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Immunology and Infection

फ्लोरोसेंट एंटीबायोटिक जांच का उपयोग कर बैक्टीरियल प्रतिरोध का दृश्य

doi: 10.3791/60743 Published: March 2, 2020

Summary

फ्लोरोसेंटी टैग किए गए एंटीबायोटिक्स शक्तिशाली उपकरण हैं जिनका उपयोग रोगाणुरोधी प्रतिरोध के कई पहलुओं का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। यह लेख फ्लोरोसेंटी टैग एंटीबायोटिक दवाओं की तैयारी और बैक्टीरिया में एंटीबायोटिक प्रतिरोध का अध्ययन करने के लिए उनके आवेदन का वर्णन करता है। जांच का उपयोग स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री, फ्लो साइटोमेट्री और माइक्रोस्कोपी द्वारा बैक्टीरियल प्रतिरोध (उदाहरण के लिए, एफलक्स) के तंत्र का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।

Abstract

फ्लोरोसेंट एंटीबायोटिक्स बहुउद्देशीय अनुसंधान उपकरण हैं जो अन्य तरीकों पर उनके महत्वपूर्ण लाभ के कारण एंटीमाइक्रोबियल प्रतिरोध के अध्ययन के लिए आसानी से उपयोग किए जाते हैं। इन जांचों को तैयार करने के लिए, एंटीबायोटिक दवाओं के अजाइड डेरिवेटिव संश्लेषित किए जाते हैं, फिर क्लिक केमिस्ट्री द्वारा अजाइड-अल्किन डाइपोलर साइक्लोअलावा का उपयोग करके अल्काइन-फ्लोरोफोरस के साथ मिलकर। शुद्धिकरण के बाद, फ्लोरोसेंट एंटीबायोटिक की एंटीबायोटिक गतिविधि न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता आकलन द्वारा परीक्षण किया जाता है। बैक्टीरियल संचय का अध्ययन करने के लिए, या तो स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री या फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग किया जा सकता है, जिससे रेडियोधर्मी एंटीबायोटिक डेरिवेटिव पर निर्भर तरीकों की तुलना में बहुत सरल विश्लेषण की अनुमति मिलती है। इसके अलावा, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग बैक्टीरिया के भीतर स्थानीयकरण की जांच करने के लिए किया जा सकता है, जो प्रतिरोधी प्रजातियों में होने वाली कार्रवाई के तरीके और परिवर्तनों के बारे में मूल्यवान जानकारी प्रदान करता है। रोगाणुरोधी प्रतिरोध के अध्ययन में फ्लोरोसेंट एंटीबायोटिक जांच का उपयोग भविष्य के विस्तार के लिए बहुत क्षमता के साथ एक शक्तिशाली तरीका है ।

Introduction

रोगाणुरोधी प्रतिरोध (एएमआर) एक बढ़ता संकट है जो दुनिया भर में मानव स्वास्थ्य के लिए एक बड़ा खतरा बन गया है । सबसे एंटीबायोटिक दवाओं के प्रतिरोध की सूचना दी गई है, और सभी चिकित्सकीय उपलब्ध दवाओं के लिए प्रतिरोधी बैक्टीरिया की वजह से संक्रमण उभर रहे हैं । एएमआर के उदय का मुकाबला करने के लिए, हमें इस बहुआयामी घटना और एंटीबायोटिक दवाओं और बैक्टीरिया के बीच अंतर्निहित तंत्र और बातचीत के बारे में अपनी समझ बढ़ाने की जरूरत है । एक पहलू है कि ऐतिहासिक रूप से खराब समझा गया है बैक्टीरिया में एंटीबायोटिक दवाओं की परमीशन, संचय और efflux की घटना के साथ है । यह ज्ञान नई दवाओं को डिजाइन करने और प्रतिरोध के तंत्र को समझने में महत्वपूर्ण है। इसलिए, यह एएमआर अनुसंधान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है ।

एंटीबायोटिक एकाग्रता को मापने के लिए दो मुख्य दृष्टिकोण किए जा सकते हैं: दवा को सीधे मापने या क्वांटिफिकेशन की सुविधा के लिए डिज़ाइन किए गए मोईटी के साथ टैगिंग करना। हालांकि एंटीबायोटिक टैगिंग का पता लगाने में सुधार, यह इस तरह के रोगाणुरोधी गतिविधि और स्थायित्व के रूप में दवा की जैविक गतिविधि, बेफिक्र कर सकते हैं । यह अनटैग तरीकों के लिए कोई समस्या नहीं है; हालांकि, पता लगाना चुनौतीपूर्ण हो सकता है। पिछले कुछ वर्षों में, तकनीकी प्रगति के कारण बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) का उपयोग करके अनुसंधान में तेजी आई है ताकि बैक्टीरिया1,2,3,4,5,6,7में एंटीबायोटिक एकाग्रता को सीधे माप सके । इन अध्ययनों से पता चला है कि विभिन्न प्रकार के बैक्टीरिया में इंट्रासेलुलर संचय का अध्ययन करना संभव है, जिसमें ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया का सबसे व्यापक रूप से अध्ययन किया जाता है। तब अणु की परगम्यता को गतिविधि से जोड़ा गया है और इसका उपयोग औषधि विकास2,3,4को सूचित करने के लिए किया जाता है, हालांकि संचय और लक्षित गतिविधि5को सीधे जोड़ते समय सावधानी बरती जानी चाहिए । एमएस विकास से पहले, केवल एंटीबायोटिक्स जिनकी एकाग्रता को सीधे मापा जा सकता है, वे थे जो आंतरिक फ्लोरेसेंस, जैसे टेट्रासाइक्लिन और क्विनोलोन8,9,10,11रखने वाले थे। हालांकि स्पष्ट रूप से दायरे में सीमित, संचय और प्रभावलों की जांच की गई और मात्रा निर्धारित की गई, जो फ्लोरेसेंस-आधारित क्वांटिफिकेशन की उपयोगिता को दर्शाती है।

टैग एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग कई दशकों से रेडियोधर्मी और फ्लोरोसेंट टैग के साथ वितरण, कार्रवाई के तरीके और प्रतिरोध का अध्ययन करने के लिए किया गया है। रेडियो टैग जांच लगभग माता पिता के यौगिक के समान होने का लाभ है, इसलिए जैविक गतिविधि काफी अलग होने की संभावना नहीं है । एंटीबायोटिक दवाओं में इन तत्वों की प्रमुखता के कारण 3एच, 14सी और 15एन जैसे आइसोटोप का अक्सर उपयोग किया जाता रहा है, और विभिन्न प्रकार के एंटीबायोटिक मचानों की जांच1,10,12,13की की गई है। जबकि रेडियो-जांच का पता लगाना सरल है, कई साजो-सामान की चिंताएं हैं (उदाहरण के लिए, सुरक्षा, आइसोटोप आधा जीवन) जिन्होंने इस दृष्टिकोण के उपयोग को सीमित कर दिया है। एक और रणनीति फ्लोरोसेंट-टैग एंटीबायोटिक दवाओं है। इन जांचों का उपयोग एमएस की तुलना में सरल प्रौद्योगिकी का उपयोग करके और विकिरण8की साजो-सामान की समस्याओं के बिना माता-पिता की दवा के वितरण और कार्रवाई और प्रतिरोध के तरीकों की जांच करने के लिए किया जा सकता है। इस दृष्टिकोण के लिए मुख्य दोष यह है कि एंटीबायोटिक दवाओं आम तौर पर अपेक्षाकृत छोटे अणु हैं, इसलिए एक फ्लोरोसेंट moiety की शुरूआत एक महत्वपूर्ण रासायनिक परिवर्तन बन गया है । यह परिवर्तन फिजियोकेमिकल गुणों और जीवाणुरोधी गतिविधि को प्रभावित कर सकता है। इसलिए, माता-पिता एंटीबायोटिक के परिणाम प्रतिनिधि उत्पन्न करने के लिए इन कारकों का आकलन करने के लिए सावधानी बरती जानी चाहिए।

इस कार्य में, फ्लोरोसेंट एंटीबायोटिक दवाओं के संश्लेषण, मूल्यांकन और उपयोग के लिए एक विधि वर्णित है, जैसा कि हमारे पिछले प्रकाशनों14,15,16में है। पिछले काम के माध्यम से, फ्लोरोसेंट एंटीबायोटिक दवाओं की एक संख्या तैयार किया गया है और प्रयोजनों की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया (पत्थर एट अल8देखें) । जैविक गतिविधि को प्रभावित करने की संभावना को कम करने के लिए, इस काम में बहुत छोटे फ्लोरोफोरस का उपयोग किया जाता है: नाइट्रोबेंजोक्साडिज़ोल (एनबीडी, ग्रीन) और 7-(डिमेथिलामिनो)-2-ऑक्सो-2 एच-क्रोमन-4-वाईएल (DMACA, नीला)। इसके अलावा, माइक्रोब्रोथ कमजोर पड़ने वाले न्यूनतम अवरोध एकाग्रता (एमआईसी) परख का उपयोग करके जीवाणुरोधी गतिविधि के आकलन का वर्णन किया गया है, ताकि गतिविधि पर संशोधनों के प्रभाव को मापा जा सके। इन फ्लोरोसेंटी टैग की गई जांच का उपयोग स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक परख, प्रवाह साइटोमेट्री और माइक्रोस्कोपी में किया जा सकता है। संभावित अनुप्रयोगों की सीमा है जहां फ्लोरोसेंट एंटीबायोटिक दवाओं का लाभ निहित है । सेलुलर संचय को केवल एमएस का उपयोग करके कुछ संभव नहीं है, केवल एमएस का उपयोग करके मात्रानिर्धारित, वर्गीकृत और कल्पना की जा सकती है। यह आशा की जाती है कि फ्लोरोसेंट एंटीबायोटिक दवाओं के उपयोग के माध्यम से प्राप्त ज्ञान प्रतिरोध की हमारी समझ में सहायता करेगा, और AMR के खिलाफ लड़ाई ।

