Summary
Her demonstrerer vi en metode til kvantificering af leverstørrelse i larvezebrafisk, hvilket giver mulighed for at vurdere virkningerne af genetiske og farmakologiske manipulationer på levervækst og udvikling.
Abstract
I flere transgene zebrafisk modeller af hepatocellulære karcinom (HCC), hepatomegaly kan observeres i de tidlige larve stadier. Kvantificering larve lever størrelse i zebrafisk HCC modeller giver et middel til hurtigt at vurdere virkningerne af narkotika og andre manipulationer på en oncogene-relaterede fænotype. Her viser vi, hvordan du løser zebrafisk larver, dissekere væv omkring leveren, fotografere lever ved hjælp af lyse-felt mikroskopi, måle leverområdet, og analysere resultater. Denne protokol muliggør hurtig, præcis kvantificering af leverstørrelse. Da denne metode indebærer måling af leverområdet, kan det undervurdere forskelle i levervolumen, og komplementære metoder er nødvendige for at skelne mellem ændringer i cellestørrelse og ændringer i celletal. Den dissektion teknik, der er beskrevet heri er et glimrende værktøj til at visualisere leveren, tarmen, og bugspytkirtlen i deres naturlige positioner for utallige downstream applikationer, herunder immunfluorescens farvning og in situ hybridisering. Den beskrevne strategi for kvantificering larve lever størrelse gælder for mange aspekter af leverudvikling og regenerering.
Introduction
Hepatocellulære karcinom (HCC) er den mest almindelige primære malignitet i leveren1 og den tredje hyppigste årsag til kræft-relaterede dødelighed2. For bedre at forstå mekanismer af hepatocarcinogenese og identificere potentielle HCC terapeutiske, vi og andre har udviklet transgene zebrafisk, hvor hepatocyt-specifikke udtryk for onkogener såsom β-catenin3,4, Kras (V12)5,6, Myc7, eller Yap18 fører til HCC hos voksne dyr. I disse zebrafisk, leverudvidelsen er noteret så tidligt som 6 dage efter befrugtning (dpf), hvilket giver en letkøbt platform til at teste virkningerne af narkotika og genetiske ændringer på oncogene-drevet leverovervækst. Nøjagtig og præcis måling af larvelever størrelse er afgørende for bestemmelse af virkningerne af disse manipulationer.
Leverstørrelse og form kan vurderes semi-kvantitativt i faste zebrafisk larver ved CY3-SA mærkning9 eller i levende zebrafisk larver ved hjælp af hepatocyt-specifikke fluorescerende reportere og fluorescens dissekere mikroskopi5,6. Sidstnævnte metode er relativt hurtig, og dens manglende præcision kan løses ved at fotografere og måle området for hver lever ved hjælp af billedbehandling software7,10. Men, Det kan være teknisk udfordrende at ensartet position alle levende larver i et eksperiment, således at to-dimensionelle leverområde er en nøjagtig repræsentation af leverens størrelse. En lignende teknik til kvantificering af leverstørrelse indebærer brug af lysplade fluorescens mikroskopi til at kvantificere larve levervolumen8,hvilket kan være mere præcis til påvisning af størrelsesforskelle, når leveren er udvidet ikke-ensartet i forskellige dimensioner. Fluorescens-aktiverede cellesortering (FACS) kan bruges til at tælle antallet af fluorescerende mærket hepatocytter og andre levercelletyper i larvelever8,11. I denne metode, larve lever er samlet og dissociated, så oplysninger om individuelle leverstørrelse og form er tabt. Kombineret med en anden leverstørrelsebestemmelsesmetode muliggør FACS differentiering mellem øget celletal (hyperplasi) og øget cellestørrelse (hypertrofi). Alle disse metoder anvender dyr fluorescensteknologi (mikroskop- eller cellesortering) og kræver, bortset fra CY3-SA-mærkning, mærkning af hepatocytter med en fluorescerende reporter.
Her beskriver vi i detaljer en metode til kvantificering zebrafisk larve lever område ved hjælp af lyse felt mikroskopi og billedbehandling software3,12,13,14. Denne protokol muliggør præcis kvantificering af området for de enkelte lever på stedet uden brug af fluorescensmikroskopi. Mens analysere leverstørrelse, vi blinde billedet identitet til at reducere investigator bias og forbedre videnskabelige stringens15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøg udføres efter procedurer, der er godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) fra University of Utah.
1. Fastsættelse Larver
- På 3-7 dage efter befrugtning (dpf), euthanize larver med tricaine metanulfonat (0,03%) og saml op til 15 larver i et 2 ml rør ved hjælp af en glaspipette og pipettepumpe.
- Vask larver to gange med 1 ml koldt (4 °C) 1x fosfatbuffered saltvand (PBS) på is. For hver vask skal du fjerne så meget væske som muligt fra røret med en glaspipette og pipettepumpe og derefter tilsættes 1 ml kold PBS til rør.
- Fjern så meget PBS som muligt ved hjælp af en glaspipette og pipettepumpe, og tilsæt 1 ml koldt (4 °C) 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS.
FORSIGTIG: PFA er et irriterende og formodet kræftfremkaldende stof. Handsker skal bæres ved håndtering af PFA, og koncentrerede opløsninger skal håndteres i en kemisk røghætte. - Inkuberved 4 °C mindst natten over (men op til flere måneder) med blid vuggening.
2. Dissekere væv omkring leveren
- Fjern larver fra PFA ved skylning 3x med 1 ml koldt (4 °C) PBS og rokkende i 5 min i mellem skylninger.
BEMÆRK: Det er i orden at opbevare de skyllede larver i PBS i en dag eller to ved 4 °C. - Pipette flere larver i PBS i en brønd af en 9-brønd runde-bund glas fad.
- Fjern huden omkringliggende lever.
- Brug fine pincet til at holde larver på ryggen (mave op), gribende på hver side af hovedet så forsigtigt som muligt. Brug derefter meget fine pincet i din anden hånd for at få fat i huden bare overliggende hjertet.
- Træk huden nedad diagonalt mod halen af fisken og bunden af skålen på venstre eller højre side af fisken. Gentag for anden side (højre eller venstre side).
- Fortsæt sensationsprægede flapper af huden og trække ned / tilbage, indtil alle af huden og melanophores overliggende eller i nærheden af leveren er blevet fjernet.
- Fjern æggeblomme, hvis den er til stede.
- For 5-6 dpf larver, løft æggeblomme ud i ét stykke ved at holde fisken med fine pincet på ryggen og ved hjælp af de meget fine pincet til prod æggeblomme forsigtigt.
- For 3-4 dpf larver, skrabe æggeblomme ud i stykker. Hold fisken med fine pincet på ryggen og bruge de meget fine pincet til at slagtilfælde æggeblomme, startende fra ventrale side.
- Placer dissekeret larver i frisk kold PBS ved hjælp af en glaspipette og pipettepumpe.
3. Billedbehandling
- For at montere larver, hæld et par ml af 3% methyl cellulose på låget af en ren plast Petri skål.
- Brug en glaspipette og pipettepumpe til at tilføje larver til methylcellulose, tilføjer så lidt PBS med larver som muligt.
- Under et dissekeret mikroskop ved lav forstørrelse, bruge fine pincet til at orientere fisken, så de ompåderes højre side, vender til venstre.
BEMÆRK: Sørg for, at fiskene er orienteret perfekt på deres side eller leveren målinger kan ikke være nøjagtige. - Tag et billede af hver fisk.
- Bekræft, at de fisk, der skal fotograferes, er justeret perfekt, med det ene øje direkte oven på det andet øje. Brug om nødvendigt fine pincet til at trykke let på hovedet eller halen af fisk til at justere orienteringen. Hvis fiskens hale er bøjet, skal du fjerne halen ved at klemme den kraftigt med pincet for at fjerne den, så fisken lægger sig fladt.
- Zoom ind på høj forstørrelse og fokusere på leveren, og sørg for, at leverens kontur er klart synlig.
- Fastgør et billede, og gem filen.
- Gentag for alle fisk, og sørg for forstørrelsen er den samme for hvert billede.
- Tag et billede af et mikrometer ved hjælp af samme forstørrelse (se figur 2H).
4. Billedanalyse
- Mål området for hver fisks lever ved hjælp af billedbehandling software.
- Blind alle lever billeder for at undgå potentielle investigator bias og fremme videnskabeligestringens 15. Dette trin kan gøres manuelt af et andet lab medlem eller ved hjælp af et edb-program (Supplerende materiale). Omdøb filer tilfældigt, og opret en "randomiseringsfil", der indeholder en liste over de oprindelige filnavne og tilsvarende blinde filnavne.
- Åbn randomiserede filer i rækkefølge, begyndende med fil 1.
- Vælg værktøjet til frihåndsmarkeringer, og omrids hver lever.
- Tryk på Ctrl-M for at måle arealet af hver lever.
- For lever, der ikke kan måles nøjagtigt, skal du indsætte en pladsholdermåling (meget lille eller meget stor, så den let kan udelukkes senere).
- Gem målingerne i en tekstfil ("målefil").
- Un-blind og analysere data
- Åbn "målfil" og "randomiseringsfil" i et regnearksprogram.
- Indsæt en ny kolonne i "målefilen", og tilføj de oprindelige filnavne til de blinde filer ved hjælp af "randomiseringsfilen". Gem denne fil som "ikke-blindet målefil".
- Sorter data efter oprindeligt filnavn.
- Sørg for at udelukke eventuelle levermålinger, for hvilke billederne var utilstrækkelige (se figur 2A-G).
- Om nødvendigt omregnes måleværdierne til den ønskede skala (f.eks. mm2).
- Åbn skaleringslinjen i billedbehandlingssoftwaren.
- Brug værktøjet lige streg til at måle 1 mm på skalabjælken. Billedbehandlingssoftwaren vil måle i de samme enheder som leveren (pixel), hvilket giver en konverteringsfaktor.
- Brug konverteringsfaktoren til at konvertere målinger i "ublindet målefil".
- Brug regnearksprogrammet eller indsættelse af data i en videnskabelig grafing- og statistiksoftware, bestemme middel- og standardafvigelse og beregne p-værdi(er).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Transgene zebrafisk, der udtrykker hepatocyt-specifikke aktiverede β-catenin(Tg(fabp10a:pt-β-cat) zebrafisk)3 og ikke-transgene kontrolsøskende blev aflivet ved 6 dpf- og leverområdet, blev kvantificeret ved hjælp af brightfield mikroskopi og billedbehandlingssoftware. Transgene zebrafisk har øget leverstørrelsen betydeligt (0,0006 cm2)sammenlignet med deres ikke-transgene søskende (0,0004 cm2, p < 0,0001; Figur 1).
Figur 1: Leverstørrelsesanalyse af 6 dpf (dage efter befrugtning) zebrafisk. (A-B) Repræsentativt brightfield billede af 6 dpf ikke-transgene zebrafisk larver, som viser naturlig position og form af leveren overliggende tarmen. Leverområdet er blevet skitseret i (B). Skalastænger = 0,1 mm. (C-D) Repræsentativt brightfield-billede af 6 dpf transgene zebrafisklarver, der udtrykker hepatocyt-specifik aktiveret b-catenin (ABC), og som viser forstørret lever. Leverområdet er blevet skitseret i (D). Skalastænger = 0,1 mm. (E) Graf, der viser målinger af leverstørrelse (gennemsnitlig ± standardafvigelse) på 6 dpf ikke-transgene zebrafisklarver (ikke-Tg) og transgene zebrafisklarver, der udtrykker leverstandardspecifik aktiveret b-catenin (ABC). Prøverne blev sammenlignet ved hjælp af uparret t-test. p < 0,0001. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Eksempler på utilstrækkelige billeder og mikrometer. (A-G) Repræsentative billeder af larvelever, der bør udelukkes fra analyse. Skalastænger = 0,1 mm. (A) Larver med hud, der dækker leveren. (B) Larver med æggeblomme tilsløre leveren. (C) Larver med dele af leveren klemt af. (D) Larver med lever forvredet og falder af. (E) Larver med manglende lever. (F) Larver med lever kontur, der er vanskeligt at identificere, fordi billedet er sløret / out-of-fokus. (G) Larver med forkert positionering. De to øjne er ikke justeret direkte oven på hinanden. (H) Billede af mikrometer, der anvendes til at generere skala barer og konvertere billedbehandling software målinger fra pixels til cm2. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kvantificering af leverstørrelse er afgørende i undersøgelser med henblik på at forstå leverudvikling, regenerering, og oncogenesis. Protokollen beskrevet her er en relativt hurtig, nem og billig teknik til leverstørrelse kvantificering i larve zebrafisk. At udvise passende forsigtighed, mens du udfører visse aspekter af protokollen kan støtte i øget nøjagtighed af resultater og nedsat frustration.
Korrekt fiksering af larver er afgørende for at få velbevarede biologiske prøver og forhindre deres opløsning. Fortynding af PFA-opløsningen på 4 % kan forekomme, når PBS ikke fjernes helt, før PFA tilsætning til de skyllede larver tilkommer. Brug af vellavede PFA-løsninger og pipettering af hele eller det meste af PBS-løsningen før PFA-tilføjelse er nyttigt at løse dette problem.
Selvom hurtig og nem at udføre efter megen praksis, dissektion teknik kræver betydelig manuel fingerfærdighed. Mens dissekere, Det er afgørende at fjerne hud og æggeblomme helt ud fra over leveren, således at hele leveren er udsat. Hvis dette ikke gøres, kan det resultere i billeder, hvor visningen af levergrænsen er skjult (figur 2A,B). Ufaglærte og kraftige bevægelser, mens dissekere kan føre til klemning af dele af leveren (figur 2C) eller løsne levertilbehør, hvilket resulterer i, at leveren forskydes (figur 2D) eller helt mangler (figur 2E). Brugerne bør lægge tilstrækkeligt mange timer i retning af honing deres dissekere færdigheder på praksis prøver, før du går videre til eksperimentelle prøver.
Under montering, huden over leveren er blevet fjernet, øge sandsynligheden for leveren falder ud under efterfølgende trin. For at undgå denne mulighed bør der anvendes blide pipetteringsbevægelser under denne proces.
Under billedindkøb ved hjælp af brightfield mikroskop, er det afgørende, at god kvalitet billeder er taget. Slørede billeder uden for fokus vil gøre det vanskeligt at vurdere den sande grænse for leveren (figur 2F). Da denne metode indebærer måling af overfladearealet af den venstre lap af leveren, er det afgørende, at larver er orienteret godt på sin side og ikke vippes (Figur 2G). Sørg for, at arvens øjne er justeret (det ene øje, der dækker synet af den anden). Mens måling overfladeareal ved hjælp af billedbehandling software, er det vigtigt at trække grænsen så tæt som muligt på den virkelige skitse af leveren for at undgå måling uoverensstemmelser. Undgå billeder, hvor leveren ikke kan måles nøjagtigt (Figur 2A-G). Men, Huske på, at udelukke lever kan skæve data, som større lever er mere tilbøjelige til at blive forstyrret end mindre lever.
En af begrænsningerne i denne protokol er, at den kun gælder for faste larver. Alternative metoder såsom fluorescensmikroskopi kan anvendes til at måle leverstørrelse i levende larver, der udtrykker hæmortocytspecifikke fluorescerende reportere5,7,10. Disse alternative metoder gør det muligt at foretage sekventielle målinger på det samme dyr, og de er også hurtigere, da de ikke kræver fiksering eller dissektion af vævet, der overgår leveren. Fordelene ved denne protokol i forhold til fluorescensmikroskopi hos levende dyr er: 1) større fleksibilitet med hensyn til, hvornår lever måles, da zebrafisk kan holdes på fiksativ i uger eller måneder, før de fotograferes; 2) ingen krav om at indarbejde en fluorescerende reporter, som kan være besværlig, når der beskæftiger sig med homozygotmutanter; og 3) anvendelse af trin 1 og 2 til andre forsøg, herunder immunfluorescensfarvning eller in situ-hybridiseringsundersøgelser. Vi bruger begge metoder, afhængigt af den særlige anvendelse. For eksempel bruger vi typisk levende billeddannelse og hepatocyt-specifikke journalister til high-throughput screening3,og følge op på potentielle hit forbindelser ved hjælp af protokollen beskrevet her3.
Denne protokol tager kun højde for overfladearealet ved kvantificering af leverstørrelse, så det registrerer ikke ændringer i cellemetabolisme eller morfologi, og den skelner heller ikke mellem stigninger i celletal og stigninger i cellestørrelse. For at løse denne begrænsning, supplerende analyser til at vurdere steatose16, histologi6, celle nummer8,11, celle størrelse3,17, spredning3,18, og / eller apoptose19 kan udføres.
En anden begrænsning af denne protokol er, at det forudsætter, at stigninger eller fald i overfladearealet af venstre leverlap afspejler ændringer i overfladeareal og volumen af leveren som helhed. Denne antagelse kan ikke gælde, når leveren vækst er ikke-ensartet. For at undersøge leverform og kontrollere for ikke-symmetriske stigninger i levervækst, vi rutinemæssigt gør lysplade fluorescens mikroskopi8 eller konfokale mikroskopi3 på vores transgene modeller. Lysplade fluorescens mikroskopi kan bruges til direkte at kvantificere larve levervolumen8. Ved transgene zebrafisk, der udtrykker hepatocyt-specifik Yap1, blev leverområdet og levervolumen ligeledes øget sammenlignet med ikke-transgene kontrolsøskende8.
