Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Visualisering av bakteriell resistens ved hjelp av fluorescerende antibiotikasonder

doi: 10.3791/60743 Published: March 2, 2020

Summary

Fluorescerende merkede antibiotika er kraftige verktøy som kan brukes til å studere flere aspekter av antimikrobiell resistens. Denne artikkelen beskriver utarbeidelsen av fluorescerende merket antibiotika og deres anvendelse for å studere antibiotikaresistens hos bakterier. Sonder kan brukes til å studere mekanismer for bakteriell resistens (f.eks. efflux) ved spektrofotometri, flytcytometri og mikroskopi.

Abstract

Fluorescerende antibiotika er flerbruksforskningsverktøy som lett brukes til studiet av antimikrobiell resistens, på grunn av deres betydelige fordel over andre metoder. For å forberede disse sondene syntetiseres azidederivater av antibiotika, deretter kombinert med alkyne-fluoropforer ved hjelp av azide-alkyne dipolar cycloaddition ved klikkkjemi. Etter rensing testes antibiotikaaktiviteten til fluorescerende antibiotika ved minimum hemmende konsentrasjonsvurdering. For å studere bakteriell akkumulering kan enten spektrofototri eller flytcytometri brukes, noe som gjør det mulig for mye enklere analyse enn metoder som er avhengige av radioaktive antibiotikaderivater. Videre kan konfokal mikroskopi brukes til å undersøke lokalisering i bakteriene, og gir verdifull informasjon om handlingsmåte og endringer som oppstår hos resistente arter. Bruk av fluorescerende antibiotikasonder i studien av antimikrobiell resistens er en kraftig metode med mye potensial for fremtidig ekspansjon.

Introduction

Antimikrobiell resistens (AMR) er en stigende krise som utgjør en stor trussel mot menneskers helse rundt om i verden. Resistens mot de fleste antibiotika er rapportert, og infeksjoner forårsaket av bakterier som er resistente mot alle klinisk tilgjengelige legemidler, oppstår. For å bekjempe fremveksten av AMR, må vi øke vår forståelse av dette mangefasetterte fenomenet og de underliggende mekanismene og interaksjonene mellom antibiotika og bakterier. Et aspekt som historisk er dårlig forstått, er permeasjonen av antibiotika til bakterier, sammen med fenomenene akkumulering og efflux. Denne kunnskapen er avgjørende for å designe nye stoffer og forstå motstandsmekanismer. Derfor spiller dette en kritisk rolle i AMR-forskning.

Det er to hovedtilnærminger som kan tas for å måle antibiotikakonsentrasjon: måle stoffet direkte eller tagge med et moiety designet for å lette kvantifisering. Selv om merking av antibiotika forbedrer deteksjon, dette kan perturb den biologiske aktiviteten til stoffet, som antimikrobiell aktivitet og permeabilitet. Dette er ikke et problem for ikke-kodede metoder; Deteksjon kan imidlertid være utfordrende. I de siste årene har teknologiske fremskritt ført til en boom i forskning utnytte massespektrometri (MS) å direkte måle antibiotikakonsentrasjonen i bakterier1,2,3,4,5,6,7. Disse studiene har vist at det er mulig å studere intracellulær akkumulering hos en rekke bakterier, med gramnegative bakterier som er mest studert. Kvantifisering av molekylpermeabilitet har da vært knyttet til aktivitet og brukes til å informere legemiddelutvikling2,3,4, men forsiktighet må tas når direkte konflatering og målaktivitet5. Før MS utvikling, de eneste antibiotika hvis konsentrasjon kunne måles direkte var de som har iboende fluorescens, som tetracyklin og quinolones8,9,10,11. Selv om det åpenbart var begrenset i omfang, ble akkumulering og efflux undersøkt og kvantifisert, noe som illustrerer nytten av fluorescensbasert kvantifisering.

Tagged antibiotika har blitt brukt i mange tiår for å studere distribusjoner, virkningsformer og resistens, med radioaktive og fluorescerende koder er vanlig. Radiomerkede sonder har fordelen av å være nesten identisk med den overordnede forbindelsen, derfor er den biologiske aktiviteten usannsynlig å være betydelig annerledes. Isotoper som 3H, 14C og 15N har blitt ofte brukt på grunn av fremtredende av disse elementene i antibiotika, og en rekke antibiotika stillas har blitt undersøkt1,10,12,13. Selv om påvisning av radiosonder er enkel, er det en rekke logistiske bekymringer (f.eks. sikkerhet, isotop halveringstid) som har begrenset bruken av denne tilnærmingen. En annen strategi er fluorescerende-merket antibiotika. Disse sondene kan brukes til å undersøke distribusjon og virkningsformer og motstand av moderstoffet, ved hjelp av enklere teknologi enn MS og uten logistiske problemer med stråling8. Den største ulempen med denne tilnærmingen er at antibiotika er generelt relativt små molekyler, derav innføringen av en fluorescerende moiety utgjør en betydelig kjemisk endring. Denne endringen kan påvirke fysiokjemiske egenskaper og antibakteriell aktivitet. Det må derfor utvises forsiktighet for å vurdere disse faktorene for å generere resultatrepresentant for foreldreantibiotika.

I dette arbeidet er en metode beskrevet for å syntetisere, vurdere og bruke fluorescerende antibiotika, som i våre tidligere publikasjoner14,15,16. Gjennom tidligere arbeid har en rekke fluorescerende antibiotika blitt utarbeidet og brukt til en rekke formål (se Stone et al.8). For å minimere sannsynligheten for å påvirke biologisk aktivitet, brukes svært små fluoropforer i dette arbeidet: nitrobenzoksadiazol (NBD, grønn) og 7-(dimetylamino)-2-oksokso-2H-chromen-4-yl (DMACA, blå). Videre er vurderingen av antibakteriell aktivitet ved hjelp av mikrobroth fortynning minimum hemming konsentrasjon (MIC) analyse beskrevet, slik at effekten av modifikasjoner på aktivitet kan måles. Disse fluorescerende merkede sondene kan brukes i spektrofotometriske analyser, flytcytometri og mikroskopi. Utvalget av mulige anvendelser er hvor fordelen med fluorescerende antibiotika ligger. Cellulær akkumulering kan kvantifiseres, kategoriseres og visualiseres, noe som ikke er mulig å bruke MS alene. Det er håpet at kunnskapen som oppnås gjennom bruk av fluorescerende antibiotika vil hjelpe til med vår forståelse av resistens, og kampen mot AMR.

Protocol

1. Syntese av Alkyne-fluoropforer

  1. Syntese av NBD-alkyne (7-nitro-N-(prop-2-yn-1-yl)benzo[ c ][1,2,5]oxadiazol-4-amine)
    1. Oppløs 1031 mg 4-kloro-7-nitro-benzofuran (5.181 mmol) i 60 ml tetrahydrofuran (THF). Tilsett 1857 mg CsCO3 (5.696 mmol), deretter 0,39 ml propargylamin (6,1 mmol). Varm reaksjonen på 50 °C i 2 timer, som vil bli fra brun til grønn, og avkjøl deretter til romtemperatur (RT).
    2. Filtrer reaksjonen ved hjelp av et filtreringsmiddel (se Materialtabell)og vask med etylacetat (EA). Konsentrer filtratet under redusert trykk, og løs deretter rester i 150 ml EA og flytt til en 500 ml skilletrakt.
    3. Vask EA-oppløsningen med henholdsvis 100 ml med vann og saltlake. Deretter kombinerer de vandige fasene og vask 2x med 100 ml EA.
    4. Tørk de kombinerte organiske fasene over vannfri magnesiumsulfat, og filtrer og konsentrat under redusert trykk.
    5. Rens det råproduktet ved flashkromatografi på silikagel (20–30 % EA i petroleumseter [PE]), kontroll av renhet ved flytende kromatografimassespektrometri (LCMS, [M+H]+ = 219,1) og/eller kjernefysisk magnetisk resonans (NMR) spektroskopi, kjemiske skift som følger:
      1.1 11 H NMR (CD3OD, 600 MHz) δ 8,54 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 6,35 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 4,31 (dd, J = 5,7 Hz, J = 2,5 Hz, 2H), 2,43 (t, J = 2,5 Hz, 1H); 13.13 til 13 C NMR (CD3OD, 150 MHz) δ 144,3, 143,7, 142,2, 135,8, 125,7, 100,0, 76,5, 74,2, 33,4.
      MERK: Når du utfører rensing ved silikagelkromatografi, klargjør du kolonnen ved hjelp av den mindre polare av løsemidlene som er oppført. Råolje forbindelsen kan enten lastes som en konsentrert løsning eller adsorbed på silikaen hvis løselighet ikke tillater det. Etter at forbindelsen er lagt til toppen av silikaen, kjør gjennom 1-2 kolonnevolumer av samme løsemiddel som brukes til silikafukting. Start deretter med løsemiddelforholdet oppført, kjører gjennom minst 1 kolonne volum av hvert løsemiddel, og sørg for å ikke gjøre store hopp i løsemiddelsammensetning. Samle brøker, og kontroller renhet/identitet ved HJELP av LCMS eller TLC (tynt lagkromatografi). Kombiner rene brøker og konsentrat under redusert trykk ved roterende fordampning.
  2. Syntese av DMACA-alkyne (2-(7-(dimetylamino)-2-oksyno-2H-kromosom-4-yl)-N-(prop-2-yn-1-yl)acetamid).
    1. Oppløs 5,02 g 3-(dimetylamino)fenol (36,6 mmol) i 30 ml etanol, og tilsett deretter 6,7 ml diethyl 1,3-acetonedicarboxylate (36 mmol). Legg til 10,5 g ZnCl2 (77,2 mmol), og refluk sluk deretter den røde løsningen i 42 timer. Legg til ytterligere 9,20 g ZnCl2 (67,6 mmol), og refluks deretter i 8 timer.
    2. Avkjøl reaksjonen og konsentratet under redusert trykk. Spre den resulterende røde fasten i 200 ml EA, filter, og overfør deretter til en 500 ml skilletrakt.
    3. Vask EA med 200 ml hver vann og saltlake, og tørk deretter over vannfri magnesiumsulfat. Filtrer den tørkede organiske fasen og konsentrat under redusert trykk.
    4. Rens det røde fastfaststoff (etyl 2-(7-(dimetylamino)-2-oksy-2H-kromoen-4-yl)acetat) ved flashkromatografi på silikagel (0–100% EA i PE), kontroll av renhet med LCMS ([M+H]+ = 275,1) og/eller NMR, kjemiske skift som følger:
      1.1 11 H NMR (CDCl3, 600 MHz) δ 7,30 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 6,52 (dd, J = 8,9 Hz, J = 2,6 Hz, 1H), 6,40 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 5,87 (m, 1H), 2,96 (m, 8H), 2,25 (d, J = 1,2 Hz, 3H).
    5. Oppløs 488 mg etyl 2-(7-(dimetylamino)-2-oksokso-2H-kromosom-4-yl)acetat (1,18 mmol) i 10 ml THF, og tilsett deretter en løsning på 157 mg LiOH· H2O (3,74 mmol) i 15 ml vann. Rør reaksjonen ved RT i 3 timer, og flytt deretter til en separattrakt og fortynn med ytterligere 50 ml vann.
    6. Vask reaksjonsblandingen 2x med 50 ml diethyleter (Et2O), vask deretter den kombinerte organiske fase 2x med 25 ml vann. Ta noen gule utfellinger med det organiske laget. Konsentrer den organiske fasen under redusert trykk ved hjelp av en roterende fordamper.
    7. Surgjør den vandige fasen til pH = 2 med konsentrert HCl, og avkjøl til 4 °C over natten. Filtrer den sure vandige fasen og tilsett det gule fastet i den konsentrerte organiske fasen.
      MERK: 2-(7-(dimetylamino)-2-oksy-2H-kromok-4-yl)eddiksyre kan brukes uten ytterligere rensing, men dette kan kontrolleres av LCMS ([M+H]+ = 247.1) og/eller NMR, kjemiske skift som følger:
      1.1 11 H NMR (CDCl3, 600 MHz) δ 7,41 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 6,62 (dd, J = 9,2 Hz, J = 2,8 Hz, 1H), 6,52 (d, J = 2,8 Hz, 1H), 5,98 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 3,05 (s, 6H), 2,35 (d, J = 0,9 Hz, 2H); 13.13 til 13 C NMR (CDCl3, 150 MHz) δ 162.2, 155.7, 152.9, 152.8, 125.3, 109.7, 109.3, 109.1, 108.8, 98.3, 40.2, 18.5.
    8. Oppløs 466 mg 2-(7-(dimetylamino)-2-oksy-2H-kromosom-4-yl)eddiksyre (1,89 mmol) i 7 ml tørr N,N-dimetylformamid (DMF) og plasser under en atmosfære av nitrogen.
    9. Løs opp 0,33 ml propargylamin (5,1 mmol) i 7 ml tørr DMF under nitrogen. Tilsett 1,30 ml di-isopropylethyl amin (DIPEA, 7,50 mmol) til dyeoppløsningen, deretter 535 mg O-(1H-6-klorobenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium heksafluorophospfat (HCTU, 1,29 mmol). Rør den aktiverte hellløsningen i 15 min ved RT, tilsett deretter aminløsningen dråpevis, og la den røre over natten.
    10. Neste dag fortynner du reaksjonen med 35 ml vann og konsentrerer seg under redusert trykk.
    11. Partisjoner den resulterende oransje fast mellom EA og saltlake (100 ml hver) i en 250 ml skilletrakt. Skill lagene (kjør de to lagene i forskjellige flasker), og vask den vandige fasen med 100 ml EA.
    12. Konsentrer de kombinerte organiske fasene under redusert trykk, og oppløs deretter den oransje fastheten i 3 ml acetonitrile (ACN)/vann (v/v). Rens det råproduktet ved å injisere på et omvendt fasemedium trykk flytende kromatografi (MPLC) system utstyrt med en C18 patronkolonne (løsningsmiddel A: vann, oppløsningsmiddel B: ACN).
    13. Kontroller fraksjoner for renhet ved LCMS ([M+H]+ = 284.1, NMR kjemiske skift gitt nedenfor), og kombiner og lyofilize passende fraksjoner for å gi 2-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)-N-(prop-2-yn-1-yl)acetamide, NMR kjemiske skift som følger:
      1.1 11 H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 8,65 (t, J = 5,4 Hz, 1H), 7,52 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 6,72 (dd, J = 9,1, 2,6 Hz, 1H), 6,55 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 6,00 (s, 1H), 3,88–3,87 (m, 2H), 3,62 (s, 2H), 3,13 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 3,01 (s, 6H); 13.13 til 13 C NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ 167,7, 160,7, 155,4, 152,9, 151,0, 126,0, 109,4, 109,1, 108,1, 97,5, 80,9, 73,3, 39,7, 38,4, 28,2.

