Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Visualisering av bakteriell resistens med fluorescerande antibiotikasonder

Published: March 2, 2020 doi: 10.3791/60743
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Centre for Superbug Solutions, Institute for Molecular Biosciences, The University of Queensland

Summary

Fluorescerande märkta antibiotika är kraftfulla verktyg som kan användas för att studera flera aspekter av antimikrobiell resistens. Denna artikel beskriver beredningen av fluorescerande taggade antibiotika och deras tillämpning på att studera antibiotikaresistens hos bakterier. Sonder kan användas för att studera mekanismer för bakteriell resistens (t.ex. efflux) genom spektrophotometri, flödescytometri och mikroskopi.

Abstract

Fluorescerande antibiotika är mångsidiga forskningsverktyg som lätt används för studier av antimikrobiell resistens, på grund av deras betydande fördel jämfört med andra metoder. För att förbereda dessa sonder syntetiseras azidderivat av antibiotika, sedan tillsammans med alkyne-fluorofforer med azidalkyne dipolär cykloaddition genom klickkemi. Efter rening testas fluorescerande antibiotikas antibiotikas antibiotikas antibiotiska aktivitet genom minsta analys av hämmande koncentration. För att studera bakteriell ackumulering kan antingen spektrofotometri eller flödescytometri användas, vilket möjliggör mycket enklare analys än metoder som förlitar sig på radioaktiva antibiotikaderivat. Dessutom kan konfokal mikroskopi användas för att undersöka lokalisering inom bakterierna, vilket ger värdefull information om verkningssätt och förändringar som sker i resistenta arter. Användningen av fluorescerande antibiotikasonder i studien av antimikrobiell resistens är en kraftfull metod med stor potential för framtida expansion.

Introduction

Antimikrobiell resistens (AMR) är en stigande kris som utgör ett stort hot mot människors hälsa runt om i världen. Resistens mot de flesta antibiotika har rapporterats, och infektioner orsakade av bakterier som är resistenta mot alla kliniskt tillgängliga läkemedel växer fram. För att bekämpa uppkomsten av amr måste vi öka vår förståelse av detta mångfacetterade fenomen och de underliggande mekanismerna och interaktionerna mellan antibiotika och bakterier. En aspekt som historiskt dåligt har förstått är permeationen av antibiotika till bakterier, tillsammans med fenomenen av ackumulering och efflux. Denna kunskap är avgörande för att utforma nya läkemedel och förståelse mekanismer för resistens. Detta spelar därför en avgörande roll i AMR-forskningen.

Det finns två huvudsakliga metoder som kan vidtas för att mäta antibiotikakoncentration: mätning av läkemedlet direkt eller märkning med en moiety som syftar till att underlätta kvantifiering. Även om märkning av antibiotika förbättrar upptäckt, kan detta störa den biologiska aktiviteten hos läkemedlet, såsom antimikrobiell aktivitet och permeabilitet. Detta är inte ett problem för otaggade metoder; detektion kan dock vara utmanande. Under de senaste åren har tekniska framsteg lett till en boom i forskning som använder massa pektrometri (MS) för att direkt mäta antibiotikakoncentrationen i bakterier1,2,3,4,5,6,7. Dessa studier har visat att det är möjligt att studera intracellulär ackumulering i en mängd olika bakterier, med gramnegativa bakterier som de mest studerade. Kvantifiering av molekylpermeabilitet har sedan kopplats till aktivitet och används för att informera läkemedelsutveckling2,3,4, men försiktighet måste iakttas när direkt sammanfallande ackumulering och målaktivitet5. Före ms utveckling, den enda antibiotika vars koncentration kunde mätas direkt var de som har inneboende fluorescens, såsom tetracyklin och kinoloner8,9,10,11. Även om det uppenbarligen begränsades i omfattning undersöktes och kvantifierades ackumulering och kvantifierades, vilket illustrerar nyttan av fluorescensbaserad kvantifiering.

Taggade antibiotika har använts i många decennier för att studera distributioner, handlingssätt och resistens, med radioaktiva och fluorescerande taggar är vanligt. Radiotaggade sonder har fördelen av att vara nästan identiska med den överordnade föreningen, därav den biologiska aktiviteten är osannolikt att vara betydligt annorlunda. Isotoper som 3H, 14C och 15N har ofta använts på grund av framträdandet av dessa element i antibiotika, och en mängd olika antibiotika byggnadsställningar har undersökts1,10,12,13. Även om detektion av radiosonder är enkel, finns det ett antal logistiska problem (t.ex. säkerhet, isotop halveringstid) som har begränsat användningen av detta tillvägagångssätt. En annan strategi är fluorescerande taggade antibiotika. Dessa sonder kan användas för att undersöka spridning och handlingssätt och resistens hos det överordnade läkemedlet, med hjälp av enklare teknik än MS och utan logistiska problem med strålning8. Den största nackdelen med detta tillvägagångssätt är att antibiotika är i allmänhet relativt små molekyler, därav införandet av en fluorescerande moiety utgör en betydande kemisk förändring. Denna förändring kan påverka fysiokemiska egenskaper och antibakteriell aktivitet. Därför måste man se till att bedöma dessa faktorer för att generera resultat som är representativa för moderantibiotikan.

I detta arbete beskrivs en metod för att syntetisera, bedöma och använda fluorescerande antibiotika, som i våra tidigare publikationer14,15,16. Genom tidigare arbete har ett antal fluorescerande antibiotika förberetts och använts för en mängd olika ändamål (se Sten m.fl.8). För att minimera sannolikheten för att påverka biologisk aktivitet används mycket små fluorofforer i detta arbete: nitrobenzoxadiazole (NBD, grön)och 7-(dimetylamino)-2-oxo-2 H-krom-4-yl (DMACA, blå). Vidare beskrivs bedömningen av antibakteriell aktivitet med hjälp av den lägsta mikrobrotsutspädningskoncentrationen (MIC), så att effekten av ändringar på aktiviteten kan mätas. Dessa fluorescerande taggade sonder kan användas i spektrofotometriska analyser, flödecytometri och mikroskopi. Utbudet av möjliga tillämpningar är där fördelen med fluorescerande antibiotika ligger. Cellulär ackumulering kan kvantifieras, kategoriseras och visualiseras, något som inte är möjligt med hjälp av MS ensam. Förhoppningen är att den kunskap som erhållits genom användning av fluorescerande antibiotika kommer att bidra till vår förståelse av resistens, och kampen mot AMR.

Protocol

1. Syntes av Alkyne-fluorofforer

  1. Syntes av NBD-alkyne (7-nitro-N-(prop-2-yn-1-yl)benzo[c][1,2,5]oxadiazol-4-amine)
    1. Lös upp 1 031 mg 4-kloro-7-nitro-benzofuran (5.181 mmol) i 60 ml tetrahydrofuran (THF). Tillsätt 1 857 mg CsCO3 (5,696 mmol), sedan 0,39 ml propargylamin (6,1 mmol). Värm reaktionen till 50 °C för 2 h, som svänger från brunt till grönt, sedan svalna till rumstemperatur (RT).
    2. Filtrera reaktionen med hjälp av ett filtreringshjälpmedel (se Materialtabell)och tvätta med etylacetat (EA). Koncentrera filtratet under reducerat tryck och lös sedan upp återstoden i 150 ml EA och flytta till en 500 ml separattratt.
    3. Tvätta EA-lösningen med 100 ml med vatten respektive saltlake. Kombinera sedan de vattenhaltiga faserna och tvätta 2x med 100 ml EA.
    4. Torka de kombinerade organiska faserna över vattenfri magnesiumsulfat, filtrera och koncentrera dig under reducerat tryck.
    5. Rena råprodukten genom flashkromatografi på kiselgel (20–30 % EA i petroleumeter [PE]), kontroll renhet genom flytande kromatografimasspektrometri (LCMS, [M+H]+ = 219.1) och/eller kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopi, kemiska förändringar enligt följande:
      1 H NMR (CD3OD, 600 MHz) δ 8,54 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 6,35 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 4,31 (dd, J = 5,7 Hz, J = 2,5 Hz, 2H), 2,43 (t, J = 2,5 Hz, 1H); 13 C NMR (CD3OD, 150 MHz) δ 144,3, 143,7, 142,2, 135,8, 125,7, 100,0, 76,5, 74,2, 33,4.
      OBS: När du utför rening genom kiselgel kromatografi, förbereda kolonnen med mindre polarav de angivna lösningsmedelna. Rå förening kan antingen laddas som en koncentrerad lösning eller adsorbed på kiseldioxid om löslighet inte tillåter det. Efter att föreningen har lagts till i toppen av kiseldioxid, gå igenom 1-2 kolumn volymer av samma lösningsmedel som används för kiseldioxid vätning. Börja sedan med det lösningsmedelsförhållande som anges, löper genom minst 1 kolumnvolym av varje lösningsmedel och se till att inte göra stora hopp i lösningsmedelssammansättning. Samla fraktioner och kontrollera renhet/identitet genom LCMS eller TLC (tunn lagerkromatografi). Kombinera rena fraktioner och koncentrera sig under minskat tryck genom roterande avdunstning.
  2. Syntes av DMACA-alkyne (2-(7-(dimetylamino)-2-oxo-2H-krom-4-yl)-N-(prop-2-yn-1-yl)acetamide).
    1. Lös upp 5,02 g 3-(dimetylamino)fenol (36,6 mmol) i 30 ml etanol, tillsätt sedan 6,7 ml diethyl 1,3-acetonedicarboxylate (36 mmol). Tillsätt 10,5 g ZnCl2 (77,2 mmol), sedan reflux den röda lösningen för 42 h. Tillsätt ytterligare 9,20 g ZnCl2 (67,6 mmol), sedan reflux för 8 h.
    2. Kyl reaktionen och koncentrera dig under reducerat tryck. Sprid den resulterande röda fasta i 200 ml EA, filtrera, sedan överföra till en 500 ml separera tratt.
    3. Tvätta EA med 200 ml vardera vatten och saltlake, torka sedan över vattenfri magnesiumsulfat. Filtrera den torkade organiska fasen och koncentrera dig under reducerat tryck.
    4. Rena den röda fasta (etyl 2-(7-(dimetylamino)-2-oxo-2H-kromat-4-yl)acetat) genom blixtkromatografi på kiselgel (0–100% EA i PE), kontrollrenhet av LCMS ([M+H]+ = 275,1) och/eller NMR, kemiska förändringar enligt följande:
      1 H NMR (CDCl3, 600 MHz) δ 7,30 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 6,52 (dd, J = 8,9 Hz, J = 2,6 Hz, 1H), 6,40 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 5,87 (m, 1H), 2,96 (m, 8H), 2,25 (d, J = 1,2 Hz, 3H).
    5. Lös upp 488 mg etyl 2-(7-(dimetylamino)-2-oxo-2H-krom-4-yl)acetat (1,18 mmol) i 10 ml THF, tillsätt sedan en lösning på 157 mg LiOH· H2O (3,74 mmol) i 15 ml vatten. Rör reaktionen på RT för 3 h, sedan flytta till en separera tratt och späd med ytterligare 50 ml vatten.
    6. Tvätta reaktionsblandningen 2x med 50 ml dietyleter (Et2O), tvätta sedan den kombinerade organiska fas 2x med 25 ml vatten. Ta någon gul fällning med det organiska lagret. Koncentrera den organiska fasen under reducerat tryck med hjälp av en roterande förångare.
    7. Försura vattenfasen till pH = 2 med koncentrerad HCl och kyl till 4 °C över natten. Filtrera den syrade vattenfasen och tillsätt den gula fasta till den koncentrerade organiska fasen.
      OBS: Den 2-(7-(dimetylamino)-2-oxo-2H-kromat-4-yl)ättiksyra kan användas utan ytterligare rening, men detta kan kontrolleras av LCMS ([M + H]+ = 247,1) och/eller NMR, kemiska förändringar enligt följande:
      1 H NMR (CDCl3, 600 MHz) δ 7,41 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 6,62 (dd, J = 9,2 Hz, J = 2,8 Hz, 1H), 6,52 (d, J = 2,8 Hz, 1H), 5,98 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 3,05 (s, 6H), 2,35 (d, J = 0,9 Hz, 2H); 13 C NMR (CDCl3,150 MHz) δ 162.2, 155.7, 152.9, 152.8, 125.3, 109.7, 109.3, 109.1, 108.8, 98.3, 40.2, 18.5.
    8. Lös upp 466 mg 2-(7-(dimetylamino)-2-oxo-2H-krom-4-yl)ättiksyra (1,89 mmol) i 7 ml torr N,N-dimetylformamid (DMF) och placera under en atmosfär av kväve.
    9. Lös 0,33 ml propargylamin (5,1 mmol) i 7 ml torr DMF under kväve. Tillsätt 1,30 ml di-isopropylethyl amine (DIPEA, 7,50 mmol) till färglösningen, sedan 535 mg O-(1H-6-chlorobenzotriazole-1-yl)-1,1,3,3,3-tetramethyluronium hexafluorfosfat (HCTU, 1,29 mmol). Rör om den aktiverade färglösningen i 15 min på RT, tillsätt sedan aminlösningen på ett dropwise och låt röra om över natten.
    10. Nästa dag spädreaktionen med 35 ml vatten och koncentrera dig sedan under reducerat tryck.
    11. Skilj upp den resulterande orangefasta mellan EA och saltlake (100 ml vardera) i en 250 ml-separattratt. Separera skikten (kör de två lagren i olika flaskor) och tvätta vattenfasen med 100 ml EA.
    12. Koncentrera de kombinerade organiska faserna under reducerat tryck och lös sedan upp den orangefasta i 3 ml 1:1 acetonitrile (ACN)/vatten (v/v). Rena råprodukten genom att injicera på ett vätskekromatografisystem för omvänd fas (MPLC) som är utrustat med en C18-kassettkolonn (lösningsmedel A: vatten, lösningsmedel B: ACN).
    13. Kontrollera fraktioner för renhet av LCMS ([M+H]+ = 284,1, NMR kemiska förändringar som anges nedan), kombinera och lyofilize lämpliga fraktioner för att ge 2-(7-(dimetylamino)-2-oxo-2H-krom-4-yl)-N-(prop-2-yn-1-yl)acetamid, NMR kemiska förändringar enligt följande:
      1 H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 8,65 (t, J = 5,4 Hz, 1H), 7,52 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 6,72 (dd, J = 9,1, 2,6 Hz, 1H), 6,55 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 6,00 (s, 1H), 3,88–3,87 (m, 2H), 3,62 (s, 2H), 3,13 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 3.01 (s, 6H); 13 C NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ 167,7, 160,7, 155,4, 152,9, 151,0, 126,0, 109,4, 109,1, 108,1, 97,5, 80,9, 73,3, 39,7, 38,4, 28,2.

2. Syntes av fluorescerande antibiotika

  1. Förbered en azid-derivat av ett antibiotikum som beskrivs tidigare14,15,16.
    OBS: Förfarandet är specifikt för varje antibiotikum och kräver noggrann undersökning av strukturen aktivitetsförhållande (SAR) av modermolekylen för att säkerställa att den funktionaliserade antibiotika behåller aktivitet jämförbar med föräldern. (t.ex. ciprofloxacin16, linezolid14, och trimethoprim15). Se figur 1 för exempel på publicerade fluorescerande antibiotika och det allmänna syntessystemet.
  2. Klicka reaktionsprocedur A
    OBS: För de flesta av antibiotika, följ förfarandet som beskrivs här för koppar katalyserade Huisgen [2 +3] cycloaddition av azid (steg 2.1) och fluorescerande alkyne (beredd i steg 1).
    1. Placera azid-antibiotikumet i en rund bottenkolv och tillsätt tert-butanol(tBuOH) och vatten (1:1 v/v, 25 ml vardera per mmol azid).
    2. Tillsätt fluorofforsalkyne beredd i steg 1.1 (3 eq.) och värm reaktionen till 50 °C. Tillsätt sedan kopparsulfat (100 mM i vatten, 0,6 eq.) till reaktionen, följt av askorbinsyra (500 mM i vatten, 2,4 eq.).
    3. Rör om reaktionen vid 50 °C för 1 h, eller tills analysen av LCMS vid indikation på reaktionskompletteringen (fullständig förbrukning av startazid).
    4. Kyl reaktionen och rena beroende på vad som är lämpligt för antibiotikabyggnadsställningen och fortsätt för rening antingen steg 2.3 eller 2.4.
      OBS: Flera olika reningsmetoder är möjliga, beroende på byggnadsställningens polaritet och stabilitet.
  3. Klicka reaktionsprocedur B
    OBS: Följ detta förfarande för peptidbaserade antibiotika, för att ge starkare reaktionsförhållanden (opublicerat arbete, Phetsang, 2019).
    1. Placera peptidaa-antibiotikum i en rund bottenkolv och tillsätt tillräckligt DMF (750 ml/mmol azid) för att lösa upp.
    2. Tillsätt fluorofforsalkyne beredd i steg 1 (5 eq.) och värm reaktionen till 50 °C för 1 h.
    3. Tillsätt koppar (I) jodid (20 eq.), sedan DIPEA (120 eq.), sedan ättiksyra (240 eq.).
    4. Rör om reaktionen vid 50 °C för 1 h, eller tills analysen av LCMS indikerar att reaktionsavslutningen (dvs. fullständig förbrukning av startazid). Kyl reaktionen och fortsätt för rening med metod 1 (se steg 2.3).
  4. Reningsmetod 1 (används för ciprofloxacin, trimetoprim och linezolid)
    1. Injicera den kylda klickreaktionen direkt på en MPLC C18-kassettkolumn.
    2. Införliva en lång tvättfas (ungefär 10 min) i början av körningen (100% lösningsmedel A), kör sedan en lutning upp till 100% lösningsmedel B, följt av en återgång till lösningsmedel A.
      Obs: Lösningsmedel A kan väljas från vatten, 0,05–0,1 % myrsyra (FA) i vatten, 0,05–0,1 % trifluoroacettiksyra (TFA) i vatten, beroende på löslighet, stabilitet och den bästa upplösningen av toppar. Lösningsmedel B kan väljas från acetonitrile (ACN), 0,05–0,1 % FA i ACN, 0,05–0,1 % TFA i ACN, för att matcha lösningsmedel A. Om elution visar sig vara svårt kan metanol användas i stället för ACN.
    3. Samla in och kombinera lämpliga fraktioner, vilket indikeras av LCMS och färg (korrekt massa sett, singular topp), sedan lyofilize att ge (semi) ren fluorescerande antibiotika.
    4. Ytterligare rena produkten om det behövs. Bedöma renhet av NMR och/eller LCMS och högtrycksvätskekromatografi (HPLC), med hjälp av en kolonn och metod som är lämplig för byggnadsställningen.
  5. Reningsmetod 2
    OBS: Om löslighet tillåter, prepurification kan utföras av vattenlösning (används för makrolider, opublicerat arbete, Stone 2019).
    1. Späd den kylda klickreaktionen med vatten och Et2O (1:1 v/v, cirka 10-faldig utspädning från den första reaktionsvolymen), överföra till en lämplig storlek som separerar tratt.
    2. Separera lagren och tvätta vattenfasen två gånger med Et2O.
    3. Tvätta de kombinerade organiska faserna 2x med vatten (lika volym med organisk fas), torka sedan över Na2SO4.
    4. Filtrera den torkade organiska fasen och koncentrera dig under reducerat tryck.
    5. Rena råprodukten av MPLC och/eller HPLC enligt beskrivningen i steg 2.4.4.
      OBS: Se bild 2 för exempel på ofullständig, fullständig och renad klickreaktion LCMS-spår. Typiska renade avkastning för antibiotika-fluoroffor klick reaktioner varierar från 30-80%.
      VARNING: De flesta av de kemikalier som används i dessa synter har särskilda säkerhetsrisker. Försiktighet måste alltid iakttas, inklusive användning av personlig skyddsutrustning. Et2O, tBuOH, FA, ättiksyra, PE, EA, THF, ACN, DMF, EtOH, DIPEA, propargylamin och HCTU är alla brandfarliga; undvika kontakt med värme- eller gnistkällor. THF, propargylamin, DIPEA, tBuOH, FA, DMF och PE är alla giftiga; undvika exponering. Propargylamin, CsCO3, ZnCl2, LiOH-H2O, DIPEA, CuI, FA, ättiksyra och HCl är alla frätande; undvika kontakt och vara medveten om ytkontakt. ZnCl2, CuSO4, CuI och PE utgör miljörisker. vara uppmärksam på villkoren för bortskaffande. THF kan bilda explosiva peroxider; vara försiktig med lagringsförhållanden. Organiska azider är explosiva; ta hand om särskilt med storskalig produktion.

3. Utvärdering av antimikrobiell aktivitet

OBS: Allt arbete som involverar bakterier bör utföras under sterila förhållanden för att undvika kontaminering av antingen analysen eller laboratoriet. Alla medier ska autoklavas före användning, och plastoch utrustning såsom pipetter måste hållas sterila. Det rekommenderas att arbetet utförs i en biocontainment huva (typ 2).

  1. Streak glycerol lager av bakteriella stammar som är lämpliga för antibiotika byggnadsställning på lysogeny buljong agar (LB, beredd per tillverkares instruktioner), och växa över natten på 37 °C.
    OBS: Valet av bakterier för att testa antibakteriell aktivitet måste göras baserat på den antibiotikabyggnadsställning som används. Ett representativt utbud av 5–10 bakterier bör väljas från de arter som är kända för att vara mottagliga för antibiotikan, med hänsyn till laboratoriets logistiska kapacitet. Om möjligt bör resistenta bakterier också testas. Protokollet nedan kommer att fungera på de flesta bakterier, men kontrollera om särskilda villkor krävs (t.ex. CO2,specialmedia) och göra ändringar vid behov. Bakterier som framgångsrikt analyseras med hjälp av dessa villkor inkluderar Staphylococci, Streptococci, Bacilli, E. coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa och Enterococcus faecium.
  2. Välj en enda koloni från plattan, och kultur över natten i 5 ml katjonjusterad Mueller-Hinton Broth (CAMHB, förberedd per tillverkares instruktioner) vid 37 °C.
  3. Späd över natten kulturer ~ 40-faldig i CAMHB och växa till en mitten av loggen fas, optisk densitet på 600 nm (OD600) = 0,4-0,8, volym 5 ml).
  4. Förbered lagerlösningar av varje fluorescerande antibiotikum vid 1,28 mg/ml i sterilt vatten och pipett 10 μL antibiotika till den första kolonnen på en 96 brunnsplatta.
  5. Tillsätt 90 μl CAMHB i den första kolumnen och 50 μL till alla andra brunnar. Utför sedan seriell 2-faldig utspädning över plattan.
  6. Blanda noggrant, späd sedan mitten av loggfasen kulturer till ~ 106 koloni bildar enheter (CFU) / ml och lägga till 50 μL till alla brunnar, för att ge en slutlig koncentration av ~ 5 x 105 CFU / ml.

    kulturvolym (mL) = (medievolym i mL)/(OD600 x 1 000)

    t.ex. för en OD600 = 0,5 kultur i en önskad medievolym på 12 ml, lägg till (12/(0,5 x 1 000) = 0,024 ml kultur till 12 ml media
  7. Täck plattorna med lock och inkubera vid 37 °C för 18–24 h utan att skaka.
  8. Inspektera plattorna visuellt, med MIC är den lägsta koncentrationen väl utan synlig tillväxt.
    OBS: Se tabell 1 för några exempel på aktiva och inaktiva fluorescerande antibiotika.

4. Analys av probe ackumulering av spektrofotometri och flödecytometri

OBS: Dessa centrifugeringstider har optimerats för E. coli, så små förändringar kan behövas för andra arter. Representativa data för sondackumulering rapporteras för den NBD-märkta ciprofloxacin-sonden.

  1. Streak glycerol lager av bakteriestammar på LB agar och växa över natten på 37 ° C.
  2. Välj en enda koloni från plattan och kulturen över natten i LB vid 37 °C.
  3. Späd över natten kulturer ~ 50-faldig i media och växa till mitten av loggfasen (OD600 = 0,4–0,8).
  4. Centrifugera kulturerna på 1 470 x g i 25 min och dekantera media.
  5. Resuspend bakterierna i 1 ml fosfat-buffrad realine (PBS), sedan centrifugera på 1.470 x g för 15 min.
  6. Dekantera media och resuspend tvättade pellets i PBS till en slutlig OD600 = 2.
  7. Tillsätt om så önskas 10,1 μl karbonylcyanid 3-klorfenylhydrazone (CCCP, 10 mM i PBS) till 1 ml bakterier (slutlig koncentration 100 μM) och inkubera vid 37 °C i 10 min.
    OBS: CCCP är en efflux pumphämmare. Tillägg av CCCP kommer att göra det möjligt att undersöka effekterna av efflux.
  8. Centrifugera kulturerna på 18 000 x g i 4 min vid 20 °C och dekantera media.
  9. Tillsätt 1 ml fluorescerande antibiotikalösning (10–100 μM i PBS) till pelleten och inkubera vid 37 °C i 30 minuter.
  10. Centrifugera kulturerna vid 18 000 x g i 7 min vid 4 °C och dekantera media.
  11. Resuspend bakterierna i 1 ml kall PBS, och upprepa steg 4.9.
  12. Upprepa steg 4.10 totalt 4x.
  13. Om så önskas, lyse bakterier genom att lägga till 180 μl lysbuffert (20 mM Tris-HCl, pH 8.0 och 2 mM natrium EDTA) sedan 70 μL lysozym (72 mg/mL i H2O).
  14. Inkubera vid 37°C i 30 min och frys sedan-tina 3x (−78 °C i 5 min, sedan 34 °C i 15 min).
  15. Sonicate proverna i 20 min, sedan värma till 65 °C i 30 min.
  16. Centrifugera lysedproverna (18 000 x g,8 min), filtrera sedan genom ett 10 kDa-filtermembran.
  17. Tvätta filtret 4x med 100 μl vatten.
  18. Överför lysat till en svart 96-brunnsplatta med platt botten och mät fluorescensintensiteten på en plattläsare med magnetisering och utsläppsvåglängder som är lämpliga för fluorofformen (dvs. DMACA: λex = 400 nm, λem = 490 nm; Obs: λex = 475 nm, λem = 545 nm).
    OBS: Se figur 3 för exempel på spektrofotometriska analyser av bakterier med hjälp av fluorescerande NBD-märkt ciprofloxacin antibiotika.
  19. För analys genom flödecytometri kan samma tillväxt- och färgningsförhållanden användas (steg 4.1–4.17), med ändringar enbart i den slutliga beredningen.
    1. Ta med den totala volymen till 1 ml PBS.
    2. Läs prover på en flödescytometer med en flödeshastighet på cirka 60 μL/min med logaritmisk förstärkning för datainsamlingen (F1 excitation = 488 nm; emission = 525/20 nm).
    3. Registrera totalt 10 000 händelser och analysera sedan data med lämplig programvara.
    4. Rita fluorescensintensiteten från F1 mot antalet händelser räknas, uppskatta medianen fluorescensintensitet från histogramtopparna efter att bakterierna färgats.
      OBS: Se figur 4 för exempel på flödecytometri analyser av bakterier med hjälp av NBD-märkt ciprofloxacin antibiotika.

5. Förberedelse för mikroskopisk analys

  1. Odla subkulturer till OD600 = 0,4, som för MIC bedömning, sedan dela in 1 ml alikvoter och centrifugera på 18.000 x g för 3-5 min.
  2. Dekantera och kassera media, sedan avbryta bakteriell pellet i 500 μL av HBSS.
  3. Centrifugera vid 18.000 x g i 3 min, sedan dekantera och kassera media.
  4. Förbered lösningar av antibiotikasonder i HBSS vid koncentrationer av 1–100 μM.
  5. Resuspend de tvättade bakterierna i 500 μL av sondlösningen och inkubera vid 37 °C i 30 minuter.
  6. Upprepa steg 5.3. För ett flerfaldigt märkningsexperiment, resuspend pelleten i 500 μL av en ortogonally färgad nukleinsyra färgämne. För grönt, använd Syto9 (5 μM i HBSS); för blått, använd Hoechst 33342 (20 μg/ml i HBSS). Inkubera på RT i 15–30 min.
  7. Upprepa steg 5.3, sedan återsuspend i 500 μL FM4-64FX (5 μg/ml i HBSS) och inkubera på RT i 5 min.
  8. Upprepa steg 5.3, sedan återsuspend i 500 μL HBSS, och upprepa steg 5.3 igen.
  9. Upprepa steg 5.8, tillsätt slutligen de tvättade, färgade bakterierna i 15 μL monteringsmedium (se Materialtabell).
  10. Pipettmonteringsmedium på ett mikroskopr och toppa med en högpresterande täckslip och tätningskanter med klart nagellack.
    OBS: Se figur 5 för exempel på konfokala mikroskopibilder tagna med NBD-märkt ciprofloxacin och trimetoprim antibiotika, och figur 6 för DMACA-märkta oxazolidinone (linezolid) antibiotika.

Representative Results

Bild 1 Illustrerar nyckeln klicka kemi reaktion (A) för beredning av fluorescerande antibiotika, och med (B) exempel på strukturer av våra publicerade fluorescerande antibiotika baserade på ciprofloxacin (cipro), trimethoprim (TMP), och linezolid. Dessa sonder var alla syntetiserade från motsvarande antibiotika via en azid mellanliggande. De kopplades sedan till NBD och DMACA fluorofforer, varje functionalized med en alkyne.

Figur 2 visar exempel LCMS spår från en ciprofloxacin-N3 och NBD-alkyne klick reaktion, där aziden eluted på 3,2 min och produkten på 3,8 min. Jämföra 1 och 2 visar hur utvecklingen av klickreaktionen kan följas av försvinnandet av azid topp (av UV eller MS detektor). Spectra 3 visar effekten av rening, med felaktiga toppar försvinner från MS och UV spår. Både renhet och reaktionsframsteg skulle kunna kvantifieras genom integreringen av produkttoppen och eventuella föroreningartoppar.

Figur 3 visar typiska resultat från bedömningen av intracellulär ackumulering genom fluorescensspektroskopi i närvaro och avsaknad av efflux. I detta experiment behandlades E. coli med TMP-NBD med eller utan tillsats av CCCP, som kollapsar protonmotivet kraft (PMF). Bakteriens intracellulära fluorescens var betydligt högre när den förbehandlades med CCCP, vilket indikerar att efflux minskade ackumulering en hos dessa bakterier. Detta experiment upprepades med hjälp av bakterier som inte hade brist på tolC, vilket visar kapaciteten hos denna analys för att undersöka effekterna av enskilda efflux pumpkomponenter. I detta fall, även om det fanns en ökning av intracellulär fluorescens jämfört med vilda typer bakterier, CCCP ackumulering ökade fortfarande. Dessa resultat tyder på att tolC deltar iTMP efflux men är inte den enda PMF-enhet pump inblandade.

Bild 4 visar resultatet av samma experiment som figur 2, men med ackumulering mätt med flödecytometri istället för spektroskopi. Samma datatrender observerades, vilket visar att antingen teknik kan användas för att studera fenomenet efflux medierad intracellulär ackumulering.

Figur 5 visar representativa konfokalmikroskopi bilder av grampositiva(S. aureus)och gramnegativa bakterier (E. coli) märkta med TMP-NBD (1) och cipro-NBD (2 + 3) lysrör sonder, respektive. I båda fallen lades det röda membranet färgning FM4-64FX till för att jämföra samlokalisering. För TMP-NBD användes även det blå nukleinsyrafärgen Hoechst-33342. Genom att överlagra dessa bilder visualiserades lokaliseringen av antibiotikan i bakterierna. Jämföra paneler 2 och 3 visar hur effekten av efflux undersöktes, med efflux hämmare CCCP används i 2, vilket resulterar i intracellulär ackumulering. I panel 3lades ingen CCCP till. Efflux är därför aktiv och ingen sondackumulering sågs.

Figur 6 visar representativa konfokala mikroskopibilder av Grampositiva(S. aureus)bakterier märkta med DMACA-märkta oxazolidinon sond Lz-NBD. Det röda membranet färgämne FM4-64FX lades till för att jämföra samlokalisering, och den gröna nukleinsyrafärgämnet Hoechst-33342 användes också. Genom att överlagra dessa bilder visualiserades lokaliseringen av antibiotika nantibiotiker, vilket visar inre lokalisering skiljer sig från membranet och nukleinsyra.

Tabell 1 visar MIC-värden för tre serier av fluorescerande antibiotika, ciprofloxacin, trimetoprim (TMP) och linezolid (Lz), med data som presenteras för moderantibiotika, NBD och DMACA derivat av varje. Representativa arter för varje antibiotikum valdes ut, inklusive både grampositiva och gramnegativa. För ciprofloxacin-serien förlorade båda fluorescerande sonder antibiotikaaktivitet jämfört med moderläkemedlet, men behöll viss aktivitet mot alla arter. På samma sätt förlorade linezolid sonder en del aktivitet, men förblev en måttlig till svag antibiotika. TMP sonder förlorade nästan all aktivitet mot vilda bakterier typ, men var aktiva mot efflux bristfällig E. coli, vilket tyder på att förlusten av antibakteriell aktivitet berodde på brist på ackumulering.

Figure 1
Figur 1: Syntes och strukturer av antibiotika-härledda sonder. A)Det allmänna reaktionsschemat för syntes av fluorescerande antibiotikasonder från azid-antibiotika och alkyne-fluorofforer. (B)Strukturerna i våra publicerade sonder baserade på ciprofloxacin, trimetoprim och linezolid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Mätning av biotikuresistens av LCMS. Analytiska LCMS spår från (1) ofullständig, (2) komplett, och (3) HPLC renas ciprofloxacin-N3 + NBD-alkyne klicka reaktioner som visar försvinnandet av startmaterial vid reaktion slutförande, och diverse toppar på rening. A = UV-Vis-spår (absorbans vid 250 nm), B = MS-spårning (positivt och negativt läge). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Mätning av mätning av antibiotikahärdade sondackumulering. Fluorescensspektroscopic mätning av cellulär ackumulering av TMP-NBD (50 μM) i vild typ (1, ATCC 25922) och ΔtolC (2, ATCC 25922) E. coli ruvade(A) med och (B) utan tillsats av CCCP (100 μM). Statistisk signifikans (**p ≤ 0,01; ***p ≤ 0,001) visas mellan frånvaro eller förekomst av CCCP och mellan vild typ och ΔtolCE. coli. Data som rapporteras är medelvärdet ± SD för tre experiment. Denna siffra är anpassad från vår tidigare publikation15, och illustrerar användningen av spektroskopi för att belysa efflux roll på intracellulära ackumulering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Flödecytometrimätning av antibiotikahärledd sondackumulering. Flödescytometrimätning av cellulär ackumulering med TMP-NBD i vild typ (1, ATCC 25922) och ΔtolC (2, ATCC 25922) E. samruvad med och utan tillsats av CCCP (100 μM). Medianfluorescensaktivitet visas från 10 000 bakteriella händelser, Statistisk signifikans (***, p ≤ 0,001; ****, p ≤ 0,0001) visas mellan frånvaro och förekomst av CCCP och mellan vild typ och ΔtolCE. coli. Data som rapporteras är medelvärdet ± SD för tre experiment. Denna siffra är anpassad från vår tidigare publikation15, och illustrerar användningen av flöde cytometri för att klargöra efflux roll på intracellulära ackumulering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Bild 5: Konfokal mikroskopivisualisering av lokalisering av NBD-sond. Konfokalmikroskopi bilder av 1) levande S. aureus märkta med Hoechst-33342 (blå, nukleinsyra), TMP-NBD (grön), FM4-64FX (röd, membran) och överlagrad; 2) levande E. coli behandlas med CCCP (efflux hämmare) märkt med cipro-NBD (grön), FM4-64FX (röd, membran) och överlagrad; 3) bo E. coli märkt med cipro-NBD (grön), FM4-64FX (röd, membran) och överlagrad. Denna siffra är anpassad från våra tidigare publikationer15,16,och illustrerar användningen av mikroskopi för att undersöka sondlokalisering, inklusive effekterna av efflux. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Bild 6: Confocal mikroskopi visualisering av DMACA-sond lokalisering. Konfokalmikroskopi bilder av levande S. aureus märkta med oxazolidinone sond Lz-DMACA (blå), Sytox grön (grön, nukleinsyra), och FM4-64FX (röd, membran). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

MIC (μg/mL)
Arter Stam Cipro Cipro-NBD Cipro-DMACA Tmp TMP-NBD TMP-DMACA Linezolid (Lz) Lz-NBD Lz-DMACA
Staphylococcus aureus ATCC 25923 0.125 - 0.5 32 - ≥64 16 1 16 >64
ATCC 43300 1 16 >64
Streptokocker pneumoniae ATCC 700677 1 4 64
Enterococcus faecium ATCC 35667 1 - 8 32 32 - ≥64
ATCC 51559 2 16 32
Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 0.015 - 0.06 8 - 16 8 - 32
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 0.25 - 1 32 - ≥64 32 - ≥64
Escherichia coli ATCC 25922 ≤0,004 8 2 0.5 >64 >64
Mutant ΔtolC 0.125 0.25 2

Tabell 1. Antibiotikaverksamhet av fluorescerande antibiotikasonder baserade på ciprofloxacin, trimetoprim och linezolid mot lämpliga kliniskt relevanta bakteriestammar, mätt med buljong mikroutspädning MIC analyser. I de flesta fall förlorade sonderna viss aktivitet jämfört med moderläkemedlet, men behöll en del mätbar antibiotikastyrka (tillräckligt för att vara användbara i ytterligare studier).

Discussion

Skapandet av en framgångsrik fluorescerande antibiotikasond måste börja med noggrann planering och behandling av SAR av moderbolaget drogen. Om sar inte är känt eller helt utforskat kan flera alternativ behöva testas för att hitta en plats som kan ändras selektivt utan att den biologiska aktiviteten avskaffas. När en plats/s har identifierats är installationen av en linker moiety ofta nödvändig för att ge trappavstånd mellan det biologiska verkningsstället och den inaktiva fluorofforten. Man måste vara noga med att den reaktion som används för att fästa länkern på antibiotikan lämnar en biostabil funktionell grupp, och undviker till exempel estester som är mottagliga för klyvning av esteras in vivo. Beroende på antibiotikans farmakodynamiska och farmakokinetiska profil kan en enkel alkyllänkare användas, annars bör ett mindre lipofiliskt alternativ som en polyetenglykol (PEG) övervägas. Med länkaren bifogad, den antibakteriella aktiviteten bör bedömas för att säkerställa att MIC mot relevanta bakterier liknar modersubstansen.

I detta arbete rekommenderar vi användning av Huigsen azide-alkyne [3 +2] dipolär cycloaddition (klicka kemi, se figur 1)för att bli sänd fluoroffor till antibiotika, av flera skäl. Klickreaktioner är mycket selektiva, vilket innebär att skydd av reaktiva grupper på antibiotika inte är nödvändigt, och vidare lämnar reaktionen en stabil, biokompatibel triazolmoiety. Azidkomponenten introduceras till antibiotikumdelen i våra ingrepp, eftersom detta i allmänhet är lättare att åstadkomma med en mängd olika strukturella typer än införandet av en alkyne. Syntheses av två alkyne-härledda fluorofforer beskrivs här, även om andra kan utforskas om så önskas. NBD och DMACA valdes på grund av sin ringa storlek, vilket minimerar möjligheten att störa cellpenetration och målinteraktion. Klickreaktionen i sig utförs med kopparkatalys, där antingen Cu2+ (CuSO4, med ett askorbinsyrareducerande medel) eller Cu+ (CuI) kan användas som startreagens. Efter rening(figur 2)bör de minst utvecklade länderna testas som med aziden. Även med noggrann hänsyn till fluorofforval och fastsättningsställe är det möjligt att dålig antibiotikaaktivitet kommer att observeras. Detta innebär dock inte att en inaktiv sond är utan användning. Som visas med TMP sonder, föreningar med dålig antibakteriell aktivitet kan fortfarande binda till samma mål som förälder narkotikamissbruk. Detta kan möjliggöra studier om verkningssätt och undersökning av fenomen som leder till resistens, såsom efflux.

Som beskrivs i protokollavsnittet är det möjligt att analysera bakteriell märkning av fluorescerande antibiotika med antingen en enkel spektrofotometrianalys (figur 3) eller flödescytometri (figur 4). Båda metoderna kan kvantifiera cellulär ackumulering, och genom lysning celler och undersöka fluorescens lokalisering i lysate, är det möjligt att bedöma intracellulär ackumulering. I detta protokoll beskrivs användningen av lysozyme för celllys, eftersom detta är en snabb, universell teknik. Andra lysis villkor, såsom övernattning behandling med glycine-HCl7, har också framgångsrikt använts. Med hjälp av denna teknik är det möjligt att studera effekten av efflux på antibiotikacellulär ackumulering, vilket är en viktig resistensmekanism. Om efflux verkligen finns i bakterierna, en brist på intracellulära ackumulering kommer att observeras, även om detta kan räddas med hjälp av en efflux hämmare som CCCP.

Mikroskopi kan också utföras för att visuellt inspektera sondlokalisering i olika bakterier, samla information om verkningssätt, och eventuellt också motstånd (se figur 5 för representativa exempel). För att se lokalisering inom bakterier krävs ett högupplöstkonfokalmikroskop, utrustat med funktioner som SIM (strukturerad belysningsmikroskop), SR-SIM (superresolution-SIM), Luftyscan eller STED (stimulerad utarmning av utsläpp). Dessutom bör högpresterande följeskydd användas, och analys efter avbildning som utförs på en lämplig programvara (t.ex. FIJI, Zen eller Imaris). Lokalisering av sonder jämförs med färgämnen som färgar specifika arkitekturer, såsom Hoechst-33342 (blå, nukleinsyra), Syto-9 (grön, nukleinsyra) och FM4-64FX (röd, membran). Valet av färgämnen bör göras för att matcha fluorescerande antibiotika, så att varje färg som används har minimal spektral överlappning. För att få bästa möjliga bilder kan optimering krävas. Till exempel, om bakterier är för trångt på bilden, ta bara del av den suspenderade pelleten, späd sedan med mer montering medium. Däremot, om bakterier är för glesa på bilden, helt enkelt börja med fler bakterier. I detta protokoll rekommenderas användning av en termoreversibel gel som är kompatibel med levande celler (t.ex. Cygel) för levande cellavbildning, eftersom den immobiliserar bakterier (inklusive rörliga bakterier), men andra monteringsmedier eller agarose har också använts framgångsrikt.

Sammantaget, trots utmaningar som kan ställas inför vid utarbetandet av en biologiskt aktiv fluorescerande antibiotikaderivat, enkelheten i deras användning och deras mångsidighet gör dessa sonder attraktiva verktyg för forskning inom AMR. Framtida arbete med fluorescerande antibiotika har potential att ge insikt i mekanismer för antibiotikaresistens, förbättra vår förståelse för hur nuvarande antibiotika fungerar och bidra till utvecklingen av bättre läkemedel.

Disclosures

Författarna har inget att deklarera.

Acknowledgments

MRLS stöds av australian GraduateGraduate Award (APA) och ett Institut för molekylär biovetenskap Research Advancement Award. Wanida Phetsang stöddes av UQ International Scholarship (UQI) och IMB GraduateGraduate Award (IMBPA). MAC är en NHMRC princip forskarassistent (APP1059354) och har också en fraktionerad professorsforskar stipendiat utnämning vid University of Queensland, med sin återstående tid som VD för Inflazome Ltd, ett företag som utvecklar läkemedel för att ta itu med kliniska otillfredsställda behov i inflammatorisk sjukdom. MATB stöds delvis av Wellcome Trust Strategic Grant WT1104797/Z/14/Z och NHMRC Development grant APP1113719. Mikroskopi utfördes vid Australian Cancer Research Foundation (ACRF)/Institute for Molecular Bioscience Cancer Biology Imaging Facility, som inrättades med stöd av ACRF.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-(dimethylamino)phenol Alfa-Aesar B23067
4-chloro-7-nitro-benzofuran Sigma-Aldrich 163260-5G
Amicon Ultra-0.5 centrifugal filter unit with Ultracel- 10 membrane Merck UFC501096
Atlantis Prep T3 OBD (100 A, 5 uM, 10x250 mm) Waters 186008205
Atlantis T3 column (100 A, 5 uM, 2.1 × 50 mm) Waters 186003734
Bruker Avance 600 MHz spectrometer Bruker
Buchi Reveleris C18 12g Cartridge Buchi BUC145152103
CCCP Sigma-Aldrich C2759
Celite 545 Sigma-Aldrich 22140-5KG-F
Cygel ABCAM Ab109204
Elyra PS,1 SIM/STORM confocal microscope Zeiss
FM4-64FX, fixable analog of FM™ 4-64 membrane stain Life Technologies Australia Pt F34653
Gallios flow cytometer Beckman Coulter
Gamma 2-16 LSCplus lyophilise CHRIST
Gilson HPLC 2020 Gilson
Hanks' Balanced Salt solution, Modified, with sodium bicarbonate, without phenol red, calcium chloride and magnesium sulfate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture Sigma-Aldrich H6648-500ML
Hettich Zentrifugen Rotofix 32 Hettich
High performance #1.5 cover slips (18 x 18 mm) Schott/Zeiss 474030-9000-000
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - Fluo Life Technologies Australia Pt H21492
LB AMRESCO J106
Leica STED 3X Super Resolution Microscope with White Light Laser excitation Leica
Lysozyme from chicken egg white
lyophilized powder		 Sigma-Aldrich L6876
Mueller Hinton II Broth Cation adjusted Becton Dickinson 212322
Propargylamine Sigma-Aldrich P50900-5G
Reveleris GRACE MPLC Buchi
Shimadzu LCMS-2020 Shimadzu
Sigma 1-15 Microcentrifuge Sigma-Aldrich
Silica gel 60 (0.040-0.063 mm) for column chromatography (230-400 mesh ASTM) Merck 1093859025
SYTO 9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain Life Technologies Australia Pt S34854
TECAN Infinite M1000 PRO TECAN

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cai, H., Rose, K., Liang, L. H., Dunham, S., Stover, C. Development of a liquid chromatography/mass spectrometry-based drug accumulation assay in Pseudomonas aeruginosa. Analytical Biochemistry. 385 (2), 321-325 (2009).
  2. Bhat, J., Narayan, A., Venkatraman, J., Chatterji, M. LC-MS based assay to measure intracellular compound levels in Mycobacterium smegmatis: Linking compound levels to cellular potency. Journal of Microbiological Methods. 94 (2), 152-158 (2013).
  3. Davis, T. D., Gerry, C. J., Tan, D. S. General Platform for Systematic Quantitative Evaluation of Small-Molecule Permeability in Bacteria. ACS Chemical Biology. 9 (11), 2535-2544 (2014).
  4. Richter, M. F., et al. Predictive compound accumulation rules yield a broad-spectrum antibiotic. Nature. 545, 299 (2017).
  5. Iyer, R., et al. Evaluating LC-MS/MS To Measure Accumulation of Compounds within Bacteria. ACS Infectious Diseases. 4 (9), 1336-1345 (2018).
  6. Prochnow, H., et al. Subcellular Quantification of Uptake in Gram-Negative Bacteria. Analytical Chemistry. 91 (3), 1863-1872 (2019).
  7. Dumont, E., et al. Antibiotics and efflux: combined spectrofluorimetry and mass spectrometry to evaluate the involvement of concentration and efflux activity in antibiotic intracellular accumulation. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 74 (1), 58-65 (2019).
  8. Stone, M. R. L., Butler, M. S., Phetsang, W., Cooper, M. A., Blaskovich, M. A. T. Fluorescent Antibiotics: New Research Tools to Fight Antibiotic Resistance. Trends in Biotechnology. 36 (5), 523-536 (2018).
  9. Piddock, L. J. V., Johnson, M. M. Accumulation of 10 fluoroquinolones by wild-type or efflux mutant Streptococcus pneumoniae. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (3), 813-820 (2002).
  10. Mortimer, P. G. S., Piddock, L. J. V. A comparison of methods used for measuring the accumulation of quinolones by enterobacteriaceae, pseudomonas aeruginosa and staphylococcus aureus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 28 (5), 639-653 (1991).
  11. Li, X. Z., Nikaido, H., Poole, K. Role of MexA-MexB-OprM in antibiotic efflux in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (9), 1948-1953 (1995).
  12. Vince, R., Weiss, D., Pestka, S. Binding of N-substituted erythromycylamines to ribosomes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 9 (1), 131-136 (1976).
  13. Vazquez, D. Antibiotics affecting chloramphenicol uptake by bacteria Their effect on amino acid incorporation in a cell-free system. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Nucleic Acids and Protein Synthesis. 114 (2), 289-295 (1966).
  14. Phetsang, W., et al. An azido-oxazolidinone antibiotic for live bacterial cell imaging and generation of antibiotic variants. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 22 (16), 4490-4498 (2014).
  15. Phetsang, W., et al. Fluorescent trimethoprim conjugate probes to assess drug accumulation in wild type and mutant Escherichia coli. ACS Infectious Diseases. 2 (10), 688-701 (2016).
  16. Stone, M. R. L., et al. Fluoroquinolone-derived fluorescent probes for studies of bacterial penetration and efflux. MedChemComm. 10 (6), 901-906 (2019).

Tags

Immunologi och infektion Utgåva 157 antibiotika resistens bakterier efflux fluorescerande mikroskopi
Visualisering av bakteriell resistens med fluorescerande antibiotikasonder
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stone, M. R. L., Phetsang, W.,… More

Stone, M. R. L., Phetsang, W., Cooper, M. A., Blaskovich, M. A. T. Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes. J. Vis. Exp. (157), e60743, doi:10.3791/60743 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter