Summary
在这里，我们演示了一种量化幼虫斑马鱼肝脏大小的方法，提供了一种评估遗传和药理操作对肝脏生长和发育的影响的方法。
Abstract
在肝细胞癌（HCC）的几个转基因斑马鱼模型中，在早期幼虫阶段可以观察到肝球菌。在斑马鱼HCC模型中量化幼虫肝大小提供了一种快速评估药物和其他操作对与基因相关的表型的影响的方法。在这里，我们展示如何修复斑马鱼幼虫，解剖肝脏周围的组织，使用明亮的显微显微镜拍摄肝脏，测量肝脏面积，并分析结果。该协议能够快速、精确地定量肝脏大小。由于这种方法涉及测量肝脏面积，它可能会低估肝脏体积的差异，并且需要补充方法来区分细胞大小的变化和细胞数的变化。本文描述的解剖技术是一个很好的工具，用于可视化肝脏、肠道和胰腺的自然位置，用于各种下游应用，包括免疫荧光染色和原位杂交。所述的量化幼肝大小的策略适用于肝脏发育和再生的许多方面。
Introduction
肝细胞癌（HCC）是肝脏1最常见的原发性恶性肿瘤，是导致癌症相关死亡的第三大原因2。为了更好地了解肝癌的机理和识别潜在的HCC治疗，我们和其他人已经开发出转基因斑马鱼，其中肝细胞特异性表达的肿瘤基因，如β-卡泰宁3，4，克拉斯（V12）5，6，Myc7，或Yap18导致成年动物的HCC。在这些斑马鱼中，肝增增早在受精后6天（dpf），为测试药物和基因改变对卵基因驱动肝过度生长的影响提供了一个方便的平台。准确和精确测量幼虫肝大小对于确定这些操作的影响至关重要。
肝脏大小和形状可以半定量评估在固定斑马鱼幼虫由CY3-SA标签9或活斑马鱼幼虫使用肝细胞特异性荧光报告机和荧光解剖显微镜5，6。后一种方法比较快，使用图像处理软件7、10拍摄和测量每个肝脏的面积，可以解决其精度不足的问题。然而，在实验中统一定位所有活幼虫，使二维肝区准确表示肝脏大小，在技术上可能具有挑战性。一种类似的量化肝脏大小的技术包括使用光片荧光显微镜来量化幼虫肝体积8，当肝脏在不同维度上不均匀地扩张时，这可能更准确检测大小差异。荧光活化细胞分拣（FACS）可用于计算幼肝8、11中荧光标记肝细胞和其他肝细胞类型的数量。在这种方法中，幼虫肝被集中和分离，因此有关单个肝脏大小和形状的信息丢失。结合另一种肝大小测定方法，FACS 能够区分增加的细胞数（增生）和增加的细胞大小（肥大）。所有这些方法都采用昂贵的荧光技术（显微镜或细胞分拣机），除 CY3-SA 标签外，还需要用荧光报告器标记肝细胞。
在这里，我们详细介绍了使用明场显微镜和图像处理软件3，12，13，14量化斑马鱼幼肝区域的方法。该协议允许在原位对单个肝脏区域进行精确定量，而无需使用荧光显微镜。在分析肝脏大小时，我们盲注图像特征，以减少研究者的偏见，提高科学严谨性。
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Protocol
动物研究按照犹他大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的程序进行。
1. 修复幼虫
- 在受精后3~7天（dpf），用三联甲甲烷酸酯（0.03%）对幼虫实施安乐死使用玻璃移液器和移液器泵在 2 mL 管中收集多达 15 个幼虫。
- 用1mL的冷（4°C）1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）在冰上洗涤幼虫两次。每次清洗时，用玻璃移液器和移液器泵从管中取出尽可能多的液体，然后将 1 mL 的冷 PBS 添加到管中。
- 使用玻璃移液器和移液器泵尽可能多地去除 PBS，并在 PBS 中加入 1 mL 的冷 （4°C） 4% 甲醛 （PFA）。
注意：PFA是一种刺激性和可疑的致癌物质。处理 PFA 时应佩戴手套，集中溶液应在化学烟气罩中处理。 - 在4°C孵育至少一夜之间（但长达数月），轻轻摇动。
