Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी का उपयोग करलारल जेब्राफिश में जिगर का आकार मात्रा

Published: February 2, 2020 doi: 10.3791/60744
* These authors contributed equally

Summary

यहां हम लार्वा जेब्राफिश में जिगर के आकार की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक विधि प्रदर्शित करते हैं, जो यकृत के विकास और विकास पर आनुवंशिक और फार्माकोलॉजिक जोड़तोड़ के प्रभावों का आकलन करने का एक तरीका प्रदान करते हैं।

Abstract

हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा (एचसीसी) के कई ट्रांसजेनिक जेब्राफिश मॉडल में, हेपेटोमेगाली प्रारंभिक लार्वा चरणों के दौरान मनाया जा सकता है। जेब्राफिश एचसीसी मॉडल में लार्वा जिगर के आकार का मात्रा निर्धारित करने से ऑन्कोजीन से संबंधित फेनोटाइप पर दवाओं और अन्य जोड़तोड़ के प्रभावों का तेजी से आकलन करने का साधन प्रदान करता है। यहां हम ज़ेब्राफिश लार्वा को ठीक करने, यकृत के आसपास के ऊतकों को विच्छेदन करने, उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके फोटोग्राफ यकृत, यकृत क्षेत्र को मापने और परिणामों का विश्लेषण करने का तरीका दिखाते हैं। यह प्रोटोकॉल जिगर के आकार के तेजी से, सटीक मात्रा करण को सक्षम बनाता है। चूंकि इस विधि में यकृत क्षेत्र को मापना शामिल है, यह यकृत की मात्रा में अंतर को कम कर सकता है, और कोशिका के आकार में परिवर्तन और सेल संख्या में परिवर्तन के बीच अंतर करने के लिए पूरक पद्धतियों की आवश्यकता होती है। यहां वर्णित विच्छेदन तकनीक प्रतिरक्षण और सीटू संकरण सहित असंख्य डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए अपने प्राकृतिक पदों में जिगर, आंत और अग्न्याशय की कल्पना करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण है। लार्वा जिगर के आकार की मात्रा निर्धारित करने के लिए वर्णित रणनीति जिगर के विकास और उत्थान के कई पहलुओं पर लागू होती है।

Introduction

हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा (एचसीसी) जिगर1 का सबसे आम प्राथमिक द्रोह और कैंसर से संबंधित मृत्यु दर2का तीसरा प्रमुख कारण है । हेपेटोकार्सिनोजेनेसिस के तंत्र को बेहतर ढंग से समझने और संभावित एचसीसी चिकित्सा की पहचान करने के लिए, हमने और अन्य ने ट्रांसजेनिक जेब्राफिश विकसित की है जिसमें हेपेटोसाइट-विशिष्ट अभिव्यक्ति ऑन्कोजीन जैसे कि ओकोजीन3, 4,क्रास (V12)5,6,Myc7,या Yap18 वयस्क जानवरों में एचसीसी की ओर जाता है। इन जेब्राफिश में, लिवर इज़ाफ़ा को निषेचन (डीपीएफ) के बाद 6 दिनों के रूप में जल्दी नोट किया जाता है, जो ऑन्कोजीन-चालित लिवर ओवरग्रोथ पर दवाओं और आनुवंशिक परिवर्तनों के प्रभावों का परीक्षण करने के लिए एक फेसियल प्लेटफॉर्म प्रदान करता है। इन जोड़तोड़ के प्रभावों का निर्धारण करने के लिए लार्वा यकृत आकार का सटीक और सटीक माप आवश्यक है।

