketler barındıran hayvanlardan hücreleri yeniden birleştirmelerine ve böylece 3D kültüründe mozaik organoidler oluşturmalarına olanak tanır. Geçerli protokolün bir sınırlaması, stromal bölmenin kültür koşullarına dahil olmamasıdır. Ancak, vivo ECM,,23,24,25,26daha iyi özetlemek için birincil hücrelerden veya hücre hatlarından oluşturulan organoidler ile kokültür stromal bileşenleri için yeni yöntemler geliştirilmektedir ve bu yöntemler bu protokole uyarlanabilir.26 Buna ek olarak, bu protokol MyoEC ve LEC fraksiyonları (~ 90% arınma) büyük bir zenginleştirme elde ederken, kesirler saf hücre soyları temsil etmediğini unutmayın.
Bu protokolün başarısı bir dizi temel adıma dayanır. İlk olarak, hafifçe ama iyice MG doku sindirmek önemlidir. Dokunun aşırı hazımsızlığı hücre ölümüne ve epitel hücrelerinin daha düşük iyileşmesine yol açacaktır. Eksik sindirim stromal ve yağ hücresi kontaminasyonuna neden olur ve bu da daha sonraki analizleri (örn. immünororesans, protein analizi ve mRNA ölçümleri) engeller. İkinci olarak, protokol adım 2.8 kirletici hücreleri kaldırmak için MG dokusunu iyice durulamak önemlidir. Protokol adım 2.9'da MG doku parçaları 60 mm'lik bir tabağa salınır. Araştırmacılar, çanak yapışmadan önce, hemen yayımlanan parçaları izlemek gerekir. Yağ damlacıkları veya tek hücreler gözlenirse, protokol adımları 2.6 ve 2.8-2.11 tekrarlanmalıdır. Bunu yapmak için, orta ve doku parçaları çanak toplanır, yeni bir 70 μm süzgeç içine yerleştirilir, 37 ° C DMEM/F12 ile 4X yıkanır ve daha sonra yeni bir 60 mm çanak içine serbest bırakılır. Üçüncü olarak, ilk tripsin-EDTA (%0.05) izlemek esastır miyocs ilk 3 dakika içinde ayırabilirsiniz, çünkü yakından kuluçka, ama onlar da 6 dakika kadar yapışabilir. Tripsin-EDTA (%0.05) suboptimal oldu ve kuluçka MiyoMlar başarılı arıtma ile 10 dakika devam etti. Ancak, >10 dk tripsinizasyon MyoECs ve LED'lerin eşzamanlı toplanması ile sonuçlandı. Ayrıca yemeğin ilk kuluçka sırasında rahatsız edilmeden kalması da önemlidir. Aksi takdirde, MYOEC fraksiyonunun LED ile kontaminasyonu oluşabilir. Tersi de doğrudur; MyoEC'ler çanaktan tamamen kopmuş değilse, LEC fraksiyonu kontamine olurlar. Araştırmacılar sadece MyoEC salgılayan muhabir fareler kullanıyorsa, bir floresan mikroskobu altında ayrımı görselleştirmek daha kolaydır(Şekil 2F-I). Son olarak, araştırmacılar immünororesans analizleri için organoidleri sabitlemeyi planlıyorlarsa, %4'lük PFA'nın pH (7.4) ve sıcaklığı (4 °C) ECM'nin başarılı bir şekilde dissosiyalması için önemlidir. Organoidler diğer analizler için (örneğin protein ve mRNA ölçümleri) toplanıyorsa, geri kazanım solüsyonunun 4 °C'de olması önemlidir. ECM çözülmiyorsa, kurtarma çözeltisi ile kuluçka 10 dakika (yani, 30 dk toplam kuluçka) uzatılabilir. Ancak, daha uzun kuluçka süreleri 3D yapısı ve hücre ölümü kaybına yol açacaktır. Kurtarma protokolü (Malzemeler Tablosundalistelenen) geniş delikli ipuçlarının kullanımını belirtir. Bu organoidlerin 3Boyutlu yapısının yanı sıra hücrelerin bütünlüğünü korumak için önemlidir.
Bu dört temel adıma ek olarak, protokolün başarısını etkileyen iki faktör vardır. İlk olarak, organoid büyüme hücre çoğalmasını azaltmak ve bu nedenle ECM organoid büyümesini azaltmak genetik mutasyonlar ile sınırlı olabilir. Sadece birkaç organoid elde edilirse, sonraki fiksasyon adımı sık lıkla onların kaybına neden olur. Bunu gidermek için, MiyoECs:LECs (protokol adımları 4.1-4.2) oranı korunurken ECM içinde gömülü hücre sayısı artırılmalıdır. İkinci olarak, hücreler bir ECM'ye aktarıldıktan sonra günlük büyümelerini izlemek ve medya yenilemekonusunda dikkatli olmak önemlidir (her 2-3 günde bir). Bu protokol daha iyi görselleştirme için fenol kırmızısı serbest reaktifleri belirtir, ancak aynı başarı ve büyüme fenol kırmızıpozitif reaktifler kullanılarak elde edilir. Fiksasyondan önce orta yenilemenin gerçekleştiği günler (protokol adım 4.6) hücre kaybını azaltmak için aşırı özenle yapılmalıdır. %10 ECM üst tabakası hassastır; bu nedenle, mekanik rahatsızlıkları en aza indirmek için oda duvarlarına sıvı boru ile titreyen veya orta yenileme yapılmalıdır.
Organoidlerin süt üreten acini'ye farklılaşması, hidrokortizon veya deksametazon, insülin ve prolaktin gibi farklılaşma takviyeleri ile tedavi gerektirir. Bu protokolde deksametazon önerilir. Buna ek olarak, prolaktin ticari olarak kullanılabilir iken, bu protokolde kullanılan prolaktin Ulusal Hormon ve Peptid Programı elde edildi. Yine Alveologenez Ortamını değiştirirken organoidleri rahatsız etmemek çok önemlidir. Farklılaşma en az 5 gün gerektirir. Bu başka bir 3-5 gün uzatılabilir, ancak ECM taban katmanı 10-12 gün sonra bozulur. Diferansiye organoidler süt le doldurulur ve lümenleri daha koyu görünür.
Bu, meme epitel morfogenezine ve farklılaşmaya kompartmana özgü, soy katkılarını ele almak için kullanılabilecek etkili bir tekniktir. Bu teknikle araştırmacılar, farklı genetik olarak manipüle edilmiş MiyoEC'ler veLED'ler 21veya farklı genetik mutasyonlar barındıran farelerden elde edilen MiyoEC ve LED'lerden oluşan mozaik organoidler üretebilirler. Bu, araştırmacıların soyu kendine özgü hücre bölmelerinin organ morfogenene katkılarını ve süt üretimi gibi özel fonksiyonların edinimi ne kadar önemli olduğunu daha iyi anlamalarını sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Ben Abrams'a Kaliforniya Üniversitesi, Santa Cruz (UCSC) Kök Hücrelerin Biyolojisi Enstitüsü'nden (IBSC) teknik yardım ve çekirdek destek için teşekkür ederiz. Susan Strome ve Bill Saxton'a Solamere İplik Disk Konfokal Mikroskobu'nu kullandıkları için teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Howard Hughes Tıp Enstitüsü'nden UCSC'ye James H. Gilliam Fellowships for Advanced Study programı (S.R.), NIH'den (NIH GM058903) öğrenci gelişimini en üst düzeye çıkarma (H.M.) ve Ulusal Bilim Vakfı lisansüstü araştırma bursu (O.C. DGE 1339067) ve bir hibe (A18-0370) UC-Kanser Araştırma Koordinasyon Komitesi (LH) tarafından.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352096 | |
| 24 well ultra-low attachment plate (Corning) | Fisher Scientific | CLS3473-24EA | |
| 35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353001 | |
| 50 ml High-Clarity polypropylene conical tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352098 | |
| 60 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353004 | |
| 70 µM nylon cell strainer (Corning) | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Pen/Strep also works |
| B27 supplement without vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| B6 ACTb-EGFP mice | The Jackson Laboratory | 003291 | |
| BD Insulin syringe 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| Class 2 Dispase (Roche) | Millipore Sigma | 4942078001 | |
| Class 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004206 | |
| Corning Cell Recovery solution | Fisher Scientific | 354253 | Follow the guidelines for use – Extraction of Three-Dimensional Structures from Corning Matrigel Matrix |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment 6-well | Fisher Scientific | CLS3471 | |
| Dexamethasone | Millipore Sigma | D4902-25MG | |
| DMEM/F12, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11039-021 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington Biochemical | LS002007 | |
| Donkey anti-Goat 647 | Thermo Fisher Scientific | A21447 | Use at 1:500, Lot: 1608641, stock 2 mg/mL, RRID:AB_2535864 |
| Donkey anti-Mouse 647 | Jackson ImmunoResearch | 715-606-150 | Use at 1:1000, Lot: 140554, stock 1.4 mg/mL |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Thermo Fisher Scientific | 11330-057 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-250 | Without Mg2+/Ca2+ |
| EGF | Fisher Scientific | AF-100-15-100ug | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068–085 | 100% US Origin, premium grade, Lot: 059B18 |
| Fluoromount-G (Southern Biotech) | Fisher Scientific | 0100-01 | Referred to as mounting media in text |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Goat anti-WAP | Santa Cruz Biotech | SC-14832 | Use at 1:250, Lot: J1011, stock 200 µg/mL, RRID:AB_677601 |
| Hoechst 33342 | AnaSpec | AS-83218 | Use 1:2000, stock is 20mM |
| Insulin | Millipore Sigma | I6634-100mg | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| KRT14–CreERtam | The Jackson Laboratory | 5107 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR); Phenol Red-Free; 10 mL | Fisher Scientific | CB-40230C | Lot: 8204010, stock concentration 8.9 mg/mL |
| MillexGV Filter Unit 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGV033RS | |
| Millicell EZ SLIDE 8-well glass, sterile | Millipore Sigma | PEZGS0816 | These chamber slides are great for gasket removal but other brands can work well (e.g. Lab Tek II). |
| Mouse anti-SMA | Millipore Sigma | A2547 | Use at 1:500, Lot: 128M4881V, stock 5.2 mg/mL, RRID:AB_476701 |
| N-2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S671-3 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | S468-500 | |
| Nrg1 | R&D | 5898-NR-050 | |
| Ovine Pituitary Prolactin | National Hormone and Peptide Program | Purchased from Dr. Parlow at Harbor-UCLA Research and Education Institute | |
| Paraformaldahyde | Millipore Sigma | PX0055-3 | |
| Pentobarbital | Millipore Sigma | P3761 | |
| R26R-EYFP | The Jackson Laboratory | 6148 | |
| Rho inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| R-spondin | Peprotech | 120-38 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | x100-500ML | Laboratory grade |
| Trypsin EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 |
References
- Macias, H., Hinck, L. Mammary gland development. Wiley Interdisciplinary Reviews in Developmental Biology. 1 (4), 533-557 (2012).
- Daniel, C. W., De Ome, K. B., Young, J. T., Blair, P. B., Faulkin, L. J. Jr The in vivo life span of normal and preneoplastic mouse mammary glands: a serial transplantation study. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 61 (1), 53-60 (1968).
- Ip, M. M., Asch, B. B. Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. , Kluwer Academic/Plenum Publishers. (2000).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
- Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
- Lasfargues, E. Y. Cultivation and behavior in vitro of the normal mammary epithelium of the adult mouse. II. Observations on the secretory activity. Experimental Cell Research. 13 (3), 553-562 (1957).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Orkin, R. W., et al. A murine tumor producing a matrix of basement membrane. Journal of Experimental Medicine. 145 (1), 204-220 (1977).
- Lee, E. Y., Parry, G., Bissell, M. J. Modulation of secreted proteins of mouse mammary epithelial cells by the collagenous substrata. Journal of Cell Biology. 98 (1), 146-155 (1984).
- Lee, E. Y., Lee, W. H., Kaetzel, C. S., Parry, G., Bissell, M. J. Interaction of mouse mammary epithelial cells with collagen substrata: regulation of casein gene expression and secretion. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 82 (5), 1419-1423 (1985).
- Bissell, M. J., Barcellos-Hoff, M. H. The influence of extracellular matrix on gene expression: is structure the message? Journal of Cell Science. 8 (Suppl), 327-343 (1987).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Jarde, T., et al. Wnt and Neuregulin1/ErbB signalling extends 3D culture of hormone responsive mammary organoids. Nature Commununications. 7, 13207 (2016).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Daniel, C. W., Strickland, P., Friedmann, Y. Expression and functional role of E- and P-cadherins in mouse mammary ductal morphogenesis and growth. Developmental Biology. 169 (2), 511-519 (1995).
- Runswick, S. K., O'Hare, M. J., Jones, L., Streuli, C. H., Garrod, D. R. Desmosomal adhesion regulates epithelial morphogenesis and cell positioning. Nature Cell Biology. 3 (9), 823-830 (2001).
- Chanson, L., et al. Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 108 (8), 3264-3269 (2011).
- Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. Journal of Visualized Experiments. (106), e53179 (2015).
- Macias, H., et al. SLIT/ROBO1 signaling suppresses mammary branching morphogenesis by limiting basal cell number. Developmental Cell. 20 (6), 827-840 (2011).
- Welm, B. E., Dijkgraaf, G. J., Bledau, A. S., Welm, A. L., Werb, Z. Lentiviral transduction of mammary stem cells for analysis of gene function during development and cancer. Cell Stem Cell. 2 (1), 90-102 (2008).
- Smith, P., et al. VANGL2 regulates luminal epithelial organization and cell turnover in the mammary gland. Scientific Reports. 9 (1), 7079 (2019).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
- Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology. PLoS One. 6 (9), e25661 (2011).
- Labarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture. Journal of Visualized Experiments. (71), e50011 (2013).
- Marlow, R., Dontu, G. Modeling the breast cancer bone metastatic niche in complex three-dimensional cocultures. Methods in Molecular Biology. 1293, 213-220 (2015).
- Koledova, Z., Lu, P. A 3D Fibroblast-Epithelium Co-culture Model for Understanding Microenvironmental Role in Branching Morphogenesis of the Mammary Gland. Methods in Molecular Biology. 1501, 217-231 (2017).
