Summary
Hier demonstreren we een methode voor het kwantificeren van levergrootte bij larve zebravissen, die een manier bieden om de effecten van genetische en farmacologische manipulaties op levergroei en ontwikkeling te beoordelen.
Abstract
In verschillende transgene zebravismodellen van hepatocellulair carcinoma (HCC) kunnen hepatomegaly worden waargenomen tijdens vroege larvestadia. Het kwantificeren van de larve levergrootte bij zebravis HCC-modellen biedt een middel om snel de effecten van geneesmiddelen en andere manipulaties op een oncogene-gerelateerd fenotype te beoordelen. Hier laten we zien hoe ze zebravislarven kunnen fixeren, de weefsels rond de lever ontleden, levers fotograferen met behulp van heldere microscopie, levergebied meten en resultaten analyseren. Dit protocol maakt een snelle, nauwkeurige kwantificering van de levergrootte mogelijk. Aangezien deze methode het meten van levergebied omvat, kan het verschillen in levervolume onderschatten, en de aanvullende methodologieën zijn vereist om tussen veranderingen in celgrootte en veranderingen in celaantal te onderscheiden. De dissectie techniek hierbeschreven is een uitstekend hulpmiddel om de lever, darm en alvleesklier te visualiseren in hun natuurlijke posities voor talloze downstream toepassingen, waaronder immunofluorescentie kleuring en in situ hybridisatie. De beschreven strategie voor het kwantificeren van de grootte van de larvelever is van toepassing op vele aspecten van leverontwikkeling en regeneratie.
Introduction
Hepatocellulair carcinoma (HCC) is de meest voorkomende primaire maligniteit van de lever1 en de derde belangrijkste oorzaak van kankergerelateerde sterfte2. Om mechanismen van hepatocarcinogenese beter te begrijpen en potentiële HCC-therapieën te identificeren, hebben wij en anderen transgene zebravis ontwikkeld waarin hepatocyte-specifieke expressie van oncogenes zoals β-catenine3,4, Kras(V12)5,6, Myc7of Yap18 leidt tot HCC bij volwassen dieren. Bij deze zebravis wordt leververgroting al op 6 dagen na de bevruchting (dpf) opgemerkt, waardoor een facile-platform wordt geboden voor het testen van de effecten van geneesmiddelen en genetische veranderingen op oncogene aangedreven leverbegroeiing. Nauwkeurige en nauwkeurige meting van de grootte van de larvelever is essentieel voor het bepalen van de effecten van deze manipulaties.
Levergrootte en -vorm kunnen semi-kwantitatief worden beoordeeld in vaste zebravislarven door CY3-SAlabeling 9 of in levende zebravislarven met behulp van hepatocyte-specifieke fluorescerende verslaggevers en fluorescentie ontledenmicroscopie5,6. Deze laatste methode is relatief snel en het gebrek aan precisie kan worden aangepakt door het gebied van elke lever te fotograferen en te meten met behulp van beeldverwerkingssoftware7,10. Het kan echter technisch uitdagend zijn om alle levende larven uniform te positioneren in een experiment zodanig dat tweedimensionaal levergebied een nauwkeurige weergave is van levergrootte. Een soortgelijke techniek voor het kwantificeren van de levergrootte omvat het gebruik van lichtplaatfluorescentiemicroscopie om larve levervolume8te kwantificeren, die nauwkeuriger kan zijn voor het detecteren van grootteverschillen wanneer de lever niet-uniform in verschillende dimensies wordt uitgebreid. Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) kan worden gebruikt om het aantal fluorescerende gelabelde hepatocyten en andere leverceltypes in larvelevers8,11te tellen. Bij deze methode worden larvelevers samengevoegd en gescheiden, zodat informatie over individuele levergrootte en -vorm verloren gaat. In combinatie met een andere levergroottebepalingsmethode maakt FACS differentiatie mogelijk tussen verhoogd celgetal (hyperplasie) en verhoogde celgrootte (hypertrofie). Al deze methoden maken gebruik van dure fluorescentietechnologie (microscoop of celsorteerder) en, met uitzondering van CY3-SA-etikettering, vereisen etikettering van hepatocyten met een fluorescerende verslaggever.
Hier beschrijven we in detail een methode voor het kwantificeren van zebravissen larve lever gebied met behulp van bright-field microscopie en beeldverwerking software3,12,13,14. Dit protocol maakt nauwkeurige kwantificering van het gebied van individuele levers ter plaatse mogelijk zonder het gebruik van fluorescentiemicroscopie. Tijdens het analyseren van levergrootte, verblinden we de beeldidentiteit om de vooringenomenheid van onderzoekers te verminderen en wetenschappelijke strengheid te verbeteren15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dierstudies worden uitgevoerd volgens procedures die zijn goedgekeurd door het Institutioneel Comité voor dierenverzorging en -gebruik (IACUC) van de Universiteit van Utah.
1. Vaststelling van larven
- Op 3-7 dagen na de bevruchting (dpf), euthanaseren larven met tricaine methaansulfonaat (0,03%) en verzamel tot 15 larven in een buis van 2 mL met behulp van een glazen pipet- en pipetpomp.
- Was larven twee maal met 1 mL koude (4 °C) 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) op ijs. Verwijder voor elke wasbeurt zoveel mogelijk vloeistof uit de buis met een glazen pipet- en pipetpomp en voeg vervolgens 1 mL koude PBS toe aan de buis.
- Verwijder zoveel PBS mogelijk met behulp van een glazen pipet en pipet pomp, en voeg 1 mL koud (4 °C) 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS.
LET OP: PFA is een irriterende en vermoedelijke kankerverwekkende stof. Handschoenen moeten worden gedragen bij het hanteren van PFA, en geconcentreerde oplossingen moeten worden behandeld in een chemische rookkap. - Incubeer op 4 °C ten minste 's nachts (maar tot enkele maanden) met zacht schommelen.
2. Ontleden weefsels rond lever
- Verwijder larven uit PFA door 3x te spoelen met 1 mL koude (4 °C) PBS en schommel gedurende 5 min tussen spoelingen door.
LET OP: Het is goed om de gespoelde larven in PBS een dag of twee bij 4 °C te houden. - Pipeter verschillende larven in PBS in een put van een 9-goed ronde-bodem glazen schotel.
- Verwijder de huid omringende lever.
- Gebruik fijne tangen om larve op zijn rug te houden (buik omhoog), grijpen aan weerszijden van het hoofd zo voorzichtig mogelijk. Gebruik dan zeer fijne tangen in je andere hand om de huid te grijpen net boven het hart.
- Trek de huid diagonaal naar beneden naar de staart van de vis en de onderkant van de schotel aan de linker- of rechterkant van de vis. Herhaal dit voor de andere kant (rechts of linkerkant).
- Doorgaan grijpen flappen van de huid en trekken naar beneden / terug totdat alle van de huid en melanophores bovenliggendof in de buurt van de lever zijn verwijderd.
- Verwijder dooier, indien aanwezig.
- Voor 5-6 dpf larven, til dooier af in een stuk door het houden van de vis met fijne tangen op zijn rug en met behulp van de zeer fijne tangen om de dooier zachtjes prik.
- Voor 3-4 dpf larven, schraap de dooier af in stukken. Houd de vis met fijne tangen op zijn rug en gebruik de zeer fijne tangen om de dooier aaien, vanaf de ventrale kant.
- Plaats ontleedlarven in verse koude PBS met behulp van een glazen pipet en pipet pomp.
3. Beeldvorming
- Om larven te monteren, giet een paar mL van 3% methylcellulose op het deksel van een schone plastic petrischaal.
- Gebruik een glazen pipet en pipetpomp om larven toe te voegen aan de methylcellulose, en voeg zo weinig MOGELIJK PBS toe met de larven.
- Onder een ontledende microscoop bij lage vergroting, gebruik fijne tangen om de vissen te oriënteren, zodat ze tot aan hun rechterkant, naar links.
LET OP: Zorg ervoor dat de vissen perfect zijn gericht op hun kant of de lever metingen kunnen niet nauwkeurig zijn. - Maak een foto van elke vis.
- Bevestig dat de te fotograferen vis perfect is uitgelijnd, met het ene oog direct op het andere oog. Gebruik indien nodig fijne tangen om licht op kop of staart van vissen te tikken om de oriëntatie aan te passen. Als de staart van vissen is gebogen, verwijder de staart door het krachtig met kracht te knijpen om het te verwijderen zodat de vissen plat legt.
- Zoom in op hoge vergroting en focus op de lever, ervoor te zorgen dat de lever omtrek is duidelijk zichtbaar.
- Maak een afbeelding vast en sla het bestand op.
- Herhaal voor alle vissen, ervoor te zorgen dat de vergroting is hetzelfde voor elke foto.
- Maak een foto van een micrometer met dezelfde vergroting (zie figuur 2H).
4. Beeldanalyse
- Meet het gebied van de lever van elke vis met behulp van beeldverwerkingssoftware.
- Blind alle lever foto's om potentiële onderzoeker bias te voorkomen en wetenschappelijke strengheid te bevorderen15. Deze stap kan handmatig worden gedaan door een ander lablid of met behulp van een computerprogramma(Aanvullend Materiaal). Wijzig de naam van bestanden willekeurig en maak een "randomisatiebestand" met een lijst met de oorspronkelijke bestandsnamen en bijbehorende geblindeerde bestandsnamen.
- Open gerandomiseerde bestanden in volgorde, te beginnen met bestand 1.
- Kies de vrije hand selecties tool en schets elke lever.
- Druk op Ctrl-M om het gebied van elke lever te meten.
- Voor levers die niet nauwkeurig kunnen worden gemeten, voegt u een tijdelijke aanduidingmeting in (zeer klein of zeer groot, zodat deze later gemakkelijk kan worden uitgesloten).
- Sla de metingen op in een tekstbestand ('meetbestand').
- Blind en analyseren van gegevens
- Open "meetbestand" en "randomisatiebestand" in een spreadsheetprogramma.
- Voeg een nieuwe kolom in het "meetbestand" in en voeg de oorspronkelijke bestandsnamen voor de geblindeerde bestanden toe met behulp van het "randomisatiebestand". Sla dit bestand op als 'ongeblindeerd meetbestand'.
- Sorteer gegevens op oorspronkelijke bestandsnaam.
- Zorg ervoor dat u levermetingen uitsluit waarvoor foto's ontoereikend waren (zie figuur 2A–G).
- Zet indien nodig meetwaarden om in gewenste schaal (mm2, bijvoorbeeld).
- Open de schaalbalk in de beeldverwerkingssoftware.
- Gebruik het rechte lijngereedschap om 1 mm te meten op de schaalbalk. De beeldverwerkingssoftware meet in dezelfde eenheden als de levers (pixels), waardoor een conversiefactor wordt gegeven.
- Gebruik de conversiefactor om metingen om te zetten in het "ongeblindeerde meetbestand".
- Met behulp van het spreadsheetprogramma of het plakken van gegevens in een wetenschappelijke grafiek- en statistieksoftware, bepaal je gemiddelde en standaarddeviatie en bereken je p-waarde(s).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Transgene zebravissen die hepatocyte-specifieke geactiveerde β-catenine uitdrukken (Tg (fabp10a:pt-β-cat) zebravis)3 en niet-transgene controle broers en zussen werden geëuthanaseerd op 6 dpf en lever gebied werd gekwantificeerd met behulp van brightfield microscopie en beeldverwerking software. Transgene zebravissen hebben de levergrootte aanzienlijk vergroot (0,0006 cm2)in vergelijking met hun niet-transgene broers en zussen (0,0004 cm2, p < 0,0001; Figuur 1).
Figuur 1: Levergrootteanalyse van 6 dpf (dagen na bevruchting) zebravissen. (A-B) Representatief helderveldbeeld van 6 dpf niet-transgene zebravissenlarve, die natuurlijke positie en vorm van lever toont die de darm overgaan. Levergebied is beschreven in (B). Schaalstaven = 0,1 mm. (C-D) Representatief helderveldbeeld van 6 dpf transgene zebravissenlarve die hepatocyte-specifieke geactiveerde b-catenine (ABC) uitdrukken, met vergrote lever. Levergebied is beschreven in (D). Schaalstaven = 0,1 mm.( E) Grafiek met levergroottemetingen (gemiddelde ± standaarddeviatie) van 6 dpf niet-transgene zebravislarven (Non-Tg) en transgene zebravislarven die hepatocyte-specifieke geactiveerde b-catenine (ABC) uitdrukken. Monsters werden vergeleken met behulp van ongepaarde t-test. p < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Voorbeelden van onvoldoende beelden en micrometer. (A-G) Representatieve beelden van larve levers die moeten worden uitgesloten van analyse. Schaalstaven = 0,1 mm. (A) Larve met huid die de lever bedekt. (B) Larve met dooier verduisteren de lever. (C) Larve met delen van de lever eraf geknepen. (D) Larve met lever ontwricht en vallen. (E) Larve met ontbrekende lever. (F) Larve met lever overzicht dat is moeilijk te identificeren, omdat het beeld is wazig / out-of-focus. (G) Larve met onjuiste positionering. De twee ogen zijn niet direct op elkaar gericht. (H) Afbeelding van de micrometer, gebruikt om schaalbalken te genereren en beeldverwerkingssoftwaremetingen van pixels om te zetten naar cm2. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kwantificering van levergrootte is cruciaal in studies gericht op het begrijpen van leverontwikkeling, regeneratie en oncogenese. Het hier beschreven protocol is een relatief snelle, gemakkelijke en goedkope techniek voor levergroottekwantificering bij larve zebravissen. Het uitoefenen van de nodige voorzichtigheid tijdens het uitvoeren van bepaalde aspecten van het protocol kan helpen bij een grotere nauwkeurigheid van de resultaten en verminderde frustratie.
Een goede fixatie van de larven is cruciaal om goed bewaarde biologische monsters te krijgen en hun desintegratie te voorkomen. Verdunning van de 4% PFA-oplossing kan optreden wanneer PBS niet volledig wordt verwijderd vóór de toevoeging van PFA aan de gespoelde larven. Het gebruik van goed gemaakte PFA-oplossingen en het opaien van alle of de meeste PBS-oplossing voorafgaand aan PFA-toevoeging is handig om dit probleem aan te pakken.
Hoewel snel en gemakkelijk uit te voeren na veel oefening, de dissectie techniek vereist aanzienlijke handmatige behendigheid. Tijdens het ontleden, is het cruciaal om de huid en dooier volledig af van boven de lever te verwijderen, zodat de hele lever wordt blootgesteld. Als u dit niet doet, kunnen beelden worden gemaakt waarbij het zicht op de levergrens wordt verduisterd(figuur 2A,B). Ongeschoolde en krachtige bewegingen tijdens het ontleden kunnen leiden tot knijpen af van delen van de lever(figuur 2C) of het losmaken van leverbevestigingen, waardoor de lever wordt verplaatst (figuur 2D) of volledig ontbreekt(figuur 2E). Gebruikers moeten in voldoende aantallen uren in de richting van honen hun ontleden vaardigheden op de praktijk monsters alvorens over te gaan tot experimentele monsters.
Tijdens de montage is de huid boven de lever verwijderd, waardoor de kans op een val van de lever tijdens de volgende stappen toeneemt. Om die mogelijkheid te vermijden, moeten tijdens dit proces zachte pipetterbewegingen worden gebruikt.
Tijdens het inkopen van afbeeldingen met behulp van de brightfield microscoop, is het van cruciaal belang dat goede kwaliteit beelden worden genomen. Wazige, onscherpe beelden zullen het moeilijk maken om de ware grens van de lever te beoordelen (figuur 2F). Aangezien deze methode het meten van het oppervlak van de linkerkwab van de lever omvat, is het van cruciaal belang dat de larve goed op zijn kant is gericht en niet gekanteld(figuur 2G). Zorg ervoor dat beide ogen van de larve zijn uitgelijnd (een oog dat het uitzicht op de andere). Tijdens het meten van oppervlakte met behulp van beeldverwerkingssoftware, is het belangrijk om de grens zo dicht mogelijk bij de echte omtrek van de lever te trekken om meetverschillen te voorkomen. Sluit beelden uit waarbij de lever niet nauwkeurig kan worden gemeten(figuur 2A–G). Houd er echter rekening mee dat het uitsluiten van levers de gegevens kan scheeftrekken, omdat grotere levers eerder worden verstoord dan kleinere levers.
Een van de beperkingen van dit protocol is dat het alleen van toepassing is op vaste larven. Alternatieve methoden zoals fluorescentiemicroscopie kunnen worden gebruikt om levergrootte te meten bij levende larven die hepatocyte-specifieke fluorescerende verslaggevers uitdrukken5,7,10. Deze alternatieve methoden maken het mogelijk om sequentiële metingen te verrichten op hetzelfde dier, en ze zijn ook sneller, omdat ze geen fixatie of dissectie van de weefsels boven de lever vereisen. De voordelen van dit protocol ten opzichte van fluorescentiemicroscopie bij levende dieren zijn: 1) meer flexibiliteit met betrekking tot wanneer levers worden gemeten, aangezien zebravis weken of maanden in fixatief kunnen worden gehouden voordat ze worden gefotografeerd; 2) geen vereiste voor de integratie van een fluorescerende verslaggever, die omslachtig kan zijn bij het omgaan met homozygous mutanten; en 3) toepasbaarheid van de stappen 1 en 2 voor andere experimenten, met inbegrip van immunofluorescentiekleuring of in situ hybridisatiestudies. We gebruiken beide methoden, afhankelijk van de specifieke toepassing. We gebruiken bijvoorbeeld meestal live imaging en hepatocyte-specifieke verslaggevers voor high-throughput screening3, en follow-up op potentiële hit verbindingen met behulp van het protocol hier beschreven3.
Dit protocol houdt alleen rekening met het oppervlak voor kwantificering van de levergrootte, zodat het geen veranderingen in het celmetabolisme of morfologie detecteert, noch maakt het onderscheid tussen toename van het celaantal en de toename van de celgrootte. Om deze beperking aan te pakken, kunnen aanvullende tests voor de beoordeling van steatose16, histologie6, celnummer8,11, celgrootte3,17, proliferatie3,18, en/of apoptose19 worden uitgevoerd.
Een andere beperking van dit protocol is dat het ervan uitgaat dat verhogingen of dalingen in het oppervlak van de linker leverkwab reflecterend zijn op de veranderingen in het oppervlak en het volume van de lever als geheel. Deze veronderstelling kan niet van toepassing zijn wanneer de levergroei niet-uniform is. Om de levervorm te onderzoeken en te controleren op niet-symmetrische toename van levergroei, doen we routinematig lichtplaatfluorescentiemicroscopie8 of confocale microscopie3 op onze transgene modellen. Lichtplaatfluorescentiemicroscopie kan worden gebruikt om het larvelevervolume direct te kwantificeren8. Bij transgene zebravis die hepatocyte-specifieke Yap1 uitdrukt, werden het levergebied en het levervolume eveneens verhoogd in vergelijking met niet-transgene controlebroers en -zussen8.
De hier beschreven dissectietechniek kan worden gecombineerd met immunofluorescentiekleuring, celspecifieke fluorescerende reporterlijnen en/of andere etiketteringstechnieken om andere aspecten van leverontwikkeling te bestuderen naast levergrootte3,19,20. Aangezien dit dissectieprotocol ook de darm en alvleesklier blootstelt, kan het nuttig zijn voor studies van andere viscerale organen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We willen maurine Hobbs en de Gecentraliseerde Zebrafish Animal Resource (CZAR) aan de Universiteit van Utah erkennen voor het verstrekken van zebravishouderij, laboratoriumruimte en apparatuur om delen van dit onderzoek uit te voeren. Uitbreiding van de CZAR wordt gedeeltelijk ondersteund door NIH grant # 1G20OD018369-01. We willen ook Rodney Stewart, Chloe Lim, Lance Graham, Cody James, Garrett Nickum en het Huntsman Cancer Institute (HCI) Zebrafish Facility bedanken voor de opvang van zebravissen. We willen Kenneth Kompass bedanken voor hulp bij r-programmering. Dit werk werd mede gefinancierd door subsidies van de Huntsman Cancer Foundation (in combinatie met subsidie P30 CA042014 toegekend aan Huntsman Cancer Institute) (KJE) en NIH/NCI R01CA22570 (KJE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Camera for dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Fine (Dumont #5) forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Glass pipets | VWR | 14672-608 | |
| Image analysis software | Image J/FIJI | ImageJ/FIJI can be dowloaded for free: https://imagej.net/Welcome | |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phosphate-buffered saline | Various suppliers | ||
| Pipette pump | VWR | 53502-233 | |
| Plastic Petri dishes | USA Scientific Inc | 2906 | |
| Pyrex 9-well round-bottom glass dish | VWR | 89090-482 | |
| Software for blinding files | R project | R can be downloaded for free: https://www.r-project.org/ | |
| Scientific graphing and statistics software | GraphPad Prism | ||
| Spreadsheet program | Microsoft Excel | ||
| Tricaine methanesulfonate (Tricaine-S) | Western Chemical | 200-226 | |
| Very fine (Dumont #55) forceps | Fine Science Tools | 11255-20 |
References
- Lin, D. -C., et al. Genomic and Epigenomic Heterogeneity of Hepatocellular Carcinoma. Cancer Research. 77 (9), 2255-2265 (2017).
- Ghouri, Y. A., Mian, I., Rowe, J. H. Review of hepatocellular carcinoma: Epidemiology, etiology, and carcinogenesis. Journal of Carcinogenesis. 16, 1 (2017).
- Evason, K. J., et al. Identification of Chemical Inhibitors of β-Catenin-Driven Liver Tumorigenesis in Zebrafish. PLoS Genetics. 11 (7), 1005305 (2015).
- Kalasekar, S. M., et al. Heterogeneous beta-catenin activation is sufficient to cause hepatocellular carcinoma in zebrafish. Biology Open. 8 (10), (2019).
- Nguyen, A. T., et al. A high level of liver-specific expression of oncogenic Kras(V12) drives robust liver tumorigenesis in transgenic zebrafish. Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 801-813 (2011).
- Nguyen, A. T., et al. An inducible kras(V12) transgenic zebrafish model for liver tumorigenesis and chemical drug screening. Disease Models & Mechanisms. 5 (1), 63-72 (2012).
- Li, Z., et al. A transgenic zebrafish liver tumor model with inducible Myc expression reveals conserved Myc signatures with mammalian liver tumors. Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 414-423 (2013).
- Cox, A. G., et al. Yap reprograms glutamine metabolism to increase nucleotide biosynthesis and enable liver growth. Nature Cell Biology. 18 (8), 886-896 (2016).
- Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease. Development. 132 (15), Cambridge, England. 3561-3572 (2005).
- Huang, X., Zhou, L., Gong, Z. Liver tumor models in transgenic zebrafish: an alternative in vivo approach to study hepatocarcinogenes. Future Oncology. 8 (1), London, England. 21-28 (2012).
- Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. Tumor-Associated Neutrophils and Macrophages Promote Gender Disparity in Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish. Cancer Research. 77 (6), 1395-1407 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2012).
- Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
- Dai, W., et al. High fat plus high cholesterol diet lead to hepatic steatosis in zebrafish larvae: a novel model for screening anti-hepatic steatosis drugs. Nutrition & Metabolism. 12, 42 (2015).
- Kim, S. -H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin. Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 255-267 (2011).
- Delous, M., et al. Sox9b is a key regulator of pancreaticobiliary ductal system development. PLoS Genetics. 8 (6), 1002754 (2012).
- Shin, D., Lee, Y., Poss, K. D., Stainier, D. Y. R. Restriction of hepatic competence by Fgf signaling. Development. 138 (7), Cambridge, England. 1339-1348 (2011).
- Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. R. The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. 56 (5), Baltimore, Md. 1958-1970 (2012).