Den dissektion teknik, der er beskrevet her kan kombineres med immunfluorescens farvning, celle-specifikke fluorescerende reporter linjer, og / eller andre mærkning teknikker til at studere andre aspekter af leveren udvikling foruden leverstørrelse3,19,20. Da denne dissektion protokol også udsætter tarmen og bugspytkirtlen, Det kan være nyttigt for undersøgelser af andre viscerale organer samt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne anerkende Maurine Hobbs og den centraliserede Zebrafish Animal Resource (CZAR) ved University of Utah for at levere zebrafiskopdræt, laboratorierum og udstyr til at udføre dele af denne forskning. Udvidelse af Zar-familien understøttes til dels af NIH-tilskuddet # 1G20OD018369-01. Vi vil også gerne takke Rodney Stewart, Chloe Lim, Lance Graham, Cody James, Garrett Nickum, og Huntsman Cancer Institute (HCI) Zebrafish Facility for zebrafisk pleje. Vi vil gerne takke Kenneth Kompass for hjælp med R programmering. Dette arbejde blev delvist finansieret af tilskud fra Huntsman Cancer Foundation (i samarbejde med tilskud P30 CA042014 tildelt Huntsman Cancer Institute) (KJE) og NIH/NCI R01CA22570 (KJE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Camera for dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Fine (Dumont #5) forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Glass pipets | VWR | 14672-608 | |
| Image analysis software | Image J/FIJI | ImageJ/FIJI can be dowloaded for free: https://imagej.net/Welcome | |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phosphate-buffered saline | Various suppliers | ||
| Pipette pump | VWR | 53502-233 | |
| Plastic Petri dishes | USA Scientific Inc | 2906 | |
| Pyrex 9-well round-bottom glass dish | VWR | 89090-482 | |
| Software for blinding files | R project | R can be downloaded for free: https://www.r-project.org/ | |
| Scientific graphing and statistics software | GraphPad Prism | ||
| Spreadsheet program | Microsoft Excel | ||
| Tricaine methanesulfonate (Tricaine-S) | Western Chemical | 200-226 | |
| Very fine (Dumont #55) forceps | Fine Science Tools | 11255-20 |
References
- Lin, D. -C., et al. Genomic and Epigenomic Heterogeneity of Hepatocellular Carcinoma. Cancer Research. 77 (9), 2255-2265 (2017).
- Ghouri, Y. A., Mian, I., Rowe, J. H. Review of hepatocellular carcinoma: Epidemiology, etiology, and carcinogenesis. Journal of Carcinogenesis. 16, 1 (2017).
- Evason, K. J., et al. Identification of Chemical Inhibitors of β-Catenin-Driven Liver Tumorigenesis in Zebrafish. PLoS Genetics. 11 (7), 1005305 (2015).
- Kalasekar, S. M., et al. Heterogeneous beta-catenin activation is sufficient to cause hepatocellular carcinoma in zebrafish. Biology Open. 8 (10), (2019).
- Nguyen, A. T., et al. A high level of liver-specific expression of oncogenic Kras(V12) drives robust liver tumorigenesis in transgenic zebrafish. Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 801-813 (2011).
- Nguyen, A. T., et al. An inducible kras(V12) transgenic zebrafish model for liver tumorigenesis and chemical drug screening. Disease Models & Mechanisms. 5 (1), 63-72 (2012).
- Li, Z., et al. A transgenic zebrafish liver tumor model with inducible Myc expression reveals conserved Myc signatures with mammalian liver tumors. Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 414-423 (2013).
- Cox, A. G., et al. Yap reprograms glutamine metabolism to increase nucleotide biosynthesis and enable liver growth. Nature Cell Biology. 18 (8), 886-896 (2016).
- Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease. Development. 132 (15), Cambridge, England. 3561-3572 (2005).
- Huang, X., Zhou, L., Gong, Z. Liver tumor models in transgenic zebrafish: an alternative in vivo approach to study hepatocarcinogenes. Future Oncology. 8 (1), London, England. 21-28 (2012).
- Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. Tumor-Associated Neutrophils and Macrophages Promote Gender Disparity in Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish. Cancer Research. 77 (6), 1395-1407 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2012).
- Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
- Dai, W., et al. High fat plus high cholesterol diet lead to hepatic steatosis in zebrafish larvae: a novel model for screening anti-hepatic steatosis drugs. Nutrition & Metabolism. 12, 42 (2015).
- Kim, S. -H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin. Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 255-267 (2011).
- Delous, M., et al. Sox9b is a key regulator of pancreaticobiliary ductal system development. PLoS Genetics. 8 (6), 1002754 (2012).
- Shin, D., Lee, Y., Poss, K. D., Stainier, D. Y. R. Restriction of hepatic competence by Fgf signaling. Development. 138 (7), Cambridge, England. 1339-1348 (2011).
- Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. R. The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. 56 (5), Baltimore, Md. 1958-1970 (2012).