जिगर के आकार और आकार का मूल्यांकन CY3-SA लेबलिंग9 द्वारा या लाइव जेब्राफिश लार्वा में हेपेटोसाइट-विशिष्ट फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स और फ्लोरेसेंस विच्छेदन माइक्रोस्कोपी5,6द्वारा फिक्स्ड जेब्राफिश लार्वा में अर्ध-मात्रात्मक रूप से किया जा सकता है। उत्तरार्द्ध विधि अपेक्षाकृत त्वरित है, और छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर7,10का उपयोग करके प्रत्येक यकृत के क्षेत्र को फोटोग्राफ और मापने के द्वारा सटीक की कमी को संबोधित किया जा सकता है। हालांकि, एक प्रयोग में सभी जीवित लार्वा को समान रूप से स्थिति में रखना तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकता है कि दो-आयामी यकृत क्षेत्र यकृत के आकार का सटीक प्रतिनिधित्व है। जिगर के आकार की मात्रा के लिए एक समान तकनीक में लार्वा यकृत की मात्रा8को निर्धारित करने के लिए प्रकाश शीट फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करना शामिल है, जो आकार के अंतर का पता लगाने के लिए अधिक सटीक हो सकता है जब जिगर को विभिन्न आयामों में गैर-समान रूप से विस्तारित किया जाता है। फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल छंटाई (FACS) का उपयोग लार्वा यकृत8,11में फ्लोरोसेंटलेबल लेबल हेपेटोसाइट्स और अन्य यकृत कोशिका प्रकारों की संख्या को गिनने के लिए किया जा सकता है। इस विधि में, लार्वा यकृत को पूल किया जाता है और अलग किया जाता है, इसलिए व्यक्तिगत यकृत आकार और आकार के बारे में जानकारी खो जाती है। एक और जिगर के आकार निर्धारण विधि के साथ संयोजन में, FACS वृद्धि हुई सेल संख्या (हाइपरप्लासिया) और बढ़ी हुई सेल आकार (हाइपरट्रॉफी) के बीच भेदभाव को सक्षम बनाता है। इन तरीकों के सभी महंगी फ्लोरेसेंस प्रौद्योगिकी (माइक्रोस्कोप या सेल सॉर्टर) को रोजगार और, CY3-एसए लेबलिंग के अलावा, एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के साथ हेपेटोसाइट्स की लेबलिंग की आवश्यकता है ।

यहां हम ब्राइट-फील्ड माइक्रोस्कोपीऔर इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर3,12,13,14का उपयोग करके जेब्राफिश लार्वा लिवर क्षेत्र की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक विधि का विस्तार से वर्णन करते हैं । यह प्रोटोकॉल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के उपयोग के बिना सीटू में व्यक्तिगत यकृत के क्षेत्र की सटीक मात्रा को सक्षम बनाता है। जिगर के आकार का विश्लेषण करते समय, हम अन्वेषक पूर्वाग्रह को कम करने और वैज्ञानिक कठोरता15में सुधार करने के लिए छवि पहचान अंधा ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

पशु अध्ययन यूटा विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित प्रक्रियाओं के बाद किया जाता है।

1. लार्वा फिक्सिंग

  1. 3-7 दिनों के बाद निषेचन (डीपीएफ) में, ट्राइकेन मीथेनसल्फोनेट (0.03%) के साथ लार्वा को इच्छामृत्यु दें और एक ग्लास पिपेट और पिपेट पंप का उपयोग करके 2 एमएल ट्यूब में 15 लार्वा इकट्ठा करें।
  2. बर्फ पर 1 मिलीएम ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) 1x फॉस्फेट-बफर्ड लवण (पीबीएस) के साथ दो बार लार्वा धोएं। प्रत्येक धोने के लिए, एक गिलास पिपेट और पिपेट पंप के साथ ट्यूब से जितना संभव हो उतना तरल निकालें, और फिर ट्यूब में ठंडे पीबीएस के 1 मिलील जोड़ें।
  3. एक ग्लास पिपेट और पिपेट पंप का उपयोग करके जितना संभव हो उतना पीबीएस निकालें, और पीबीएस में 1 मिलीएम ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) जोड़ें।
    सावधानी: पीएफए एक अड़चन और संदिग्ध कैंसरजन है। पीएफए को संभालते समय दस्ताने पहने जाने चाहिए, और केंद्रित समाधानों को रासायनिक धुएं हुड में संभाला जाना चाहिए।
  4. कोमल कमाल के साथ कम से कम रात में (लेकिन कई महीनों तक) 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।