2. 解剖肝脏周围的组织
- 用1 mL的冷（4°C）PBS冲洗3x，并在冲洗之间摇动5分钟，从PFA中去除幼虫。
注意：在 4°C 下将冲洗过的幼虫在 PBS 中保存一两天是可以的。 - 将几根幼虫在PBS中放入一个9井圆底玻璃盘的一口井中。
- 去除肝脏周围的皮肤。
- 使用细钳将幼虫放在其背上（腹部向上），尽可能轻轻地抓住头部的两侧。然后用非常精细的钳子在你的另一只手抓住皮肤刚刚覆盖心脏。
- 将皮肤沿对角线向下拉向鱼的尾部，将鱼的左侧或右侧的盘子底部拉下。对其他侧（右侧或左侧）重复上述步骤。
- 继续抓住皮瓣，拉下/后退，直到所有皮肤上或肝脏附近的黑色素被移除。
- 取出蛋黄（如果存在）。
- 对于 5-6 dpf 幼虫，将鱼的背上用细钳的鱼放在一块中提起蛋黄，并使用非常精细的钳子轻轻抬高蛋黄。
- 对于 3⁄4 dpf 幼虫，将蛋黄切成碎片。将鱼背上用细腻的钳子抓住，用非常细的钳子从腹侧开始抚摸蛋黄。
- 使用玻璃移液器和移液器泵将解剖的幼虫放入新鲜冷的PBS中。
3. 成像
- 要安装幼虫，将几 mL 的 3% 甲基纤维素倒在干净的塑料培养皿的盖子上。
- 使用玻璃移液器和移液器泵向甲基纤维素中添加幼虫，尽可能少地加入带幼虫的PBS。
- 在低放大倍率的解剖显微镜下，用细钳来定位鱼，使其位于右侧，朝左。
注：确保鱼的侧向正确，或肝脏测量可能不准确。 - 拍下每条鱼的照片。
- 确认要拍摄的鱼完全对齐，一只眼睛直接放在另一只眼睛的顶部。如有必要，使用细钳轻轻敲打鱼的头部或尾部以调整方向。如果鱼的尾巴弯曲，用钳子用力捏住鱼尾，使鱼平放。
- 放大到高放大倍率，并聚焦于肝脏，确保肝脏的轮廓清晰可见。
- 捕捉图片并保存文件。
- 对所有鱼重复上述步骤，确保每张图片的放大倍数相同。
- 使用相同的放大倍率拍摄微米的照片（参见图2H）。
4. 图像分析
- 使用图像处理软件测量每条鱼的肝脏面积。
- 蒙住所有的肝脏图片，以避免潜在的调查人员偏见，促进科学的严谨15。此步骤可以由其他实验室成员手动完成，也可以使用计算机程序 （补充材料）。随机重命名文件并创建一个"随机化文件"，其中包含原始文件名和相应的盲化文件名的列表。
- 按顺序打开随机文件，从文件 1 开始。
- 选择手绘工具并勾勒出每个肝脏。
- 按 Ctrl-M 测量每个肝脏的面积。
- 对于无法准确测量的任何肝脏，插入占位符测量值（非常小或非常大，因此以后可以轻松排除）。
- 将测量值保存在文本文件中（"测量文件"）。
- 无盲分析数据
- 在电子表格程序中打开"测量文件"和"随机化文件"。
- 在"测量文件"中插入一个新列，并使用"随机化文件"添加盲注文件的原始文件名。将此文件另存为"无盲测量文件"。
- 按原始文件名对数据进行排序。
- 请务必排除任何肝脏测量图片不足（参见图 2A+G）。
- 如有必要，将测量值转换为所需的刻度（例如 mm2）。
- 打开图像处理软件中的比例尺。
- 使用直线工具在刻度杆上测量 1 mm。图像处理软件将测量与肝脏（像素）相同的单位，给出一个转换因子。
- 使用转换系数转换"无盲测量文件"中的测量值。
- 使用电子表格程序或将数据粘贴到科学的图形和统计软件中，确定均值和标准偏差并计算p值。
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Representative Results
转基因斑马鱼表达肝细胞特异性活性β-卡特宁（Tg（fabp10a：pt-α-cat）斑马鱼3，非转基因对照兄弟姐妹在6dpf和肝脏区域使用明场显微镜和图像处理软件进行定量。转基因斑马鱼与非转基因兄弟姐妹相比，肝脏尺寸显著增加（0.0006厘米2），（0.0004厘米2，p<0.0001; 图 1.
图1：6 dpf（受精后天）斑马鱼的肝脏大小分析。（A-B）6dpf非转基因斑马鱼幼虫的代表性亮场图像，显示肝脏覆盖肠道的自然位置和形状。肝脏区域已在 （B） 中勾勒。刻度条 = 0.1 mm. （C-D） 代表 6 dpf 转基因斑马鱼幼虫的明亮场图像，表示肝细胞特异性活性 b-catenin （ABC），显示肝脏增大。肝脏区域已在 （D） 中勾勒。刻度条 = 0.1 mm. （E） 显示 6 dpf 非转基因斑马鱼幼虫 （非 Tg） 和表达肝细胞特异性活性 b-catenin （ABC） 的肝脏尺寸测量值 （均值 = 标准偏差） 的图形。使用未配对的 t 测试对样本进行比较。p < 0.0001.请点击此处查看此图的较大版本。
图 2：图像和千分尺不足的示例。（A-G）幼虫肝的代表性图像，应排除在分析之外。比例尺 = 0.1 毫米 （A） 拉瓦，皮肤覆盖肝脏.（B） 拉瓦与蛋黄遮蔽肝脏.（C） 拉瓦与部分肝脏被挤压掉.（D） 拉瓦与肝脏脱位和脱落。（E） 缺少肝脏的拉瓦.（F） 拉瓦与肝脏轮廓，是很难识别，因为图像是模糊的/失焦。（G） 拉瓦的定位不当.两只眼睛不直接对齐。（H） 千分尺的图像，用于生成比例条，并将图像处理软件测量值由像素转换至厘米2。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
肝脏大小的定量对于旨在了解肝脏发育、再生和肿瘤发生的研究至关重要。这里描述的方案是一种相对快速、简单和廉价的幼虫斑马鱼肝脏大小定量技术。在执行协议的某些方面时，适当谨慎行事有助于提高结果的准确性并减少挫折感。
正确固定幼虫对于获得保存完好的生物样本和防止其解体至关重要。在将 PFA 添加到冲洗的幼虫之前未完全去除 PBS 时，可能会出现 4% PFA 溶液的稀释。在添加 PFA 之前使用制作良好的 PFA 解决方案并移液全部或大部分 PBS 解决方案有助于解决此问题。
虽然经过大量练习后，快速且易于执行，但解剖技术需要大量的手动灵巧性。解剖时，将皮肤和蛋黄从肝脏上方完全去除，使整个肝脏暴露，这一点至关重要。如果不这样做，可能会导致图像中肝脏边界的视图被遮挡 （图 2A，B）。解剖时不熟练和有力的运动可能导致肝脏部分被挤压（图2C）或肝脏附件松动，导致肝脏置换（图2D）或完全缺失（图2E）。在进入实验样本之前，用户应投入足够的时间在练习样本上磨练他们的解剖技能。
在安装过程中，肝脏上方的皮肤已被移除，增加了肝脏在随后的步骤中脱落的可能性。为了避免这种可能性，在此过程中应采用温和的移液运动。
在使用明场显微镜进行图像采集时，拍摄高质量的图像至关重要。模糊、失焦的图像将使得难以评估肝脏的真实边界（图2F）。由于这种方法涉及测量肝脏左叶的表面面积，因此幼虫在侧侧方向良好且不倾斜（图2G）至关重要。确保幼虫的两只眼睛对齐（一只眼睛遮住另一只眼睛）。在使用图像处理软件测量表面积时，必须尽可能将边界拉近肝脏的真实轮廓，以避免测量差异。排除任何无法准确测量肝脏的图像 （图2A+G）。但是，请记住，排除肝脏可能会扭曲数据，因为较大的肝脏比较小的肝脏更容易扰。
该协议的一个限制是，它只适用于固定幼虫。荧光显微镜等替代方法可用于测量活幼虫的肝脏大小，表达肝细胞特异性荧光报告器5、7、10。这些替代方法使顺序测量可以在同一动物上进行，而且它们也更快，因为它们不需要固定或解剖覆盖肝脏的组织的组织。与活体动物的荧光显微镜相比，此方案的优点是：1） 在测量肝脏时具有更大的灵活性，因为斑马鱼在拍摄之前可以固定数周或数月;2） 无需加入荧光报告器，在处理同源突变体时可能很麻烦;3） 步骤 1 和步骤 2 适用于其他实验，包括免疫荧光染色或原位杂交研究。我们使用这两种方法，具体取决于特定的应用程序。例如，我们通常使用活成像和肝细胞专用检测器进行高通量筛查3，并使用此处描述的协议3跟踪潜在的命中化合物。
该协议只考虑肝大小的表面积，因此不检测细胞代谢或形态的变化，也不区分细胞数量增加和细胞大小增加。为了解决这一局限性，可以进行补充测定，评估脂肪组16、成体学6、细胞8、11、细胞大小3、17、增殖3、18和/或凋亡19。
该协议的另一个限制是，它假定左肝叶表面积的增加或减少反映了整个肝脏表面积和体积的变化。当肝脏生长不均匀时，这一假设可能不适用。为了检查肝脏形状并检查肝脏生长的非对称性增加，我们通常在我们的转基因模型上做光片荧光显微镜8或共聚焦显微镜3。光片荧光显微镜可用于直接量化幼虫肝体积8。在表达肝细胞特异性Yap1的转基因斑马鱼中，与非转基因对照兄弟姐妹8相比，肝脏面积和肝体积也明显增加。
这里描述的解剖技术可以结合免疫荧光染色，细胞特异性荧光报告线，和/或其他标记技术，研究肝脏发育的其他方面，除了肝脏大小3，19，20。由于这种解剖方案也暴露了肠道和胰腺，它可能有助于研究其他内脏器官。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们要感谢犹他大学的Maurine Hobbs和集中的斑马鱼动物资源（CZAR），他们提供了斑马鱼的饲养、实验室空间和设备，以开展部分研究。国家卫生研究院拨款 #1G20OD018369-01 部分支持 CZAR 的扩展。我们还要感谢罗德尼·斯图尔特、克洛伊·林、兰斯·格雷厄姆、科迪·詹姆斯、加勒特·尼克姆以及亨茨曼癌症研究所（HCI）斑马鱼护理设施。我们要感谢肯尼思·康帕斯在研发方面的帮助。这项工作的部分资金来自亨茨曼癌症基金会的赠款（连同授予亨茨曼癌症研究所P30 CA042014的赠款）和NIH/NCI R01CA222570（KJE）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Camera for dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Fine (Dumont #5) forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Glass pipets | VWR | 14672-608 | |
| Image analysis software | Image J/FIJI | ImageJ/FIJI can be dowloaded for free: https://imagej.net/Welcome | |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phosphate-buffered saline | Various suppliers | ||
| Pipette pump | VWR | 53502-233 | |
| Plastic Petri dishes | USA Scientific Inc | 2906 | |
| Pyrex 9-well round-bottom glass dish | VWR | 89090-482 | |
| Software for blinding files | R project | R can be downloaded for free: https://www.r-project.org/ | |
| Scientific graphing and statistics software | GraphPad Prism | ||
| Spreadsheet program | Microsoft Excel | ||
| Tricaine methanesulfonate (Tricaine-S) | Western Chemical | 200-226 | |
| Very fine (Dumont #55) forceps | Fine Science Tools | 11255-20 |
References
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