Protocol

1. अल्काइन-फ्लोरोफोरस का संश्लेषण

  1. एनबीडी-अल्काइन का संश्लेषण (7-नाइट्रो-एन-(प्रोप-2-yn-1-yl) बेंजो [c][1,2,5]oxadiazol-4-amine)
    1. टेट्राहाइड्रोफर्न (टीएचएफ) के 60 मिलील में 1,031 मिलीग्राम 4-क्लोरो-7-नाइट्रो-बेंजोफ्यूरन (5.181 एममोल) भंग करें। CsCO3 (5.696 mmol), तो प्रोपरग्यालमाइन (6.1 mmol) के 0.39 मिलीग्राम जोड़ें। 2 घंटे के लिए 50 डिग्री सेल्सियस की प्रतिक्रिया को गर्म करें, जो भूरे रंग से हरे रंग में बदल जाएगा, फिर कमरे के तापमान (आरटी) में ठंडा हो जाएगा।
    2. फ़िल्टरिंग सहायता का उपयोग करके प्रतिक्रिया फ़िल्टर करें (सामग्री की तालिकादेखें), और एथिल एसीटेट (ईए) से धोएं। कम दबाव में फिल्ट्रेट को केंद्रित करें, फिर ईए के 150 मीटर में अवशेषों को भंग करें और 500 मीटर अलग कीप में चले जाएं।
    3. क्रमशः पानी और नमकीन के साथ 100 मीटर के साथ ईए समाधान धोलें। फिर जलीय चरणों को मिलाकर ईए के 100 मीटर के साथ 2x धोएं।
    4. निर्जल मैग्नीशियम सल्फेट पर संयुक्त कार्बनिक चरणों को सुखाएं, फिर कम दबाव में फ़िल्टर करें और ध्यान केंद्रित करें।
    5. सिलिका जेल पर फ्लैश क्रोमेटोग्राफी द्वारा कच्चे उत्पाद को शुद्ध करें (पेट्रोलियम ईथर [पीई में 20-30% ईए]), तरल क्रोमेटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसीएमएस, [एम +एच]+ = 219.1) और/या परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी, रासायनिक बदलाव ों द्वारा शुद्धता की जांच करें:
      1 एच एनएमआर (सीडी3ओडी, 600 मेगाहर्ट्ज) 8.54 (डी, जे = 8.7 हर्ट्ज, 1H), 6.35 (d, J = 8.4 हर्ट्ज, 1H), 4.31 (डीडी, जे = 5.7 हर्ट्ज, जे = 2.5 हर्ट्ज, 2H), 2.43 (टी, जे = 2.5 हर्ट्ज, 1H); 13 सी एनएमआर (सीडी3ओडी, 150 मेगाहर्ट्ज) 144.3, 143.7, 142.2, 135.8, 125.7, 100.0, 76.5, 74.2, 33.4.
      नोट: सिलिका जेल क्रोमेटोग्राफी द्वारा शुद्धि करते समय, सूचीबद्ध सॉल्वैंट्स के कम ध्रुवीय का उपयोग करके कॉलम तैयार करें। क्रूड कंपाउंड को या तो एक केंद्रित समाधान के रूप में लोड किया जा सकता है या सिलिका पर सोखलिया जा सकता है यदि घुलनशीलता इसकी अनुमति नहीं देती है। सिलिका के शीर्ष पर यौगिक जोड़े जाने के बाद, सिलिका गीला करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एक ही सॉल्वेंट के 1-2 कॉलम वॉल्यूम से गुजरें। फिर सूचीबद्ध सॉल्वेंट अनुपात के साथ शुरू करें, प्रत्येक सॉल्वेंट के कम से कम 1 कॉलम वॉल्यूम के माध्यम से चल रहा है, और सॉल्वेंट संरचना में बड़ी छलांग नहीं लगाना सुनिश्चित करें। अंशों को इकट्ठा करें, और एलसीएमएस या टीएलसी (पतली परत क्रोमेटोग्राफी) द्वारा शुद्धता/पहचान की जांच करें। शुद्ध अंशों को मिलाएं और रोटरी वाष्पीकरण द्वारा कम दबाव में ध्यान केंद्रित करें।
  2. DMACA-alkyne का संश्लेषण (2-(7-(डाइमेथिलामिनो)-2-ऑक्सो-2H-क्रोमन-4-yl) ।N-(प्रोप-2-yn-1-yl) acetamide) ।
    1. इथेनॉल के 30 मीटर में 3-(डाइमेथिलामिनो) फिनॉल (36.6 mmol) के 5.02 ग्राम को भंग करें, फिर 6.7 मीटर का आहार 1,3-एसीटोनडिकार्बोसिलेट (36 एममोल) जोड़ें। ZnCl2 (77.2 mmol) के 10.5 ग्राम जोड़ें, तो 42 घंटे के लिए लाल समाधान भाटा. ZnCl2 (67.6 mmol) के एक अतिरिक्त 9.20 ग्राम जोड़ें, तो 8 घंटे के लिए भाटा.
    2. प्रतिक्रिया को ठंडा करें और कम दबाव में ध्यान केंद्रित करें। ईए, फ़िल्टर के 200 मीटर में परिणामी लाल ठोस तितर-बितर करें, फिर 500 मीटर अलग कीप में स्थानांतरित करें।
    3. ईए को 200 एमएल पानी और नमकीन से धोएं, फिर हाइड्रोस मैग्नीशियम सल्फेट पर सूख जाएं। सूखे कार्बनिक चरण को फ़िल्टर करें और कम दबाव में ध्यान केंद्रित करें।
    4. लाल ठोस शुद्ध (एथिल 2-(7-(डाइमेथिलामिनो)-2-ऑक्सो-2 एच-क्रोमन-4-yl) एसीटेट) सिलिका जेल पर फ्लैश क्रोमेटोग्राफी द्वारा (पीई में 0-100% ईए), एलसीएमएस द्वारा शुद्धता की जांच ([[एम +एच]+ = 275.1) और/या एनएमआर, रासायनिक बदलाव इस प्रकार है:
      1 एच एनएमआर (सीडीसीएल3,600 मेगाहर्ट्ज) 7.30 (डी, J = 8.9 हर्ट्ज, 1H), 6.52 (डीडी, जे = 8.9 हर्ट्ज, जे = 2.6 हर्ट्ज, 1H), 6.40 (d, J = 2.6 हर्ट्ज, 1H), 5.87 (m, 1H), 2.96 (m, 8H), 2.25 (d, J = 1.2 हर्ट्ज, 3H)।
    5. 488 मिलीग्राम एथिल 2-(7-(डाइमेथिलमिनो) को भंगकरें- 2-ऑक्सो-2 एच-क्रोमन-4-वाईएल) एसीटेट (1.18 mmol) THF के 10 mL में, फिर 157 मिलीग्राम LiOH का समाधान जोड़ें · 15 मीटर पानी में एच2ओ (3.74 एममोल)। 3 एच के लिए आरटी पर प्रतिक्रिया हिलाओ, तो एक अलग कीप के लिए कदम है और पानी की एक अतिरिक्त ५० मिलीग्राम के साथ पतला ।
    6. रिएक्शन मिश्रण 2x को 50 मिलील के साथ डायथिल ईथर (ईटी2ओ) धोएं, फिर संयुक्त कार्बनिक चरण 2x को 25 मिलीग्राम पानी से धोएं। कार्बनिक परत के साथ किसी भी पीले रंग की तेज़ ले लो। रोटरी वाष्पीकरण का उपयोग करके कम दबाव में कार्बनिक चरण को केंद्रित करें।
    7. केंद्रित एचसीएल के साथ पीएच = 2 के लिए जलीय चरण को अम्लीय करें, और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें। अम्लीय जलीय चरण को फ़िल्टर करें और केंद्रित कार्बनिक चरण में पीले ठोस जोड़ें।
      नोट: 2-(7-(डाइमेथिलामिनो)-2-ऑक्सो-2 एच-क्रोमन-4-yl) एसिटिक एसिड का उपयोग आगे शुद्धि के बिना किया जा सकता है, लेकिन इसे एलसीएमएस ([एम +एच]+ = 247.1) और/या एनएमआर, रासायनिक बदलावों द्वारा इस प्रकार की जांच की जा सकती है:
      1 एच एनएमआर (सीडीसीएल3,600 मेगाहर्ट्ज) 7.41 (डी, J = 9.0 हर्ट्ज, 1H), 6.62 (डीडी, जे = 9.2 हर्ट्ज, जे = 2.8 हर्ट्ज, 1H), 6.52 (d, J = 2.8 हर्ट्ज, 1H), 5.98 (d, J = 0.9 हर्ट्ज, 1H), 3.05 (एस, 6H), 2.35 (d, J= 0.9 हर्ट्ज, 2H); 13 सी एनएमआर (सीडीसीएल3,150 मेगाहर्ट्ज) 162.2, 155.7, 152.9, 152.8, 125.3, 109.7, 109.3, 109.1, 108.8, 98.3, 40.2, 18.5।
    8. 2 की 466 मिलीग्राम भंग करें - (7- (डाइमेथिलामिनो) 2 - ऑक्सो-2एच- क्रोमन-4-वाईएल) एसिटिक एसिड (1.89 एमओएल) सूखी एन,एन-डाइमेथिलफॉर्ममाइड (डीएमएफ) के 7 मिलील में और नाइट्रोजन के वायुमंडल में रखें।
    9. नाइट्रोजन के तहत सूखी डीएमएफ के 7 एमएल में प्रोपरग्यालमाइन (5.1 एमओएल) के 0.33 मीटर को भंग करें। डाइ समाधान के लिए डी-आइसोप्रोपिलेथिल अमीन (DIPEA, 7.50 mmol) के 1.30 एमएल जोड़ें, फिर 535 मिलीग्राम -(1H-6-क्लोरोबेंजोत्रिज़ोल-1-yl- 1,1,3,3-tetramethyluronium हेक्साफ्लोरोफोस्फेट (HCTU, 1.29 mmol) । आरटी में 15 मिन के लिए सक्रिय रंग समाधान हिलाओ, तो अमीन समाधान ड्रॉपवाइज जोड़ें, और रात भर हलचल करने के लिए छोड़ दें ।
    10. अगले दिन, 35 मिलीग्राम पानी के साथ प्रतिक्रिया को पतला करें फिर कम दबाव में ध्यान केंद्रित करें।
    11. 250 मीटर अलग कीप में ईए और नमकीन (100 मीटर प्रत्येक) के बीच परिणामी नारंगी ठोस विभाजन। परतों को अलग करना (दो परतों को विभिन्न फ्लास्क में चलाएं), और ईए के 100 मीटर के साथ जलीय चरण को धोएं।
    12. कम दबाव में संयुक्त कार्बनिक चरणों को केंद्रित करें, फिर 1:1 एसीटोनिट्रिल (एसीएन) /पानी (v/v) के 3 मिलील में नारंगी ठोस को फिर से भंग करें । एक C18 कारतूस कॉलम (विलायक ए: पानी, विलायक बी: ACN) से लैस रिवर्स चरण मध्यम दबाव तरल क्रोमेटोग्राफी (एमपीएलसी) प्रणाली पर इंजेक्शन द्वारा कच्चे उत्पाद को शुद्ध करें।
    13. एलसीएमएस ([एम +एच]+ = = 284.1, नीचे दिए गए एनएमआर रासायनिक बदलावों द्वारा शुद्धता के लिए अंशों की जांच करें), फिर 2-(7-(डाइमेथिलामिनो) देने के लिए उचित अंशों को मिलाएं और लियोफिलाइज करें-2-ऑक्सो-2 एच-क्रोमन-4-वाईएल)-एन-(प्रॉप-2-yn-1-yl)acetamide, NMR रासायनिक बदलाव इस प्रकार है:
      1 एच एनएमआर (600 मेगाहर्ट्ज, डीएमएसओ-डी6)8.65 (टी, जे = 5.4Hz, 1H), 7.52 (d, J = 9.0Hz, 1H), 6.72 (डीडी, जे = 9.1, 2.6 हर्ट्ज, 1H), 6.55 (d, J = 2.6 हर्ट्ज, 1H), 6.00 (s, 1H), 3.88-3.87 (m, 2H), 3.62 (s, 2H), 3.13 (टी, J = 2.5 हर्ट्ज, 1H), 3.01 (s, 6h), 13 सी एनएमआर (125 मेगाहर्ट्ज, डीएमएसओ-डी6)167.7, 160.7, 155.4, 152.9, 151.0, 126.0, 109.4, 109.1, 108.1, 97.5, 80.9, 73.3, 39.7, 38.4, 28.2.

2. फ्लोरोसेंट एंटीबायोटिक्स का संश्लेषण

  1. एंटीबायोटिक का एजाइड-डेरिवेटिव तैयार करें जैसा कि पहले14,15,16वर्णित है ।
    नोट: प्रक्रिया प्रत्येक एंटीबायोटिक के लिए विशिष्ट है और यह सुनिश्चित करने के लिए कि कार्यात्मक एंटीबायोटिक माता पिता के बराबर गतिविधि को बरकरार रखती है, माता पिता के अणु की संरचना गतिविधि संबंध (एसएआर) की सावधानीपूर्वक जांच की आवश्यकता है । (जैसे, सिप्रोफ्लोक्सासिन16,लाइनजोलिड14,और ट्राइमेथोप्रिम15)। प्रकाशित फ्लोरोसेंट एंटीबायोटिक दवाओं के उदाहरणों के लिए चित्रा 1 देखें, और सामान्य संश्लेषण योजना।
  2. क्लिक करें प्रतिक्रिया प्रक्रिया ए
    नोट: अधिकांश एंटीबायोटिक दवाओं के लिए, तांबे के उत्प्रेरक ह्यूइसजेन [2 +3] अजाइड (चरण 2.1) और फ्लोरोसेंट एल्किन (चरण 1 में तैयार) के साइक्लोअलावा के लिए यहां विस्तृत प्रक्रिया का पालन करें।
    1. एक गोल नीचे फ्लास्क में अजाइड-एंटीबायोटिक रखें और tert-butanol(टीBuOH) और पानी (1:1 v/v, 25 mL प्रत्येक mmol azide प्रति) जोड़ें ।
    2. चरण 1.1 (3 eq) में तैयार फ्लोरोफोर-अल्किन जोड़ें और 50 डिग्री सेल्सियस की प्रतिक्रिया को गर्म करें। फिर प्रतिक्रिया में कॉपर सल्फेट (पानी में 100 मीटर, 0.6 ईक्यू) डालें, इसके बाद एस्कोम्बिक एसिड (पानी में 500 मीटर, 2.4 ईक्यू)।
    3. प्रतिक्रिया को पूरा करने के संकेत पर एलसीएमएस द्वारा विश्लेषण तक 1 घंटे के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया हिलाएं, या विश्लेषण तक (अजाइड शुरू करने की पूरी खपत)।
    4. प्रतिक्रिया को ठंडा करें और एंटीबायोटिक पाड़ के लिए उपयुक्त के रूप में शुद्ध करें और 2.3 या 2.4 चरण से शुद्धि के लिए आगे बढ़ें।
      नोट: पाड़ की ध्रुवता और स्थिरता के आधार पर कई अलग-अलग शुद्धिकरण विधियां संभव हैं।
  3. क्लिक करें प्रतिक्रिया प्रक्रिया B
    नोट: पेप्टाइड आधारित एंटीबायोटिक दवाओं के लिए इस प्रक्रिया का पालन करें, मजबूत प्रतिक्रिया शर्तों (अप्रकाशित काम, Phetsang, 2019) प्रदान करने के लिए।
    1. पेप्टाइड एजाइड-एंटीबायोटिक को गोल बॉटम फ्लास्क में रखें और भंग करने के लिए पर्याप्त डीएमएफ (750 mL/mmol azide) जोड़ें।
    2. चरण 1 (5 eq) में तैयार फ्लोरोफोर-अल्किन जोड़ें और 1 घंटे के लिए 50 डिग्री सेल्सियस की प्रतिक्रिया को गर्म करें।
    3. कॉपर (I) iodide (20 eq.), तो DIPEA (१२० eq.), तो एसिटिक एसिड (२४० eq.) जोड़ें ।
    4. 1 घंटे के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया हिलाओ, या जब तक LCMS द्वारा विश्लेषण प्रतिक्रिया पूरा होने (यानी, अजाइड शुरू करने की पूरी खपत) इंगित करता है। प्रतिक्रिया को ठंडा करें और विधि 1 द्वारा शुद्धि के लिए आगे बढ़ें (चरण 2.3 देखें)।
  4. शुद्धि विधि 1 (सिप्रोफ्लोक्सासिन, ट्राइमेथोप्रिम और लाइनज़ोलिड के लिए उपयोग की जाती है)
    1. एक एमपीएलसी C18 कारतूस कॉलम पर सीधे ठंडा क्लिक प्रतिक्रिया इंजेक्ट करें।
    2. रन (100% सॉल्वेंट ए) की शुरुआत में एक लंबे वॉश चरण (लगभग 10 मिन) को शामिल करें, फिर 100% विलायक बी तक एक ढाल चलाएं, जिसके बाद सॉल्वेंट ए में वापसी हुई।
      नोट: सॉल्वेंट ए को पानी से चुना जा सकता है, पानी में 0.05-0.1% फोरमिक एसिड (एफए), पानी में 0.05-0.1% ट्राइफ्लोरोसेटिक एसिड (टीएफए), घुलनशीलता, स्थिरता और चोटियों के सर्वोत्तम समाधान के आधार पर। सॉल्वेंट बी को एसीटीएएन में एसीटीनट्रिक (एसीएन), 0.05-0.1% एफए, एसीएन में 0.05-0.1% टीएफए से चुना जा सकता है, जो सॉल्वेंट ए से मेल खाता है। यदि एल्यूशन मुश्किल साबित होता है, तो एसीएन के स्थान पर मेथनॉल का उपयोग किया जा सकता है।
    3. एलसीएमएस और रंग (सही द्रव्यमान देखा, विलक्षण चोटी) द्वारा इंगित उचित अंशों को इकट्ठा करें और संयोजित करें, फिर (अर्ध) शुद्ध फ्लोरोसेंट एंटीबायोटिक देने के लिए लियोफिलाइज करें।
    4. जरूरत पड़ने पर उत्पाद को और शुद्ध करें। पीपाड़ के लिए उपयुक्त कॉलम और विधि का उपयोग करते हुए एनएमआर और/या एलसीएमएस और उच्च दबाव वाले तरल क्रोमेटोग्राफी (एचपीएलसी) द्वारा शुद्धता का आकलन करें ।
  5. शुद्धि विधि 2
    नोट: यदि घुलनशीलता की अनुमति देता है, तो जलीय वर्कअप (मैक्रोलिड्स, अप्रकाशित कार्य, स्टोन 2019 के लिए उपयोग किया जाता है) द्वारा प्रीप्रिशुद्धि की जा सकती है।
    1. पानी और एट2O (1:1 v/v, प्रारंभिक प्रतिक्रिया मात्रा से लगभग 10 गुना कमजोर पड़ने के साथ ठंडा क्लिक प्रतिक्रिया पतला), एक उचित आकार अलग कीप को स्थानांतरित ।
    2. परतों को अलग और एट2ओ के साथ दो बार जलीय चरण धोने।
    3. संयुक्त कार्बनिक चरणों 2x को पानी (कार्बनिक चरण के साथ समान मात्रा) से धोएं, फिर एनए2एसओ4पर सूखजाएं।
    4. सूखे कार्बनिक चरण को फ़िल्टर करें और कम दबाव में ध्यान केंद्रित करें।
    5. एमपीएलसी और/या एचपीएलसी द्वारा कच्चे उत्पाद को शुद्ध करें जैसा कि चरण 2.4.4 में वर्णित है।
      नोट: अधूरे, पूर्ण और शुद्ध क्लिक रिएक्शन एलसीएमएस निशान के उदाहरणों के लिए चित्रा 2 देखें। एंटीबायोटिक फ्लोरोफोर क्लिक प्रतिक्रियाओं के लिए विशिष्ट शुद्ध पैदावार 30-80% से लेकर होती है।
      सावधानी: इन संश्लेषण में उपयोग किए जाने वाले अधिकांश रसायनों में विशिष्ट सुरक्षा खतरे होते हैं। व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों के उपयोग सहित हर समय सावधानी बरती जानी चाहिए। ईटी2ओ, टीबुओह, एफए, एसिटिक एसिड, पीई, ईए, टीएचएफ, एसीएन, डीएमएफ, ईटीओएच, डिपईए, प्रोपरग्यालमाइन और एचसीटीयू सभी ज्वलनशील हैं; गर्मी या चिंगारी स्रोतों के साथ संपर्क से बचें। टीएचएफ, प्रोपरग्यालमाइन, डिपईए, टीबुओह, एफए, डीएमएफ और पीई सभी विषाक्त हैं; एक्सपोजर से बचें। प्रोपरग्यालमाइन, सीएससीओ3,जेडएनसीएल2,लिओएच-एच2ओ, डीआईपीईए, कुई, एफए, एसिटिक एसिड और एचसीएल सभी संक्षारक हैं; संपर्क से बचें और सतह संपर्क के बारे में पता हो। ZnCl2,CuSO4,कुई, और पीई वर्तमान पर्यावरणीय खतरों; निपटान की स्थिति के प्रति सचेत रहें। टीएचएफ विस्फोटक पेरोक्साइड बना सकता है; भंडारण की स्थिति के साथ ध्यान रखना। कार्बनिक azides विस्फोटक हैं; विशेष रूप से बड़े पैमाने पर उत्पादन के साथ ध्यान रखें।

3. रोगाणुरोधी गतिविधि का मूल्यांकन

नोट: बैक्टीरिया से जुड़े सभी काम बाँझ परिस्थितियों में किया जाना चाहिए या तो परख या प्रयोगशाला के संदूषण से बचने के लिए । उपयोग से पहले सभी मीडिया को स्वचालित किया जाना चाहिए, और प्लास्टिक के बर्तन और उपकरण जैसे पिपेट को बाँझ रखा जाना चाहिए। यह सिफारिश की जाती है कि काम बायोएवमेंट हुड (टाइप 2) में किया जाए।

  1. बैक्टीरियल उपभेदों के लकीर ग्लाइसेरोल स्टॉक एंटीबायोटिक पाड़ के लिए उपयुक्त लाइसोजेनी शोरबा आगर (पौंड, निर्माता के निर्देशों के अनुसार तैयार) पर, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात बढ़ते हैं ।
    नोट: जीवाणुरोधी गतिविधि का परीक्षण करने के लिए बैक्टीरिया का विकल्प एंटीबायोटिक पाड़ इस्तेमाल किया जा रहा है के आधार पर किया जाना चाहिए । प्रयोगशाला की साजो-सामान की क्षमताओं पर विचार के साथ एंटीबायोटिक के प्रति अतिसंवेदनशील होने वाली प्रजातियों से 5-10 बैक्टीरिया की प्रतिनिधि सीमा को चुना जाना चाहिए । हो सके तो प्रतिरोधी बैक्टीरिया का भी परीक्षण किया जाना चाहिए। नीचे दिए गए प्रोटोकॉल ज्यादातर बैक्टीरिया पर काम करेंगे, लेकिन जांच अगर विशेष शर्तों की आवश्यकता है (जैसे, सीओ2,विशेष मीडिया) और आवश्यक के रूप में परिवर्तन करते हैं । इन स्थितियों का उपयोग करके सफलतापूर्वक एसेस किए गए बैक्टीरिया में स्टेफिलोकोसी, स्ट्रेप्टोकोसी, बेसिली, ई कोलाई, क्लेबसिएला निमोनिया, स्यूडोमोनास एरुजिनोसा और एंटोकोकस फेसियम शामिल हैं।
  2. थाली से एक ही कॉलोनी चुनें, और संस्कृति रातोंरात 5 मिलील में कोटेशन समायोजित म्यूलर-हिंटन शोरबा (CAMHB, प्रति निर्माता के निर्देशों के लिए तैयार) 37 डिग्री सेल्सियस पर।
  3. रातोंरात संस्कृतियों को पतला करें ~ 40-CAMHB में गुना और एक मध्य लॉग चरण, 600 एनएम (ओडी600)= 0.4-0.8, वॉल्यूम 5 मिलील पर ऑप्टिकल घनत्व तक बढ़ें।
  4. बाँझ पानी में १.२८ मिलीग्राम/mL पर प्रत्येक फ्लोरोसेंट एंटीबायोटिक के स्टॉक समाधान तैयार करें, और एक ९६ अच्छी तरह से थाली के पहले कॉलम के लिए एंटीबायोटिक के 10 μL पिपेट ।
  5. पहले कॉलम में कैमएचबी के 90 माइक्रोन और अन्य सभी कुओं में 50 माइक्रोन जोड़ें। इसके बाद थाली के पार सीरियल 2 गुना कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करें।
  6. अच्छी तरह से मिश्रण है, तो मध्य लॉग चरण संस्कृतियों को कमजोर करने के लिए ~१० कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU)/mL और सभी कुओं के लिए ५० μL जोड़ें, ~ 5 x 105 CFU/mL की एक अंतिम एकाग्रता प्रदान करने के लिए ।

    संस्कृति की मात्रा (mL) = (mL में मीडिया की मात्रा)/(ओडी600 x 1,000)

    उदाहरण के लिए, 12 मिलीग्राम की वांछित मीडिया मात्रा में एक ओडी600 = 0.5 संस्कृति के लिए, जोड़ें (12/(0.5 x 1,000) = संस्कृति के 0.024 mL मीडिया के 12 मिलीग्राम करने के लिए
  7. प्लेटों को ढक्कन से ढककर बिना मिलाते हुए 18-24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  8. नेत्रहीन प्लेटों का निरीक्षण, एमआईसी के साथ कोई दिखाई विकास के साथ सबसे कम एकाग्रता अच्छी तरह से किया जा रहा है ।
    नोट: सक्रिय और निष्क्रिय फ्लोरोसेंट एंटीबायोटिक दवाओं के कुछ उदाहरणों के लिए तालिका 1 देखें।

4. स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री और फ्लो साइटोमेट्री द्वारा जांच संचय का विश्लेषण

नोट: इन केंद्रीकरण समय ई. कोलाईके लिए अनुकूलित किया गया है, तो अन्य प्रजातियों के लिए मामूली परिवर्तन की जरूरत हो सकती है। एनबीडी लेबल सिप्रोफ्लोक्सिन जांच के लिए जांच संचय के लिए प्रतिनिधि डेटा की सूचना है ।

  1. बैक्टीरियल के स्ट्रीक ग्लाइसेरोल स्टॉक ्स एलबी एगर पर चलते हैं और रात भर ३७ डिग्री सेल्सियस पर बढ़ते हैं ।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पर एलबी में रात भर थाली और संस्कृति से एक ही कॉलोनी उठाओ।
  3. रातोंरात संस्कृतियों को पतला करें ~ 50-मीडिया में गुना और मध्य लॉग चरण (ओडी600 = 0.4-0.8) तक बढ़ें।
  4. 25 मिन के लिए 1,470 x ग्राम पर संस्कृतियों को अपकेंद्रित्र और मीडिया को तबाह करें।
  5. फॉस्फेट-बफर्ड लवइन (पीबीएस) के 1 मिलील में बैक्टीरिया को फिर से निलंबित करें, फिर 15 मिन के लिए 1,470 x ग्राम पर अपकेंद्री।
  6. मीडिया को डिडेंट करें और पीबीएस में धुले हुए छर्रों को अंतिम ओडी600 = 2 पर फिर से निलंबित करें।
  7. यदि वांछित हो, तो कार्बोनाइल सायनाइड 3-क्लोरोफेनाइलहाइराज़ोन (सीसीपी, पीबीएस में 10 एमएम) के 1 एमएल में बैक्टीरिया (अंतिम एकाग्रता 100 माइक्रोन) के 1 एमएल में 10.1 माइक्रोन जोड़ें और 10 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: सीसीएसपी एक एफलक्स पंप अवरोधक है। सीसीएसपी के अलावा एफलुक्स के प्रभाव की परीक्षा की अनुमति होगी।
  8. 20 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिन के लिए 18,000 x ग्राम पर संस्कृतियों को केंद्रित करें और मीडिया को डिडेंट करें।
  9. पैलेट में फ्लोरोसेंट एंटीबायोटिक सॉल्यूशन (पीबीएस में 10-100 माइक्रोन) का 1 mL जोड़ें, और 30 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  10. 4 डिग्री सेल्सियस पर 7 मिन के लिए 18,000 x ग्राम पर संस्कृतियों को केंद्रित करें और मीडिया को डिडेंट करें।
  11. ठंडे पीबीएस के 1 मिलील में बैक्टीरिया को फिर से निलंबित करें, और चरण 4.9 दोहराएं।
  12. दोहराएं चरण 4.10 कुल 4x।
  13. यदि वांछित हो, तो लिसिस बफर (20 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 8.0, और 2 एमएम सोडियम ईटीए) के 180 माइक्रोन जोड़कर बैक्टीरिया को फिर लिसोज़िम (एच2ओ में 72 मिलीग्राम/एमएल) के 70 माइक्रोन करें।
  14. 30 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, फिर फ्रीज-गल 3x (5 मिन के लिए −78 डिग्री सेल्सियस, फिर 15 मिन के लिए 34 डिग्री सेल्सियस)।
  15. 20 मिन के लिए सैंपल, फिर 30 मिन के लिए 65 डिग्री सेल्सियस तक हीट करें।
  16. मुख्य तदित नमूनों (18,000 x g,8 मिन), तो एक 10 केडीए फिल्टर झिल्ली के माध्यम से फिल्टर।
  17. फिल्टर को 4x को 100 माइक्रोन पानी से धो लें।
  18. एक फ्लैट नीचे काले 96 अच्छी तरह से थाली के लिए lysate हस्तांतरण और उत्तेजना और उत्सर्जन फ्लोरोफोर के लिए उपयुक्त तरंगदैर्ध्य के साथ एक प्लेट रीडर पर फ्लोरेसेंस तीव्रता को मापने (यानी, DMACA:1 = 400 एनएम,em = 490 एनएम; NBD:पूर्व = 475 एनएम,उन्हें = 545 एनएम)
    नोट: फ्लोरोसेंट एनबीडी लेबल सिप्रोफ्लोक्सिन एंटीबायोटिक का उपयोग कर बैक्टीरिया के स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक विश्लेषण के उदाहरणों के लिए चित्रा 3 देखें।
  19. प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण के लिए, एक ही विकास और धुंधला स्थितियों का उपयोग किया जा सकता है (चरण 4.1-4.17), केवल अंतिम तैयारी में परिवर्तन के साथ।
    1. कुल मात्रा को पीबीएस के 1 एमएल में लाएं।
    2. डेटा अधिग्रहण के लिए लोगार्थिक प्रवर्धन का उपयोग करते हुए लगभग 60 माइक्रोन/मिन की प्रवाह दर पर प्रवाह साइटोमीटर पर नमूने पढ़ें (F1 उत्तेजना = 488 एनएम; उत्सर्जन = 525/20 एनएम)।
    3. कुल 10,000 घटनाओं को रिकॉर्ड करें, फिर उपयुक्त सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण करें।
    4. घटनाओं की गिनती की संख्या के खिलाफ F1 से फ्लोरेसेंस तीव्रता प्लॉट, बैक्टीरिया दाग के बाद हिस्टोग्राम चोटियों से औसत फ्लोरेसेंस तीव्रता का आकलन ।
      नोट: NBD लेबल सिप्रोफ्लोक्सिन एंटीबायोटिक का उपयोग कर बैक्टीरिया के प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के उदाहरणों के लिए चित्रा 4 देखें ।

5. सूक्ष्म विश्लेषण के लिए तैयारी

  1. एमिक मूल्यांकन के लिए ओडी600 = 0.4 के लिए उपसंस्कृतियों को बढ़ाएं, फिर 3-5 मिन के लिए 1 8,000 x ग्राम पर 1 मिलीएल एलिकोट्स और सेंट्रलाइज में विभाजित करें।
  2. Decant और त्यागने मीडिया, तो HBSS के ५०० μL में जीवाणु गोली फिर से निलंबित ।
  3. 3 मिन के लिए 18,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र, फिर डिवेंट और मीडिया को त्यागें।
  4. 1-100 माइक्रोन की सांद्रता पर एचबीएसएसएस में एंटीबायोटिक जांच के समाधान तैयार करें।
  5. जांच समाधान के 500 माइक्रोन में धोए गए बैक्टीरिया को फिर से निलंबित करें, और 30 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  6. दोहराएं चरण 5.3। एक से अधिक लेबलिंग प्रयोग के लिए, एक ऑर्थोगोनली रंग के न्यूक्लिक एसिड रंग े के 500 माइक्रोन में गोली को फिर से निलंबित करें। हरे रंग के लिए, Syto9 (एचबीएस में 5 μM) का उपयोग करें; नीले रंग के लिए, Hoechst ३३३४२ (HBSS में 20 μg/mL) का उपयोग करें । 15-30 मिन के लिए आरटी पर इनक्यूबेट।
  7. दोहराएं चरण ५.३, तो FM4-64FX (HBSS में 5 μg/mL) के ५०० μL में फिर से निलंबित और 5 मिन के लिए आरटी में इनक्यूबेट ।
  8. चरण 5.3 दोहराएं, फिर एचबीएसएस के 500 माइक्रोन में फिर से निलंबित करें, और एक बार फिर चरण 5.3 दोहराएं।
  9. चरण 5.8 दोहराएं, फिर अंत में बढ़ते माध्यम के 15 माइक्रोन में धोए गए, रंगे बैक्टीरिया को निलंबित करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
  10. एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर बढ़ते माध्यम और एक उच्च प्रदर्शन कवर स्लिप के साथ शीर्ष पर पिपेट, तो स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ किनारों सील ।
    नोट: NBD लेबल सिप्रोफ्लोक्सिम एंटीबायोटिक दवाओं के साथ ली गई कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी छवियों के उदाहरणों के लिए चित्रा 5 देखें, और DMACA-लेबल ऑक्साजोलिडिनोन (linezolid) एंटीबायोटिक के लिए चित्रा 6

Representative Results

चित्रा 1 फ्लोरोसेंट एंटीबायोटिक्स की तैयारी के लिए प्रमुख क्लिक करें रसायन विज्ञान प्रतिक्रिया(ए)और सिप्रो, ट्राइमेथोप्रिम (टीएमपी), और लाइनज़ोलिड पर आधारित हमारे प्रकाशित फ्लोरोसेंट एंटीबायोटिक दवाओं की संरचनाओं के उदाहरणों के साथ(बी)दिखाता है। इन जांच सभी एक अजाइड मध्यवर्ती के माध्यम से इसी एंटीबायोटिक दवाओं से संश्लेषित किया गया । वे तो NBD और DMACA फ्लोरोफोरस के साथ मिलकर थे, प्रत्येक एक alkyne के साथ कार्यकिया ।

चित्रा 2 उदाहरण से पता चलता है कि एक सिप्रोफ्लोक्सासिन-एन3 और एनबीडी-अल्काइन क्लिक रिएक्शन से एलसीएमएस निशान, जहां अजाइड 3.2 मिन और उत्पाद 3.8 मिन में उभरा है। 1 और 2 की तुलना से पता चलता है कि अजाइड चोटी (यूवी या एमएस डिटेक्टर द्वारा) के गायब होने के बाद क्लिक प्रतिक्रिया की प्रगति कैसे हो सकती है। स्पेक्ट्रा 3 शुद्धिकरण के प्रभाव को प्रदर्शित करता है, जिसमें एमएस और यूवी निशान से गायब गलत चोटियां हैं। शुद्धता और प्रतिक्रिया प्रगति दोनों उत्पाद चोटी और किसी भी अशुद्धता चोटियों के एकीकरण से मात्रा निर्धारित किया जा सकता है ।

चित्रा 3 प्रभावलों की उपस्थिति और अनुपस्थिति में फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा इंट्रासेलर संचय के आकलन से विशिष्ट परिणामों को दर्शाता है। इस प्रयोग में ई कोलाई के साथ या सीसीएसपी के अलावा के बिना टीएमपी-एनबीडी के साथ इलाज किया गया, जो प्रोटोन मोटिव फोर्स (पीएमएफ) को ध्वस्त कर देता है । सीसीएसपी के साथ पुनर्व्यवहार करते समय बैक्टीरिया का इंट्रासेलुलर फ्लोरेसेंस काफी अधिक था, यह दर्शाता है कि एफलक्स ने इन बैक्टीरिया में संचय को कम कर दिया। इस प्रयोग को टोलसीमें कमी वाले बैक्टीरिया का उपयोग करके दोहराया गया था, जो व्यक्तिगत प्रभावपंप घटकों के प्रभाव की जांच करने के लिए इस परख की क्षमता को प्रदर्शित करता है। इस मामले में, हालांकि जंगली प्रकार के बैक्टीरिया की तुलना में इंट्रासेलुलर फ्लोरेसेंस में वृद्धि हुई थी, सीसीएसपी संचय अभी भी बढ़ गया है। इन निष्कर्षों से संकेत मिलता है कि TOLC भाग लेता है inTMP efflux लेकिन एकमात्र PMF ड्राइव शामिल पंप नहीं है ।

चित्रा 4 चित्रा 2के रूप में एक ही प्रयोग के परिणाम से पता चलता है, लेकिन संचय के बजाय स्पेक्ट्रोस्कोपी के प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा मापा जाता है । एक ही डेटा प्रवृत्तियों को देखा गया, यह प्रदर्शित करते हुए कि या तो तकनीक का उपयोग प्रभावलों की मध्यस्थता अंतरकोशिकीय संचय की घटना का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।

चित्रा 5 ग्राम-पॉजिटिव(एस ऑरियस)और ग्राम-निगेटिव बैक्टीरिया(ई कोलाई)की प्रतिनिधि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी छवियों को दिखाता है, जो क्रमशः टीएमपी-एनबीडी(1)और सिप्रो-एनबीडी(2 +3)फ्लोरोसेंट जांच के साथ लेबल किया गया है। दोनों ही मामलों में, सह-स्थानीयकरण की तुलना करने के लिए लाल झिल्ली रंग ी एफएम 4-64एफएक्स जोड़ी गई थी। टीएमपी-एनबीडी के लिए ब्लू न्यूक्लिक एसिड डाया होचस्ट-33342 का भी इस्तेमाल किया गया। इन छवियों को ओवरले करके, बैक्टीरिया में एंटीबायोटिक के स्थानीयकरण की कल्पना की गई थी। पैनलों की तुलना 2 और 3 से पता चलता है कि कैसे efflux के प्रभाव की जांच की गई थी, efflux अवरोधक CCCP 2में इस्तेमाल के साथ, इंट्रासेलुलर संचय में जिसके परिणामस्वरूप । पैनल 3में कोई सीसीएसपी नहीं जोड़ा गया । इसलिए, एफलक्स सक्रिय है और कोई जांच संचय नहीं देखा गया था।

चित्रा 6 डीएमएमएए लेबल वाले ऑक्साजोलिडिनोन प्रोब एलजेड-एनबीडी के साथ लेबल किए गए ग्राम-पॉजिटिव(एस ऑरियस)बैक्टीरिया की प्रतिनिधि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी छवियों को दिखाता है। सह-स्थानीयकरण की तुलना करने के लिए लाल झिल्ली दयो एफएफ4-64एफएक्स जोड़ा गया था, और हरे न्यूक्लिक एसिड रंगे Hoechst-33342 का भी उपयोग किया गया था। इन छवियों को ओवरले करके, बैक्टीरिया में एंटीबायोटिक के स्थानीयकरण की कल्पना की गई थी, जिसमें झिल्ली और न्यूक्लिक एसिड से अलग आंतरिक स्थानीयकरण दिखाया गया था।

तालिका 1 फ्लोरोसेंट एंटीबायोटिकदवाओं, सिप्रोफ्लोक्सिन, ट्राइमेथोप्रिम (टीएमपी), और लाइनज़ोलिड (एलजेड) की तीन श्रृंखलाओं के लिए एमआईसी मूल्यों को दिखाती है, जिसमें प्रत्येक के माता-पिता एंटीबायोटिक, एनबीडी और डीएमएमए डेरिवेटिव के लिए प्रस्तुत डेटा है। प्रत्येक एंटीबायोटिक के लिए प्रतिनिधि प्रजातियों को चुना गया, जिसमें ग्राम-सकारात्मक और ग्राम-नकारात्मक दोनों शामिल हैं । सिप्रोफ्लोक्सेसिन श्रृंखला के लिए, दोनों फ्लोरोसेंट जांच ने माता-पिता की दवा की तुलना में एंटीबायोटिक गतिविधि खो दी, लेकिन सभी प्रजातियों के खिलाफ कुछ गतिविधि को बनाए रखा। इसी तरह, linezolid जांच कुछ गतिविधि खो दिया है, लेकिन एक मध्यम से कमजोर एंटीबायोटिक बने रहे । टीएमपी जांच जंगली प्रकार के बैक्टीरिया के खिलाफ लगभग सभी गतिविधि खो दिया है, लेकिन efflux कमी ई. कोलाईके खिलाफ सक्रिय थे, यह दर्शाता है कि जीवाणुरोधी गतिविधि के नुकसान संचय की कमी के कारण था ।

Figure 1
चित्रा 1: संश्लेषण और एंटीबायोटिक-व्युत्पन्न जांच की संरचनाएं। (A)एजाइड-एंटीबायोटिक्स और एल्किन-फ्लोरोफोर्स से फ्लोरोसेंट एंटीबायोटिक जांच के संश्लेषण के लिए सामान्य प्रतिक्रिया योजना । (ख)सिप्रोफ्लोक्सेसिन, ट्राइमेथोप्रिम और लाइनजोलिड पर आधारित हमारी प्रकाशित जांच की संरचनाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एलसीएमएस द्वारा एंटीबायोटिक-व्युत्पन्न जांच शुद्धता का मापन। विश्लेषणात्मक एलसीएमएस (1) अधूरा, (2) पूर्ण से निशान, और (3) एचपीएलसी शुद्ध ciprofloxacin-N3 + NBD-alkyne क्लिक प्रतिक्रियाओं प्रतिक्रिया पूर्णहोने पर शुरू सामग्री के लापता होने का प्रदर्शन, और शुद्धि पर विविध चोटियों । A = यूवी-विस ट्रेस (250 एनएम पर अवशोषण), बी = एमएस ट्रेस (सकारात्मक और नकारात्मक मोड)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: एंटीबायोटिक व्युत्पन्न जांच संचय के प्लेट रीडर माप । जंगली प्रकार (1, एटीसीसी 25922) और ई. कोलाई इनक्यूबेटेड(ए)के साथ और (बी)में टीएमपी-एनबीडी (50 माइक्रोन) के सेलुलर संचय का फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रोस्कोपिक मापन बिना सीसीसीपी (100 माइक्रोनएम) के अतिरिक्त है। सांख्यिकीय महत्व (**p♫ 0.01; ***p ♫ 0.001) सीसीसीपी की अनुपस्थिति या उपस्थिति के बीच और जंगली प्रकार औरटॉलसीई कोलाईके बीच दिखाया गया है। रिपोर्ट किए गए डेटा तीन प्रयोगों के लिए मतलब ± एसडी हैं। यह आंकड़ा हमारे पिछले प्रकाशन15से अनुकूलित है, और इंट्रासेलर संचय पर प्रभावलों की भूमिका को स्पष्ट करने के लिए स्पेक्ट्रोस्कोपी के उपयोग को दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: एंटीबायोटिक-व्युत्पन्न जांच संचय का प्रवाह साइटोमेट्री माप। जंगली प्रकार (1, एटीसीसी 25922) और सीसीसी 25922 ई. कोलाई में टीएमपी-एनबीडी का उपयोग करके सेलुलर संचय का प्रवाह साइटोमेट्री मापसीसीपी (100 माइक्रोन) के अलावा और बिना शामिल है। औसत फ्लोरेसेंस गतिविधि 10,000 बैक्टीरियल घटनाओं, सांख्यिकीय महत्व (***, पी * 0.001; ****, पी ‧ 0.0001) से दिखाई जाती है, जो सीसीसीपी की अनुपस्थिति और उपस्थिति और जंगली प्रकार औरटॉलसीई कोलाईके बीच दिखाई जाती है। रिपोर्ट किए गए डेटा तीन प्रयोगों के लिए मतलब ± एसडी हैं। यह आंकड़ा हमारे पिछले प्रकाशन15से अनुकूलित है, और इंट्रासेलर संचय पर efflux की भूमिका को स्पष्ट करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री के उपयोग को दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: एनबीडी-प्रोब स्थानीयकरण की कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी दृश्य। 1 की कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी छवियां) होचस्ट-33342 (नीला, न्यूक्लिक एसिड), टीएमपी-एनबीडी (हरा), FM4-64FX (लाल, झिल्ली), और मढ़ा के साथ लेबल एस ऑरियस रहते हैं; 2) लाइव ई. कोलाई सीसीओपी (efflux अवरोधक) के साथ इलाज cipro-NBD (हरे), FM4-64FX (लाल, झिल्ली), और मढ़ा के साथ लेबल; 3) लाइव ई. कोलाई cipro-NBD (हरे), FM4-64FX (लाल, झिल्ली) के साथ लेबल, और मढ़ा । यह आंकड़ा हमारे पिछले प्रकाशनों15,16से अनुकूलित है, और प्रभावलक्स के प्रभाव सहित स्थानीयकरण की जांच करने के लिए माइक्रोस्कोपी के उपयोग को दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: DMACA-जांच स्थानीयकरण के Confocal माइक्रोस्कोपी दृश्य । ऑक्साजोलिडिनोन प्रोब एलजेड-डीएमएसीए (नीला), सिटॉक्स ग्रीन (हरा, न्यूक्लिक एसिड) और एफएम4-64एफएक्स (लाल, झिल्ली) के साथ लेबल किए गए लाइव एस ऑरियस की कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी छवियां। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

एमआईसी (μg/mL)
प्रजातियां तनाव सिप्रो सिप्रो-एनबीडी सिप्रो-ड्मैका Tmp टीएमपी-एनबीडी टीएमपी-डीएमएमएए लाइनजोलिड (एलजेड) एलजेड-एनबीडी एलजेड-ड्मैका
स्टेफिलोकोकस ऑरियस एटीसीसी 25923 0.125 - 0.5 32 - ‧64 16 1 16 64
एटीसीसी 43300 1 16 64
स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया एटीसीसी 700677 1 4 64
आंत्रकोकस मल एटीसीसी 35667 1 - 8 32 32 - ‧64
एटीसीसी 51559 2 16 32
क्लेबसिएला निमोनिया एटीसीसी 13883 0.015 - 0.06 8 - 16 8 - 32
स्यूडोमोनास एरुजिनोसा एटीसीसी 27853 0.25 - 1 32 - ‧64 32 - ‧64
एस्चेरिचिया कोलाई एटीसीसी 25922 ‧0.004 8 2 0.5 64 64
उत्परिवर्ती 0.125 0.25 2

तालिका 1. ब्रोथ माइक्रोडिल्यूटन एमआईएस के द्वारा मापा गया उचित चिकित्सकीय प्रासंगिक जीवाणु उपभेदों के खिलाफ फ्लोरोसेंट एंटीबायोटिक जांच की एंटीबायोटिक गतिविधियां, और उचित चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक बैक्टीरियल उपभेदों के खिलाफ लाइनजोलिड। ज्यादातर मामलों में, जांच माता पिता की दवा की तुलना में कुछ गतिविधि खो दिया है, लेकिन कुछ औसत दर्जे का एंटीबायोटिक शक्ति बनाए रखा (आगे के अध्ययन में उपयोगी होने के लिए पर्याप्त) ।

Discussion

एक सफल फ्लोरोसेंट एंटीबायोटिक जांच का निर्माण सावधानीपूर्वक योजना और माता पिता की दवा के SAR के विचार के साथ शुरू करना चाहिए । यदि एसएआर को ज्ञात या पूरी तरह से पता नहीं लगाया जाता है, तो एक ऐसी साइट खोजने के लिए कई विकल्पों का परीक्षण करने की आवश्यकता हो सकती है जिसे जैविक गतिविधि को समाप्त किए बिना चुनिंदा रूप से संशोधित किया जा सकता है। एक बार साइट/एस की पहचान कर ली गई है, तो कार्रवाई की जैविक साइट और निष्क्रिय फ्लोरोफोर के बीच स्टेरिक स्पेसिंग प्रदान करने के लिए लिंकर मोइटी की स्थापना अक्सर आवश्यक होती है । ध्यान रखा जाना चाहिए कि एंटीबायोटिक के लिए लिंकर संलग्न करने के लिए इस्तेमाल की प्रतिक्रिया एक जैव स्थिर कार्यात्मक समूह छोड़ देता है, परहेज, उदाहरण के लिए, एस्टर है कि वीवो में esterases द्वारा दरार के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं । एंटीबायोटिक के फार्माकोडायनामिक और फार्माकोकिनेटिक प्रोफाइल के आधार पर, एक साधारण एल्किल लिंकर का उपयोग किया जा सकता है, या किसी अन्य में पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) लिंकर जैसे कम लिपोफिलिक विकल्प पर विचार किया जाना चाहिए। लिंकर संलग्न के साथ, जीवाणुरोधी गतिविधि का आकलन किया जाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि प्रासंगिक बैक्टीरिया के खिलाफ एमआईसी मूल यौगिक के समान हैं।

इस काम में, हम कई कारणों से, ह्यूगसेन अजाइड-अल्किन [3 +2] डाइपोलर साइक्लोड (क्लिक केमिस्ट्री, देखें फिगर 1)के उपयोग की सलाह देते हैं, जो कई कारणों से फ्लोरोफोर को एंटीबायोटिक से लिगेट करते हैं। क्लिक करें प्रतिक्रियाएं अत्यधिक चयनात्मक हैं, जिसका अर्थ है कि एंटीबायोटिक पर प्रतिक्रियाशील समूहों की सुरक्षा आवश्यक नहीं है, और आगे, प्रतिक्रिया एक स्थिर, जैव संगत ट्राइजोल मोईटी छोड़ देती है। अजाइड घटक हमारी प्रक्रियाओं में एंटीबायोटिक भाग के लिए पेश किया जाता है, क्योंकि यह आम तौर पर एक alkyne की शुरूआत की तुलना में संरचनात्मक प्रकार की एक किस्म के साथ अधिक आसानी से पूरा किया जाता है । दो alkyne-व्युत्पन्न फ्लोरोफोरस के संश्लेषण यहां वर्णित हैं, हालांकि दूसरों को अगर वांछित पता लगाया जा सकता है । एनबीडी और DMACA अपने छोटे आकार के कारण चुना गया था, सेल प्रवेश और लक्ष्य बातचीत के साथ हस्तक्षेप की संभावना को कम । क्लिक करें प्रतिक्रिया ही कॉपर उत्प्रेरक का उपयोग करके किया जाता है, जहां या तो सीयू2 + (क्यूएसओ4,एक एस्कोबिक एसिड कम करने वाले एजेंट के साथ) या सीयू+ (कुआई) का उपयोग शुरुआती अभिकर्मक के रूप में किया जा सकता है। शुद्धिकरण(चित्रा 2) केबाद, एमआईसी को फिर अजाइड के साथ परीक्षण किया जाना चाहिए। यहां तक कि फ्लोरोफोर पसंद और लगाव की साइट पर सावधानीपूर्वक विचार करने के साथ, यह संभव है कि खराब एंटीबायोटिक गतिविधि देखी जाएगी। हालांकि, इसका मतलब यह नहीं है कि एक निष्क्रिय जांच उपयोग के बिना है । जैसा कि टीएमपी जांच के साथ दिखाया गया है, गरीब जीवाणुरोधी गतिविधि वाले यौगिक अभी भी माता-पिता की दवा के समान लक्ष्य से बांध सकते हैं। यह कार्रवाई के तरीके और घटनाओं की परीक्षा के तरीके पर अध्ययन सक्षम कर सकता है जिससे प्रतिरोध, जैसे कि efflux।

जैसा कि प्रोटोकॉल अनुभाग में उल्लिखित है, फ्लोरोसेंट एंटीबायोटिक दवाओं द्वारा बैक्टीरियल लेबलिंग का विश्लेषण करना संभव है या तो एक साधारण स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री परख(चित्रा 3)या प्रवाह साइटोमेट्री(चित्रा 4)का उपयोग करके। दोनों विधियां सेलुलर संचय की मात्रा निर्धारित करने में सक्षम हैं, और कोशिकाओं को लायसेटिंग करके और lysate में फ्लोरेसेंस स्थानीयकरण की जांच करके, इंट्रासेलर संचय का आकलन करना संभव है। इस प्रोटोकॉल में सेल लिसिस के लिए लिसोज़िम के इस्तेमाल का वर्णन किया गया है, क्योंकि यह एक रैपिड, यूनिवर्सल तकनीक है। ग्लाइसिन-एचसीएल7के साथ रात भर इलाज जैसी अन्य लाइसिस स्थितियों का भी सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है। इस तकनीक का उपयोग करके, एंटीबायोटिक सेलुलर संचय पर एफलक्स के प्रभाव का अध्ययन करना संभव है, जो प्रतिरोध का एक प्रमुख तंत्र है। यदि एफलक्स वास्तव में बैक्टीरिया में मौजूद है, तो इंट्रासेलुलर संचय की कमी देखी जाएगी, हालांकि इसे सीसीएसपी जैसे एफलक्स अवरोधक का उपयोग करके बचाया जा सकता है।

माइक्रोस्कोपी भी नेत्रहीन विभिन्न बैक्टीरिया में जांच स्थानीयकरण का निरीक्षण करने के लिए किया जा सकता है, कार्रवाई के मोड पर जानकारी जुटाने, और संभवतः भी प्रतिरोध (प्रतिनिधि उदाहरण के लिए चित्रा 5 देखें) । बैक्टीरिया के भीतर स्थानीयकरण देखने के लिए, एक उच्च संकल्प कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप की आवश्यकता होती है, सिम (संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी), एसआर-सिम (सुपररिज़ॉल्यूशन-सिम), एयरिकस्कैन, या एसटीईडी (उत्तेजित उत्सर्जन कमी) जैसी क्षमताओं से लैस है। इसके अलावा, उच्च प्रदर्शन कवर स्लिप का उपयोग किया जाना चाहिए, और एक उपयुक्त सॉफ्टवेयर (जैसे, फिजी, ज़ेन या इमरिस) पर पोस्ट-इमेजिंग विश्लेषण किया जाना चाहिए। जांच के स्थानीयकरण की तुलना उन रंगों से की जाती है जो विशिष्ट आर्किटेक्चर को दाग देते हैं, जैसे कि होचस्ट-33342 (नीला, न्यूक्लिक एसिड), सिको-9 (हरा, न्यूक्लिक एसिड), और एफएम4-64एफएक्स (लाल, झिल्ली)। फ्लोरोसेंट एंटीबायोटिक से मेल खाने के लिए रंगों का चुनाव किया जाना चाहिए, ताकि उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक रंग में न्यूनतम स्पेक्ट्रल ओवरलैप हो। सर्वोत्तम संभव छवियों को प्राप्त करने के लिए, अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। उदाहरण के लिए, यदि स्लाइड पर बैक्टीरिया की बहुत भीड़ होती है, तो निलंबित गोली का केवल एक हिस्सा लें, फिर अधिक बढ़ते माध्यम के साथ पतला करें। इसके विपरीत, यदि बैक्टीरिया स्लाइड पर बहुत विरल हैं, तो बस अधिक बैक्टीरिया से शुरू करें। इस प्रोटोकॉल में, लाइव सेल इमेजिंग के लिए लाइव सेल (जैसे, साइगेल) के साथ संगत होने वाले थर्मो रिवर्सिबल जेल का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है, क्योंकि यह बैक्टीरिया (मोटिवल बैक्टीरिया सहित) को स्थिर करता है, लेकिन अन्य बढ़ते मीडिया या अगारोज का भी सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है।

कुल मिलाकर, जैविक रूप से सक्रिय फ्लोरोसेंट एंटीबायोटिक डेरिवेटिव की तैयारी में सामना की जा सकने वाली चुनौतियों के बावजूद, उनके उपयोग की सादगी और उनकी बहुमुखी प्रतिभा इन जांचों को एएमआर में अनुसंधान के लिए आकर्षक उपकरण बनाती है। फ्लोरोसेंट एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग कर भविष्य के काम एंटीबायोटिक प्रतिरोध के तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान करने की क्षमता है, कैसे वर्तमान एंटीबायोटिक दवाओं काम की हमारी समझ में सुधार, और बेहतर दवाओं के विकास में सहायता ।

Disclosures

लेखकों के पास घोषणा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

एमआरएलएस को एक ऑस्ट्रेलियाई स्नातकोत्तर पुरस्कार (एपीए) और आणविक जैव विज्ञान अनुसंधान उन्नति पुरस्कार के लिए एक संस्थान द्वारा समर्थित किया जाता है। वानिडा फेसांग को यूक्यू इंटरनेशनल स्कॉलरशिप (यूक्यूआई) और आईएमबी पोस्टग्रेजुएट अवार्ड (IMBPA) ने समर्थन दिया था । मैक एक एनएचएमआरसी सिद्धांत अनुसंधान फेलो (APP1059354) है और क्वींसलैंड विश्वविद्यालय में एक आंशिक प्राध्यापक अनुसंधान फेलो नियुक्ति भी रखती है, जिसमें इंफ्लाज़ोम लिमिटेड के सीईओ के रूप में उनका शेष समय है, जो भड़काऊ रोग में नैदानिक अनमेट जरूरतों को संबोधित करने के लिए दवाओं का विकास करने वाली कंपनी है। MATB वेलकम ट्रस्ट सामरिक अनुदान WT1104797/Z/14/Z और NHMRC विकास अनुदान APP1113719 द्वारा भाग में समर्थित है । माइक्रोस्कोपी ऑस्ट्रेलियन कैंसर रिसर्च फाउंडेशन (ACRF) /आणविक जैव विज्ञान कैंसर जीव विज्ञान इमेजिंग सुविधा के लिए संस्थान में किया गया था, जो ACRF के समर्थन से स्थापित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-(dimethylamino)phenol Alfa-Aesar B23067
4-chloro-7-nitro-benzofuran Sigma-Aldrich 163260-5G
Amicon Ultra-0.5 centrifugal filter unit with Ultracel- 10 membrane Merck UFC501096
Atlantis Prep T3 OBD (100 A, 5 uM, 10x250 mm) Waters 186008205
Atlantis T3 column (100 A, 5 uM, 2.1 × 50 mm) Waters 186003734
Bruker Avance 600 MHz spectrometer Bruker
Buchi Reveleris C18 12g Cartridge Buchi BUC145152103
CCCP Sigma-Aldrich C2759
Celite 545 Sigma-Aldrich 22140-5KG-F
Cygel ABCAM Ab109204
Elyra PS,1 SIM/STORM confocal microscope Zeiss
FM4-64FX, fixable analog of FM™ 4-64 membrane stain Life Technologies Australia Pt F34653
Gallios flow cytometer Beckman Coulter
Gamma 2-16 LSCplus lyophilise CHRIST
Gilson HPLC 2020 Gilson
Hanks' Balanced Salt solution, Modified, with sodium bicarbonate, without phenol red, calcium chloride and magnesium sulfate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture Sigma-Aldrich H6648-500ML
Hettich Zentrifugen Rotofix 32 Hettich
High performance #1.5 cover slips (18 x 18 mm) Schott/Zeiss 474030-9000-000
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - Fluo Life Technologies Australia Pt H21492
LB AMRESCO J106
Leica STED 3X Super Resolution Microscope with White Light Laser excitation Leica
Lysozyme from chicken egg white
lyophilized powder
Sigma-Aldrich L6876
Mueller Hinton II Broth Cation adjusted Becton Dickinson 212322
Propargylamine Sigma-Aldrich P50900-5G
Reveleris GRACE MPLC Buchi
Shimadzu LCMS-2020 Shimadzu
Sigma 1-15 Microcentrifuge Sigma-Aldrich
Silica gel 60 (0.040-0.063 mm) for column chromatography (230-400 mesh ASTM) Merck 1093859025
SYTO 9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain Life Technologies Australia Pt S34854
TECAN Infinite M1000 PRO TECAN

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References

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फ्लोरोसेंट एंटीबायोटिक जांच का उपयोग कर बैक्टीरियल प्रतिरोध का दृश्य
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Stone, M. R. L., Phetsang, W., Cooper, M. A., Blaskovich, M. A. T. Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes. J. Vis. Exp. (157), e60743, doi:10.3791/60743 (2020).More

Stone, M. R. L., Phetsang, W., Cooper, M. A., Blaskovich, M. A. T. Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes. J. Vis. Exp. (157), e60743, doi:10.3791/60743 (2020).

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