2. लिवर के आसपास के ऊतकों को विच्छेदन

  1. 1 मिलीआर ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) पीबीएस के साथ 3x को धोकर पीएफए से लार्वा निकालें और कुल्ला के बीच में 5 मिन के लिए कमाल करें।
    नोट: 4 डिग्री सेल्सियस पर एक या दो दिन के लिए पीबीएस में कुल्ला लार्वा रखना ठीक है।
  2. पीबीएस में कई लार्वा को 9-अच्छी तरह से गोल-बॉटम ग्लास डिश के एक कुएं में पिपेट करें।
  3. जिगर के आसपास की त्वचा को हटा दें।
    1. अपनी पीठ (पेट ऊपर) पर लार्वा रखने के लिए ठीक संदंश का उपयोग करें, सिर के दोनों ओर धीरे-धीरे संभव हो। फिर त्वचा को दिल को ओवरलाइंग करने के लिए अपने दूसरे हाथ में बहुत बारीक संदंश का उपयोग करें।
    2. मछली की पूंछ और मछली के बाईं या दाईं ओर पकवान के नीचे की ओर तिरछे त्वचा नीचे खींचो । दूसरी तरफ (दाएं या बाएं पक्ष) के लिए दोहराएं।
    3. त्वचा के फ्लैप हथियाने और नीचे खींच जारी रखें/
  4. यदि उपस्थित हो तो जर्दी निकालें।
    1. 5-6 डीपीएफ लार्वा के लिए, मछली को अपनी पीठ पर ठीक संदंश के साथ पकड़कर और जर्दी को धीरे-धीरे बढ़ाने के लिए बहुत अच्छे संदंश का उपयोग करके एक टुकड़े में जर्दी को हटा दें।
    2. 3-4 डीपीएफ लार्वा के लिए, टुकड़ों में जर्दी को कुरेदें। अपनी पीठ पर ठीक संदंश के साथ मछली पकड़ो और बहुत ठीक संदंश का उपयोग करने के लिए जर्दी स्ट्रोक, वेंट्रल पक्ष से शुरू ।
  5. एक ग्लास पिपेट और पिपेट पंप का उपयोग करके ताजा ठंडे पीबीएस में विच्छेदित लार्वा रखें।

3. इमेजिंग

  1. लार्वा माउंट करने के लिए, एक साफ प्लास्टिक पेट्री डिश के ढक्कन पर 3% मिथाइल सेल्यूलोज के कुछ mL डालें।
  2. मिथाइल सेल्यूलोज में लार्वा जोड़ने के लिए एक ग्लास पिपेट और पिपेट पंप का उपयोग करें, जितना संभव हो लार्वा के साथ थोड़ा पीबीएस जोड़ें।
  3. कम आवर्धन पर एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, मछली उन्मुख करने के लिए ठीक संदंश का उपयोग करें ताकि वे अपने दाईं ओर बिछा रहे हैं, बाएं का सामना करना पड़ रहा है ।
    नोट: सुनिश्चित करें कि मछली पूरी तरह से उनके पक्ष में उन्मुख हैं या जिगर माप सही नहीं हो सकता है।
  4. प्रत्येक मछली की तस्वीर लें।
    1. पुष्टि करें कि मछली फोटो खिंचवाने के लिए पूरी तरह से गठबंधन किया है, एक आंख के साथ सीधे दूसरी आंख के शीर्ष पर । यदि आवश्यक हो, तो अभिविन्यास को समायोजित करने के लिए सिर या मछली की पूंछ पर हल्के से टैप करने के लिए ठीक संदंश का उपयोग करें। यदि मछली की पूंछ झुक ी हुई है, तो इसे हटाने के लिए संदंश के साथ जबरदस्ती चुटकी देकर पूंछ को हटा दें ताकि मछली फ्लैट दे।
    2. उच्च आवर्धन में ज़ूम करें और जिगर पर ध्यान केंद्रित करें, यह सुनिश्चित करें कि यकृत की रूपरेखा स्पष्ट रूप से दिखाई दे रही है।
    3. एक तस्वीर स्नैप और फ़ाइल को बचाने के लिए।
    4. सभी मछली के लिए दोहराएं, सुनिश्चित करें कि आवर्धन प्रत्येक चित्र के लिए एक ही है।
    5. एक ही आवर्धन का उपयोग कर एक माइक्रोमीटर की तस्वीर ले लो (चित्रा 2एचदेखें) ।

4. छवि विश्लेषण

  1. छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रत्येक मछली के जिगर के क्षेत्र को मापें।
    1. ब्लाइंड सभी जिगर चित्रों संभावित अन्वेषक पूर्वाग्रह से बचने के लिए और वैज्ञानिक कठोरता15को बढ़ावा देने के । यह कदम किसी अन्य प्रयोगशाला सदस्य द्वारा मैन्युअल रूप से किया जा सकता है या कंप्यूटर प्रोग्राम(अनुपूरक सामग्री)का उपयोग कर सकता है। फ़ाइलों का नाम बेतरतीब ढंग से बदलें और एक "यादृच्छिक फ़ाइल" बनाएं जिसमें मूल फ़ाइल नामों और संबंधित अंधा फ़ाइल नामों की सूची हो।
    2. फ़ाइल 1 से शुरू होने वाली यादृच्छिक फ़ाइलों को व्यवस्थित करें।
    3. फ्रीहैंड चयन उपकरण चुनें और प्रत्येक यकृत की रूपरेखा।
    4. प्रत्येक जिगर के क्षेत्र को मापने के लिए सीटीआरएल-एम दबाएं।
    5. किसी भी यकृत के लिए जिसे सही तरीके से मापा नहीं जा सकता है, एक प्लेसहोल्डर माप (बहुत छोटा या बहुत बड़ा डालें, इसलिए इसे आसानी से बाद में बाहर रखा जा सकता है)।
    6. टेक्स्ट फ़ाइल ("माप फ़ाइल") में माप को सहेजें।
  2. संयुक्त राष्ट्र अंधा और डेटा का विश्लेषण
    1. स्प्रेडशीट प्रोग्राम में "माप फ़ाइल" और "यादृच्छिकता फ़ाइल" खोलें।
    2. "माप फ़ाइल" में एक नया कॉलम डालें और "यादृच्छिकफ़ाइल" का उपयोग करके अंधा फ़ाइलों के लिए मूल फ़ाइल नाम जोड़ें। इस फ़ाइल को "अनब्लाइंड माप फ़ाइल" के रूप में सहेजें।
    3. मूल फ़ाइल नाम से डेटा सॉर्ट करें।
    4. किसी भी जिगर माप जिसके लिए तस्वीरें अपर्याप्त थे बाहर करने के लिए सुनिश्चित करें (चित्र 2ए-जीदेखें) ।
    5. यदि आवश्यक हो, तो माप मूल्यों को वांछित पैमाने (मिमी2,उदाहरण के लिए) में परिवर्तित करें।
      1. इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर में स्केल बार खोलें।
      2. स्केल बार पर 1 मिमी मापने के लिए सीधी रेखा उपकरण का उपयोग करें। इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर एक रूपांतरण कारक देते हुए यकृत (पिक्सल) के समान इकाइयों में मापेगा।
      3. "अनब्लाइंड माप फ़ाइल" में माप को बदलने के लिए रूपांतरण कारक का उपयोग करें।
    6. स्प्रेडशीट प्रोग्राम का उपयोग करना या डेटा को वैज्ञानिक ग्राफिंग और सांख्यिकी सॉफ्टवेयर में चिपकाना, मतलब और मानक विचलन निर्धारित करें और पी वैल्यू (एस) की गणना करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ट्रांसजेनिक जेब्राफिश ने हेपेटोसाइट-विशिष्ट सक्रिय-कैटेनिन(टीजी (fabp10a: पीटी-"-कैट) ज़ेब्राफिश)3 और गैर-ट्रांसजेनिक नियंत्रण भाई बहन को 6 डीपीएफ में इच्छामृत्यु दी गई थी और न्यूलंफ़िक माइक्रोस्कोपी और छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके जिगर क्षेत्र को निर्धारित किया गया था। ट्रांसजेनिक जेब्राफिश ने अपने गैर-ट्रांसजेनिक भाई बहन (0.0004 सेमी2, पी एंड एलटी; 0.0001) की तुलना में जिगर का आकार (0.0006 सेमी2)में काफी वृद्धि की है; चित्रा 1)

Figure 1
चित्रा 1: 6 डीपीएफ (निषेचन के बाद दिन) जेब्राफिश का लिवर साइज एनालिसिस। (ए-बी) 6 डीपीएफ नॉन-ट्रांसजेनिक जेब्राफिश लार्वा की प्रतिनिधि ब्राइटफील्ड छवि, जो आंत के ऊपर से निकलने वाले यकृत की प्राकृतिक स्थिति और आकार दिखाती है। लिवर क्षेत्र(बी)में रेखांकित किया गया है । स्केल बार = 0.1 मिमी (सी-डी)6 डीपीएफ ट्रांसजेनिक जेब्राफिश लार्वा की प्रतिनिधि ब्राइटफील्ड छवि हेपेटोसाइट-विशिष्ट सक्रिय बी-कैटेनिन (एबीसी) को व्यक्त करते हुए, बढ़े हुए जिगर को दिखाते हैं। लिवर क्षेत्र(डी)में रेखांकित किया गया है । स्केल बार = 0.1 मिमी.(ई)ग्राफ जिसमें 6 डीपीएफ नॉन-ट्रांसजेनिक जेब्राफिश लार्वा (नॉन-टीजी) और ट्रांसजेनिक जेब्राफिश लार्वा का लिवर साइज दिखाया गया है, जो हेपेटोसाइट-विशिष्ट सक्रिय बी-कैटेनिन (एबीसी) को व्यक्त करता है। नमूनों की तुलना अनपेयर टी टेस्ट का उपयोग करके की गई । पी एंड एलटी; 0.0001। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: अपर्याप्त छवियों और माइक्रोमीटर के उदाहरण। (ए-जी) लार्वा यकृत की प्रतिनिधि छवियां जिन्हें विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए। स्केल बार = 0.1 मिमी (ए)लिवर को कवर करने वाली त्वचा के साथ लार्वा। (ख)लिवर को अस्पष्ट करने वाली जर्दी के साथ लार्वा। (ग)जिगर के कुछ हिस्सों के साथ लार्वा बंद चुटकी । (D)लिवर के साथ लारवा उखड़ गया और गिर गया । (ई)लापता जिगर के साथ लार्वा। (एफ)लिवर की रूपरेखा के साथ लार्वा जिसे पहचानना मुश्किल है क्योंकि छवि धुंधली/आउट-ऑफ-फोकस है । (जी)गलत स्थिति के साथ लार्वा । दोनों आंखें सीधे एक-दूसरे के ऊपर गठबंधन नहीं कर रही हैं । (H)माइक्रोमीटर की छवि, स्केल बार उत्पन्न करने और पिक्सेल से सेमी2तक छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर माप को परिवर्तित करने के लिए उपयोग की जाती है कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

जिगर के विकास, उत्थान और ऑनकोजेनेसिस को समझने के उद्देश्य से अध्ययनों में यकृत के आकार का परिमाणीकरण महत्वपूर्ण है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल लार्वा जेब्राफिश में जिगर के आकार की मात्रा के लिए अपेक्षाकृत त्वरित, आसान और सस्ती तकनीक है। प्रोटोकॉल के कुछ पहलुओं का प्रदर्शन करते समय उचित सावधानी बरतना परिणामों की बढ़ती सटीकता में सहायता कर सकता है और हताशा में कमी आ सकती है।

लार्वा का उचित निर्धारण अच्छी तरह से संरक्षित जैविक नमूने प्राप्त करने और उनके विघटन को रोकने की दिशा में महत्वपूर्ण है। 4% पीएफए समाधान का कमजोर पड़ना तब हो सकता है जब पीबीएस को कुल्ला लार्वा में पीएफए के अलावा करने से पहले पूरी तरह से नहीं हटाया जाता है। अच्छी तरह से बनाया पीएफए समाधान का उपयोग करना और पीएफए अतिरिक्त से पहले सभी या अधिकांश पीबीएस समाधान को बाहर निकालना इस मुद्दे को हल करने में सहायक है।

हालांकि बहुत अभ्यास के बाद तेजी से और आसान प्रदर्शन करने के लिए, विच्छेदन तकनीक पर्याप्त मैनुअल निपुणता की आवश्यकता है । विच्छेदन करते समय, त्वचा और जर्दी को पूरी तरह से जिगर के ऊपर से हटाना महत्वपूर्ण है ताकि पूरे जिगर का संपर्क हो जाए। ऐसा करने में विफलता छवियों में परिणाम कर सकते हैं जहां जिगर की सीमा का दृश्य अस्पष्ट है(चित्र ा 2ए, बी)। विच्छेदन करते समय अकुशल और सशक्त आंदोलनों जिगर के कुछ हिस्सों(चित्रा 2सी)या जिगर अनुलग्नकों के ढीला करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, जिगर विस्थापित किया जा रहा है(चित्रा 2डी)या पूरी तरह से लापता(चित्रा 2ई)। उपयोगकर्ताओं को प्रयोगात्मक नमूनों पर जाने से पहले अभ्यास नमूनों पर अपने विच्छेदन कौशल को सम्मानित करने की दिशा में पर्याप्त संख्या में घंटे लगाने चाहिए ।