2. Syntese av fluorescerende antibiotika

  1. Forbered et azidederivat av et antibiotikum som beskrevet tidligere14,15,16.
    MERK: Prosedyren er spesifikk for hvert antibiotikum og krever nøye undersøkelse av strukturaktivitetsforholdet (SAR) til det overordnede molekylet for å sikre at det funksjonaliserte antibiotika beholder aktiviteten som kan sammenlignes med forelderen. (f.eks. ciprofloksacin16, linezolid14og trimethoprim15). Se figur 1 for eksempler på publiserte fluorescerende antibiotika, og den generelle synteseordningen.
  2. Klikk reaksjonsprosedyre A
    MERK: For de fleste antibiotika følger du prosedyren som er beskrevet her for kobberkatalysert Huisgen [2+3] cycloaddition av azide (trinn 2.1) og fluorescerende alkyne (utarbeidet i trinn 1).
    1. Plasser azide-antibiotika i en rund bunnkolbe og tilsett tert-butanol(tBuOH) og vann (1:1 v/v, 25 ml hver per mmolazid).
    2. Tilsett fluorophore-alkyne tilberedt i trinn 1.1 (3 eq.) og varm reaksjonen på 50 °C. Deretter tilsett kobbersulfat (100 mM i vann, 0,6 eq.) til reaksjonen, etterfulgt av askorbinsyre (500 mM i vann, 2,4 eq.).
    3. Rør reaksjonen ved 50 °C i 1 t, eller til analyse av LCMS ved indikasjon på reaksjonsfullføring (fullstendig forbruk av startazid).
    4. Avkjøl reaksjonen og rense som passer for antibiotikastillaset og fortsett for rensing enten i trinn 2.3 eller 2.4.
      MERK: Flere ulike rensemetoder er mulige, avhengig av polariteten og stabiliteten til stillaset.
  3. Klikk reaksjonsprosedyre B
    MERK: Følg denne prosedyren for peptidbaserte antibiotika, for å gi sterkere reaksjonsforhold (upublisert arbeid, Phetsang, 2019).
    1. Plasser peptidazide-antibiotika i en rund bunnkolbe og tilsett nok DMF (750 ml/mmol azide) til å oppløses.
    2. Tilsett fluorophore-alkyne tilberedt i trinn 1 (5 eq.) og varm reaksjonen på 50 °C i 1 t.
    3. Tilsett kobber (I) jodid (20 eq.), deretter DIPEA (120 eq.), deretter eddiksyre (240 eq.).
    4. Rør reaksjonen ved 50 °C i 1 t, eller til analysen med LCMS indikerer at reaksjonsfullføring (dvs. fullstendig forbruk av startazid). Avkjøl reaksjonen og fortsett for rensing ved metode 1 (se trinn 2.3).
  4. Rensemetode 1 (brukes til ciprofloxacin, trimethoprim og linezolid)
    1. Injiser den avkjølte klikkreaksjonen direkte på en MPLC C18-patronkolonne.
    2. Innlemme en lang vaskefase (omtrent 10 min) i begynnelsen av løpet (100% løsemiddel A), deretter kjøre en gradient opp til 100% løsemiddel B, etterfulgt av en retur til løsemiddel A.
      MERK: Løsemiddel A kan velges fra vann, 0,05–0,1 % maursyre (FA) i vann, 0,05–0,1 % trifluoreddiksyre (TFA) i vann, avhengig av løselighet, stabilitet og den beste oppløsningen av topper. Løsemiddel B kan velges fra acetonitrile (ACN), 0,05–0,1 % FA i ACN, 0,05–0,1 % TFA i ACN, for å matche løsemiddel A. Hvis elution viser seg vanskelig, kan metanol brukes i stedet for ACN.
    3. Samle og kombinere passende fraksjoner, som angitt av LCMS og farge (riktig masse sett, entall topp), deretter lyofilize å gi (semi) ren fluorescerende antibiotika.
    4. Renk produktet ytterligere ved behov. Vurder renhet ved nmr og/eller LCMS og høytrykks flytende kromatografi (HPLC), ved hjelp av en kolonne og metode som passer for stillaset.
  5. Rensemetode 2
    MERK: Hvis løselighet tillater det, kan prepurifisering utføres av vandig workup (brukes til makrolider, upublisert arbeid, Stone 2019).
    1. Fortynn den avkjølte klikkreaksjonen med vann og Et2O (1:1 v/v, ca. 10 ganger fortynning fra det første reaksjonsvolumet), og overføring til en passende størrelse som skiller trakt.
    2. Skill lagene og vask den vandige fasen to ganger med Et2O.
    3. Vask de kombinerte organiske fasene 2x med vann (likt volum med organisk fase), og tørk deretter over Na2SO4.
    4. Filtrer den tørkede organiske fasen og konsentrat under redusert trykk.
    5. Rens råoljeproduktet fra MPLC og/eller HPLC som beskrevet i trinn 2.4.4.
      MERK: Se figur 2 for eksempler på ufullstendige, fullstendige og rensede klikkreaksjon LCMS-spor. Typiskrensede utbytter for antibiotikafluoropforklikkreaksjonene varierer fra 30–80 %.
      FORSIKTIG: De fleste kjemikaliene som brukes i disse syntetene har spesifikke sikkerhetsfarer. Forsiktighet må utvises til enhver tid, inkludert bruk av personlig verneutstyr. Et2O, tBuOH, FA, eddiksyre, PE, EA, THF, ACN, DMF, EtOH, DIPEA, propargylamine og HCTU er alle brannfarlige; unngå kontakt med varme- eller gnistkilder. THF, propargylamin, DIPEA, tBuOH, FA, DMF og PE er alle giftige; unngå eksponering. Propargylamine, CsCO3,ZnCl2,LiOH-H2O, DIPEA, CuI, FA, eddiksyre og HCl er alle korrosive; unngå kontakt og vær oppmerksom på overflatekontakt. ZnCl2,CuSO4,CuI og PE presenterer miljøfarer; vær oppmerksom på avhendingsforhold. THF kan danne eksplosive peroksider; vær forsiktig med lagringsforholdene. Organiske azider er eksplosive; vær spesielt forsiktig med storskala produksjon.

3. Evaluering av antimikrobiell aktivitet

MERK: Alt arbeid som involverer bakterier bør utføres under sterile forhold for å unngå kontaminering av analysen eller laboratoriet. Alle medier skal autoklasperes før bruk, og plastutstyr og utstyr som pipetter må holdes sterilt. Det anbefales at arbeidet utføres i en biocontainment hette (type 2).

  1. Streak glycerol bestander av bakterielle stammer som passer for antibiotika stillas på lysogeny kjøttkraft agar (LB, utarbeidet per produsentens instruksjoner), og vokse over natten ved 37 ° C.
    MERK: Valget av bakterier for å teste antibakteriell aktivitet må gjøres basert på antibiotikastillaset som brukes. Et representativt utvalg på 5-10 bakterier bør velges fra artene som er kjent for å være utsatt for antibiotika, med hensyn til laboratoriets logistiske evner. Hvis det er mulig, bør resistente bakterier også testes. Protokollen nedenfor vil fungere på de fleste bakterier, men sjekk om spesielle forhold er nødvendig (f.eks CO2, spesielle medier) og gjøre endringer etter behov. Bakterier som er vellykket utsår ved hjelp av disse forholdene inkluderer Staphylococci, Streptococci, Bacilli, E. coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa og Enterococcus faecium.
  2. Velg en enkelt koloni fra platen, og kultur over natten i 5 ml av kationjustert Mueller-Hinton Broth (CAMHB, utarbeidet per produsentens instruksjoner) ved 37 °C.
  3. Fortynn overnattingskulturene ~ 40 ganger i CAMHB og vokse til en midt-logg fase, optisk tetthet på 600 nm (OD600) = 0,4-0,8, volum 5 ml).
  4. Forbered lagerløsninger av hvert fluorescerende antibiotika ved 1,28 mg/ml i sterilt vann, og pipette 10 μL antibiotika til den første kolonnen i en 96 brønnplate.
  5. Tilsett 90 μL CAMHB i den første kolonnen og 50 μL til alle andre brønner. Deretter utfører du seriell 2-fold fortynning over platen.
  6. Bland grundig, deretter fortynne midtloggfasekulturer til ~ 106 kolonidannende enheter (CFU) / ml og tilsett 50 μL til alle brønner, for å gi en endelig konsentrasjon på ~ 5 x 105 CFU / ml.

    volum av kultur (ml) = (medievolum i ml)/(OD600 x 1000)

    f.eks. for en OD600 = 0,5 kultur i et ønsket medievolum på 12 ml, legg til (12/(0,5 x 1000) = 0,024 ml kultur til 12 ml medier
  7. Dekk platene med lokk og inkubator ved 37 °C i 18–24 timer uten risting.
  8. Inspiser platene visuelt, og MIC er den laveste konsentrasjonen godt uten synlig vekst.
    MERK: Se tabell 1 for noen eksempler på aktive og inaktive fluorescerende antibiotika.

4. Analyse av probeakkumulering av Spektrofotometri og Flow Cytometri

MERK: Disse sentrifugeringstidene er optimalisert for E. coli, så små endringer kan være nødvendig for andre arter. Representative data for sondeakkumulering rapporteres for den NBD-merkede ciprofloksacinsonden.

  1. Streak glyserol bestander av bakteriestammer på LB agar og vokse over natten på 37 ° C.
  2. Velg en enkelt koloni fra tallerkenen og kulturen over natten i LB ved 37 °C.
  3. Fortynn over natten kulturer ~ 50 ganger i media og vokse til midten av loggfasen (OD600 = 0,4-0,8).
  4. Sentrifuge kulturene på 1470 x g for 25 min og dekantere media.
  5. Resuspender bakteriene i 1 ml fosfatbufret saltvann (PBS), og sentrifuge på 1470 x g i 15 min.
  6. Dekanter media og resuspender de vasket pellets i PBS til en endelig OD600 = 2.
  7. Om ønskelig, tilsett 10,1 μL karbonylcyanid 3-klorylhydrazon (CCCP, 10 mM i PBS) til 1 ml bakterier (endelig konsentrasjon 100 μM) og inkubator ved 37 °C i 10 min.
    MERK: CCCP er en efflux pumpehemmer. Tillegg av CCCP vil tillate undersøkelse av virkningen av efflux.
  8. Sentrifuge kulturene på 18.000 x g for 4 min ved 20 °C og dekantere media.
  9. Tilsett 1 ml fluorescerende antibiotikaoppløsning (10–100 μM i PBS) til pelleten, og inkuber ved 37 °C i 30 min.
  10. Sentrifuge kulturene på 18.000 x g for 7 min ved 4 °C og dekantere media.
  11. Resuspender bakteriene i 1 ml kald PBS, og gjenta trinn 4,9.
  12. Gjenta trinn 4,10 totalt 4x.
  13. Hvis ønskelig, lyse bakterier ved å legge til 180 μL lysel lysis buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8.0 og 2 mM natrium EDTA) deretter 70 μL lysozyme (72 mg/ml i H2O).
  14. Inkuber ved 37 °C i 30 min, deretter fryse-tine 3x (−78 °C i 5 min, deretter 34 °C for 15 min).
  15. Sonikere prøvene i 20 min, og varm deretter til 65 °C i 30 min.
  16. Sentrifuge lysed prøvene (18.000 x g, 8 min), deretter filtrere gjennom en 10 kDa filtermembran.
  17. Vask filteret 4x med 100 μL vann.
  18. Overfør lysattil en flat-bunn svart 96 brønnplate og mål fluorescensintensiteten på en plateleser med eksitasjon og utslippsbølgelengder som passer for fluoropforene (dvs. DMACA: λex = 400 nm, λem = 490 nm; NBD: λex = 475 nm, λem = 545 nm).
    MERK: Se figur 3 for eksempler på spektrofotoriske analyser av bakterier ved hjelp av fluorescerende NBD-merket ciprofloksacinantibiotika.
  19. For analyse etter flytcytometri kan samme vekst- og fargeforhold brukes (trinn 4.1–4.17), med endringer utelukkende i det endelige preparatet.
    1. Ta det totale volumet til 1 ml PBS.
    2. Les prøver på et strømningscytometer med en strømningshastighet på ca. 60 μL/min, ved hjelp av logaritmisk forsterkning for datainnhentingen (F1 eksitasjon = 488 nm; utslipp = 525/20 nm).
    3. Registrer totalt 10 000 hendelser, og analyser deretter dataene ved hjelp av riktig programvare.
    4. Plott fluorescensintensiteten fra F1 mot antall hendelser teller, estimere median fluorescensintensitet fra histogrammet toppene etter at bakteriene ble farget.
      MERK: Se figur 4 for eksempler på flytende cytometrianalyser av bakterier ved hjelp av NBD-merket ciprofloksacinantibiotika.

5. Forberedelse til mikroskopisk analyse

  1. Dyrke subkulturer til OD600 = 0,4, som for MIC vurdering, deretter dele inn i 1 ml aliquots og sentrifuge på 18.000 x g for 3-5 min.
  2. Dekanter og kast medier, og deaktiver deretter bakteriell pellet på nytt i 500 μL HBSS.
  3. Sentrifuge på 18.000 x g i 3 min, deretter dekantere og kaste media.
  4. Forbered løsninger av antibiotikasonder i HBSS ved konsentrasjoner på 1–100 μM.
  5. Resuspender de vasket bakteriene i 500 μL av sondeoppløsningen, og inkuber ved 37 °C i 30 min.
  6. Gjenta trinn 5.3. For et eksperiment med flere merkinger, må pelleten på nytt i 500 μL av et ortogonalt farget nukleinsyrefarge. For grønt, bruk Syto9 (5 μM i HBSS); for blå, bruk Hoechst 33342 (20 μg/ml i HBSS). Inkubator ved RT i 15-30 min.
  7. Gjenta trinn 5.3, deretter resuspendere i 500 μL fm4-64FX (5 μg/ml i HBSS) og inkuber på RT i 5 min.
  8. Gjenta trinn 5.3, deretter resuspenderi 500 μL HBSS, og gjenta trinn 5.3 igjen.
  9. Gjenta trinn 5.8, og stopp deretter de vasket, møkkebakteriene i 15 μL monteringsmedium (se Materialtabell).
  10. Pipettemonteringsmedium på et mikroskoplysbilde og topp med en høy ytelsesdekselslip, og forsegle deretter kantene med klar neglelakk.
    MERK: Se figur 5 for eksempler på konfokal mikroskopibilder tatt med NBD-merket ciprofloxacin og trimethoprim antibiotika, og figur 6 for DMACA-merket oksazolidinon (linezolid) antibiotika.

Representative Results

Figur 1 Illustrerer den viktigste klikkkjemireaksjonen (A) for fremstilling av fluorescerende antibiotika, og med (B) eksempler på strukturer av våre publiserte fluorescerende antibiotika basert på ciprofloxacin (cipro), trimethoprim (TMP) og linezolid. Disse sondene ble alle syntetisert fra tilsvarende antibiotika via en azide mellomliggende. De ble deretter koblet til NBD og DMACA fluorophores, hver funksjonalisert med en alkyne.

Figur 2 viser eksempel LCMS spor fra en ciprofloxacin-N3 og NBD-alkyne klikk reaksjon, hvor aziden eluted på 3,2 min og produktet på 3,8 min. Sammenligne 1 og 2 viser hvordan fremdriften av klikkreaksjonen kan følges av forsvinningen av azide peak (av UV eller MS detektor). Spectra 3 viser virkningen av rensing, med feilaktige topper forsvinner fra MS og UV spor. Både renhet og reaksjonsfremgang kan kvantifiseres ved integrering av produkttoppen og eventuelle urenheter.

Figur 3 viser typiske resultater fra vurderingen av intracellulær akkumulering ved fluorescensspektroskopi i nærvær og fravær av efflux. I dette eksperimentet ble E. coli behandlet med TMP-NBD med eller uten tilsetning av CCCP, som kollapser protonmotivstyrken (PMF). Den intracellulære fluorescensen til bakteriene var signifikant høyere når den ble behandlet med CCCP, noe som indikerer at efflux reduserte akkumuleringen i disse bakteriene. Dette eksperimentet ble gjentatt ved hjelp av bakterier mangelfull i tolC, viser kapasiteten til denne analysen for å undersøke virkningen av individuelle efflux pumpekomponenter. I dette tilfellet, selv om det var en økning i intracellulær fluorescens sammenlignet med villtypebakterier, økte CCCP-akkumuleringen fortsatt. Disse funnene indikerer at tolC deltar iTMP efflux, men er ikke den eneste PMF-drivpumpen involvert.

Figur 4 viser resultatet av det samme eksperimentet som figur 2, men med akkumuleringen målt ved flytcytometri i stedet for spektroskopi. De samme datatrendene ble observert, noe som viste at begge teknikkene kan brukes til å studere fenomenet efflux mediert intracellulær akkumulering.

Figur 5 viser representative konfokale mikroskopibilder av gram-positive (S. aureus) og gram-negative bakterier (E. coli) merket med TMP-NBD (1) og cipro-NBD ( 2+ 3) fluorescerende sonder, henholdsvis. I begge tilfeller ble den røde membranen fm4-64FX lagt til for å sammenligne kolokalisering. For TMP-NBD ble også det brukt blå nukleinsyrefarge Hoechst-33342. Ved å legge over disse bildene ble lokaliseringen av antibiotika i bakteriene visualisert. Sammenligning av paneler 2 og 3 viser hvordan virkningen av efflux ble undersøkt, med efflux-hemmeren CCCP brukt i 2, noe som resulterer i intracellulær akkumulering. I panel 3ble ingen CCCP lagt til. Derfor er efflux aktiv og ingen sondeakkumulering ble sett.

Figur 6 viser representative konfokale mikroskopibilder av Gram-positive (S. aureus) bakterier merket med DMACA-merket oksazolidinon sonde Lz-NBD. Den røde membranen dye FM4-64FX ble lagt til for å sammenligne kolokalisering, og den grønne nukleinsyre dye Hoechst-33342 ble også brukt. Ved å legge over disse bildene ble lokaliseringen av antibiotika i bakteriene visualisert, og viste intern lokalisering forskjellig fra membranen og nukleinsyren.

Tabell 1 viser MIC-verdier for tre serier av fluorescerende antibiotika, ciprofloxacin, trimethoprim (TMP) og linezolid (Lz), med data presentert for de overordnede antibiotika-, NBD- og DMACA-derivatene av hver. Representative arter for hvert antibiotika ble valgt, inkludert både gram-positive og gram-negative. For ciprofloxacin-serien mistet begge fluorescerende sonder antibiotikaaktivitet sammenlignet med moderstoffet, men beholdt noe aktivitet mot alle arter. På samme måte mistet linezolid-sondene noe aktivitet, men forble et moderat til svakt antibiotika. TMP-sondene mistet nesten all aktivitet mot ville bakterier, men var aktive mot efflux mangelfull E. coli, noe som indikerer at tapet av antibakteriell aktivitet skyldtes mangel på akkumulering.

Figure 1
Figur 1: Syntese og strukturer av antibiotika-avledede sonder. (A) Den generelle reaksjonsordningen for syntese av fluorescerende antibiotikasonder fra azideantibiotika og alkyne-fluoropforer. (B) Strukturene til våre publiserte sonder basert på ciprofloxacin, trimethoprim og linezolid. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Måling av antibiotikaavledet sonderenhet ved LCMS. Analytiske LCMS-spor fra (1) ufullstendige, (2) fullstendige, og (3) HPLC renset ciprofloxacin-N3 + NBD-alkyne klikkreaksjoner som viser forsvinningen av startmateriell ved ferdigstillelse av reaksjon, og diverse topper på rensing. A = UV-Vis spor (absorbans på 250 nm), B = MS spor (positiv og negativ modus). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Platelesermåling av antibiotikaavledet sondeakkumulering. Fluorescensspektroskopisk måling av cellulær akkumulering av TMP-NBD (50 μM) i vill type (1, ATCC 25922) og ΔtolC (2, ATCC 25922) E. coli inkubert (A) med og (B) uten tilsetning av CCCP (100 μM). Statistisk signifikans (**p ≤ 0,01; ***p ≤ 0,001) vises mellom fravær eller tilstedeværelse av CCCP og mellom vill type og ΔtolCE. coli. Rapporterte data er gjennomsnittlig ± SD for tre eksperimenter. Dette tallet er tilpasset fra vår forrige publikasjon15, og illustrerer bruken av spektroskopi for å belyse effluksrollen på intracellulær akkumulering. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Flow cytometrimåling av antibiotikaavledet sondeakkumulering. Flow cytometri måling av cellulær akkumulering ved hjelp av TMP-NBD i vill type (1, ATCC 25922) og ΔtolC (2, ATCC 25922) E. coli inkubert med og uten tilsetning av CCCP (100 μM). Median fluorescensaktivitet er vist fra 10 000 bakterielle hendelser, statistisk signifikans (***, p ≤ 0,001; ****, p ≤ 0,0001) vises mellom fravær og tilstedeværelse av CCCP og mellom vill type og ΔtolCE. coli. Rapporterte data er gjennomsnittlig ± SD for tre eksperimenter. Dette tallet er tilpasset fra vår forrige publikasjon15, og illustrerer bruken av flyt cytometri for å belyse rollen efflux på intracellulær akkumulering. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Confocal mikroskopi visualisering av NBD-sonde lokalisering. Konfokal mikroskopi bilder av 1) leve S. aureus merket med Hoechst-33342 (blå, nukleinsyre), TMP-NBD (grønn), FM4-64FX (rød, membran), og overlaid; 2) leve E. coli behandlet med CCCP (efflux hemmer) merket med cipro-NBD (grønn), FM4-64FX (rød, membran), og overlaid; 3) leve E. coli merket med cipro-NBD (grønn), FM4-64FX (rød, membran), og overlaid. Dette tallet er tilpasset fra våre tidligere publikasjoner15,16, og illustrerer bruken av mikroskopi for å undersøke probe lokalisering, inkludert virkningen av efflux. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Konfokal mikroskopivisualisering av DMACA-probe lokalisering. Konfokal mikroskopi bilder av levende S. aureus merket med oksazolidinon sonde Lz-DMACA (blå), Sytox grønn (grønn, nukleinsyre) og FM4-64FX (rød, membran). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

MIC (μg/ml)
Arter Belastning Cipro Cipro-NBD (andre verdenskrig) Cipro-DMACA Tmp TMP-NBD (andre) TMP-DMACA Linezolid (Lz) Lz-NBD Lz-DMACA
Stafylokokker aureus ATCC 25923 (Andre) 0.125 - 0.5 32 - ≥64 16 1 16 >64
ATCC 43300 1 16 >64
Streptococcus pneumoniae ATCC 700677 1 4 64
Enterococcus faecium ATCC 35667 (Andre) 1 - 8 32 32 - ≥64
ATCC 51559 ATCC (ANDRE) 2 16 32
Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 (Andre) 0.015 - 0.06 8 - 16 8 - 32
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 (Andre) 0.25 - 1 32 - ≥64 32 - ≥64
Escherichia coli ATCC 25922 ≤0,004 8 2 0.5 >64 >64
Mutant ΔtolC 0.125 0.25 2

Tabell 1. Antibiotikaaktiviteter av fluorescerende antibiotikasonder basert på ciprofloxacin, trimetoprim og linezolid mot passende klinisk relevante bakterielle stammer, målt ved kjøttkraft mikrodilution MIC analyser. I de fleste tilfeller mistet sondene noe aktivitet i forhold til det overordnede stoffet, men beholdt noen målbar antibiotikastyrke (tilstrekkelig til å være nyttig i videre studier).

Discussion

Opprettelsen av en vellykket fluorescerende antibiotikasonde må begynne med nøye planlegging og vurdering av SAR av moderstoffet. Hvis SAR ikke er kjent eller fullstendig utforsket, kan det hende at flere alternativer må testes for å finne et nettsted som kan endres selektivt uten å avskaffe biologisk aktivitet. Når et nettsted/s er identifisert, er installasjon av en linker moiety ofte viktig for å gi steric avstand mellom det biologiske handlingsstedet og inaktiv fluoropfor. Forsiktighet må tas at reaksjonen som brukes til å feste linker til antibiotika forlater en bio-stabil funksjonell gruppe, unngå for eksempel estere som er utsatt for spalting av esterases in vivo. Avhengig av den farmakodynamiske og farmakokinetiske profilen til antibiotika, kan en enkel alkyllinker brukes, ellers bør et mindre lipofilt alternativ som en polyetylenglykol (PEG) linker vurderes. Med linker festet, bør den antibakterielle aktiviteten vurderes for å sikre at MICs mot relevante bakterier ligner på den overordnede forbindelsen.

I dette arbeidet anbefaler vi bruk av Huigsen azide-alkyne [3+2] dipolar cycloaddition (klikk kjemi, se figur 1)for å ligate fluorophore til antibiotika, av flere grunner. Klikkreaksjoner er svært selektive, noe som betyr at beskyttelse av reaktive grupper på antibiotika ikke er nødvendig, og videre etterlater reaksjonen en stabil, biokompatibel triazolmoiety. Azidekomponenten introduseres til antibiotikadelen i våre prosedyrer, da dette generelt lettere oppnås med en rekke strukturelle typer enn innføring av en alkyne. Syntesene til to alkyne-avledede fluoropforer er beskrevet her, selv om andre kan utforskes hvis ønskelig. NBD og DMACA ble valgt på grunn av sin lille størrelse, noe som minimerer muligheten for å forstyrre cellepenetrasjon og målinteraksjon. Klikkreaksjonen i seg selv utføres ved hjelp av kobberkatalys, der enten Cu2+ (CuSO4, med et askorbinsyrereduksjonsmiddel) eller Cu+ (CuI) kan brukes som startreagens. Etter rensing (figur 2)skal MICene testes som med aziden. Selv med nøye vurdering av fluoropforvalg og vedleggssted, er det mulig at dårlig antibiotikaaktivitet vil bli observert. Dette betyr imidlertid ikke at en inaktiv sonde er uten bruk. Som vist med TMP-sondene, kan forbindelser med dårlig antibakteriell aktivitet fortsatt binde seg til samme mål som det overordnede stoffet. Dette kan muliggjøre studier på handlingsmåte og undersøkelse av fenomener som fører til motstand, for eksempel efflux.

Som beskrevet i protokolldelen, er det mulig å analysere bakteriell merking ved fluorescerende antibiotika ved hjelp av enten en enkel spektrofotometrianalyse (figur 3) eller flytcytometri (figur 4). Begge metodene er i stand til å kvantifisere cellulær akkumulering, og ved å lysing celler og undersøke fluorescens lokalisering i lysate, er det mulig å vurdere intracellulær akkumulering. I denne protokollen beskrives bruk av lysozym for cellelysis, da dette er en rask, universell teknikk. Andre lysisforhold, som behandling over natten med glycine-HCl7,har også blitt brukt. Ved hjelp av denne teknikken er det mulig å studere virkningen av efflux på antibiotikacellulær akkumulering, som er en viktig mekanisme for resistens. Hvis efflux faktisk er tilstede i bakteriene, vil mangel på intracellulær akkumulering observeres, selv om dette kan reddes ved hjelp av en efflux-hemmer som CCCP.

Mikroskopi kan også utføres for å visuelt inspisere probelokalisering i forskjellige bakterier, få informasjon om handlingsmåte, og potensielt også motstand (se figur 5 for representative eksempler). For å se lokalisering i bakterier, er det nødvendig med et høyoppløselig konfokalmikroskop, utstyrt med evner som SIM (strukturert belysningmikroskopi), SR-SIM (superresolution-SIM), Airyscan eller STED (stimulert utslippsuttømming). Videre bør høyytelses coverslips brukes, og etter bildebehandling analyse utført på en passende programvare (f.eks FIJI, Zen eller Imaris). Lokalisering av sonder sammenlignes med fargestoffer som flekker spesifikke arkitekturer, som Hoechst-33342 (blå, nukleinsyre), Syto-9 (grønn, nukleinsyre) og FM4-64FX (rød, membran). Valget av fargestoffer bør gjøres for å matche fluorescerende antibiotika, slik at hver farge som brukes har minimal spektral overlapping. For å få best mulig bilder, kan optimalisering være nødvendig. For eksempel, hvis bakterier er for overfylt på lysbildet, ta bare en del av suspendert pellet, deretter fortynne med mer monteringsmedium. I motsetning, hvis bakterier er for sparsomme på lysbildet, starter du bare med flere bakterier. I denne protokollen anbefales bruk av en termoreversibel gel som er kompatibel med levende celler (f.eks. Cygel) for levende celleavbildning, da den immobiliserer bakterier (inkludert motilbakterier), men andre monteringsmedier eller agarose har også blitt brukt.

Samlet sett, til tross for utfordringer som kan møtes i utarbeidelsen av en biologisk aktiv fluorescerende antibiotikaderivater, gjør enkelheten i bruken og deres allsidighet disse sondene attraktive verktøy for forskning i AMR. Fremtidig arbeid ved hjelp av fluorescerende antibiotika har potensial til å gi innsikt i mekanismer for antibiotikaresistens, forbedre vår forståelse av hvordan dagens antibiotika opererer, og hjelpe utviklingen av bedre legemidler.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å erklære.

Acknowledgments

MRLS støttes av en Australsk Postgraduate Award (APA) og et Institutt for molekylær biovitenskap Research Advancement Award. Wanida Phetsang ble støttet av UQ International Scholarship (UQI) og IMB Postgraduate Award (IMBPA). MAC er en NHMRC prinsippstipendiat (APP1059354) og har også en brøkdel professoriell stipendiat avtale ved University of Queensland, med sin gjenværende tid som administrerende direktør i Inflazome Ltd, et selskap som utvikler legemidler for å løse kliniske udekkede behov i inflammatorisk sykdom. MATB støttes delvis av Wellcome Trust Strategic Grant WT1104797/Z/14/Z og NHMRC Development grant APP1113719. Mikroskopi ble utført ved Australian Cancer Research Foundation (ACRF)/Institute for Molecular Bioscience Cancer Biology Imaging Facility, som ble etablert med støtte fra ACRF.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-(dimethylamino)phenol Alfa-Aesar B23067
4-chloro-7-nitro-benzofuran Sigma-Aldrich 163260-5G
Amicon Ultra-0.5 centrifugal filter unit with Ultracel- 10 membrane Merck UFC501096
Atlantis Prep T3 OBD (100 A, 5 uM, 10x250 mm) Waters 186008205
Atlantis T3 column (100 A, 5 uM, 2.1 × 50 mm) Waters 186003734
Bruker Avance 600 MHz spectrometer Bruker
Buchi Reveleris C18 12g Cartridge Buchi BUC145152103
CCCP Sigma-Aldrich C2759
Celite 545 Sigma-Aldrich 22140-5KG-F
Cygel ABCAM Ab109204
Elyra PS,1 SIM/STORM confocal microscope Zeiss
FM4-64FX, fixable analog of FM™ 4-64 membrane stain Life Technologies Australia Pt F34653
Gallios flow cytometer Beckman Coulter
Gamma 2-16 LSCplus lyophilise CHRIST
Gilson HPLC 2020 Gilson
Hanks' Balanced Salt solution, Modified, with sodium bicarbonate, without phenol red, calcium chloride and magnesium sulfate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture Sigma-Aldrich H6648-500ML
Hettich Zentrifugen Rotofix 32 Hettich
High performance #1.5 cover slips (18 x 18 mm) Schott/Zeiss 474030-9000-000
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - Fluo Life Technologies Australia Pt H21492
LB AMRESCO J106
Leica STED 3X Super Resolution Microscope with White Light Laser excitation Leica
Lysozyme from chicken egg white
lyophilized powder
Sigma-Aldrich L6876
Mueller Hinton II Broth Cation adjusted Becton Dickinson 212322
Propargylamine Sigma-Aldrich P50900-5G
Reveleris GRACE MPLC Buchi
Shimadzu LCMS-2020 Shimadzu
Sigma 1-15 Microcentrifuge Sigma-Aldrich
Silica gel 60 (0.040-0.063 mm) for column chromatography (230-400 mesh ASTM) Merck 1093859025
SYTO 9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain Life Technologies Australia Pt S34854
TECAN Infinite M1000 PRO TECAN

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cai, H., Rose, K., Liang, L. H., Dunham, S., Stover, C. Development of a liquid chromatography/mass spectrometry-based drug accumulation assay in Pseudomonas aeruginosa. Analytical Biochemistry. 385, (2), 321-325 (2009).
  2. Bhat, J., Narayan, A., Venkatraman, J., Chatterji, M. LC-MS based assay to measure intracellular compound levels in Mycobacterium smegmatis: Linking compound levels to cellular potency. Journal of Microbiological Methods. 94, (2), 152-158 (2013).
  3. Davis, T. D., Gerry, C. J., Tan, D. S. General Platform for Systematic Quantitative Evaluation of Small-Molecule Permeability in Bacteria. ACS Chemical Biology. 9, (11), 2535-2544 (2014).
  4. Richter, M. F., et al. Predictive compound accumulation rules yield a broad-spectrum antibiotic. Nature. 545, 299 (2017).
  5. Iyer, R., et al. Evaluating LC-MS/MS To Measure Accumulation of Compounds within Bacteria. ACS Infectious Diseases. 4, (9), 1336-1345 (2018).
  6. Prochnow, H., et al. Subcellular Quantification of Uptake in Gram-Negative Bacteria. Analytical Chemistry. 91, (3), 1863-1872 (2019).
  7. Dumont, E., et al. Antibiotics and efflux: combined spectrofluorimetry and mass spectrometry to evaluate the involvement of concentration and efflux activity in antibiotic intracellular accumulation. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 74, (1), 58-65 (2019).
  8. Stone, M. R. L., Butler, M. S., Phetsang, W., Cooper, M. A., Blaskovich, M. A. T. Fluorescent Antibiotics: New Research Tools to Fight Antibiotic Resistance. Trends in Biotechnology. 36, (5), 523-536 (2018).
  9. Piddock, L. J. V., Johnson, M. M. Accumulation of 10 fluoroquinolones by wild-type or efflux mutant Streptococcus pneumoniae. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46, (3), 813-820 (2002).
  10. Mortimer, P. G. S., Piddock, L. J. V. A comparison of methods used for measuring the accumulation of quinolones by enterobacteriaceae, pseudomonas aeruginosa and staphylococcus aureus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 28, (5), 639-653 (1991).
  11. Li, X. Z., Nikaido, H., Poole, K. Role of MexA-MexB-OprM in antibiotic efflux in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39, (9), 1948-1953 (1995).
  12. Vince, R., Weiss, D., Pestka, S. Binding of N-substituted erythromycylamines to ribosomes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 9, (1), 131-136 (1976).
  13. Vazquez, D. Antibiotics affecting chloramphenicol uptake by bacteria Their effect on amino acid incorporation in a cell-free system. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Nucleic Acids and Protein Synthesis. 114, (2), 289-295 (1966).
  14. Phetsang, W., et al. An azido-oxazolidinone antibiotic for live bacterial cell imaging and generation of antibiotic variants. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 22, (16), 4490-4498 (2014).
  15. Phetsang, W., et al. Fluorescent trimethoprim conjugate probes to assess drug accumulation in wild type and mutant Escherichia coli. ACS Infectious Diseases. 2, (10), 688-701 (2016).
  16. Stone, M. R. L., et al. Fluoroquinolone-derived fluorescent probes for studies of bacterial penetration and efflux. MedChemComm. 10, (6), 901-906 (2019).
Visualisering av bakteriell resistens ved hjelp av fluorescerende antibiotikasonder
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stone, M. R. L., Phetsang, W., Cooper, M. A., Blaskovich, M. A. T. Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes. J. Vis. Exp. (157), e60743, doi:10.3791/60743 (2020).More

Stone, M. R. L., Phetsang, W., Cooper, M. A., Blaskovich, M. A. T. Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes. J. Vis. Exp. (157), e60743, doi:10.3791/60743 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter