Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Visualisatie van bacteriële resistentie met behulp van fluorescerende antibiotica sondes

Published: March 2, 2020 doi: 10.3791/60743
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Centre for Superbug Solutions, Institute for Molecular Biosciences, The University of Queensland

Summary

Fluorescerende gelabelde antibiotica zijn krachtige instrumenten die kunnen worden gebruikt om meerdere aspecten van antimicrobiële resistentie te bestuderen. Dit artikel beschrijft de voorbereiding van fluorescerende gelabelde antibiotica en hun toepassing op het bestuderen van antibioticaresistentie bij bacteriën. Sondes kunnen worden gebruikt om mechanismen van bacteriële resistentie (bijvoorbeeld efflux) te bestuderen door spectrofotometrie, stroomcytometrie en microscopie.

Abstract

Fluorescerende antibiotica zijn multifunctionele onderzoeksinstrumenten die gemakkelijk worden gebruikt voor de studie van antimicrobiële resistentie, vanwege hun aanzienlijke voordeel ten opzichte van andere methoden. Om deze sondes voor te bereiden, worden azidederivaten van antibiotica gesynthetiseerd, in combinatie met alkyne-fluorophores met azide-alkyne dipolaire cycloaddition door klikchemie. Na zuivering wordt de antibioticaactiviteit van het tl-antibioticum getest door een minimale remmende concentratiebeoordeling. Om bacteriële accumulatie te bestuderen, kan spectrofotometrie of stroomcytometrie worden gebruikt, waardoor veel eenvoudigere analyse mogelijk is dan methoden die afhankelijk zijn van radioactieve antibioticaderivaten. Bovendien kan confocale microscopie worden gebruikt om lokalisatie binnen de bacteriën te onderzoeken, waardoor waardevolle informatie wordt verstrekt over de werkingswijze en veranderingen die zich voordoen bij resistente soorten. Het gebruik van fluorescerende antibiotica sondes in de studie van antimicrobiële resistentie is een krachtige methode met veel potentieel voor toekomstige expansie.

Introduction

Antimicrobiële resistentie (AMR) is een toenemende crisis die een grote bedreiging vormt voor de menselijke gezondheid over de hele wereld. Resistentie tegen de meeste antibiotica is gemeld, en infecties veroorzaakt door bacteriën resistent tegen alle klinisch beschikbare geneesmiddelen zijn in opkomst. Om de opkomst van AMR tegen te gaan, moeten we ons begrip van dit veelzijdige fenomeen en de onderliggende mechanismen en interacties tussen antibiotica en bacteriën vergroten. Een aspect dat historisch slecht is begrepen is de permeatie van antibiotica in bacteriën, samen met de verschijnselen van accumulatie en efflux. Deze kennis is cruciaal bij het ontwerpen van nieuwe geneesmiddelen en het begrijpen van mechanismen van resistentie. Dit speelt dan ook een cruciale rol in AMR-onderzoek.

Er zijn twee belangrijke benaderingen die kunnen worden genomen om de concentratie van antibiotica te meten: het direct meten van het medicijn of het taggen met een moiety die is ontworpen om kwantificering te vergemakkelijken. Hoewel het taggen van het antibioticum de detectie verbetert, kan dit de biologische activiteit van het medicijn verstoren, zoals antimicrobiële activiteit en doorlaatbaarheid. Dit is geen probleem voor niet-gelabelde methoden; detectie kan echter een uitdaging zijn. In de afgelopen jaren hebben technologische vooruitgang geleid tot een hausse in het onderzoek met behulp van massaspectrometrie (MS) om de antibioticaconcentratie in bacteriën1,2,3,4,5,6,7direct te meten. Deze studies hebben aangetoond dat het mogelijk is om intracellulaire accumulatie in een verscheidenheid van bacteriën te bestuderen, met gram-negatieve bacteriën het meest bestudeerd. Kwantificering van de doorlaatbaarheid van moleculen is dan gekoppeld aan activiteit en gebruikt om de ontwikkeling van geneesmiddelen te informeren2,3,4, hoewel voorzichtigheid geboden moet worden wanneer de accumulatie en doelactiviteit direct worden conflating5. Vóór de ontwikkeling van de lidstaten waren de enige antibiotica waarvan de concentratie rechtstreeks kon worden gemeten , antibiotica die intrinsieke fluorescentie bezitten, zoals tetracycline en de quinolonen8,9,10,11. Hoewel duidelijk beperkt in omvang, accumulatie en efflux werden onderzocht en gekwantificeerd, ter illustratie van het nut van fluorescentie gebaseerde kwantificering.

Gelabelde antibiotica zijn gebruikt voor vele decennia om distributies, manieren van handelen, en resistentie te bestuderen, met radioactieve en fluorescerende tags gemeenschappelijk. Radio-tagged sondes hebben het voordeel dat ze bijna identiek zijn aan de bovenliggende verbinding, vandaar dat de biologische activiteit waarschijnlijk niet significant anders zal zijn. Isotopen zoals 3H, 14C en 15N zijn vaak gebruikt vanwege de bekendheid van deze elementen in antibiotica, en een verscheidenheid aan antibiotica steigers zijn onderzocht1,10,12,13. Hoewel de detectie van radiosondes eenvoudig is, zijn er een aantal logistieke problemen (bijvoorbeeld veiligheid, isotoop half-life) die het gebruik van deze aanpak hebben beperkt. Een andere strategie is fluorescerende antibiotica. Deze sondes kunnen worden gebruikt om de distributie en de werkingswijzen en weerstand van het moedermedicijn te onderzoeken, met behulp van eenvoudigere technologie dan MS en zonder de logistieke problemen van straling8. Het belangrijkste nadeel van deze aanpak is dat antibiotica over het algemeen relatief kleine moleculen zijn, vandaar de introductie van een fluorescerende moiety een aanzienlijke chemische verandering. Deze wijziging kan invloed hebben op fysiochemische eigenschappen en antibacteriële activiteit. Daarom moet ervoor worden gezorgd dat deze factoren worden beoordeeld om resultaten te genereren die representatief zijn voor het moederantibioticum.

In dit werk wordt een methode beschreven om fluorescerende antibiotica te synthetiseren, te beoordelen en te gebruiken, zoals in onze vorige publicaties14,15,16. Door middel van eerder werk zijn een aantal fluorescerende antibiotica bereid en gebruikt voor verschillende doeleinden (zie Stone et al.8). Om de kans op gevolgen voor de biologische activiteit tot een minimum te beperken, worden in dit werk zeer kleine fluorophoren gebruikt: nitrobenzoxadiazole (NBD, groen) en 7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-chromen-4-yl (DMACA, blauw). Verder wordt de beoordeling van antibacteriële activiteit met behulp van de microbouillonverdunningsminimumremmingsconcentratie (MIC)-test beschreven, zodat het effect van wijzigingen op de activiteit kan worden gemeten. Deze fluorescerende sondes kunnen worden gebruikt in spectrofotometrische testen, flow cytometrie en microscopie. Het scala van mogelijke toepassingen is waar het voordeel van fluorescerende antibiotica ligt. Cellulaire accumulatie kan worden gekwantificeerd, gecategoriseerd en gevisualiseerd, iets wat niet mogelijk is met behulp van MS alleen. Het is te hopen dat de kennis opgedaan door het gebruik van fluorescerende antibiotica zal helpen bij ons begrip van resistentie, en de strijd tegen AMR.

Protocol

1. Synthese van Alkyne-fluorophores

  1. Synthese van NBD-alkyne (7-nitro-N-(prop-2-yn-1-yl)benzo[c][1,2,5]oxadiazol-4-amine)
    1. Los 1.031 mg 4-chloor-7-nitro-benzofuran (5.181 mmol) op in 60 mL tetrahydrofuran (THF). Voeg 1.857 mg CsCO3 (5.696 mmol) toe, dan 0,39 mL propargylamine (6,1 mmol). Verwarm de reactie tot 50 °C gedurende 2 uur, die van bruin naar groen verandert en vervolgens afkoelen tot kamertemperatuur (RT).
    2. Filtreer de reactie met behulp van een filterhulpmiddel (zie Tabel met materialen)en was met ethylacetaat (EA). Concentraat het filtraat onder verminderde druk, los het residu op in 150 mL EA en ga naar een scheidingstrechter van 500 mL.
    3. Was de EA-oplossing met respectievelijk 100 mL met water en pekel. Combineer vervolgens de waterige fasen en was 2x met 100 mL EA.
    4. Droog de gecombineerde organische fasen over watervrij magnesiumsulfaat en filtreer en concentreer u onder verminderde druk.
    5. Zuiver het ruwe product door flitschromatografie op silicagel (20-30% EA in petroleumether [PE]), het controleren van zuiverheid door vloeibare chromatografiemassaspectrometrie (LCMS, [M+H]+ = 219.1) en/of nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie, chemische verschuivingen als volgt:
      1. H NMR (CD3OD, 600 MHz) δ 8,54 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 6,35 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 4,31 (dd, J = 5,7 Hz, J = 2,5 Hz, 2H), 2,43 (t, J = 2,5 Hz, 1H); 13. C NMR (CD3OD, 150 MHz) δ 144,3, 143,7, 142.2, 135,8, 125,7, 100,0, 76,5, 74,2, 33,4.
      OPMERKING: Bereid bij het uitvoeren van zuivering door silicagelchromatografie de kolom voor met behulp van de minder polaire oplosmiddelen die worden vermeld. Ruwe verbinding kan ofwel worden geladen als een geconcentreerde oplossing of adsorbeerde op het silica als oplosbaarheid het niet toelaat. Nadat de verbinding is toegevoegd aan de bovenkant van het silica, loopt u door 1-2 kolomvolumes van hetzelfde oplosmiddel dat wordt gebruikt voor silicabevochtiging. Begin dan met de vermelde oplosmiddelverhouding, die door minstens 1 kolomvolume van elk oplosmiddel loopt, en zorg ervoor om geen grote sprongen in oplosmiddelsamenstelling te maken. Verzamel breuken en controleer zuiverheid/identiteit door LCMS of TLC (dunne laagchromatografie). Combineer pure fracties en concentraat onder verminderde druk door roterende verdamping.
  2. Synthese van DMACA-alkyne (2-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)-N-(prop-2-yn-1-yl)paracetamol).
    1. Los 5,02 g 3-(dimethylamino)fenol (36,6 mmol) op in 30 mL ethanol en voeg vervolgens 6,7 mL diethyl 1,3-acetonedicarboxylaat (36 mmol) toe. Voeg 10,5 g ZnCl2 (77,2 mmol) toe, en reflux vervolgens de rode oplossing voor 42 uur. Voeg een extra 9,20 g ZnCl2 (67,6 mmol), dan reflux voor 8 uur.
    2. Koel de reactie af en concentreer u onder verminderde druk. Verspreid de resulterende rode vaste stof in 200 mL EA, filter, dan overbrengen naar een 500 mL scheiden trechter.
    3. Was de EA met 200 mL elk van water en pekel, dan droog over watervrij magnesiumsulfaat. Filtreer de gedroogde organische fase en concentraat onder verminderde druk.
    4. Zuiver de rode stof (ethyl 2-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)acetaat) door flitschromatografie op silicagel (0-100% EA in PE), waarbij de zuiverheid door LCMS ([M+H]+ = 275,1) en/of NMR, chemische verschuivingen als volgt worden gecontroleerd:
      1. H NMR (CDCl3, 600 MHz) δ 7,30 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 6,52 (dd, J = 8,9 Hz, J = 2,6 Hz, 1H), 6,40 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 5,87 (m, 1H), 2,96 (m, 8H), 2,25 (d, J = 1,2 Hz, 3H).
    5. Los 488 mg ethyl 2-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)acetaat (1,18 mmol) op in 10 mL THF en voeg vervolgens een oplossing van 157 mg LiOH toe· H2O (3,74 mmol) in 15 mL water. Roer de reactie bij RT gedurende 3 uur, ga dan naar een scheidingstrechter en verdun met nog eens 50 mL water.
    6. Was het reactiemengsel 2x met 50 mL diethylether (Et2O) en was vervolgens de gecombineerde organische fase 2x met 25 mL water. Neem elke gele neerslag met de organische laag. Concentraat de organische fase onder verminderde druk met behulp van een roterende verdamper.
    7. Verzur de waterige fase tot pH = 2 met geconcentreerde HCl en koel 's nachts af tot 4 °C. Filtreer de verzuurde waterige fase en voeg de gele vaste stof toe aan de geconcentreerde organische fase.
      OPMERKING: Het 2-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-chroom-4-yl)azijnzuur kan zonder verdere zuivering worden gebruikt, maar dit kan worden gecontroleerd door LCMS ([M+H]+ = 247.1) en/of NMR, chemische verschuivingen als volgt:
      1. H NMR (CDCl3, 600 MHz) δ 7.41 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 6,62 (dd, J = 9,2 Hz, J = 2,8 Hz, 1H), 6,52 (d, J = 2,8 Hz, 1H), 5,98 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 3,05 (s, 6H), 2,35 (d, J = 0,9 Hz, 2H); 13. C NMR (CDCl3, 150 MHz) δ 162,2, 155,7, 152,9, 152,8, 125,3, 109,7, 109,3, 109,1, 108,8, 98,3, 40,2, 18,5.
    8. Los 466 mg 2-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-chroom-4-yl)azijnzuur (1,89 mmol) op in 7 mL droge N, N-dimethylformamide (DMF) en plaats onder een atmosfeer van stikstof.
    9. Los 0,33 mL propargylamine (5,1 mmol) op in 7 mL droge DMF onder stikstof. Voeg 1,30 mL di-isopropylethylamine (DIPEA, 7,50 mmol) toe aan de kleurstofoplossing, vervolgens 535 mg O-(1H-6-chlorobenzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorofosfaat (HCTU, 1,29 mmol). Roer de geactiveerde kleurstof oplossing voor 15 min op RT, voeg dan de amine oplossing dropwise, en laat om 's nachts te roeren.
    10. De volgende dag, verdun de reactie met 35 mL water dan concentreren onder verminderde druk.
    11. Deling de resulterende oranje vaste stof tussen EA en pekel (100 mL per stuk) in een 250 mL scheidingstrechter. Scheid de lagen (voer de twee lagen in verschillende kolven) en was de waterige fase met 100 mL EA.
    12. Concentraat de gecombineerde organische fasen onder verminderde druk en los vervolgens de oranje vaste stof op in 3 mL van 1:1 acetonitril (ACN)/water (v/v). Zuiver het ruwe product door te injecteren op een omgekeerde fase medium pressure liquid chromatografie (MPLC) systeem uitgerust met een C18 cartridge kolom (oplosmiddel A: water, oplosmiddel B: ACN).
    13. Controleer de onderstaande fracties op zuiverheid door LCMS ([M+H]+ = 284,1, NMR chemische verschuivingen hieronder), combineren en lyophiliseren passende fracties om 2-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)-N-(prop-2-yn-1-yl)acetamide, NMR chemische verschuivingen als volgt te geven:
      1. H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 8,65 (t, J = 5,4Hz, 1H), 7,52 (d, J = 9,0Hz, 1H), 6,72 (dd, J = 9,1, 2,6 Hz, 1H), 6,55 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 6,00 (s, 1H), 3,88–3,87 (m, 2H), 3,62 (s, 2H), 3,13 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 3,01 (s, 6H); 13. C NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ 167,7, 160,7, 155,4, 152,9, 151.0, 126.0, 109.4, 109.1, 108.1, 97.5, 80.9, 73.3, 39.7, 38.4, 28.2.

2. Synthese van fluorescerende antibiotica

  1. Bereid een azide-derivaat van een antibioticum zoals eerder beschreven14,15,16.
    OPMERKING: De procedure is specifiek voor elk antibioticum en vereist een zorgvuldig onderzoek van de structuur activiteit relatie (SAR) van de ouder molecuul om ervoor te zorgen dat de gefunctionaliseerde antibioticum behoudt activiteit vergelijkbaar met de ouder. (bijvoorbeeld ciprofloxacine16, linezolid14en trimethoprim15). Zie figuur 1 voor voorbeelden van gepubliceerde fluorescerende antibiotica en het algemene syntheseschema.
  2. Klikreactieprocedure A
    LET OP: Voor de meeste antibiotica, volg de procedure hier beschreven voor koper gekatalyseerd Huisgen [2 +3] cycloaddition van azide (stap 2.1) en fluorescerende alkyne (bereid in stap 1).
    1. Plaats het azide-antibioticum in een ronde bodemkolf en voeg tert-butanol(tBuOH) en water (1:1 v/v, 25 mL per mmol azide) toe.
    2. Voeg de fluorophore-alkyne bereid in stap 1.1 (3 eq.) toe en verwarm de reactie op 50 °C. Voeg vervolgens kopersulfaat (100 mM in water, 0,6 eq.) toe aan de reactie, gevolgd door ascorbinezuur (500 mM in water, 2,4 eq.).
    3. Roer de reactie bij 50 °C gedurende 1 uur, of tot analyse door LCMS op indicatie van de voltooiing van de reactie (volledige consumptie van beginnende azide).
    4. Koel de reactie en zuiveren indien nodig voor het antibioticum steiger en ga voor zuivering, hetzij door stap 2.3 of 2.4.
      OPMERKING: Verschillende zuiveringsmethoden zijn mogelijk, afhankelijk van de polariteit en stabiliteit van het schavot.
  3. Klik reactie procedure B
    OPMERKING: Volg deze procedure voor peptide-gebaseerde antibiotica, om sterkere reactievoorwaarden te bieden (ongepubliceerd werk, Phetsang, 2019).
    1. Plaats het peptide azide-antibioticum in een ronde bodemkolf en voeg voldoende DMF (750 mL/mmol azide) toe om op te lossen.
    2. Voeg de fluorophore-alkyne bereid in stap 1 (5 eq.) toe en verwarm de reactie op 50 °C gedurende 1 uur.
    3. Voeg koper (I) jodide (20 eq.), dan DIPEA (120 eq.), dan azijnzuur (240 eq.).
    4. Roer de reactie bij 50 °C gedurende 1 uur, of totdat de analyse door LCMS reactievoltooiing aangeeft (d.w.z. volledig verbruik van startende azide). Koel de reactie af en ga verder voor zuivering volgens methode 1 (zie stap 2.3).
  4. Zuiveringsmethode 1 (gebruikt voor ciprofloxacine, trimethoprim en linezolid)
    1. Injecteer de gekoelde klikreactie direct op een MPLC C18 cartridgekolom.
    2. Neem aan het begin van de run een lange wasfase (ongeveer 10 min) op (100% oplosmiddel A), voer vervolgens een helling tot 100% oplosmiddel B uit, gevolgd door een terugkeer naar oplosmiddel A.
      OPMERKING: Oplosmiddel A kan worden gekozen uit water, 0,05-0,1% mierenzuur (FA) in water, 0,05-0,1% trifluoroacetisch zuur (TFA) in water, afhankelijk van oplosbaarheid, stabiliteit en de beste resolutie van pieken. Oplosmiddel B kan worden gekozen uit acetonitril (ACN), 0,05–0,1% FA in ACN, 0,05–0,1% TFA in ACN, om oplosmiddel A te evenaren. Indien de elutie moeilijk blijkt, mag methanol worden gebruikt in plaats van ACN.
    3. Verzamel en combineer de juiste fracties, zoals aangegeven door LCMS en kleur (juiste massa gezien, enkelvoud piek), dan lyofileren om de (semi)pure tl antibioticum te geven.
    4. Verder zuiveren van het product indien nodig. Beoordeel de zuiverheid door NMR en/of LCMS en hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC), met behulp van een kolom en methode die geschikt zijn voor het schavot.
  5. Zuiveringsmethode 2
    OPMERKING: Als de oplosbaarheid het toelaat, kan de voorzuivering worden uitgevoerd door de waterige workup (gebruikt voor macroliden, ongepubliceerd werk, Steen 2019).
    1. Verdun de afgekoelde klikreactie met water en Et2O (1:1 v/v, ongeveer 10-voudige verdunning van het eerste reactievolume), overbrengen d.m.v. een geschikte scheidingstrechter.
    2. Scheid de lagen en was de waterige fase twee maal met Et2O.
    3. Was de gecombineerde organische fasen 2x met water (gelijk volume met organische fase), droog dan over Na2SO4.
    4. Filtreer de gedroogde organische fase en concentraat onder verminderde druk.
    5. Zuiver het ruwe product door MPLC en/of HPLC zoals beschreven in stap 2.4.4.
      OPMERKING: Zie figuur 2 voor voorbeelden van onvolledige, complete en gezuiverde klikreactie LCMS-sporen. Typische gezuiverde opbrengsten voor de antibiotica-fluorophore klik reacties variëren van 30-80%.
      LET OP: De meeste chemicaliën die in deze syntheses worden gebruikt, bezitten specifieke veiligheidsrisico's. Voorzichtigheid moet te allen tijde worden ingenomen, inclusief het gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen. Et2O, tBuOH, FA, azijnzuur, PE, EA, THF, ACN, DMF, EtOH, DIPEA, propargylamine en HCTU zijn allemaal ontvlambaar; contact met warmte of vonkbronnen te voorkomen. THF, propargylamine, DIPEA, tBuOH, FA, DMF en PE zijn allemaal giftig; blootstelling te voorkomen. Propargylamine, CsCO3, ZnCl2, LiOH-H2O, DIPEA, CuI, FA, azijnzuur en HCl zijn allemaal corrosief; contact te vermijden en zich bewust te zijn van oppervlaktecontact. ZnCl2, CuSO4, CuI en PE brengen milieurisico's met zich mee; rekening houden met de verwijderingsvoorwaarden. THF kan explosieve peroxiden vormen; zorg voor de opslagvoorwaarden. Organische azides zijn explosief; zorg vooral bij grootschalige productie.

3. Evaluatie van antimicrobiële activiteit

OPMERKING: Alle werkzaamheden waarbij bacteriën betrokken zijn, moeten onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd om besmetting van de test of het laboratorium te voorkomen. Alle media moeten voor gebruik automatisch zijn afgegaan en plasticware en apparatuur zoals pipetten moeten steriel worden gehouden. Het wordt aanbevolen om te werken in een biocontainment kap (type 2).

  1. Streep glycerol voorraden van bacteriële stammen die geschikt zijn voor het antibioticum steiger op lysogeny bouillon agar (LB, bereid volgens de instructies van de fabrikant), en groeien 's nachts op 37 °C.
    OPMERKING: De keuze van bacteriën om antibacteriële activiteit te testen moet worden gemaakt op basis van het antibioticum steiger wordt gebruikt. Een representatief bereik van 5-10 bacteriën moet worden gekozen uit de soorten waarvan bekend is dat ze gevoelig zijn voor het antibioticum, met aandacht voor de logistieke mogelijkheden van het lab. Indien mogelijk moeten ook resistente bacteriën worden getest. Het onderstaande protocol werkt op de meeste bacteriën, maar controleer of er speciale voorwaarden nodig zijn (bijvoorbeeld CO2,speciale media) en breng indien nodig wijzigingen aan. Bacteriën met succes geassuieerd met behulp van deze voorwaarden omvatten Staphylococci, Streptococci, Bacilli, E. coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, en Enterococcus faecium.
  2. Kies een enkele kolonie van de plaat, en cultuur 's nachts in 5 mL van kation aangepast Mueller-Hinton Bouillon (CAMHB, bereid volgens de instructies van de fabrikant) op 37 °C.
  3. Verdun de nachtelijke culturen ~40-voudig in CAMHB en groei tot een mid-log fase, optische dichtheid op 600 nm (OD600) = 0,4-0,8, volume 5 mL).
  4. Bereid voorraadoplossingen van elk fluorescerend antibioticum op 1,28 mg/mL in steriel water en pipet 10 μL antibioticum naar de eerste kolom van een 96-putplaat.
  5. Voeg 90 μL CAMHB toe aan de eerste kolom en 50 μL aan alle andere putten. Voer vervolgens een seriële 2-voudige verdunning over de plaat uit.
  6. Meng grondig, verdun vervolgens de mid-log fase culturen tot ~ 106 kolonie vormen eenheden (CFU)/mL en voeg 50 μL aan alle putten, om een definitieve concentratie van ~ 5 x 105 CFU/mL.

    cultuurvolume (mL) = (mediavolume in mL)/(OD600 x 1.000)

    b.v., voor een OD600 = 0.5 cultuur in een gewenst mediavolume van 12 mL, voeg (12/((0.5 x 1.000) = 0.024 mL van cultuur aan 12 mL van media toe
  7. Bedek de platen met deksels en incubeer bij 37 °C gedurende 18-24 uur zonder te schudden.
  8. Visueel inspecteren van de platen, met de MIC is de laagste concentratie goed met geen zichtbare groei.
    OPMERKING: Zie tabel 1 voor enkele voorbeelden van actieve en inactieve fluorescerende antibiotica.

4. Analyse van sondeaccumulatie door spectrofotometrie en flowcytometrie

OPMERKING: Deze centrifugatie tijden zijn geoptimaliseerd voor E. coli,dus kleine veranderingen kunnen nodig zijn voor andere soorten. Representatieve gegevens voor sondeaccumulatie worden gerapporteerd voor de NBD-gelabelde ciprofloxacine-sonde.

  1. Streep glycerol voorraden van de bacteriële stammen op LB agar en groeien 's nachts op 37 °C.
  2. Kies een enkele kolonie van de plaat en cultuur 's nachts in LB bij 37 °C.
  3. Verdun 's nachts culturen ~ 50-voudige in de media en groeien tot mid-log fase (OD600 = 0,4-0,8).
  4. Centrifugeer de culturen op 1.470 x g gedurende 25 min en decanteer de media.
  5. Resuspend de bacteriën in 1 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), dan centrifugeeren op 1.470 x g voor 15 min.
  6. Decanteer de media en resuspend de gewassen pellets in PBS naar een definitieve OD600 = 2.
  7. Voeg indien gewenst 10,1 μL carbonylcyanide 3-chloorophenylhydrazone (CCCP, 10 mM in PBS) toe aan 1 mL bacteriën (eindconcentratie 100 μM) en uitbroed bij 37 °C gedurende 10 min.
    OPMERKING: CCCP is een efflux pompremmer. De toevoeging van CCCP zal het onderzoek naar de impact van de efflux mogelijk maken.
  8. Centrifugeer de culturen op 18.000 x g gedurende 4 min bij 20 °C en decanteer de media.
  9. Voeg 1 mL fluorescerende antibioticaoplossing (10-100 μM in PBS) toe aan de pellet en incubeer bij 37 °C gedurende 30 min.
  10. Centrifugeer de culturen op 18.000 x g gedurende 7 min bij 4 °C en decanteer de media.
  11. Resuspend de bacteriën in 1 mL koude PBS, en herhaal stap 4.9.
  12. Herhaal stap 4.10 in totaal 4x.
  13. Indien gewenst, lyse bacteriën door toevoeging van 180 μL lysis buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, en 2 mM natrium EDTA) dan 70 μL lysozyme (72 mg/mL in H2O).
  14. Incubeer bij 37°C gedurende 30 min, dan vries-dooi 3x (−78 °C gedurende 5 min, dan 34 °C gedurende 15 min).
  15. Soniceren van de monsters voor 20 min, dan warmte tot 65 °C voor 30 min.
  16. Centrifugeer de lysed samples (18.000 x g, 8 min), filtreer vervolgens door een 10 kDa filtermembraan.
  17. Was het filter de 4x met 100 μL water.
  18. Breng het lysaat over op een zwarte 96-putplaat met platte bodem en meet de fluorescentieintensiteit op een plaatlezer met excitatie- en emissiegolflengten die geschikt zijn voor het fluorophore (d.w.z. DMACA: λex = 400 nm, λem = 490 nm; NBD: λex = 475 nm, λem = 545 nm).
    OPMERKING: Zie figuur 3 voor voorbeelden van spectrofotometrische analyses van bacteriën met behulp van het fluorescerende NBD-gelabelde ciprofloxacineantibioticum.
  19. Voor analyse per flow cytometrie kunnen dezelfde groei- en kleuringsvoorwaarden worden gebruikt (stappen 4.1–4.17), waarbij alleen in de uiteindelijke voorbereiding wijzigingen worden aangebracht.
    1. Breng het totale volume op 1 mL PBS.
    2. Lees monsters op een stroomcytometer met een stroomsnelheid van ongeveer 60 μL/min, met behulp van logaritmische versterking voor de gegevensverwerving (F1-excitatie = 488 nm; emissie = 525/20 nm).
    3. Neem in totaal 10.000 gebeurtenissen op en analyseer de gegevens met behulp van de juiste software.
    4. Plot de fluorescentieintensiteit van de F1 tegen het aantal gebeurtenissen telt, het schatten van de mediane fluorescentie intensiteit van het histogram pieken nadat de bacteriën werd gekleurd.
      OPMERKING: Zie figuur 4 voor voorbeelden van stroomcytometrieanalyses van bacteriën met behulp van het nbd-gelabelde ciprofloxacine-antibioticum.

5. Voorbereiding voor microscopische analyse

  1. Kweek subculturen tot OD600 = 0,4, zoals voor MIC-beoordeling, verdeel dan in 1 mL aliquots en centrifuge op 18.000 x g voor 3-5 min.
  2. Decanteer en gooi media weg en schors vervolgens bacteriële pellet in 500 μL HBSS.
  3. Centrifugeer bij 18.000 x g voor 3 min en decanteer en gooi media weg.
  4. Bereid oplossingen voor van antibioticasondes in HBSS bij concentraties van 1-100 μM.
  5. Resuspend de gewassen bacteriën in 500 μL van de sondeoplossing en broed op 37 °C gedurende 30 min.
  6. Herhaal stap 5.3. Voor een meervoudig etiketteringsexperiment, resuspend de pellet in 500 μL van een orthogonally gekleurde nucleïnezuurkleurstof. Gebruik Syto9 (5 μM in HBSS) voor groen; voor blauw, gebruik Hoechst 33342 (20 μg/mL in HBSS). Incubate bij RT voor 15-30 min.
  7. Herhaal stap 5.3 en bredig vervolgens opnieuw in 500 μL FM4-64FX (5 μg/mL in HBSS) en incubeer bij RT gedurende 5 min.
  8. Herhaal stap 5.3, dan opnieuw opteschorten in 500 μL HBSS, en herhaal stap 5.3 nogmaals.
  9. Herhaal stap 5.8 en hang de gewassen, geverfde bacteriën uiteindelijk op in 15 μL montagemedium (zie Tabel met materialen).
  10. Pipette montage medium op een microscoop dia en top met een high-performance cover slip, dan afdichting randen met duidelijke nagellak.
    OPMERKING: Zie figuur 5 voor voorbeelden van confocale microscopiebeelden die zijn gemaakt met ciprofloxacine- en trimethoprimantibiotica met het NBD-label, en figuur 6 voor oxazolidinon (linezolid) antibioticum met DMACA-gelabelde oxazolidinon (linezolid).

Representative Results

Figuur 1 Illustreert de toetsklik chemie reactie (A) voor de voorbereiding van de fluorescerende antibiotica, en met (B) voorbeelden van structuren van onze gepubliceerde fluorescerende antibiotica op basis van ciprofloxacine (cipro), trimethoprim (TMP), en linezolid. Deze sondes werden allemaal gesynthetiseerd uit de overeenkomstige antibiotica via een azide intermediair. Ze werden vervolgens gekoppeld aan de NBD en DMACA fluorophores, elk gefunctionaliseerd met een alkyne.

Figuur 2 toont voorbeeld LCMS-sporen van een ciprofloxacine-N3 en NBD-alkyne klikreactie, waarbij de azide eluted op 3,2 min en het product op 3,8 min. Vergelijking 1 en 2 laat zien hoe de voortgang van de klikreactie kan worden gevolgd door het verdwijnen van de azidepiek (door UV- of MS-detector). Spectra 3 tonen de impact van zuivering, waarbij foutieve pieken uit de MS- en UV-sporen verdwijnen. Zowel de zuiverheid als de reactievooruitgang kunnen worden gekwantificeerd door de integratie van de productpiek en eventuele onzuiverheidspieken.

Figuur 3 toont typische resultaten van de beoordeling van intracellulaire accumulatie door fluorescentiespectroscopie in aanwezigheid en afwezigheid van efflux. In dit experiment werd E. coli behandeld met TMP-NBD met of zonder toevoeging van CCCP, waardoor de protonenbewegingkracht (PMF) instort. De intracellulaire fluorescentie van de bacteriën was aanzienlijk hoger bij voorbehandeling met CCCP, wat aangeeft dat de efflux de accumulatie in deze bacteriën verminderde. Dit experiment werd herhaald met behulp van bacteriën tekort aan tolC, het weergeven van de capaciteit van deze test om de impact van individuele efflux pomp componenten te onderzoeken. In dit geval, hoewel er een toename van intracellulaire fluorescentie in vergelijking met de wilde type bacteriën, CCCP accumulatie nog steeds toegenomen. Deze bevindingen geven aan dat tolC deelneemt aanTMP efflux, maar niet de enige PMF-drive pomp is.

Figuur 4 toont het resultaat van hetzelfde experiment als figuur 2,maar met de accumulatie gemeten door flow cytometrie in plaats van spectroscopie. Dezelfde gegevenstrends werden waargenomen, waaruit blijkt dat beide technieken kunnen worden gebruikt om het fenomeen van de geëmineerde intracellulaire accumulatie te bestuderen.

Figuur 5 toont representatieve confocale microscopiebeelden van respectievelijk gram-positieve(S. aureus) en gramnegatieve bacteriën(E. coli)met tmp-NBD(1) en cipro-NBD (2 + 3) fluorescerende sondes. In beide gevallen werd de rode membraankleurstof FM4-64FX toegevoegd om co-lokalisatie te vergelijken. Voor TMP-NBD werd ook de blauwe nucleïnezuurkleurstof Hoechst-33342 gebruikt. Door deze beelden te overdoden, werd de lokalisatie van het antibioticum in de bacteriën gevisualiseerd. Het vergelijken van de panelen 2 en 3 laat zien hoe de impact van de efflux werd onderzocht, met de efflux-remmer CCCP die in 2 wordtgebruikt, wat resulteert in intracellulaire accumulatie. In paneel 3is geen CCCP toegevoegd. Vandaar dat de Efflux actief is en er geen sondeaccumulatie werd gezien.

Figuur 6 toont representatieve confocale microscopiebeelden van Gram-positieve(S. aureus)bacteriën met DMACA-gelabelde oxazolidinone sonde Lz-NBD. De rode membraan kleurstof FM4-64FX werd toegevoegd om co-lokalisatie te vergelijken, en de groene nuclec zuur kleurstof Hoechst-33342 werd ook gebruikt. Door deze beelden te overdoden, werd de lokalisatie van het antibioticum in de bacteriën gevisualiseerd, die interne lokalisatie duidelijk van het membraan en het nucleïnezuur toont.

Tabel 1 toont MIC-waarden voor drie reeksen fluorescerende antibiotica, ciprofloxacine, trimethoprim (TMP) en linezolid (Lz), met gegevens die worden gepresenteerd voor het moederantibioticum, NBD en DMACA-derivaten van elk. Representatieve soorten voor elk antibioticum werden gekozen, waaronder zowel gram-positief als gram-negatief. Voor de ciprofloxacine-serie verloren beide fluorescerende sondes antibioticaactiviteit in vergelijking met het moedermedicijn, maar behielden enige activiteit tegen alle soorten. Op dezelfde manier verloren de linezolidss enige activiteit, maar bleven een matig tot zwak antibioticum. De TMP-sondes verloren bijna alle activiteit tegen wilde bacteriën, maar waren actief tegen efflux-tekort E. coli, wat aangeeft dat het verlies van antibacteriële activiteit te wijten was aan gebrek aan accumulatie.

Figure 1
Figuur 1: Synthese en structuren van antibiotica-afgeleide sondes. (A) Het algemene reactieschema voor de synthese van tl-antibioticasondes van azide-antibiotica en alkyne-fluorophores. (B) De structuren van onze gepubliceerde sondes op basis van ciprofloxacine, trimethoprim en linezolid. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Meting van de zuiverheid van de door antibiotica afgeleide sonde door LCMS. Analytische LCMS-sporen van (1) onvolledig, (2) compleet en (3) HPLC gezuiverdciprofloxacine-N3 + NBD-alkyne klikreacties die het verdwijnen van uitgangsmateriaal aantonen na het voltooien van de reactie, en diverse pieken op zuivering. A = UV-Vis spoor (absorptie bij 250 nm), B = MS trace (positieve en negatieve modus). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Plaatlezer meting van op antibiotica afgeleide sondeaccumulatie. Fluorescentiespectroscopische meting van cellulaire accumulatie van TMP-NBD (50 μM) in wilde type (1, ATCC 25922) en ΔtolC (2, ATCC 25922) E. coli geïncubeerd(A) met en(B)zonder toevoeging van CCCP (100 μM). Statistische significantie (**p ≤ 0,01; ***p ≤ 0,001) wordt weergegeven tussen de afwezigheid of aanwezigheid van CCCP en tussen het wilde type en ΔtolCE. coli. Gerapporteerde gegevens zijn het gemiddelde ± SD voor drie experimenten. Dit cijfer is aangepast aan onze vorige publicatie15, en illustreert het gebruik van spectroscopie om de rol van efflux op intracellulaire accumulatie op te helderen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Flow cytometrie meting van opantibiotica afgeleide sondeaccumulatie. Flow cytometrie meting van cellulaire accumulatie met Behulp van TMP-NBD in het wild type (1, ATCC 25922) en ΔtolC (2, ATCC 25922) E. coli geïncubeerd met en zonder toevoeging van CCCP (100 μM). Mediane fluorescentieactiviteit wordt aangetoond van 10.000 bacteriële voorvallen, Statistische significantie (***, p ≤ 0,001; ****, p ≤ 0,0001) wordt weergegeven tussen de afwezigheid en aanwezigheid van CCCP en tussen het wilde type en ΔtolCE. coli. Gerapporteerde gegevens zijn het gemiddelde ± SD voor drie experimenten. Dit cijfer is aangepast aan onze vorige publicatie15, en illustreert het gebruik van flow cytometrie om de rol van efflux op intracellulaire accumulatie op te helderen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Confocale microscopievisualisatie van nbd-sondelokalisatie. Confocale microscopie beelden van 1) live S. aureus gelabeld met Hoechst-33342 (blauw, nucleïnezuur), TMP-NBD (groen), FM4-64FX (rood, membraan), en bedekt; 2) live E. coli behandeld met CCCP (efflux-remmer) met cipro-NBD (groen), FM4-64FX (rood, membraan) en bedekt; 3) live E. coli gelabeld met cipro-NBD (groen), FM4-64FX (rood, membraan), en bedekt. Dit cijfer is aangepast aan onze eerdere publicaties15,16, en illustreert het gebruik van microscopie om de lokalisatie van sondes te onderzoeken, inclusief de impact van de efflux. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Confocale microscopievisualisatie van DMACA-sondelokalisatie. Confocale microscopie beelden van live S. aureus gelabeld met oxazolidinone sonde Lz-DMACA (blauw), Sytox groen (groen, nucleïnezuur), en FM4-64FX (rood, membraan). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

MIC (μg/mL)
Soort(en) Stam Cipro Cipro-NBD Cipro-DMACA Tmp TMP-NBD TMP-DMACA Linezolid (Lz) Lz-NBD Lz-DMACA
Staphylococcus aureus ATCC 25923 0.125 - 0.5 32 - ≥64 16 1 16 >64
ATCC 43300 1 16 >64
Streptococcus pneumoniae ATCC 700677 1 4 64
Enterococcus faecium ATCC 35667 1 - 8 32 32 - ≥64
ATCC 51559 2 16 32
Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 0.015 - 0.06 8 - 16 8 - 32
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 0.25 - 1 32 - ≥64 32 - ≥64
Escherichia coli ATCC 25922 ≤0,004 8 2 0.5 >64 >64
Mutant ΔtolC 0.125 0.25 2

Tabel 1. Antibiotica-activiteiten van fluorescerende antibioticasondes op basis van ciprofloxacine, trimethoprim en linezogleed tegen passende klinisch relevante bacteriële stammen, zoals gemeten door bouillonmicrodilning MIC-tests. In de meeste gevallen verloren de sondes enige activiteit in vergelijking met het bovenliggende medicijn, maar behielden ze een meetbare antibioticapotentie (voldoende om nuttig te zijn in verdere studies).

Discussion

De oprichting van een succesvolle fluorescerende antibioticum sonde moet beginnen met zorgvuldige planning en overweging van de SAR van de ouder drug. Als de SAR niet bekend of volledig wordt onderzocht, moeten mogelijk verschillende opties worden getest om een locatie te vinden die selectief kan worden gewijzigd zonder de biologische activiteit af te schaffen. Zodra een site/s is geïdentificeerd, is de installatie van een linkermoiety vaak essentieel om een steric afstand te bieden tussen de biologische plaats van handeling en het inactieve fluoroffere. Er moet voor worden gezorgd dat de reactie die wordt gebruikt om de linker aan het antibioticum te bevestigen, een biostabiele functionele groep achterlaat, waardoor bijvoorbeeld esters worden vermeden die gevoelig zijn voor decolleté door esterases in vivo. Afhankelijk van het farmacodynamische en farmacokinetische profiel van het antibioticum kan een eenvoudige alkyl-linker worden gebruikt, of anders moet een minder lipofiele optie zoals een linkerpolyethyleenglycol (PEG) worden overwogen. Met de linker eraan moet de antibacteriële activiteit worden beoordeeld om ervoor te zorgen dat de MIC's tegen relevante bacteriën vergelijkbaar zijn met de bovenliggende verbinding.

In dit werk raden we het gebruik van Huigsen azide-alkyne [3+2] dipolaire cycloaddition (klik chemie, zie figuur 1) aan om fluorophore te ligate neigen tot antibioticum, om een aantal redenen. Klikreacties zijn zeer selectief, wat betekent dat bescherming van reactieve groepen op het antibioticum niet nodig is, en verder laat de reactie een stabiele, biocompatibele triazole moiety achter. De azide component wordt geïntroduceerd in het antibioticum gedeelte in onze procedures, omdat dit over het algemeen gemakkelijker wordt bereikt met een verscheidenheid van structurele types dan de invoering van een alkyne. De syntheses van twee alkyne-derivatized fluorophores worden hier beschreven, hoewel anderen indien gewenst kunnen worden onderzocht. NBD en DMACA werden gekozen vanwege hun kleine omvang, waardoor de mogelijkheid van interferentie met celpenetratie en doelinteractie tot een minimum werd beperkt. De klikreactie zelf wordt uitgevoerd met behulp van koperkatalyse, waarbij cu2+ (CuSO4, met een ascorbinezuur) of Cu+ (CuI) als startreagens kan worden gebruikt. Na zuivering (figuur 2), moeten de MIC's vervolgens worden getest zoals bij de azide. Zelfs met zorgvuldige overweging van fluorophore keuze en de plaats van gehechtheid, is het mogelijk dat een slechte antibiotica activiteit zal worden waargenomen. Dit betekent echter niet dat een inactieve sonde zonder gebruik is. Zoals getoond met de TMP sondes, verbindingen met een slechte antibacteriële activiteit kan nog steeds binden aan hetzelfde doel als de moederdrug. Dit kan studies mogelijk maken naar de werkingswijze en het onderzoeken van verschijnselen die leiden tot resistentie, zoals de Efflux.

Zoals beschreven in de protocollen sectie, is het mogelijk om bacteriële etikettering te analyseren door de fluorescerende antibiotica met behulp van een eenvoudige spectrofotometrie test (Figuur 3) of flow cytometrie (figuur 4). Beide methoden zijn in staat om cellulaire accumulatie te kwantificeren, en door cellen te lyseren en fluorescentielokisatie in lysaat te onderzoeken, is het mogelijk om intracellulaire accumulatie te beoordelen. In dit protocol wordt het gebruik van lysozyme voor cellyse beschreven, omdat dit een snelle, universele techniek is. Andere lysisaandoeningen, zoals 's nachts behandeling met glycine-HCl7, zijn ook met succes gebruikt. Met behulp van deze techniek is het mogelijk om de impact van efflux op de cellulaire accumulatie van antibiotica te bestuderen, wat een belangrijk mechanisme van resistentie is. Als efflux inderdaad aanwezig is in de bacteriën, zal een gebrek aan intracellulaire accumulatie worden waargenomen, hoewel dit kan worden gered met behulp van een efflux-remmer zoals CCCP.

Microscopie kan ook worden uitgevoerd om de lokalisatie van sondes in verschillende bacteriën visueel te inspecteren, waarbij informatie wordt verkregen over de werkingswijze en mogelijk ook resistentie (zie figuur 5 voor representatieve voorbeelden). Om lokalisatie binnen bacteriën te zien, is een confocale microscoop met hoge resolutie vereist, uitgerust met mogelijkheden zoals SIM (gestructureerde verlichtingsmicroscopie), SR-SIM (superresolutie-SIM), Airyscan of STED (gestimuleerde emissie-uitputting). Bovendien moeten hoogwaardige afdekkingsbonnen worden gebruikt en moeten nabeeldvormingsanalyses worden uitgevoerd op een geschikte software (bijvoorbeeld FIJI, Zen of Imaris). Lokalisatie van sondes wordt vergeleken met kleurstoffen die specifieke architecturen bevlekken, zoals Hoechst-33342 (blauw, nucleïnezuur), Syto-9 (groen, nucleïnezuur) en FM4-64FX (rood, membraan). De keuze van kleurstoffen moet worden gemaakt om het fluorescerende antibioticum wedstrijd, zodat elke gebruikte kleur heeft minimale spectrale overlap. Om de best mogelijke beelden te verkrijgen, kan optimalisatie nodig zijn. Bijvoorbeeld, als bacteriën te druk op de glijbaan, neem slechts een deel van de zwevende pellet, dan verdunnen met meer montage medium. In tegenstelling, als bacteriën zijn te schaars op de dia, gewoon beginnen met meer bacteriën. In dit protocol wordt het gebruik van een thermoomkeerbare gel die compatibel is met levende cellen (bijvoorbeeld Cygel) aanbevolen voor live celbeeldvorming, omdat het bacteriën immobiliseert (inclusief motile bacteriën), maar ook andere montagemedia of agarose zijn met succes gebruikt.

Over het algemeen maken de eenvoud van het gebruik en hun veelzijdigheid deze sondes, ondanks de uitdagingen waarmee zij geconfronteerd kunnen worden bij de bereiding van een biologisch actieve fluorescerende antibioticaderivaten, aantrekkelijke instrumenten voor onderzoek in AMR. Toekomstig werk met fluorescerende antibiotica heeft het potentieel om inzicht te geven in mechanismen van antibioticaresistentie, ons begrip te verbeteren van hoe de huidige antibiotica werken en de ontwikkeling van betere geneesmiddelen te helpen.

Disclosures

De auteurs hebben niets te verklaren.

Acknowledgments

MRLS wordt ondersteund door een Australian Postgraduate Award (APA) en een Institute for Molecular Biosciences Research Advancement Award. Wanida Phetsang werd ondersteund door UQ International Scholarship (UQI) en IMB Postgraduate Award (IMBPA). MAC is een NHMRC principe research fellow (APP1059354) en heeft ook een fractionele professorial onderzoek collega-benoeming aan de Universiteit van Queensland, met zijn resterende tijd als CEO van Inflazome Ltd, een bedrijf dat geneesmiddelen ontwikkelt om klinische onvervulde behoeften bij ontstekingsziekte aan te pakken. MATB wordt mede ondersteund door Wellcome Trust Strategic Grant WT1104797/Z/14/Z en NHMRC Development grant APP1113719. Microscopie werd uitgevoerd op de Australian Cancer Research Foundation (ACRF)/Institute for Molecular Bioscience Cancer Biology Imaging Facility, die werd opgericht met de steun van de ACRF.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-(dimethylamino)phenol Alfa-Aesar B23067
4-chloro-7-nitro-benzofuran Sigma-Aldrich 163260-5G
Amicon Ultra-0.5 centrifugal filter unit with Ultracel- 10 membrane Merck UFC501096
Atlantis Prep T3 OBD (100 A, 5 uM, 10x250 mm) Waters 186008205
Atlantis T3 column (100 A, 5 uM, 2.1 × 50 mm) Waters 186003734
Bruker Avance 600 MHz spectrometer Bruker
Buchi Reveleris C18 12g Cartridge Buchi BUC145152103
CCCP Sigma-Aldrich C2759
Celite 545 Sigma-Aldrich 22140-5KG-F
Cygel ABCAM Ab109204
Elyra PS,1 SIM/STORM confocal microscope Zeiss
FM4-64FX, fixable analog of FM™ 4-64 membrane stain Life Technologies Australia Pt F34653
Gallios flow cytometer Beckman Coulter
Gamma 2-16 LSCplus lyophilise CHRIST
Gilson HPLC 2020 Gilson
Hanks' Balanced Salt solution, Modified, with sodium bicarbonate, without phenol red, calcium chloride and magnesium sulfate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture Sigma-Aldrich H6648-500ML
Hettich Zentrifugen Rotofix 32 Hettich
High performance #1.5 cover slips (18 x 18 mm) Schott/Zeiss 474030-9000-000
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - Fluo Life Technologies Australia Pt H21492
LB AMRESCO J106
Leica STED 3X Super Resolution Microscope with White Light Laser excitation Leica
Lysozyme from chicken egg white
lyophilized powder		 Sigma-Aldrich L6876
Mueller Hinton II Broth Cation adjusted Becton Dickinson 212322
Propargylamine Sigma-Aldrich P50900-5G
Reveleris GRACE MPLC Buchi
Shimadzu LCMS-2020 Shimadzu
Sigma 1-15 Microcentrifuge Sigma-Aldrich
Silica gel 60 (0.040-0.063 mm) for column chromatography (230-400 mesh ASTM) Merck 1093859025
SYTO 9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain Life Technologies Australia Pt S34854
TECAN Infinite M1000 PRO TECAN

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cai, H., Rose, K., Liang, L. H., Dunham, S., Stover, C. Development of a liquid chromatography/mass spectrometry-based drug accumulation assay in Pseudomonas aeruginosa. Analytical Biochemistry. 385 (2), 321-325 (2009).
  2. Bhat, J., Narayan, A., Venkatraman, J., Chatterji, M. LC-MS based assay to measure intracellular compound levels in Mycobacterium smegmatis: Linking compound levels to cellular potency. Journal of Microbiological Methods. 94 (2), 152-158 (2013).
  3. Davis, T. D., Gerry, C. J., Tan, D. S. General Platform for Systematic Quantitative Evaluation of Small-Molecule Permeability in Bacteria. ACS Chemical Biology. 9 (11), 2535-2544 (2014).
  4. Richter, M. F., et al. Predictive compound accumulation rules yield a broad-spectrum antibiotic. Nature. 545, 299 (2017).
  5. Iyer, R., et al. Evaluating LC-MS/MS To Measure Accumulation of Compounds within Bacteria. ACS Infectious Diseases. 4 (9), 1336-1345 (2018).
  6. Prochnow, H., et al. Subcellular Quantification of Uptake in Gram-Negative Bacteria. Analytical Chemistry. 91 (3), 1863-1872 (2019).
  7. Dumont, E., et al. Antibiotics and efflux: combined spectrofluorimetry and mass spectrometry to evaluate the involvement of concentration and efflux activity in antibiotic intracellular accumulation. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 74 (1), 58-65 (2019).
  8. Stone, M. R. L., Butler, M. S., Phetsang, W., Cooper, M. A., Blaskovich, M. A. T. Fluorescent Antibiotics: New Research Tools to Fight Antibiotic Resistance. Trends in Biotechnology. 36 (5), 523-536 (2018).
  9. Piddock, L. J. V., Johnson, M. M. Accumulation of 10 fluoroquinolones by wild-type or efflux mutant Streptococcus pneumoniae. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (3), 813-820 (2002).
  10. Mortimer, P. G. S., Piddock, L. J. V. A comparison of methods used for measuring the accumulation of quinolones by enterobacteriaceae, pseudomonas aeruginosa and staphylococcus aureus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 28 (5), 639-653 (1991).
  11. Li, X. Z., Nikaido, H., Poole, K. Role of MexA-MexB-OprM in antibiotic efflux in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (9), 1948-1953 (1995).
  12. Vince, R., Weiss, D., Pestka, S. Binding of N-substituted erythromycylamines to ribosomes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 9 (1), 131-136 (1976).
  13. Vazquez, D. Antibiotics affecting chloramphenicol uptake by bacteria Their effect on amino acid incorporation in a cell-free system. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Nucleic Acids and Protein Synthesis. 114 (2), 289-295 (1966).
  14. Phetsang, W., et al. An azido-oxazolidinone antibiotic for live bacterial cell imaging and generation of antibiotic variants. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 22 (16), 4490-4498 (2014).
  15. Phetsang, W., et al. Fluorescent trimethoprim conjugate probes to assess drug accumulation in wild type and mutant Escherichia coli. ACS Infectious Diseases. 2 (10), 688-701 (2016).
  16. Stone, M. R. L., et al. Fluoroquinolone-derived fluorescent probes for studies of bacterial penetration and efflux. MedChemComm. 10 (6), 901-906 (2019).

Tags

Immunologie en infectie antibioticum resistentie bacteriën efflux fluorescerend microscopie
Visualisatie van bacteriële resistentie met behulp van fluorescerende antibiotica sondes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stone, M. R. L., Phetsang, W.,… More

Stone, M. R. L., Phetsang, W., Cooper, M. A., Blaskovich, M. A. T. Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes. J. Vis. Exp. (157), e60743, doi:10.3791/60743 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter