Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Visualisering af bakteriel resistens ved hjælp af fluorescerende antibiotika sonder

Published: March 2, 2020 doi: 10.3791/60743
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Centre for Superbug Solutions, Institute for Molecular Biosciences, The University of Queensland

Summary

Fluorescerende mærkede antibiotika er kraftfulde værktøjer, der kan bruges til at studere flere aspekter af antimikrobiel resistens. Denne artikel beskriver udarbejdelsen af fluorescerende mærkede antibiotika og deres anvendelse til at studere antibiotikaresistens hos bakterier. Sonder kan bruges til at studere mekanismer af bakteriel resistens (f.eks, efflux) ved spektrofotometri, flow cytometri, og mikroskopi.

Abstract

Fluorescerende antibiotika er multipurpose forskningsværktøjer, der er let anvendes til undersøgelse af antimikrobiel resistens, på grund af deres betydelige fordel i forhold til andre metoder. For at forberede disse sonder, azide derivater af antibiotika er syntetiseret, derefter kombineret med alkyne-fluorophores ved hjælp af azide-alkyne dipolar cycloaddition ved klik kemi. Efter rensning testes fluorescerende antibiotikaantibiotikas antibiotikaaktivitet ved hjælp af en minimal hæmatorisk koncentrationsvurdering. For at studere bakteriel akkumulering, enten spektrofotometri eller flow cytometri kan anvendes, giver mulighed for meget enklere analyse end metoder afhængige af radioaktivt antibiotika derivater. Desuden kan konfokal mikroskopi bruges til at undersøge lokalisering i bakterierne, hvilket giver værdifulde oplysninger om virkningsmekanisme og ændringer, der forekommer i resistente arter. Brugen af fluorescerende antibiotikasonder i studiet af antimikrobiel resistens er en kraftfuld metode med stort potentiale for fremtidig ekspansion.

Introduction

Antimikrobiel resistens (AMR) er en stigende krise, som udgør en stor trussel mod menneskers sundhed rundt om i verden. Resistens over for de fleste antibiotika er blevet rapporteret, og infektioner forårsaget af bakterier resistente over for alle klinisk tilgængelige lægemidler er på vej frem. For at bekæmpe stigningen i AMR, er vi nødt til at øge vores forståelse af dette mangesidede fænomen og de underliggende mekanismer og interaktioner mellem antibiotika og bakterier. Et aspekt, der er blevet historisk dårligt forstået, er gennemtrængelighed af antibiotika til bakterier, sammen med fænomener af akkumulering og efflux. Denne viden er afgørende for udformningen af nye lægemidler og forståelse mekanismer af resistens. Derfor spiller dette en afgørende rolle i AMR forskning.

Der er to hovedtilgange, der kan træffes for at måle antibiotikakoncentration: måling af lægemidlet direkte eller mærkning med en moiety designet til at lette kvantificering. Selv om tagging antibiotika forbedrer påvisning, Dette kan forstyrre den biologiske aktivitet af lægemidlet, såsom antimikrobiel aktivitet og gennemtrængelighed. Dette er ikke et problem for umærkede metoder; Det kan dog være en udfordring at detektere. I de seneste år har teknologiske fremskridt ført til et boom i forskning ved hjælp af massespektrometri (MS) til direkte at måle antibiotikakoncentrationen i bakterier1,2,3,4,5,6,7. Disse undersøgelser har vist, at det er muligt at studere intracellulær ophobning i en række forskellige bakterier, med gram-negative bakterier de mest undersøgte. Kvantificeringen af molekylepermeabilitet er derefter blevet kædet sammen med aktivitet og anvendes til at informere om lægemiddeludvikling2,3,4, selv om der skal udvises forsigtighed , når der skal udvises direkte sammenblanding af akkumulering og målaktivitet5. Forud for ms udvikling, de eneste antibiotika, hvis koncentration kunne måles direkte var dem, der besidder iboende fluorescens, såsom tetracyklin og quinoloner8,9,10,11. Selv om akkumulering og udstrømning tydeligvis var begrænset, blev akkumulering og udstrømning undersøgt og kvantificeret, hvilket illustrerer nytten af fluorescensbaseret kvantificering.

Tagged antibiotika har været brugt i mange årtier til at studere distributioner, virkningsformer, og resistens, med radioaktive og fluorescerende tags er fælles. Radio-tagged sonder har den fordel, at være næsten identisk med moderselskabet sammensatte, derfor den biologiske aktivitet er usandsynligt, at være væsentligt anderledes. Isotoper som 3H, 14C og 15N er ofte blevet anvendt på grund af disse elementers fremtrædende plads i antibiotika, og en række antibiotikastilladser er blevet undersøgt1,10,12,13. Selv om detekteringen af radiosonder er enkel, er der en række logistiske problemer (f.eks. sikkerhed, isotophalveringstid), som har begrænset brugen af denne tilgang. En anden strategi er fluorescerende-mærkede antibiotika. Disse sonder kan bruges til at undersøge fordelingen og virkningsmåder og modstand af moderselskabet stof, ved hjælp af enklere teknologi end MS og uden logistiske problemer med stråling8. Den største ulempe ved denne fremgangsmåde er, at antibiotika generelt er relativt små molekyler, og derfor udgør indførelsen af en fluorescerende moiety en betydelig kemisk ændring. Denne ændring kan påvirke fysiokemiske egenskaber og antibakteriel aktivitet. Det skal derfor sikres, at disse faktorer vurderes, så der kan opnås resultater, der er repræsentative for moderantibiotika.

I dette arbejde beskrives en metode til at syntetisere, vurdere og bruge fluorescerende antibiotika, som i vores tidligere publikationer14,15,16. Gennem tidligere arbejde er en række fluorescerende antibiotika blevet tilberedt og anvendt til forskellige formål (se Stone et al.8). For at minimere sandsynligheden for at påvirke biologisk aktivitet anvendes meget små fluorophorer i dette arbejde: nitrobenzoxadiazole (NBD, grøn) og7-(dimethylamino)-2-oxo-2 H-chromen-4-yl (DMACA, blå). Endvidere beskrives vurderingen af antibakteriel aktivitet ved hjælp af den mikrobrote fortyndingsmindstehæmningskoncentration (MIC), således at virkningen af ændringer på aktiviteten kan måles. Disse fluorescerende-mærkede sonder kan bruges i spektrofotometriske analyser, flow cytometri, og mikroskopi. Rækken af mulige anvendelser er, hvor fordelen ved fluorescerende antibiotika ligger. Cellulære akkumulering kan kvantificeres, kategoriseres og visualiseres, noget ikke muligt ved hjælp af MS alene. Det er håbet, at den viden, der opnås ved brug af fluorescerende antibiotika vil støtte i vores forståelse af resistens, og kampen mod AMR.

Protocol

1. Syntese af Alkyne-fluorophores

  1. Syntese af NBD-alkyne (7-nitro-N-(prop-2-yn-1-yl)benzo[c][1,2,5]oxadiazol-4-amin)
    1. 1.031 mg 4-chloro-7-nitro-benzofuran (5,181 mmol) opløses i 60 ml tetrahydrofuran (THF). Der tilsættes 1.857 mg CsCO3 (5.696 mmol), derefter 0,39 ml propargylamin (6,1 mmol). Reaktionen opvarmes til 50 °C i 2 timer, som vil blive fra brun til grøn, og afkøles derefter til stuetemperatur (RT).
    2. Reaktionen filtreres ved hjælp af en filtreringsstøtte (se Materialetabellen)og vaskes med ethylacetat (EA). Becentratfiltraten under reduceret tryk, opløs derefter restproduktet i 150 ml EA og flyt til en 500 ml skilletragt.
    3. EA-opløsningen vaskes med henholdsvis 100 ml med henholdsvis vand og saltlage. Kombiner derefter de vandige faser og vask 2x med 100 ml EA.
    4. Tør de kombinerede organiske faser over vandfri magnesiumsulfat, derefter filtrere og koncentrere sig under reduceret tryk.
    5. Rens råproduktet ved flash-kromatografi på silicagel (20-30% EA i petroleumsether [PE]), kontrol af renhed ved flydende kromatografimassespektrometri (LCMS, [M+H]+ = 219,1) og/eller nuklear magnetisk resonans (NMR) spektroskopi, kemiske forskydninger som følger:
      1. H NMR (CD3OD, 600 MHz) δ 8,54 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 6,35 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 4,31 (dd, J = 5,7 Hz, J = 2,5 Hz, 2H), 2,43 (t, J = 2,5 Hz, 1H); 13. C NMR (CD3OD, 150 MHz) δ 144.3, 143.7, 142.2, 135,8, 125.7, 100.0, 76.5, 74.2, 33.4.
      BEMÆRK: Når kolonnen udføres rensning ved silicagelkromatografi, skal den forberedes ved hjælp af de mindre polære opløsningsmidler, der er anført. Rå forbindelse kan enten indlæses som en koncentreret opløsning eller adsorberet på silicaen, hvis opløselighed ikke tillader det. Når forbindelsen er blevet tilsat til toppen af silicaen, skal du løbe gennem 1-2 kolonnemængder af samme opløsningsmiddel, der anvendes til silicabefugtning. Start derefter med det anførte opløsningsmiddelforhold, der løber gennem mindst 1 kolonnevolumen af hvert opløsningsmiddel, og sørg for ikke at foretage store spring i opløsningsmiddelsammensætning. Opsaml brøker, og tjek renhed/identitet efter LCMS eller TLC (tyndt lagkromatografi). Kombiner rene fraktioner og koncentrat under reduceret tryk ved roterende fordampning.
  2. Syntese af DMACA-alkyne (2-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-krom-4-yl)-N-(prop-2-yn-1-yl)acetamide).
    1. 5,02 g 3-(dimethylamino)phenol (36,6 mmol) opløses i 30 ml ethanol, og der tilsættes derefter 6,7 ml diethyl 1,3-acetonedicarboxylate (36 mmol). Tilsæt 10,5 g ZnCl2 (77,2 mmol), derefter tilbagesluk den røde opløsning i 42 h. Tilsæt en ekstra 9,20 g ZnCl2 (67,6 mmol), derefter refluks i 8 h.
    2. Afkøl reaktionen og koncentrat under reduceret tryk. Dpred den resulterende røde faste stof i 200 ml EA, filter, derefter overføre til en 500 ml adskille tragt.
    3. Vask EA med 200 ml hver af vand og saltlage, derefter tørre over vandfri magnesiumsulfat. Filtrer den tørrede organiske fase og koncentrat under reduceret tryk.
    4. Rense det røde faststof (ethyl 2-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)acetat) ved flashkromatografi på silicagel (0-100% EA i PE), kontrol renhed ved LCMS ([M+H]+ = 275,1) og/eller NMR, kemiske forskydninger som følger:
      1. H NMR (CDCl3, 600 MHz) δ 7.30 (d. J = 8,9 Hz, 1H), 6,52 (dd, J = 8,9 Hz, J = 2,6 Hz, 1H), 6,40 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 5,87 (m, 1H), 2,96 (m, 8H), 2,25 (d, J = 1,2 Hz, 3H).
    5. 488 mg ethyl 2-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2 H-chromen-4-yl)acetat (1,18 mmol) i 10 ml THF, derefter tilsættes en opløsning på 157 mg LiOH· H2O (3,74 mmol) i 15 ml vand. Rør reaktionen på RT i 3 timer, derefter flytte til en separat tragt og fortyndes med en ekstra 50 ml vand.
    6. Reaktionsblandingen vaskes 2x med 50 ml diethylether (Et2O), og vask derefter den kombinerede organiske fase 2x med 25 ml vand. Tag gul bundfald med det organiske lag. Koncentrer den organiske fase under reduceret tryk ved hjælp af en roterende fordamper.
    7. Forsure den vandige fase til pH = 2 med koncentreret HCl, og afkøles til 4 °C natten over. Filtrer den sure vandige fase og tilsæt det gule faststof til den koncentrerede organiske fase.
      BEMÆRK: 2-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)eddikesyre kan anvendes uden yderligere rensning, men dette kan kontrolleres af LCMS ([M+H]+ = 247,1) og/eller NMR, kemiske forskydninger som følger:
      1. H NMR (CDCl3, 600 MHz) δ 7.41 (d. J = 9,0 Hz, 1H), 6,62 (dd, J = 9,2 Hz, J = 2,8 Hz, 1H), 6,52 (d, J = 2,8 Hz, 1H), 5,98 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 3,05 (s, 6H), 2,35 (d, J = 0,9 Hz, 2H); 13. C NMR (CDCl3, 150 MHz) δ 162.2, 155.7, 152.9, 152.8, 125.3, 109.7, 109.3, 109.1, 108.8, 98.3, 40.2, 18.5.
    8. 466 mg 2-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2 H-chromen-4-yl)eddikesyre (1,89 mmol) i 7 ml tør N,N-dimethylformamid (DMF) og anbringes under en atmosfære af kvælstof.
    9. Opløsning 0,33 ml propargylamin (5,1 mmol) i 7 ml tør DMF under nitrogen. Der tilsættes 1,30 ml di-isopropylethyl amin (DIPEA, 7,50 mmol) til farvestoffet opløsning, derefter 535 mg O-(1H-6-chlorobenzotriazol-1-yl)-1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphat (HCTU, 1,29 mmol). Rør den aktiverede farvestof opløsning i 15 min på RT, derefter tilsættes amin opløsning dropwise, og lad det røre natten over.
    10. Den næste dag, fortyndes reaktionen med 35 ml vand derefter koncentrere sig under reduceret tryk.
    11. Partition er det resulterende orange faststof mellem EA og saltlage (100 ml hver) i en 250 ml skilletragt. Adskil lagene (kør de to lag i forskellige kolber), og vask den vandige fase med 100 ml EA.
    12. Koncentrer de kombinerede organiske faser under reduceret tryk, og opløst derefter det orange faststof i 3 ml 1:1 acetonitril (ACN)/vand (v/v). Rens det rå produkt ved at injicere på et omvendt fasemedium tryk væskekromatografi (MPLC) system udstyret med en C18 patron kolonne (opløsningsmiddel A: vand, opløsningsmiddel B: ACN).
    13. Kontroller fraktioner for renhed ved LCMS ([M+H]+ = 284,1, NMR kemiske forskydninger nedenfor), derefter kombinere og lyophilize passende fraktioner til at give 2-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)-N-(prop-2-yn-1-yl)acetamide, NMR kemiske forskydninger som følger:
      1. H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 8,65 (t, J = 5,4 Hz, 1H), 7,52 (d, J = 9,0Hz, 1H), 6,72 (dd, J = 9,1, 2,6 Hz, 1H), 6,55 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 6,00 (s, 1H), 3,88-3,87 (m, 2H), 3,62 (s, 2H), 3,13 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 3,01 (s, 6H); 13. C NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ 167,7, 160,7, 155,4, 152,9, 151.0, 126.0, 109.4, 109.1, 108.1, 97.5, 80.9, 73.3, 39.7, 38.4, 28.2.

2. Syntese af fluorescerende antibiotika

  1. Der fremstilles et azide-derivat af et antibiotikum som beskrevet tidligere14,15,16.
    BEMÆRK: Proceduren er specifik for hvert antibiotikum og kræver en omhyggelig undersøgelse af forældremolekylets strukturaktivitetsforhold (SAR) for at sikre, at det funktionsdygtige antibiotikum bevarer aktivitet, der kan sammenlignes med modervirksomheden. (f.eks ciprofloxacin16,linezolid14, og trimethoprim15). Se figur 1 for eksempler på offentliggjorte fluorescerende antibiotika og den generelle synteseordning.
  2. Klik reaktion procedure A
    BEMÆRK: For de fleste af de antibiotika, følg den procedure, der er beskrevet her for kobber katalyseret Huisgen [2 +3] cycloaddition af azid (trin 2.1) og fluorescerende alkyne (fremstillet i trin 1).
    1. Anbring azide-antibiotikummet i en rund bundkolbe og tilsæt tert-butanol(tBuOH) og vand (1:1 v/v, 25 ml pr. mmol azide).
    2. Fluorophore-alkyne, der er fremstillet i trin 1.1 (3 eq.), og reaktionen opvarmes til 50 °C. Tilsæt derefter kobbersulfat (100 mM i vand, 0,6 eq.) til reaktionen, efterfulgt af ascorbinsyre (500 mM i vand, 2,4 eq.).
    3. Reaktionen omrøres ved 50 °C i 1 time, eller indtil LCMS analyseres ved angivelse af reaktionsafslutning (fuldstændigindtagelse af startazid).
    4. Afkøl reaktionen og rense efter behov for antibiotika stillads og gå videre til rensning enten ved trin 2.3 eller 2.4.
      BEMÆRK: Flere forskellige rensningsmetoder er mulige, afhængigt af stilladsets polaritet og stabilitet.
  3. Klik reaktion procedure B
    BEMÆRK: Følg denne procedure for peptid-baserede antibiotika, at give stærkere reaktionbetingelser (ikke offentliggjort arbejde, Phetsang, 2019).
    1. Anbring peptidazid-antibiotikummet i en rund bundkolbe, og tilsæt nok DMF (750 ml/mmol azide) til at opløses.
    2. Fluorophore-alkyne, der er fremstillet i trin 1 (5 eq.), og reaktionen opvarmes til 50 °C i 1 time.
    3. Tilsæt kobber (I) iodid (20 eq.), derefter DIPEA (120 eq.), derefter eddikesyre (240 eq.).
    4. Reaktionen omrøres ved 50 °C i 1 time, eller indtil lcms's analyse indikerer reaktionsafslutning (dvs. fuldstændigindtagelse af startazid). Afkøl reaktionen og fortsæt til rensning ved metode 1 (se trin 2.3).
  4. Rensningsmetode 1 (anvendes til ciprofloxacin, trimethoprim og linezolid)
    1. Sprøjt den afkølede klikreaktion direkte ind på en MPLC C18 patronkolonne.
    2. Indarbejde en lang vask fase (ca. 10 min) i begyndelsen af løbet (100% opløsningsmiddel A), derefter køre en gradient op til 100% opløsningsmiddel B, efterfulgt af en tilbagevenden til opløsningsmiddel A.
      BEMÆRK: Opløsningsmiddel A kan vælges fra vand, 0,05-0,1% myresyre (FA) i vand, 0,05-0,1% trifluoreddikesyre (TFA) i vand, afhængigt af opløselighed, stabilitet og den bedste opløsning af toppe. Opløsningsmiddel B kan vælges fra acetonitril (ACN), 0,05-0,1% FA i ACN, 0,05-0,1% TFA i ACN, til at matche opløsningsmiddel A. Hvis eluion viser sig at være vanskelig, kan methanol anvendes i stedet for ACN.
    3. Indsamle og kombinere passende fraktioner, som angivet med LCMS og farve (korrekt masse set, ental peak), derefter lyophilize at give (semi) ren fluorescerende antibiotikum.
    4. Yderligere rense produktet, hvis det er nødvendigt. Vurder renheden ved hjælp af NMR og/eller LCMS og højtryksvæskekromatografi (HPLC) ved hjælp af en søjle og metode, der passer til stilladset.
  5. Rensningsmetode 2
    BEMÆRK: Hvis opløselighed tillader det, kan forstjenlighed udføres af den vandige workup (bruges til makrolider, ikke-offentliggjort arbejde, Stone 2019).
    1. Den afkølede klikreaktion fortyndes med vand og Et2O (1:1 v/v, ca. 10 gange fortynding fra den første reaktionsvolumen), overføres til en passende størrelseskilletragt.
    2. Adskil lagene og vask den vandige fase to gange med Et2O.
    3. Vask de kombinerede organiske faser 2x med vand (lige volumen med organisk fase), derefter tørres over Na2SO4.
    4. Filtrer den tørrede organiske fase og koncentrat under reduceret tryk.
    5. Indkøb råproduktet af MPLC og/eller HPLC som beskrevet i trin 2.4.4.
      BEMÆRK: Se figur 2 for eksempler på ufuldstændige, komplette og rensede klikreaktion LCMS-spor. Typiskrensede udbytter for antibiotika-fluorophore klik reaktioner spænder fra 30-80%.
      FORSIGTIG: De fleste af de kemikalier, der anvendes i disse syntheseer, har særlige sikkerhedsrisici. Der skal til enhver tid udvises forsigtighed, herunder brug af personlige værnemidler. Et2O, tBuOH, FA, eddikesyre, PE, EA, THF, ACN, DMF, EtOH, DIPEA, propargylamin og HCTU er alle brandfarlige; undgå kontakt med varme- eller gnistkilder. THF, propargylamin, DIPEA, tBuOH, FA, DMF og PE er alle giftige; undgå eksponering. Propargylamin, CsCO3, ZnCl2, LiOH-H2O, DIPEA, CuI, FA, eddikesyre og HCl er alle ætsende; undgå kontakt og være opmærksom på overfladekontakt. ZnCl2, CuSO4,CuI og PE udgør miljøfarer være opmærksomme på bortskaffelsesbetingelserne. THF kan danne eksplosive peroxider; være forsigtig med opbevaringsforhold. Organiske azider er eksplosive; passe især med storstilet produktion.

3. Evaluering af antimikrobiel aktivitet

BEMÆRK: Alt arbejde, der involverer bakterier, bør udføres under sterile forhold for at undgå kontaminering af enten analysen eller laboratoriet. Alle medier skal autoclaved før brug, og plastware og udstyr såsom pipetter skal holdes sterile. Det anbefales, at arbejdet udføres i en bioindeslutningshætte (type 2).

  1. Streak glycerol lagre af bakterielle stammer egnet til antibiotika stillads på lysogeny bouillon agar (LB, udarbejdet pr producentens anvisninger), og vokse natten over ved 37 °C.
    BEMÆRK: Valget af bakterier til at teste antibakteriel aktivitet skal ske baseret på det anvendte antibiotikum. Et repræsentativt udvalg på 5-10 bakterier bør vælges blandt de arter, der vides at være modtagelige for antibiotika, med hensyn til de logistiske kapaciteter af laboratoriet. Hvis det er muligt, resistente bakterier bør også testes. Nedenstående protokol vil virke på de fleste bakterier, men kontrollere, om særlige betingelser er påkrævet (f.eks CO2,særlige medier) og foretage ændringer efter behov. Bakterier med succes fremsayet ved hjælp af disse betingelser omfatter Staphylococci, Streptococci, Bacilli, E. coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, og Enterococcus faecium.
  2. Vælg en enkelt koloni fra pladen, og kultur natten over i 5 ml kation justeret Mueller-Hinton Bouillon (CAMHB, udarbejdet pr producentens anvisninger) ved 37 °C.
  3. Fortynde natten kulturer ~ 40-fold i CAMHB og vokse til en mid-log fase, optisk tæthed ved 600 nm (OD600)= 0,4-0,8, volumen 5 ml).
  4. Der fremstilles lageropløsninger af hvert fluorescerende antibiotikum ved 1,28 mg/ml i sterilt vand og pipette 10 μL antibiotika til den første kolonne på en 96 brøndplade.
  5. Tilsæt 90 μL CAMHB til den første kolonne og 50 μL til alle andre brønde. Udfør derefter seriel 2-fold fortynding hen over pladen.
  6. Bland grundigt, derefter fortyndes mid-log fase kulturer til ~ 106 koloni dannende enheder (CFU) /ml og tilsæt 50 μL til alle brønde, for at give en endelig koncentration på ~ 5 x 105 CFU / ml.

    kulturvolumen =(medievolumen i ml)/(OD600 x 1.000)

    f.eks. til en OD600 = 0,5 kultur i et ønsket medievolumen på 12 ml, tilføje (12/(0,5 x 1.000) = 0,024 ml kultur til 12 ml medier
  7. Dæk pladerne med låg og inkuber ved 37 °C i 18-24 timer uden at ryste.
  8. Syner pladerne visuelt, hvor MIC er den laveste koncentration godt uden synlig vækst.
    BEMÆRK: Se tabel 1 for nogle eksempler på aktive og inaktive fluorescerende antibiotika.

4. Analyse af sondeakkumulering ved spektrofotometri og flowcytometri

BEMÆRK: Disse centrifugeringstider er blevet optimeret til E. coli, så der kan være behov for mindre ændringer for andre arter. Repræsentative data for sondens akkumulering rapporteres for den NBD-mærkede ciprofloxacin-sonde.

  1. Streak glycerol bestande af bakterielle stammer på LB agar og vokse natten over ved 37 °C.
  2. Vælg en enkelt koloni fra pladen og kultur natten over i LB ved 37 °C.
  3. Fortynde natten kulturer ~ 50-fold i medierne og vokse til midten af log fase (OD600 = 0,4-0,8).
  4. Centrifuger kulturerne ved 1.470 x g i 25 min og dekantere mediet.
  5. Resuspendere bakterierne i 1 ml fosfatbufferede saltvand (PBS), centrifugeres derefter ved 1.470 x g i 15 min.
  6. Dekanter mediet, og opbryd de vaskede pellets i PBS til en endelig OD600 = 2.
  7. Hvis det ønskes, tilsættes 10,1 μL carbonylcyanid 3-chlorophenylhydrazone (CCCP, 10 mM i PBS) til 1 ml bakterier (endelig koncentration 100 μM) og inkuberved 37 °C i 10 min.
    BEMÆRK: CCCP er en efflux pumpehæmmer. Tilføjelsen af FKSSP vil gøre det muligt at undersøge virkningen af udstrømning.
  8. Centrifugerne centrifugeres ved 18.000 x g i 4 min ved 20 °C og dekanterer mediet.
  9. Der tilsættes 1 ml fluorescerende antibiotisk opløsning (10-100 μM i PBS) til pellet, og inkuberes ved 37 °C i 30 min.
  10. Centrifugerne centrifugeres ved 18.000 x g i 7 min ved 4 °C og dekantere mediet.
  11. Resuspendere bakterierne i 1 ml kold PBS, og gentag trin 4.9.
  12. Gentag trin 4.10 i alt 4x.
  13. Hvis det ønskes, lyse bakterier ved at tilføje 180 μL lysis buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, og 2 mM natrium EDTA) derefter 70 μL lysozym (72 mg/ml i H2O).
  14. Inkuber ved 37°C i 30 min. fryses derefter op og opkæd 3x (−78 °C i 5 min. og derefter 34 °C i 15 min. ).
  15. Sonikere prøverne i 20 min, derefter varme til 65 °C i 30 min.
  16. Centrifuger lysedprøverne (18.000 x g,8 min), og filtrer derefter gennem en 10 kDa-filtermembran.
  17. Filteret vaskes 4x med 100 μL vand.
  18. Lysatet overføres til en sort 96 brøndplade med flad bund, og fluorescensintensiteten måles på en pladelæser med excitation og emissionsbølgelængder, der er passende for fluorophoren (dvs. DMACA: λex = 400 nm, λem = 490 nm; NBD: λex = 475 nm, λem = 545 nm).
    BEMÆRK: Se figur 3 for eksempler på spektrofotometriske analyser af bakterier ved hjælp af det fluorescerende NBD-mærkede ciprofloxacin-antibiotikum.
  19. Til analyse ved flow cytometri, kan de samme vækst og farvning betingelser anvendes (trin 4.1-4.17), med ændringer udelukkende i den endelige forberedelse.
    1. Bring det samlede volumen til 1 ml PBS.
    2. Prøverne aflæses på et flowcytometer med en strømningshastighed på ca. 60 μL/min ved hjælp af logaritmisk forstærkning til dataindsamlingen (F1 excitation = 488 nm; emission = 525/20 nm).
    3. Optag i alt 10.000 hændelser, og analysér derefter dataene ved hjælp af passende software.
    4. Fluorescensintensiteten afbildes fra F1 i forhold til antallet af hændelsestal, idet den ansat medianenfluorescensintensitet fra histogrammets toppe efter at bakterierne var plettet.
      BEMÆRK: Se figur 4 for eksempler på flowcytometrianalyser af bakterier ved hjælp af det NBD-mærkede ciprofloxacin-antibiotikum.

5. Forberedelse til mikroskopisk analyse

  1. Dyrk subkulturer til OD600 = 0,4, som for MIC vurdering, derefter opdeles i 1 ml aliquots og centrifuge ved 18.000 x g i 3-5 min.
  2. Dekanter og kassér medier, og suspenderes derefter bakteriepellet igen i 500 μL HBSS.
  3. Centrifugeres ved 18.000 x g i 3 min. derefter dekantere og kassér medier.
  4. Klargør opløsninger af antibiotikasonder i HBSS i koncentrationer på 1-100 μM.
  5. Opslæm de vaskede bakterier i 500 μL af sondeopløsningen og inkuberes ved 37 °C i 30 min.
  6. Gentag trin 5.3. For en flere mærkning eksperiment, resuspendpellet i 500 μL af en orthogonally farvet nukleinsyre farvestof. For grøn, brug Syto9 (5 μM i HBSS); til blå, skal du bruge Hoechst 33342 (20 μg/ml i HBSS). Inkuberpå RT i 15-30 min.
  7. Trin 5.3 gentages derefter i 500 μL FM4-64FX (5 μg/ml i HBSS) og inkuber eskløs ved RT i 5 min.
  8. Gentag trin 5.3, og ophæng derefter i 500 μL HBSS, og gentag trin 5.3 igen.
  9. Gentag trin 5.8, og til sidst suspendere de vaskede, dyed bakterier i 15 μL monteringsmedium (se Tabel over materialer).
  10. Pipettemonteringsmedium på et mikroskopdias og top med en højtydende dæksel, og luk derefter kanter med klar neglelak.
    BEMÆRK: Se figur 5 for eksempler på konfokale mikroskopibilleder taget med NBD-mærket ciprofloxacin og trimethoprim antibiotika, og figur 6 for DMACA-mærket oxazolidinone (linezolid) antibiotika.

Representative Results

Figur 1 Illustrerer de vigtigste klik kemi reaktion (A) for fremstilling af fluorescerende antibiotika, og med (B) eksempler på strukturer af vores offentliggjorte fluorescerende antibiotika baseret på ciprofloxacin (cipro), trimethoprim (TMP), og linezolid. Disse sonder blev alle syntetiseret fra de tilsvarende antibiotika via en azide mellemliggende. De blev derefter koblet til NBD og DMACA fluorophores, hver funktionaliseret med en alkyne.

Figur 2 viser eksempel LCMS spor fra en ciprofloxacin-N3 og NBD-alkyne klik reaktion, hvor azide euted på 3,2 min og produktet på 3,8 min. Sammenligning 1 og 2 viser, hvordan udviklingen af klik reaktion kunne følges af forsvinden af azide peak (af UV eller MS detektor). Spectra 3 demonstrere virkningen af rensning, med fejlagtige toppe forsvinder fra MS og UV spor. Både renhed og reaktionsfremskridt kan kvantificeres ved integration af produkttoppen og eventuelle renhedsspidser.

Figur 3 viser typiske resultater af vurderingen af intracellulær akkumulering ved fluorescensspektroskopi i nærvær og fravær af efflux. I dette eksperiment blev E. coli behandlet med TMP-NBD med eller uden tilsætning af CCCP, som kollapser protonens drivkraft (PMF). Bakteriernes intracellulære fluorescens var betydeligt højere, når de blev forbehandlet med CCCP, hvilket indikerer, at efflux reducerede akkumuleringen i disse bakterier. Dette eksperiment blev gentaget ved hjælp af bakterier mangelfuld i tolC, viser kapaciteten af denne analyse til at undersøge virkningen af de enkelte efflux pumpe komponenter. I dette tilfælde, selv om der var en stigning i intracellulær fluorescens i forhold til den vilde type bakterier, CCCP ophobning stadig steget. Disse resultater viser, at TolC deltager i TMP efflux, men er ikke den eneste PMF-drev pumpe involveret.

Figur 4 viser resultatet af det samme eksperiment som figur 2, men med akkumuleringen målt ved flowcytometri i stedet for spektroskopi. De samme datatendenser blev observeret, hvilket viser, at begge teknikker kan anvendes til at undersøge fænomenet efflux medieret intracellulær akkumulering.

Figur 5 viser repræsentative konfokale mikroskopibilleder af grampositive (S. aureus) og gramnegative bakterier (E. coli) mærket med henholdsvis TMP-NBD (1) og cipro-NBD ( 2+ 3) fluorescerende sonder. I begge tilfælde blev det røde membranfarvestof FM4-64FX tilføjet for at sammenligne co-lokalisering. For TMP-NBD blev det blå nukleinsyrefarvefarve, Hoechst-33342 også anvendt. Ved at overlejre disse billeder blev lokaliseringen af antibiotika i bakterierne visualiseret. Sammenligning af paneler 2 og 3 viser, hvordan virkningen af efflux blev undersøgt, med efflux hæmmer CCCP anvendes i 2, hvilket resulterer i intracellulær akkumulering. I panel 3blev der ikke tilføjet nogen CCCP. Derfor er efflux aktiv, og ingen sonde ophobning blev set.

Figur 6 viser repræsentative konfokale mikroskopibilleder af Gram-positive (S. aureus)bakterier mærket med DMACA-mærket oxazolidinone sonde Lz-NBD. Den røde membran farvestof FM4-64FX blev tilføjet for at sammenligne co-lokalisering, og den grønne nukleinsyre farvestof Hoechst-33342 blev også brugt. Ved at overlejre disse billeder, lokalisering af antibiotika i bakterierne blev visualiseret, viser intern lokalisering adskiller sig fra membranen og nukleinsyre.

Tabel 1 viser MIC-værdier for tre serier af fluorescerende antibiotika, ciprofloxacin, trimethoprim (TMP) og linezolid (Lz), med data præsenteret for moderantibiotika, NBD og DMACA derivater af hver. Repræsentative arter for hvert antibiotikum blev valgt, herunder både gram-positiv og gram-negativ. For ciprofloxacin serien, begge fluorescerende sonder mistet antibiotikaaktivitet i forhold til moderselskabet stof, men beholdt nogle aktivitet mod alle arter. Tilsvarende linezolid sonder mistet nogle aktivitet, men forblev en moderat til svag antibiotikum. TMP sonder mistet næsten al aktivitet mod vilde type bakterier, men var aktive mod efflux mangelfuld E. coli, hvilket indikerer, at tabet af antibakterielaktivitet skyldtes manglende ophobning.

Figure 1
Figur 1: Syntese og strukturer af antibiotika-afledte sonder. A) Den generelle reaktionsordning for syntese af fluorescerende antibiotikasonder fra azid-antibiotika og alkyne-fluorophorer. (B) Strukturerne i vores offentliggjorte sonder baseret på ciprofloxacin, trimethoprim, og linezolid. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: MÅLING af antibiotikaafledt sonderenhed ved LCMS. Analytiske LCMS spor fra (1) ufuldstændige, (2) komplet, og (3) HPLC renset ciprofloxacin-N3 + NBD-alkyne klik reaktioner viser forsvinden af udgangsmateriale ved reaktionsafslutning, og diverse toppe på rensning. A = UV-Vis spor (absorbans ved 250 nm), B = MS spor (positiv og negativ tilstand). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Pladelæsermåling af antibiotikabaseret sondeakkumulering. Fluorescensspektroskopisk måling af cellulær akkumulering af TMP-NBD (50 μM) i vildtype (1, ATCC 25922) og ΔtolC (2, ATCC 25922) E. coli inkuberet (A) med ogb) uden tilsætning af CCCP (100 μM). Statistisk signifikans (**p ≤ 0,01; ***p ≤ 0,001) påvises mellem fraværet eller tilstedeværelsen af CCCP og mellem vildtype og ΔtolCE. coli. De indberettede data er den gennemsnitlige ± SD for tre forsøg. Dette tal er tilpasset fra vores tidligere publikation15, og illustrerer brugen af spektroskopi til at belyse den rolle, som efflux på intracellulære ophobning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Flow cytometri måling af antibiotika-afledt sonde ophobning. Flow cytometri måling af cellulær akkumulering ved hjælp af TMP-NBD i i vild type (1, ATCC 25922) og ΔtolC (2, ATCC 25922) E. coli inkuberet med og uden tilsætning af CCCP (100 μM). Medianfluorescensaktivitet påvises fra 10.000 bakteriehændelser, Statistisk signifikans (***, p ≤ 0,001; ****, p ≤ 0,0001) vises mellem fraværet og tilstedeværelsen af CCCP og mellem vildtype og ΔtolCE. coli. De indberettede data er den gennemsnitlige ± SD for tre forsøg. Dette tal er tilpasset fra vores tidligere publikation15, og illustrerer brugen af flow cytometri til at belyse den rolle, som efflux på intracellulære ophobning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Konfokal mikroskopivisualisering af NBD-sondelokalisering. Konfokale mikroskopi billeder af 1) levende S. aureus mærket med Hoechst-33342 (blå, nukleinsyre), TMP-NBD (grøn), FM4-64FX (rød, membran), og overlejret; 2) levende E. coli behandlet med CCCP (efflux hæmmer) mærket med cipro-NBD (grøn), FM4-64FX (rød, membran), og overlejret; 3) levende E. coli mærket med cipro-NBD (grøn), FM4-64FX (rød, membran), og overlejret. Dette tal er tilpasset fra vores tidligere publikationer15,16, og illustrerer brugen af mikroskopi til at undersøge sonde lokalisering, herunder virkningen af efflux. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Konfokal mikroskopivisualisering af DMACA-sondelokalisering. Konfokale mikroskopi billeder af levende S. aureus mærket med oxazolidinone sonde Lz-DMACA (blå), Sytox grøn (grøn, nukleinsyre), og FM4-64FX (rød, membran). Klik her for at se en større version af denne figur.

MIC (μg/ml)
Arter Stamme Cipro Cipro-NBD Cipro-DMACA Tmp TMP-NBD TMP-DMACA Linezolid (Lz) Lz-NBD Lz-DMACA
Staphylococcus aureus ATCC 25923 0.125 - 0.5 32 - ≥64 16 1 16 >64
ATCC 43300 1 16 >64
Streptococcus pneumoniae ATCC 700677 1 4 64
Enterococcus faecium ATCC 35667 1 - 8 32 32 - ≥64
ATCC 51559 2 16 32
Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 0.015 - 0.06 8 - 16 8 - 32
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 0.25 - 1 32 - ≥64 32 - ≥64
Escherichia coli delte et link. ATCC 25922 ≤0,004 8 2 0.5 >64 >64
Mutant ΔtolC 0.125 0.25 2

Tabel 1. Antibiotikaaktiviteter af fluorescerende antibiotika sonder baseret på ciprofloxacin, trimethoprim, og linezolid mod passende klinisk relevante bakterielle stammer, målt ved bouillon mikrodilution MIC analyser. I de fleste tilfælde mistede sonderne en vis aktivitet i forhold til moderlægemidlet, men beholdt en målelig antibiotikastyrke (tilstrækkelig til at være nyttige i yderligere undersøgelser).

Discussion

Oprettelsen af en vellykket fluorescerende antibiotika sonde skal begynde med omhyggelig planlægning og overvejelse af SAR af moderselskabet stof. Hvis SAR ikke er kendt eller fuldt udforsket, kan det være nødvendigt at teste flere muligheder for at finde et sted, der kan ændres selektivt uden at afskaffe biologisk aktivitet. Når et sted/erne er blevet identificeret, er det ofte vigtigt at installere et linker moiety for at give steric afstand mellem det biologiske virkningssted og den inaktive fluorophore. Man skal være omhyggelig med, at den reaktion, der anvendes til at fastgøre linkeren til antibiotikummet, efterlader en biostabil funktionel gruppe, der for eksempel undgår estere, der er modtagelige for spaltning af esteraser in vivo. Afhængigt af antibiotikumts farmakodynamiske og farmakokinetiske profil kan der anvendes en simpel alkyllinker, eller ser det ud til, at der er en mindre lipofile mulighed, såsom en polyethylenglycol (PEG). Med linker en vedhæftet, den antibakterielle aktivitet bør vurderes for at sikre MIC mod relevante bakterier svarer til den forælder sammensatte.

I dette arbejde anbefaler vi brug af Huigsen azide-alkyne [3+2] dipolar cycloaddition (klik kemi, se figur 1)til ligatfluorophore til antibiotika, af en række årsager. Klik reaktioner er meget selektiv, hvilket betyder, at beskyttelse af reaktive grupper på antibiotika ikke er nødvendig, og yderligere, reaktionen efterlader en stabil, biokompatibel triazol moiety. Azide komponent introduceres til antibiotika del i vores procedurer, da dette generelt er lettere at udføre med en række strukturelle typer end indførelsen af en alkyne. Synteterne af to alkyne-derivatiserede fluorophorer er beskrevet her, selv om andre kunne udforskes, hvis det ønskes. NBD og DMACA blev valgt på grund af deres lille størrelse, hvilket minimerede muligheden for at forstyrre celleindtrængning og målinteraktion. Selve klikreaktionen udføres ved hjælp af kobberkatalyse, hvor enten Cu2+ (CuSO4, med et ascorbinsyrereduktionsmiddel) eller Cu+ (CuI) kan anvendes som startreagens. Efter rensning (figur 2)bør mIC'erne derefter testes som med azide. Selv med nøje overvejelse af fluorophore valg og sted for fastgørelse, er det muligt, at dårlig antibiotikaaktivitet vil blive observeret. Dette betyder dog ikke, at en inaktiv sonde er uden brug. Som vist med TMP sonder, forbindelser med dårlig antibakteriel aktivitet kan stadig binde sig til det samme mål som moderselskabet stof. Dette kan gøre det muligt at undersøge virkningstilstanden og undersøge fænomener, der fører til resistens, såsom udstrømning.

Som beskrevet i afsnittet protokoller er det muligt at analysere bakteriel mærkning af fluorescerende antibiotika ved hjælp af enten en simpel spektrofotometrianalyse (figur 3) eller flowcytometri (figur 4). Begge metoder er i stand til at kvantificere cellulær akkumulering, og ved lysing celler og undersøge fluorescens lokalisering i lysate, er det muligt at vurdere intracellulære ophobning. I denne protokol beskrives brugen af lysozym til cellelyse, da dette er en hurtig, universel teknik. Andre lysis tilstande, såsom natten behandling med glycin-HCl7, er også blevet anvendt med succes. Ved hjælp af denne teknik, er det muligt at undersøge virkningen af efflux på antibiotika cellulære ophobning, som er en vigtig mekanisme af resistens. Hvis efflux er faktisk til stede i bakterier, en mangel på intracellulære ophobning vil blive observeret, selv om dette kan reddes ved hjælp af en efflux hæmmer som CCCP.

Mikroskopi kan også udføres for visuelt at inspicere sonde lokalisering i forskellige bakterier, samle oplysninger om virkningsmekanisme, og potentielt også modstand (se figur 5 for repræsentative eksempler). For at se lokalisering inden for bakterier kræves der et konfokalmikroskop med høj opløsning, der er udstyret med funktioner som SIM (struktureret belysningsmikroskopi), SR-SIM (superopløsning-SIM), Airyscan eller STED (stimuleret emissionsudtynding). Desuden bør der anvendes højtydende dæksedler, og der foretages analyse efter billedbehandling på en passende software (f.eks. Lokalisering af sonder sammenlignes med farvestoffer, der pletter specifikke arkitekturer, såsom Hoechst-33342 (blå, nukleinsyre), Syto-9 (grøn, nukleinsyre), og FM4-64FX (rød, membran). Valget af farvestoffer bør foretages for at matche fluorescerende antibiotika, således at hver farve, der anvendes har minimal spektrale overlapning. For at opnå de bedst mulige billeder kan optimering være påkrævet. For eksempel, hvis bakterier er for overfyldt på diaset, tage kun en del af den suspenderede pellet, derefter fortyndes med mere montering medium. I modsætning hertil, hvis bakterier er for sparsomme på diaset, skal du blot starte med flere bakterier. I denne protokol anbefales brugen af en termovenbar gel, der er kompatibel med levende celler (f.eks. Cygel), til levende cellebilleddannelse, da det immobiliserer bakterier (herunder motilebakterier), men andre monteringsmedier eller agarose er også blevet anvendt med succes.

Samlet set, på trods af udfordringer, der kan blive konfronteret med udarbejdelsen af en biologisk aktiv fluorescerende antibiotikaderivater, enkelheden i deres anvendelse og deres alsidighed gør disse sonder attraktive værktøjer til forskning i AMR. Fremtidigt arbejde med fluorescerende antibiotika har potentiale til at give indsigt i mekanismer af antibiotikaresistens, forbedre vores forståelse af, hvordan de nuværende antibiotika fungerer, og støtte udviklingen af bedre lægemidler.

Disclosures

Forfatterne har intet at erklære.

Acknowledgments

MRLS støttes af en australsk Postgraduate Award (APA) og et institut for Molecular Biosciences Research Advancement Award. Wanida Phetsang blev støttet af UQ International Scholarship (UQI) og IMB Postgraduate Award (IMBPA). MAC er en NHMRC princip forsker (APP1059354) og har også en fraktioneret professoriel forskning stipendiat udnævnelse på University of Queensland, med sin resterende tid som administrerende direktør for Inflazome Ltd, en virksomhed, der udvikler lægemidler til at løse kliniske uopfyldte behov i inflammatorisk sygdom. MATB støttes delvist af Wellcome Trust Strategic Grant WT1104797/Z/14/Z og NHMRC Development grant APP1113719. Mikroskopi blev udført på Australian Cancer Research Foundation (ACRF) / Institute for Molecular Bioscience Cancer Biology Imaging Facility, som blev etableret med støtte fra ACRF.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-(dimethylamino)phenol Alfa-Aesar B23067
4-chloro-7-nitro-benzofuran Sigma-Aldrich 163260-5G
Amicon Ultra-0.5 centrifugal filter unit with Ultracel- 10 membrane Merck UFC501096
Atlantis Prep T3 OBD (100 A, 5 uM, 10x250 mm) Waters 186008205
Atlantis T3 column (100 A, 5 uM, 2.1 × 50 mm) Waters 186003734
Bruker Avance 600 MHz spectrometer Bruker
Buchi Reveleris C18 12g Cartridge Buchi BUC145152103
CCCP Sigma-Aldrich C2759
Celite 545 Sigma-Aldrich 22140-5KG-F
Cygel ABCAM Ab109204
Elyra PS,1 SIM/STORM confocal microscope Zeiss
FM4-64FX, fixable analog of FM™ 4-64 membrane stain Life Technologies Australia Pt F34653
Gallios flow cytometer Beckman Coulter
Gamma 2-16 LSCplus lyophilise CHRIST
Gilson HPLC 2020 Gilson
Hanks' Balanced Salt solution, Modified, with sodium bicarbonate, without phenol red, calcium chloride and magnesium sulfate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture Sigma-Aldrich H6648-500ML
Hettich Zentrifugen Rotofix 32 Hettich
High performance #1.5 cover slips (18 x 18 mm) Schott/Zeiss 474030-9000-000
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - Fluo Life Technologies Australia Pt H21492
LB AMRESCO J106
Leica STED 3X Super Resolution Microscope with White Light Laser excitation Leica
Lysozyme from chicken egg white
lyophilized powder		 Sigma-Aldrich L6876
Mueller Hinton II Broth Cation adjusted Becton Dickinson 212322
Propargylamine Sigma-Aldrich P50900-5G
Reveleris GRACE MPLC Buchi
Shimadzu LCMS-2020 Shimadzu
Sigma 1-15 Microcentrifuge Sigma-Aldrich
Silica gel 60 (0.040-0.063 mm) for column chromatography (230-400 mesh ASTM) Merck 1093859025
SYTO 9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain Life Technologies Australia Pt S34854
TECAN Infinite M1000 PRO TECAN

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cai, H., Rose, K., Liang, L. H., Dunham, S., Stover, C. Development of a liquid chromatography/mass spectrometry-based drug accumulation assay in Pseudomonas aeruginosa. Analytical Biochemistry. 385 (2), 321-325 (2009).
  2. Bhat, J., Narayan, A., Venkatraman, J., Chatterji, M. LC-MS based assay to measure intracellular compound levels in Mycobacterium smegmatis: Linking compound levels to cellular potency. Journal of Microbiological Methods. 94 (2), 152-158 (2013).
  3. Davis, T. D., Gerry, C. J., Tan, D. S. General Platform for Systematic Quantitative Evaluation of Small-Molecule Permeability in Bacteria. ACS Chemical Biology. 9 (11), 2535-2544 (2014).
  4. Richter, M. F., et al. Predictive compound accumulation rules yield a broad-spectrum antibiotic. Nature. 545, 299 (2017).
  5. Iyer, R., et al. Evaluating LC-MS/MS To Measure Accumulation of Compounds within Bacteria. ACS Infectious Diseases. 4 (9), 1336-1345 (2018).
  6. Prochnow, H., et al. Subcellular Quantification of Uptake in Gram-Negative Bacteria. Analytical Chemistry. 91 (3), 1863-1872 (2019).
  7. Dumont, E., et al. Antibiotics and efflux: combined spectrofluorimetry and mass spectrometry to evaluate the involvement of concentration and efflux activity in antibiotic intracellular accumulation. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 74 (1), 58-65 (2019).
  8. Stone, M. R. L., Butler, M. S., Phetsang, W., Cooper, M. A., Blaskovich, M. A. T. Fluorescent Antibiotics: New Research Tools to Fight Antibiotic Resistance. Trends in Biotechnology. 36 (5), 523-536 (2018).
  9. Piddock, L. J. V., Johnson, M. M. Accumulation of 10 fluoroquinolones by wild-type or efflux mutant Streptococcus pneumoniae. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (3), 813-820 (2002).
  10. Mortimer, P. G. S., Piddock, L. J. V. A comparison of methods used for measuring the accumulation of quinolones by enterobacteriaceae, pseudomonas aeruginosa and staphylococcus aureus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 28 (5), 639-653 (1991).
  11. Li, X. Z., Nikaido, H., Poole, K. Role of MexA-MexB-OprM in antibiotic efflux in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (9), 1948-1953 (1995).
  12. Vince, R., Weiss, D., Pestka, S. Binding of N-substituted erythromycylamines to ribosomes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 9 (1), 131-136 (1976).
  13. Vazquez, D. Antibiotics affecting chloramphenicol uptake by bacteria Their effect on amino acid incorporation in a cell-free system. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Nucleic Acids and Protein Synthesis. 114 (2), 289-295 (1966).
  14. Phetsang, W., et al. An azido-oxazolidinone antibiotic for live bacterial cell imaging and generation of antibiotic variants. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 22 (16), 4490-4498 (2014).
  15. Phetsang, W., et al. Fluorescent trimethoprim conjugate probes to assess drug accumulation in wild type and mutant Escherichia coli. ACS Infectious Diseases. 2 (10), 688-701 (2016).
  16. Stone, M. R. L., et al. Fluoroquinolone-derived fluorescent probes for studies of bacterial penetration and efflux. MedChemComm. 10 (6), 901-906 (2019).

Tags

Immunologi og infektion antibiotikum resistens bakterier efflux fluorescerende mikroskopi
Visualisering af bakteriel resistens ved hjælp af fluorescerende antibiotika sonder
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stone, M. R. L., Phetsang, W.,… More

Stone, M. R. L., Phetsang, W., Cooper, M. A., Blaskovich, M. A. T. Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes. J. Vis. Exp. (157), e60743, doi:10.3791/60743 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter