Summary
Hier zeigen wir eine Methode zur Quantifizierung der Lebergröße in Larvenzebrafischen, die eine Möglichkeit bietet, die Auswirkungen genetischer und pharmakologischer Manipulationen auf das Leberwachstum und die Leberentwicklung zu bewerten.
Abstract
In mehreren transgenen Zebrafischmodellen des hepatozellulären Karzinoms (HCC) kann Hepatomegalie in frühen Larvenstadien beobachtet werden. Die Quantifizierung der Larvenlebergröße in Zebrafisch-HCC-Modellen bietet eine Möglichkeit, die Auswirkungen von Medikamenten und anderen Manipulationen auf einen Onkogen-bezogenen Phänotyp schnell zu bewerten. Hier zeigen wir, wie man Zebrafischlarven fixiert, das Gewebe, das die Leber umgibt, seziert, Lebern mittels Hellfeldmikroskopie fotografiert, leberfarbene Flächen misst und Ergebnisse analysiert. Dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle, präzise Quantifizierung der Lebergröße. Da diese Methode die Messung des Leberbereichs beinhaltet, kann es Unterschiede im Lebervolumen unterschätzen, und ergänzende Methoden sind erforderlich, um zwischen Veränderungen der Zellgröße und Veränderungen der Zellzahl zu unterscheiden. Die hier beschriebene Dissektionstechnik ist ein ausgezeichnetes Werkzeug, um Leber, Darm und Bauchspeicheldrüse in ihren natürlichen Positionen für unzählige nachgelagerte Anwendungen, einschließlich Immunfluoreszenzfärbung und In-situ-Hybridisierung, zu visualisieren. Die beschriebene Strategie zur Quantifizierung der Larvenlebergröße ist auf viele Aspekte der Leberentwicklung und -regeneration anwendbar.
Introduction
Hepatozelluläres Karzinom (HCC) ist die häufigste primäre Malignität der Leber1 und die dritthäufigste Ursache der krebsbedingten Mortalität2. Um Mechanismen der Hepatokarzinogenese besser zu verstehen und mögliche HCC-Therapeutika zu identifizieren, haben wir und andere transgene Zebrafische entwickelt, bei denen hepatozytenspezifische Expression von Onkogenen wie z.B. '-Catenin3,4, Kras(V12)5,6, Myc7oder Yap18 zu HCC bei erwachsenen Tieren führt. Bei diesen Zebrafischen wird die Lebervergrößerung bereits 6 Tage nach der Befruchtung (dpf) festgestellt, was eine einfache Plattform für die Erprobung der Auswirkungen von Medikamenten und genetischen Veränderungen auf das Onkogen-getriebene Leberüberwuchern bietet. Genaue und genaue Messung der Larvenlebergröße ist wichtig für die Bestimmung der Auswirkungen dieser Manipulationen.
Lebergröße und -form können halbquantitativ bei festen Zebrafischlarven mit CY3-SA-Kennzeichnung9 oder bei lebenden Zebrafischlarven mit hepatozytenspezifischen Fluoreszenzreportern und Fluoreszenzsezierender Mikroskopie5,6bewertet werden. Die letztgenannte Methode ist relativ schnell, und ihre mangelnde Präzision kann durch fotografieren und messen die Fläche jeder Leber mit Bildverarbeitungssoftware7,10behandelt werden. Es kann jedoch technisch schwierig sein, alle lebenden Larven in einem Experiment einheitlich zu positionieren, so dass der zweidimensionale Leberbereich eine genaue Darstellung der Lebergröße darstellt. Eine ähnliche Technik zur Quantifizierung der Lebergröße beinhaltet die Verwendung von Lichtblattfluoreszenzmikroskopie zur Quantifizierung des Larvenlebervolumens8, was genauer sein kann, um Größenunterschiede zu erkennen, wenn die Leber in verschiedenen Dimensionen ungleichmäßig erweitert wird. Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) kann verwendet werden, um die Anzahl der fluoreszierend gekennzeichneten Hepatozyten und andere Leberzelltypen in Larvenlebern8,11zu zählen. Bei dieser Methode werden Larvenleber gepoolt und dissoziiert, so dass Informationen über die größe und Form der einzelnen Leber verloren gehen. In Kombination mit einer anderen Methode zur Bestimmung der Lebergröße ermöglicht FACS die Unterscheidung zwischen erhöhter Zellzahl (Hyperplasie) und erhöhter Zellgröße (Hypertrophie). Alle diese Methoden verwenden teure Fluoreszenztechnologie (Mikroskop oder Zellsortierer) und erfordern, mit Ausnahme der CY3-SA-Kennzeichnung, die Kennzeichnung von Hepatozyten mit einem fluoreszierenden Reporter.
Hier beschreiben wir detailliert eine Methode zur Quantifizierung von Zebrafisch-Larvenleber-Bereich mit Hellfeldmikroskopie und Bildverarbeitungssoftware3,12,13,14. Dieses Protokoll ermöglicht eine präzise Quantifizierung des Bereichs der einzelnen Lebern in situ ohne den Einsatz von Fluoreszenzmikroskopie. Bei der Analyse der Lebergröße blenden wir die Bildidentität, um die Voreingenommenheit der Ermittler zu reduzieren und die wissenschaftliche Strenge zu verbessern15.
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Protocol
Tierversuche werden nach Verfahren durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Utah genehmigt wurden.
1. Arven fixieren
- Nach 3–7 Tagen nach der Befruchtung (dpf) Larven mit Tricain-Methansulfonat einschläfern (0,03%) und sammeln Bis zu 15 Larven in einem 2 ml Rohr mit einer Glaspipette und Pipettenpumpe.
- Larven zweimal mit 1 ml Kalt (4 °C) 1x Phosphat-gepufferte Saline (PBS) auf Eis waschen. Für jede Wäsche so viel Flüssigkeit wie möglich aus dem Rohr mit einer Glaspipette und Pipettenpumpe entfernen und dann 1 ml kalte SPBS in das Rohr geben.
- Entfernen Sie so viel PBS wie möglich mit einer Glaspipette und Pipettenpumpe, und fügen Sie 1 ml kalt (4 °C) 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS hinzu.
VORSICHT: PFA ist reizend und vermutet krebserregend. Handschuhe sollten beim Umgang mit PFA getragen werden, und konzentrierte Lösungen sollten in einer chemischen Rauchhaube behandelt werden. - Bei 4 °C mindestens über Nacht (aber bis zu mehreren Monaten) mit sanftem Schaukeln inkubieren.
2. Sezieren von Geweben umgebender Leber
- Larven aus PFA entfernen, indem man 3x mit 1 ml kalt (4 °C) PBS spülen und 5 min zwischen den Spülungen schaukeln.
HINWEIS: Es ist in Ordnung, die vorgespülten Larven in PBS für ein oder zwei Tage bei 4 °C zu halten. - Mehrere Larven in PBS in einen Brunnen einer 9-Well-Rundbodenglasschale geben.
- Entfernen Sie die Haut, die die Leber umgibt.
- Verwenden Sie feine Zange, um Larven auf dem Rücken zu halten (Bauch nach oben), greifen auf beiden Seiten des Kopfes so sanft wie möglich. Dann verwenden Sie sehr feine Zange in der anderen Hand, um die Haut nur über dem Herzen zu greifen.
- Ziehen Sie die Haut diagonal zum Schwanz des Fisches und zum Boden der Schale auf der linken oder rechten Seite des Fisches. Wiederholen Sie dies für die andere Seite (rechte oder linke Seite).
- Greifen Sie weiter Klappen der Haut und ziehen Sie nach unten / zurück, bis die gesamte Haut und Melanophoren über oder in der Nähe der Leber entfernt wurden.
- Entfernen Sie Dasgelb, falls vorhanden.
- Für 5-6 dpf Larven, heben Sie Dasgelb in einem Stück, indem Sie den Fisch mit feinen Zangen auf dem Rücken und mit den sehr feinen Zangen, um das Eigelb sanft zu prod.
- Für 3-4 dpf Larven, kratzen Sie das Eigelb in Stücke. Halten Sie den Fisch mit feiner Zange auf dem Rücken und verwenden Sie die sehr feine Zange, um das Eigelb zu streicheln, beginnend von der ventralen Seite.
- Mit einer Glaspipette und Einer Pipettenpumpe sezierte Larven in frische kalte PBS geben.
3. Imaging
- Um Larven zu montieren, gießen Sie ein paar ml 3% Methylcellulose auf den Deckel einer sauberen Kunststoff-Petrischale.
- Verwenden Sie eine Glaspipette und Pipettenpumpe, um Larven in die Methylcellulose einzutragen und so wenig PBS wie möglich mit den Larven hinzuzufügen.
- Unter einem Sezieren Mikroskop bei geringer Vergrößerung, verwenden Sie feine Zange, um die Fische so zu orientieren, dass sie auf ihrer rechten Seite liegen, nach links.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Fische perfekt auf ihrer Seite ausgerichtet sind oder die Lebermessungen möglicherweise nicht genau sind. - Nehmen Sie ein Foto von jedem Fisch.
- Bestätigen Sie, dass der zu fotografierende Fisch perfekt ausgerichtet ist, wobei ein Auge direkt auf dem anderen Auge ist. Verwenden Sie bei Bedarf feine Zangen, um leicht auf Kopf oder Schwanz von Fischen zu tippen, um die Ausrichtung anzupassen. Wenn der Schwanz des Fisches gebogen ist, entfernen Sie den Schwanz, indem Sie ihn mit Kräftigen zangen, um ihn zu entfernen, so dass der Fisch flach liegt.
- Zoomen Sie auf eine hohe Vergrößerung und konzentrieren Sie sich auf die Leber, um sicherzustellen, dass die Kontur der Leber deutlich sichtbar ist.
- Fangen Sie ein Bild, und speichern Sie die Datei.
- Wiederholen Sie dies für alle Fische, um sicherzustellen, dass die Vergrößerung für jedes Bild gleich ist.
- Nehmen Sie ein Bild eines Mikrometers mit der gleichen Vergrößerung auf (siehe Abbildung 2H).
4. Bildanalyse
- Messen Sie die Fläche der Leber jedes Fisches mit Bildverarbeitungssoftware.
- Blind alle Leberbilder, um potenzielle Ermittler Voreingenommenheit zu vermeiden und fördern wissenschaftliche Strenge15. Dieser Schritt kann manuell von einem anderen Lab-Mitglied oder mit einem Computerprogramm (Ergänzendes Material) durchgeführt werden. Benennen Sie Dateien nach dem Zufallsprinzip um und erstellen Sie eine "Randomisierungsdatei", die eine Liste der ursprünglichen Dateinamen und der entsprechenden geblendeten Dateinamen enthält.
- Öffnen Sie randomisierte Dateien in der Reihenfolge, beginnend mit Datei 1.
- Wählen Sie das Freihandauswahl-Tool und skizzieren Sie jede Leber.
- Drücken Sie Strg-M, um den Bereich jeder Leber zu messen.
- Für alle Lebern, die nicht genau gemessen werden können, legen Sie eine Platzhaltermessung ein (sehr klein oder sehr groß, so dass sie später leicht ausgeschlossen werden kann).
- Speichern Sie die Messungen in einer Textdatei ("Messdatei").
- Blinden- und Analysedaten
- Öffnen Sie "Messdatei" und "Randomisierungsdatei" in einem Tabellenkalkulationsprogramm.
- Fügen Sie eine neue Spalte in die "Messdatei" ein und fügen Sie die ursprünglichen Dateinamen für die geblendeten Dateien mithilfe der "Randomisierungsdatei" hinzu. Speichern Sie diese Datei als "Unblinded measurements file".
- Sortieren Sie Daten nach dem ursprünglichen Dateinamen.
- Achten Sie darauf, alle Lebermessungen auszuschließen, für die Bilder unzureichend waren (siehe Abbildung 2A–G).
- Konvertieren Sie ggf. Messwerte in die gewünschte Skala (z. B. mm2).
- Öffnen Sie die Maßstabsleiste in der Bildverarbeitungssoftware.
- Verwenden Sie das gerade Werkzeug, um 1 mm auf der Waage zu messen. Die Bildverarbeitungssoftware misst in den gleichen Einheiten wie die Leber (Pixel), was einen Umrechnungsfaktor ergibt.
- Verwenden Sie den Umrechnungsfaktor, um Messungen in der Datei "Unblinded measurements" zu konvertieren.
- Mit dem Tabellenkalkulationsprogramm oder Einfügen von Daten in eine wissenschaftliche Graphik- und Statistiksoftware bestimmen Sie Mittelwert und Standardabweichung und berechnen p-Wert(e).
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Representative Results
Transgene Zebrafische, die Hepatozyten-spezifisches aktiviertes -Catenin (Tg(fabp10a:pt---cat) Zebrafisch)3 und nicht-transgene Kontrollgeschwister exzensieren, wurden mit 6 dpf eingeschläfert und der Leberbereich wurde mit Hilfe von Brightfield-Mikroskopie- und Bildverarbeitungssoftware quantifiziert. Transgene Zebrafische haben die Lebergröße (0,0006 cm2) im Vergleich zu ihren nicht-transgenen Geschwistern (0,0004 cm2, p < 0,0001; Abbildung 1).
Abbildung 1: Lebergrößenanalyse von 6 dpf (Tage nach der Befruchtung) Zebrafische. (A-B) Repräsentatives Hellfeldbild von 6 dpf nicht-transgenen Zebrafischlarven, die natürliche Position und Form der Leber über dem Darm zeigt. Leberbereich wurde in (B) beschrieben. Skalenstäbe = 0,1 mm. (C-D) Repräsentatives Hellfeldbild von 6 dpf transgenen Zebrafischlarven, die Hepatozyten-spezifisches aktiviertes B-Catenin (ABC) exklamieren, das vergrößerte Leber zeigt. Leberbereich wurde in (D) beschrieben. Skalarstäbe = 0,1 mm. (E) Grafik mit Lebergrößenmessungen (mittlere Standardabweichung) von 6 dpf nicht-transgenen Zebrafischlarven (Non-Tg) und transgenen Zebrafischlarven, die hepatozytspezifisches B-Catenin (ABC) exdrücken. Die Proben wurden mit einem ungepaarten t-Test verglichen. p < 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Beispiele für unzureichende Bilder und Mikrometer. (A-G) Repräsentative Bilder von Larvenlebern, die von der Analyse ausgeschlossen werden sollten. Skalenstäbe = 0,1 mm. (A) Larve mit Haut, die die Leber bedeckt. (B) Larve mit Dotter, das die Leber verdunkelt. (C) Larve mit abklapperten Leberteilen. (D) Larve mit Leber verrenkt und abfallend. (E) Larve mit fehlender Leber. (F) Larve mit Leberumriss, der schwer zu identifizieren ist, da das Bild verschwommen/nicht fokussiert ist. (G) Larve mit unsachgemäßer Positionierung. Die beiden Augen sind nicht direkt übereinander ausgerichtet. (H) Bild des Mikrometers, das verwendet wird, um Maßstabsleisten zu erzeugen und Bildverarbeitungssoftware-Messungen von Pixel in cm2umzuwandeln. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Quantifizierung der Lebergröße ist entscheidend in Studien zum Verständnis der Leberentwicklung, Regeneration, und Onkogenese. Das hier beschriebene Protokoll ist eine relativ schnelle, einfache und kostengünstige Technik zur Quantifizierung der Lebergröße bei Larvenzebrafischen. Die angemessene Vorsicht bei der Durchführung bestimmter Aspekte des Protokolls kann zu einer höheren Genauigkeit der Ergebnisse und einer verminderten Frustration führen.
Die richtige Fixierung der Larven ist entscheidend, um gut erhaltene biologische Proben zu erhalten und deren Zerfall zu verhindern. Verdünnung der 4% PFA-Lösung kann auftreten, wenn PBS vor der Zugabe von PFA zu den vorspülten Larven nicht vollständig entfernt wird. Die Verwendung von gut gemachten PFA-Lösungen und das Pipettieren der gesamten oder den meisten PBS-Lösungen vor der PFA-Zugabe ist hilfreich, um dieses Problem zu beheben.
Obwohl schnell und einfach nach viel Übung durchzuführen, erfordert die Seziertechnik erhebliche manuelle Geschicklichkeit. Während der Sezieren, Ist es wichtig, die Haut zu entfernen und Eigelb vollständig von oben der Leber, so dass die ganze Leber ausgesetzt ist. Andernfalls kann die Ansicht der Lebergrenze verdeckt ist (Abbildung 2A,B). Ungelernte und kraftvolle Bewegungen beim Sezieren können dazu führen, dass Teile der Leber abgeklemmt werden (Abbildung 2C) oder Leberanhaftungen gelockert werden, was dazu führt, dass die Leber verdrängt wird (Abbildung 2D) oder ganz fehlt (Abbildung 2E). Benutzer sollten eine ausreichende Anzahl von Stunden in die Lage versetzen, ihre Sezieren-Fähigkeiten auf Übungsproben zu verbessern, bevor sie zu experimentellen Proben übergehen.
Während der Montage wurde die Haut über der Leber entfernt, was die Wahrscheinlichkeit erhöht, dass die Leber bei nachfolgenden Schritten herausfällt. Um diese Möglichkeit zu vermeiden, sollten während dieses Prozesses sanfte Pipettierbewegungen verwendet werden.
Bei der Bildbeschaffung mit dem Hellfeldmikroskop ist es entscheidend, dass Bilder in guter Qualität aufgenommen werden. Verschwommene, nicht fokussierte Bilder machen es schwierig, die wahre Grenze der Leber zu beurteilen (Abbildung 2F). Da diese Methode die Messung der Oberfläche des linken Leberlappens beinhaltet, ist es entscheidend, dass die Larve gut auf ihrer Seite ausgerichtet und nicht geneigt ist (Abbildung 2G). Stellen Sie sicher, dass beide Augen der Larve ausgerichtet sind (ein Auge bedeckt die Ansicht des anderen). Bei der Messung der Oberfläche mit Bildverarbeitungssoftware ist es wichtig, die Grenze so nah wie möglich an die reale Kontur der Leber zu ziehen, um Messabweichungen zu vermeiden. Ausgeschlossen alle Bilder, bei denen die Leber nicht genau gemessen werden kann (Abbildung 2A–G). Beachten Sie jedoch, dass der Ausschluss von Lebern die Daten verzerren kann, da größere Lebern eher gestört werden als kleinere Lebern.
Eine der Einschränkungen dieses Protokolls ist, dass es nur für feste Larven gilt. Alternative Methoden wie Fluoreszenzmikroskopie können verwendet werden, um die Lebergröße in lebenden Larven zu messen, die hepatozytenspezifische fluoreszierende Reporter5,7,10ausdrücken. Diese alternativen Methoden ermöglichen sequentielle Messungen an demselben Tier, und sie sind auch schneller, da sie keine Fixierung oder Zerlegung der Gewebe erfordern, die die Leber überlagern. Die Vorteile dieses Protokolls gegenüber der Fluoreszenzmikroskopie bei lebenden Tieren sind: 1) mehr Flexibilität in Bezug auf die Messung von Lebern, da Zebrafische Wochen oder Monate lang fixiert gehalten werden können, bevor sie fotografiert werden; 2) keine Anforderung für die Einbeziehung eines fluoreszierenden Reporters, der im Umgang mit homozygoten Mutanten umständlich sein kann; und 3) Anwendbarkeit der Schritte 1 und 2 für andere Experimente, einschließlich Immunfluoreszenzfärbung oder In-situ-Hybridisierungsstudien. Wir verwenden beide Methoden, je nach Anwendung. Zum Beispiel verwenden wir in der Regel Live-Bildgebung und Hepatozyten-spezifische Reporter für High-Throughput-Screening3, und follow-up auf mögliche Treffer-Verbindungen mit dem Protokollbeschrieben3 .
Dieses Protokoll berücksichtigt nur die Oberfläche für die Quantifizierung der Lebergröße, so dass es keine Veränderungen im Zellstoffwechsel oder Morphologie erkennt, noch unterscheidet es zwischen Erhöhung der Zellzahl und Erhöhung der Zellgröße. Um diese Einschränkung zu beheben, können ergänzende Assays zur Beurteilung der Steatose16, Histologie6, Zellnummer8,11, Zellgröße3,17, Proliferation3,18, und/oder Apoptose19 durchgeführt werden.
Eine weitere Einschränkung dieses Protokolls ist, dass es davon ausgeht, dass Erhöhungen oder Abnahmen in der Oberfläche des linken Leberlappens die Veränderungen der Oberfläche und des Volumens der Leber als Ganzes reflektieren. Diese Annahme kann nicht gelten, wenn das Leberwachstum ungleichmäßig ist. Um die Leberform zu untersuchen und auf nicht-symmetrische Erhöhungen des Leberwachstums zu überprüfen, führen wir routinemäßig Lichtblattfluoreszenzmikroskopie8 oder konfokale Mikroskopie3 auf unseren transgenen Modellen durch. Lichtbogenfluoreszenzmikroskopie kann verwendet werden, um das Larvenlebervolumen8direkt zu quantifizieren. Bei transgenen Zebrafischen, die hepatozytenspezifischeytenspezifische Yap1, Leberbereich und Lebervolumen exzessiös erhöht im Vergleich zu nicht-transgenen Kontrollgeschwistern8.
Die hier beschriebene Dissektionstechnik kann mit Immunfluoreszenzfärbung, zellspezifischen fluoreszierenden Reporterlinien und/oder anderen Etikettierungstechniken kombiniert werden, um neben Lebergröße3,19,20auch andere Aspekte der Leberentwicklung zu untersuchen. Da dieses Sezierprotokoll auch den Darm und die Bauchspeicheldrüse freilegt, kann es auch für Studien anderer viszeraler Organe hilfreich sein.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir möchten Maurine Hobbs und die Centralized Zebrafish Animal Resource (CZAR) an der University of Utah für die Bereitstellung von Zebrafischhaltung, Laborraum und Ausrüstung zur Durchführung von Teilen dieser Forschung danken. Die Erweiterung des CZAR wird zum Teil durch den NIH-Zuschuss Nr. 1G20OD018369-01 unterstützt. Wir möchten auch Rodney Stewart, Chloe Lim, Lance Graham, Cody James, Garrett Nickum und dem Huntsman Cancer Institute (HCI) Zebrafish Facility für die Pflege von Zebrafischen danken. Wir danken Kenneth Kompass für die Unterstützung bei der R-Programmierung. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Stipendien der Huntsman Cancer Foundation (in Verbindung mit dem Stipendium P30 CA042014 an das Huntsman Cancer Institute) (KJE) und NIH/NCI R01CA222570 (KJE) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Camera for dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Fine (Dumont #5) forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Glass pipets | VWR | 14672-608 | |
| Image analysis software | Image J/FIJI | ImageJ/FIJI can be dowloaded for free: https://imagej.net/Welcome | |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phosphate-buffered saline | Various suppliers | ||
| Pipette pump | VWR | 53502-233 | |
| Plastic Petri dishes | USA Scientific Inc | 2906 | |
| Pyrex 9-well round-bottom glass dish | VWR | 89090-482 | |
| Software for blinding files | R project | R can be downloaded for free: https://www.r-project.org/ | |
| Scientific graphing and statistics software | GraphPad Prism | ||
| Spreadsheet program | Microsoft Excel | ||
| Tricaine methanesulfonate (Tricaine-S) | Western Chemical | 200-226 | |
| Very fine (Dumont #55) forceps | Fine Science Tools | 11255-20 |
References
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