Summary
Ici nous démontrons une méthode pour quantifier la taille du foie dans le poisson zèbre larvaire, fournissant un moyen d'évaluer les effets des manipulations génétiques et pharmacologiques sur la croissance et le développement de foie.
Abstract
Dans plusieurs modèles transgéniques de poisson zèbre du carcinome hépatocellulaire (HCC), l'hépatomegaly peut être observé pendant les étapes larvaires tôt. La quantification de la taille du foie larvaire dans les modèles HCC du poisson zèbre fournit un moyen d'évaluer rapidement les effets des médicaments et d'autres manipulations sur un phénotype lié à l'oncogène. Ici, nous montrons comment fixer les larves de poissons zèbres, disséquer les tissus entourant le foie, photographier les foies à l'aide de microscopie de champ lumineux, mesurer la région du foie, et analyser les résultats. Ce protocole permet une quantification rapide et précise de la taille du foie. Comme cette méthode consiste à mesurer la région du foie, elle peut sous-estimer les différences dans le volume du foie, et des méthodologies complémentaires sont nécessaires pour différencier entre les changements dans la taille des cellules et les changements dans le nombre de cellules. La technique de dissection décrite ci-dessus est un excellent outil pour visualiser le foie, l'intestin, et le pancréas dans leurs positions naturelles pour une myriade d'applications en aval, y compris la coloration d'immunofluorescence et l'hybridation in situ. La stratégie décrite pour quantifier la taille du foie larvaire s'applique à de nombreux aspects du développement et de la régénération du foie.
Introduction
Le carcinome hépatocellulaire (HCC) est la malignité primaire la plus commune du foie1 et la troisième cause principale de mortalité cancer-connexe2. Pour mieux comprendre les mécanismes de l'hépatocarcinogenèse et identifier les thérapeutiques HCC potentielles, nous et d'autres avons développé le poisson zèbre transgénique dans lequel l'expression hépatocyte-spécifique des oncogènes tels que la caténine3,4, Kras(V12)5,6, Myc7, ou Yap18 conduit à HCC chez les animaux adultes. Chez ces poissons zèbres, l'élargissement du foie est noté dès 6 jours après la fécondation (dpf), fournissant une plate-forme facile pour tester les effets des médicaments et des altérations génétiques sur la surcroissance du foie induite par les oncogènes. La mesure précise et précise de la taille du foie larvaire est essentielle pour déterminer les effets de ces manipulations.
La taille et la forme du foie peuvent être évaluées de façon semi-quantitative chez les larves fixes de poissons zèbres par CY3-SA étiquetant9 ou chez les larves vivantes de poissons zèbres à l'aide de reporters fluorescents spécifiques à l'hépatocyte et de la microscopie disséquer la fluorescence5,6. Cette dernière méthode est relativement rapide, et son manque de précision peut être abordé en photographiant et en mesurant la zone de chaque foie à l'aide d'un logiciel de traitement d'image7,10. Cependant, il peut être techniquement difficile de positionner uniformément toutes les larves vivantes dans une expérience telle que la région bidimensionnelle du foie est une représentation précise de la taille du foie. Une technique similaire pour quantifier la taille du foie consiste à utiliser la microscopie de fluorescence des feuilles légères pour quantifier le volume du foie larvaire8, qui peut être plus précis pour détecter les différences de taille lorsque le foie est élargi de façon non uniforme dans différentes dimensions. Le tri cellulaire activé par la fluorescence (FACS) peut être utilisé pour compter le nombre d'hépatocytes étiquetés fluorescents et d'autres types de cellules hépatiques dans les foies larvaires8,11. Dans cette méthode, les foies larvaires sont mis en commun et dissociés, de sorte que l'information sur la taille et la forme du foie individuel est perdue. En combinaison avec une autre méthode de détermination de la taille du foie, FACS permet la différenciation entre l'augmentation du nombre de cellules (hyperplasie) et l'augmentation de la taille des cellules (hypertrophie). Toutes ces méthodes utilisent une technologie de fluorescence coûteuse (microscope ou trieur de cellules) et, à l'exception de l'étiquetage CY3-SA, nécessitent l'étiquetage des hépatocytes avec un journaliste fluorescent.
Ici, nous décrivons en détail une méthode pour quantifier la zone du foie larvaire de poisson zèbre à l'aide de microscopie de champ lumineux et de logiciel de traitement d'image3,12,13,14. Ce protocole permet une quantification précise de la zone des foies individuels in situ sans l'utilisation de la microscopie de fluorescence. Tout en analysant la taille du foie, nous aveuglons l'identité de l'image pour réduire les biais des chercheurs et améliorer la rigueur scientifique15.
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Protocol
Les études sur les animaux sont menées selon des procédures approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'Université de l'Utah.
1. Fixation des larves
- À 3 à 7 jours après la fécondation (dpf), euthanasiez les larves avec du méthane sulfonate de tricaine (0,03 %) et recueillir jusqu'à 15 larves dans un tube de 2 ml à l'aide d'une pipette en verre et d'une pompe à pipette.
- Laver les larves deux fois avec 1 ml de saline à phosphate (PBS) froide (4 oC) à l'alin tamponné par le phosphate (PBS). Pour chaque lavage, retirer autant de liquide que possible du tube avec une pipette en verre et une pompe à pipette, puis ajouter 1 ml de PBS froid au tube.
- Retirer autant de PBS que possible à l'aide d'une pipette en verre et d'une pompe à pipettes, et ajouter 1 ml de paraformaldéhyde froid (4 oC) à 4 % dans le PBS.
CAUTION: PFA est un irritant et suspecté de cancérogène. Les gants doivent être portés lors de la manipulation de PFA, et les solutions concentrées doivent être manipulées dans une hotte chimique de fumée. - Incuber à 4 oC au moins toute la nuit (mais jusqu'à plusieurs mois) avec un léger basculement.
2. Disséquer les tissus entourant le foie
- Retirer les larves de PFA en rinçant 3x avec 1 ml de PBS froid (4 oC) et en se balançant pendant 5 min entre les rinçants.
REMARQUE : Il est acceptable de conserver les larves rincées dans le SCP pendant un jour ou deux à 4 oC. - Pipette plusieurs larves dans PBS dans un puits d'un plat en verre à fond rond de 9 puits.
- Enlever la peau entourant le foie.
- Utilisez des forceps fins pour tenir la larve sur son dos (ventre vers le haut), saisissant de chaque côté de la tête aussi doucement que possible. Ensuite, utilisez des forceps très fins dans votre autre main pour saisir la peau juste au-dessus du cœur.
- Retirez la peau en diagonale vers la queue du poisson et le fond du plat sur le côté gauche ou droit du poisson. Répéter l'opération pour l'autre côté (droite ou gauche).
- Continuer à saisir les lambeaux de peau et en tirant vers le bas / dos jusqu'à ce que toute la peau et les mélanophores s'enlisant ou près du foie ont été enlevés.
- Retirer le jaune, s'il y a de la présence.
- Pour les larves de 5 à 6 dpf, soulever le jaune en un seul morceau en tenant le poisson avec de fines forceps sur le dos et en utilisant les forceps très fins pour pousser le jaune doucement.
- Pour les larves de 3 à 4 dpf, gratter le jaune en morceaux. Tenez le poisson avec de fines forceps sur le dos et utilisez les forceps très fins pour caresser le jaune, à partir du côté ventral.
- Placer les larves disséquées dans un PBS frais et froid à l'aide d'une pipette en verre et d'une pompe à pipette.
3. Imagerie
- Pour monter les larves, versez quelques ml de cellulose méthyle de 3 % sur le couvercle d'un plat Petri en plastique propre.
- Utilisez une pipette en verre et une pompe à pipettes pour ajouter des larves à la cellulose méthyle, en ajoutant le moins de PBS possible avec les larves.
- Sous un microscope disséquant à faible grossissement, utilisez des forceps fins pour orienter les poissons afin qu'ils soient couchés sur le côté droit, face à gauche.
REMARQUE : Assurez-vous que les poissons sont parfaitement orientés sur le côté ou que les mesures du foie peuvent ne pas être exactes. - Prenez une photo de chaque poisson.
- Confirmez que le poisson à photographier est parfaitement aligné, avec un œil directement sur le dessus de l'autre œil. Si nécessaire, utilisez des forceps fins pour taper légèrement sur la tête ou la queue des poissons pour ajuster l'orientation. Si la queue du poisson est pliée, retirez la queue en la pinçant avec force avec des forceps pour l'enlever afin que le poisson soit à plat.
- Zoom sur le grossissement élevé et se concentrer sur le foie, en s'assurant que le contour du foie est clairement visible.
- Prenez une photo et enregistrez le fichier.
- Répétez l'opération pour tous les poissons, en vous assurant que le grossissement est le même pour chaque image.
- Prenez une photo d'un micromètre en utilisant le même grossissement (voir Figure 2H).
4. Analyse d'image
- Mesurez la superficie du foie de chaque poisson à l'aide d'un logiciel de traitement d'image.
- Aveugle toutes les photos du foie pour éviter les biais potentiels des chercheurs et de promouvoir la rigueur scientifique15. Cette étape peut être effectuée manuellement par un autre membre du laboratoire ou à l'aide d'un programme informatique (Matériel supplémentaire). Renommer les fichiers au hasard et créer un « fichier de randomisation » contenant une liste des noms de fichiers originaux et des noms de fichiers aveugles correspondants.
- Ouvrez les fichiers randomisés dans l'ordre, en commençant par le fichier 1.
- Choisissez l'outil de sélections à main levée et définit chaque foie.
- Appuyez sur Ctrl-M pour mesurer la surface de chaque foie.
- Pour tous les foies qui ne peuvent pas être mesurés avec précision, insérez une mesure de placeholder (très petit ou très grand, ainsi il peut être facilement exclu plus tard).
- Enregistrer les mesures dans un fichier texte (« fichier de mesures »).
- Données non aveugles et d'analyse
- Ouvrez le « fichier de mesures » et le « fichier de randomisation » dans un programme de feuilles de calcul.
- Insérez une nouvelle colonne dans le « fichier de mesures » et ajoutez les noms de fichiers originaux pour les fichiers aveuglés, à l'aide du « fichier de randomisation ». Enregistrez ce fichier en tant que « fichier de mesures non aveuglés ».
- Trier les données par nom de fichier d'origine.
- Assurez-vous d'exclure toute mesure du foie pour laquelle les images étaient inadéquates (voir la figure 2A-G).
- Si nécessaire, convertir les valeurs de mesure en échelle désirée (mm2,par exemple).
- Ouvrez la barre d'échelle dans le logiciel de traitement d'image.
- Utilisez l'outil en ligne droite pour mesurer 1 mm sur la barre d'échelle. Le logiciel de traitement d'image mesurera dans les mêmes unités que les foies (pixels), donnant un facteur de conversion.
- Utilisez le facteur de conversion pour convertir les mesures dans le « fichier de mesures non aveuglés ».
- À l'aide du programme de feuilles de calcul ou de la saisie de données dans un logiciel de graphique et de statistiques scientifiques, déterminez l'écart entre la moyenne et la norme et calculez la valeur p.
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Representative Results
Le poisson zèbre transgénique exprimant l'hépatocyte-spécifique activé - caténine (Tg(fabp10a:pt---cat) zebrafish)3 et les frères et sœurs témoins non transgéniques ont été euthanasiés à 6 dpf et la zone hépatique a été quantifiée à l'aide d'un logiciel de microscopie et de traitement d'image brightfield. Les poissons zèbres transgéniques ont considérablement augmenté la taille du foie (0,0006 cm2) par rapport à leurs frères et sœurs non transgéniques (0,0004 cm2, p 'lt; 0,0001; Figure 1).
Figure 1 : Analyse de la taille du foie de 6 dpf (jours après la fécondation) poisson zèbre. (A-B) Image lumineuse représentative de 6 dpf larve non-transgénique de poisson zèbre, qui montre la position et la forme naturelles du foie au-dessus de l'intestin. La zone hépatique a été décrite dans (B). Barres d'échelle de 0,1 mm (C-D) Image lumineuse représentative de 6 dpf de larve transgénique de poisson zèbre exprimant la b-caténine activée par hépatocyte (ABC), montrant le foie agrandi. La zone hépatique a été décrite dans (D). Barres d'échelle de 0,1 mm (E) Graphique montrant les mesures de la taille du foie (écart moyen et standard) de 6 larves de poissons zèbres non transgéniques (Non-Tg) et de larves transgéniques de poisson zèbre exprimant la b-caténine activée spécifique à l'hépatocyte (ABC). Des échantillons ont été comparés à l'aide d'un test t non apparié. p lt; 0,0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Exemples d'images et de micromètres inadéquats. (A-G) Images représentatives des foies larvaires qui devraient être exclues de l'analyse. Barres d'écailles de 0,1 mm (A) Larve avec la peau couvrant le foie. (B) La rauque avec le jaune obscurcissant le foie. (C) Larve avec des parties du foie pincées. (D) Larve avec le foie disloqué et tombant. (E) Larve avec foie manquant. (F) La rauque avec contour du foie qui est difficile à identifier parce que l'image est floue / hors de la mise au point. (G) Larve avec positionnement incorrect. Les deux yeux ne sont pas alignés directement l'un sur l'autre. (H) Image du micromètre, utilisé pour générer des barres d'échelle et convertir les mesures logicielles de traitement d'image de pixels en cm2. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
La quantification de la taille du foie est cruciale dans les études visant à comprendre le développement du foie, la régénération et l'oncogénèse. Le protocole décrit ici est une technique relativement rapide, facile et bon marché pour la quantification de la taille du foie chez le poisson zèbre larvaire. Faire preuve de prudence tout en exécutant certains aspects du protocole peut aider à une plus grande exactitude des résultats et à une diminution de la frustration.
Une bonne fixation des larves est cruciale pour obtenir des échantillons biologiques bien conservés et prévenir leur désintégration. La dilution de la solution PFA de 4 % peut se produire lorsque le PBS n'est pas complètement enlevé avant l'ajout de PFA aux larves rincées. L'utilisation de solutions PFA bien faites et la tuyauterie de la totalité ou la plupart de la solution PBS avant l'ajout de PFA est utile pour résoudre ce problème.
Bien que rapide et facile à exécuter après beaucoup de pratique, la technique de dissection exige la dextérité manuelle substantielle. Tout en disséquant, il est crucial d'enlever la peau et le jaune complètement au-dessus du foie de sorte que le foie entier est exposé. Le défaut de le faire peut donner lieu à des images où la vue de la limite hépatique est masquée (figure 2A,B). Les mouvements non qualifiés et énergiques pendant la dissection peuvent entraîner le pincement des parties du foie (figure 2C) ou le relâchement des attaches hépatiques, ce qui entraîne le déplacement du foie (figure 2D) ou l'absence complète(figure 2E). Les utilisateurs devraient consacrer un nombre suffisant d'heures à l'amélioration de leurs compétences en dissection sur des échantillons de pratique avant de passer à des échantillons expérimentaux.
Pendant le montage, la peau au-dessus du foie a été enlevée, augmentant la probabilité que le foie tombe pendant les étapes suivantes. Pour éviter cette possibilité, des mouvements doux de pipetage devraient être employés pendant ce processus.
Lors de l'achat d'images à l'aide du microscope brightfield, il est crucial que des images de bonne qualité soient prises. Les images floues et floues rendront difficile l'évaluation de la véritable limite du foie (figure 2F). Comme cette méthode consiste à mesurer la surface du lobe gauche du foie, il est crucial que la larve soit bien orientée sur le côté et non inclinée (Figure 2G). Assurez-vous que les deux yeux de la larve sont alignés (un œil couvrant la vue de l'autre). Tout en mesurant la surface à l'aide d'un logiciel de traitement d'image, il est important de tracer la limite aussi près que possible du contour réel du foie afin d'éviter les écarts de mesure. Exclure les images où le foie ne peut pas être mesuré avec précision (Figure 2A-G). Cependant, gardez à l'esprit que l'exclusion des foies peut fausser les données, comme les foies plus grands sont plus susceptibles d'être perturbés que les foies plus petits.
L'une des limites de ce protocole est qu'il ne s'applique qu'aux larves fixes. D'autres méthodes telles que la microscopie fluorescence peuvent être utilisées pour mesurer la taille du foie chez les larves vivantes exprimant des reporters fluorescents spécifiques aux hépatocytes5,7,10. Ces méthodes alternatives permettent de mesurer séquentiel le même animal, et elles sont également plus rapides, car elles ne nécessitent pas de fixation ou de dissection des tissus qui recèient le foie. Les avantages de ce protocole par rapport à la microscopie de fluorescence chez les animaux vivants sont les suivants : 1) plus de flexibilité par rapport au moment où les foies sont mesurés, car le poisson zèbre peut être maintenu en fixatif pendant des semaines ou des mois avant de les photographier; 2) aucune exigence pour l'incorporation d'un journaliste fluorescent, qui peut être encombrant e lorsqu'il s'agit de mutants homozygotes; et 3) applicabilité des étapes 1 et 2 pour d'autres expériences, y compris la coloration de l'immunofluorescence ou des études d'hybridation in situ. Nous utilisons les deux méthodes, en fonction de l'application particulière. Par exemple, nous utilisons généralement l'imagerie en direct et les reporters spécifiques aux hépatocytes pour le dépistage à haut débit3, et le suivi des composés touchés potentiels en utilisant le protocole décrit ici3.
Ce protocole ne tient compte que de la surface pour la quantification de la taille du foie, de sorte qu'il ne détecte pas les changements dans le métabolisme cellulaire ou la morphologie, ni ne différencie entre les augmentations du nombre de cellules et les augmentations de la taille des cellules. Afin de remédier à cette limitation, des essais complémentaires pour évaluer la stéatose16, histologie6, cellule numéro8,11, taille de cellule3,17, prolifération3,18, et / ou apoptose19 peut être effectuée.
Une autre limitation de ce protocole est qu'il suppose que les augmentations ou les diminutions de la surface du lobe du foie gauche reflètent les changements de surface et le volume du foie dans son ensemble. Cette hypothèse peut ne pas s'appliquer lorsque la croissance du foie n'est pas uniforme. Pour examiner la forme du foie et vérifier les augmentations non symétriques de la croissance du foie, nous faisons régulièrement la microscopie de fluorescence de feuille légère8 ou la microscopie confocale3 sur nos modèles transgéniques. La microscopie de fluorescence de feuille légère peut être employée pour quantifier directement le volume de foie larvaire8. Chez les poissons zèbres transgéniques exprimant yap1 spécifique aux hépatocytes, la superficie du foie et le volume du foie ont été augmentés de la même façon par rapport aux frères et sœurs témoins non transgéniques8.
La technique de dissection décrite ici peut être combinée avec la coloration d'immunofluorescence, les lignes fluorescentes de journaliste de cellule-spécifiques, et/ou d'autres techniques d'étiquetage pour étudier d'autres aspects du développement de foie en plus de la tailledefoie3,19,20. Comme ce protocole de dissection expose également l'intestin et le pancréas, il peut être utile pour les études d'autres organes viscéraux ainsi.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Maurine Hobbs et la Ressource animale centralisée du poisson zèbre (CZAR) de l'Université de l'Utah pour avoir fourni de l'élevage de poissons zèbres, de l'espace de laboratoire et de l'équipement pour effectuer des parties de cette recherche. L'expansion de la CZAR est soutenue en partie par la subvention des NIH no 1G20OD018369-01. Nous tenons également à remercier Rodney Stewart, Chloe Lim, Lance Graham, Cody James, Garrett Nickum et le Huntsman Cancer Institute (HCI) Zebrafish Facility pour les soins du poisson zèbre. Nous tenons à remercier Kenneth Kompass pour son aide dans le programme R. Ces travaux ont été financés en partie par des subventions de la Huntsman Cancer Foundation (en conjonction avec la subvention P30 CA042014 accordée au Huntsman Cancer Institute) (KJE) et nih/NCI R01CA222570 (KJE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Camera for dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Fine (Dumont #5) forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Glass pipets | VWR | 14672-608 | |
| Image analysis software | Image J/FIJI | ImageJ/FIJI can be dowloaded for free: https://imagej.net/Welcome | |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phosphate-buffered saline | Various suppliers | ||
| Pipette pump | VWR | 53502-233 | |
| Plastic Petri dishes | USA Scientific Inc | 2906 | |
| Pyrex 9-well round-bottom glass dish | VWR | 89090-482 | |
| Software for blinding files | R project | R can be downloaded for free: https://www.r-project.org/ | |
| Scientific graphing and statistics software | GraphPad Prism | ||
| Spreadsheet program | Microsoft Excel | ||
| Tricaine methanesulfonate (Tricaine-S) | Western Chemical | 200-226 | |
| Very fine (Dumont #55) forceps | Fine Science Tools | 11255-20 |
References
- Lin, D. -C., et al. Genomic and Epigenomic Heterogeneity of Hepatocellular Carcinoma. Cancer Research. 77 (9), 2255-2265 (2017).
- Ghouri, Y. A., Mian, I., Rowe, J. H. Review of hepatocellular carcinoma: Epidemiology, etiology, and carcinogenesis. Journal of Carcinogenesis. 16, 1 (2017).
- Evason, K. J., et al. Identification of Chemical Inhibitors of β-Catenin-Driven Liver Tumorigenesis in Zebrafish. PLoS Genetics. 11 (7), 1005305 (2015).
- Kalasekar, S. M., et al. Heterogeneous beta-catenin activation is sufficient to cause hepatocellular carcinoma in zebrafish. Biology Open. 8 (10), (2019).
- Nguyen, A. T., et al. A high level of liver-specific expression of oncogenic Kras(V12) drives robust liver tumorigenesis in transgenic zebrafish. Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 801-813 (2011).
- Nguyen, A. T., et al. An inducible kras(V12) transgenic zebrafish model for liver tumorigenesis and chemical drug screening. Disease Models & Mechanisms. 5 (1), 63-72 (2012).
- Li, Z., et al. A transgenic zebrafish liver tumor model with inducible Myc expression reveals conserved Myc signatures with mammalian liver tumors. Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 414-423 (2013).
- Cox, A. G., et al. Yap reprograms glutamine metabolism to increase nucleotide biosynthesis and enable liver growth. Nature Cell Biology. 18 (8), 886-896 (2016).
- Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease. Development. 132 (15), Cambridge, England. 3561-3572 (2005).
- Huang, X., Zhou, L., Gong, Z. Liver tumor models in transgenic zebrafish: an alternative in vivo approach to study hepatocarcinogenes. Future Oncology. 8 (1), London, England. 21-28 (2012).
- Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. Tumor-Associated Neutrophils and Macrophages Promote Gender Disparity in Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish. Cancer Research. 77 (6), 1395-1407 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2012).
- Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
- Dai, W., et al. High fat plus high cholesterol diet lead to hepatic steatosis in zebrafish larvae: a novel model for screening anti-hepatic steatosis drugs. Nutrition & Metabolism. 12, 42 (2015).
- Kim, S. -H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin. Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 255-267 (2011).
- Delous, M., et al. Sox9b is a key regulator of pancreaticobiliary ductal system development. PLoS Genetics. 8 (6), 1002754 (2012).
- Shin, D., Lee, Y., Poss, K. D., Stainier, D. Y. R. Restriction of hepatic competence by Fgf signaling. Development. 138 (7), Cambridge, England. 1339-1348 (2011).
- Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. R. The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. 56 (5), Baltimore, Md. 1958-1970 (2012).