बढ़ते के दौरान, जिगर के ऊपर त्वचा को हटा दिया गया है, बाद के चरणों के दौरान जिगर के बाहर गिरने की संभावना बढ़ रही है। इस संभावना से बचने के लिए, इस प्रक्रिया के दौरान कोमल पाइपिंग आंदोलनों को नियोजित किया जाना चाहिए।

ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप का उपयोग करछवि खरीद के दौरान, यह महत्वपूर्ण है कि अच्छी गुणवत्ता वाली छवियां ली जाएं। धुंधला, बाहर के ध्यान छवियों यह मुश्किल जिगर की सही सीमा का आकलन करने के लिए कर देगा(चित्र 2एफ)। चूंकि इस विधि में यकृत के बाएं पालि की सतह क्षेत्र को मापना शामिल है, इसलिए यह महत्वपूर्ण है कि लार्वा अच्छी तरह से अपनी तरफ उन्मुख हो और झुका हुआ न हो(चित्रा 2जी)। सुनिश्चित करें कि लार्वा की दोनों आंखें गठबंधन हैं (एक आंख दूसरे के दृश्य को कवर कर रही है)। छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग करसतह क्षेत्र को मापने के दौरान, यकृत की वास्तविक रूपरेखा के जितना संभव हो उतना सीमा खींचना महत्वपूर्ण है ताकि माप विसंगतियों से बचा जा सके। किसी भी छवियों को बाहर करें जहां यकृत को सही ढंग से मापा नहीं जा सकता है(चित्रा 2ए-जी)। हालांकि, ध्यान रखें कि यकृत को छोड़कर डेटा तिरछा कर सकते हैं, क्योंकि बड़े यकृत छोटे यकृत की तुलना में बाधित होने की संभावना अधिक होती है।

इस प्रोटोकॉल की सीमाओं में से एक यह है कि यह केवल निश्चित लार्वा पर लागू होता है। फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी जैसे वैकल्पिक तरीकों का उपयोग जीवित लार्वा में यकृत के आकार को मापने के लिए किया जा सकता है जो हेपेटोसाइट-विशिष्ट फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स5,7,10को व्यक्त करते हैं। ये वैकल्पिक तरीके अनुक्रमिक माप को एक ही जानवर पर बनाए जाने में सक्षम होते हैं, और वे भी जल्दी होते हैं, क्योंकि उन्हें यकृत ऊतकों के निर्धारण या विच्छेदन की आवश्यकता नहीं होती है। जीवित जानवरों में फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी की तुलना में इस प्रोटोकॉल के फायदे हैं: 1) जब यकृत मापा जाता है तो इस संबंध में अधिक लचीलापन, क्योंकि ज़ेब्राफ़िश को फोटो खिंचवाने से पहले हफ्तों या महीनों तक फिक्सिव में रखा जा सकता है; 2) फ्लोरोसेंट रिपोर्टर को शामिल करने के लिए कोई आवश्यकता नहीं है, जो होमोज़िगौस म्यूटेंट से निपटने के दौरान बोझिल हो सकता है; और 3) इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला या सीटू संकरण अध्ययनों सहित अन्य प्रयोगों के लिए चरण 1 और 2 की प्रयोज्यता। हम विशेष अनुप्रयोग के आधार पर दोनों तरीकों का उपयोग करते हैं। उदाहरण के लिए, हम आम तौर पर उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग3के लिए लाइव इमेजिंग और हेपेटोसाइट-विशिष्ट रिपोर्टर्स का उपयोग करते हैं, और यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके संभावित हिट यौगिकों पर अनुवर्ती प्रदर्शनकरतेहैं 3।

यह प्रोटोकॉल जिगर के आकार की मात्रा के लिए केवल सतह क्षेत्र लेता है, इसलिए यह सेल चयापचय या आकृति विज्ञान में परिवर्तन का पता नहीं लगाता है, न ही यह सेल संख्या में वृद्धि और कोशिका आकार में वृद्धि के बीच अंतर करता है। इस सीमा को संबोधित करने के लिए, स्टीटोसिस16,हिस्टोलॉजी6,सेल नंबर8,11,सेल आकार3,17,प्रसार3,18,और/या एपोप्टोसिस19 का आकलन करने के लिए पूरक परखों का प्रदर्शन किया जा सकता है ।

इस प्रोटोकॉल की एक और सीमा यह है कि यह मानता है कि बाएं जिगर पालि के सतह क्षेत्र में वृद्धि या कमी सतह क्षेत्र में परिवर्तन और पूरे यकृत के रूप में जिगर की मात्रा को प्रतिबिंबित करती है। यह धारणा तब लागू नहीं हो सकती है जब जिगर का विकास गैर-समान है। जिगर के आकार की जांच करने और जिगर के विकास में गैर सममित वृद्धि के लिए जांच करने के लिए, हम नियमित रूप से प्रकाश शीट फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी8 या हमारे ट्रांसजेनिक मॉडल पर माइक्रोस्कोपी3 confocal करते हैं । लाइट शीट फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग लार्वा यकृत की मात्रा8को सीधे निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। ट्रांसजेनिक जेब्राफिश में हेपेटोसाइट-विशिष्ट Yap1 व्यक्त, जिगर क्षेत्र और जिगर की मात्रा इसी तरह गैर ट्रांसजेनिक नियंत्रण भाई बहन8की तुलना में वृद्धि हुई थी ।

यहां वर्णित विच्छेदन तकनीक को प्रतिरक्षण धुंधला, सेल-विशिष्ट फ्लोरोसेंट रिपोर्टर लाइनों, और/या अन्य लेबलिंग तकनीकों के साथ जोड़ा जा सकता है ताकि जिगर के आकार3,19,20के अलावा जिगर के विकास के अन्य पहलुओं का अध्ययन किया जा सके । चूंकि यह विच्छेदन प्रोटोकॉल आंत और अग्न्याशय को भी उजागर करता है, इसलिए यह अन्य आंत के अंगों के अध्ययन के लिए भी मददगार हो सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम इस शोध के कुछ हिस्सों को पूरा करने के लिए जेब्राफिश पशुपालन, प्रयोगशाला अंतरिक्ष और उपकरण प्रदान करने के लिए यूटा विश्वविद्यालय में मूत्र हाब्स और केंद्रीकृत जेब्राफिश पशु संसाधन (CZAR) को स्वीकार करना चाहते हैं। जार का विस्तार एनआईएच ग्रांट # 1G20OD018369-01 द्वारा भाग में समर्थित है। हम रॉडने स्टीवर्ट, च्लोए लिम, लांस ग्राहम, कोड़ी जेम्स, गैरेट निकम और जेब्राफिश केयर के लिए व्याध कैंसर संस्थान (एचसीआई) जेब्राफिश सुविधा का भी शुक्रिया अदा करना चाहेंगे । हम आर प्रोग्रामिंग के साथ मदद के लिए केनेथ Kompass शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । इस काम को व्याध कैंसर फाउंडेशन से अनुदान द्वारा भाग में वित्त पोषित किया गया था (अनुदान P30 CA042014 के साथ संयोजन के रूप में व्याध कैंसर संस्थान) (KJE) और NIH/NCI R01CA222570 (KJE) को संमानित किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Camera for dissecting microscope Leica, for example
Dissecting microscope Leica, for example
Fine (Dumont #5) forceps Fine Science Tools 11254-20
Glass pipets VWR 14672-608
Image analysis software Image J/FIJI ImageJ/FIJI can be dowloaded for free: https://imagej.net/Welcome
Methyl cellulose Sigma M0387
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148
Phosphate-buffered saline Various suppliers
Pipette pump VWR 53502-233
Plastic Petri dishes USA Scientific Inc 2906
Pyrex 9-well round-bottom glass dish VWR 89090-482
Software for blinding files R project R can be downloaded for free: https://www.r-project.org/
Scientific graphing and statistics software GraphPad Prism
Spreadsheet program Microsoft Excel
Tricaine methanesulfonate (Tricaine-S) Western Chemical 200-226
Very fine (Dumont #55) forceps Fine Science Tools 11255-20

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lin, D. -C., et al. Genomic and Epigenomic Heterogeneity of Hepatocellular Carcinoma. Cancer Research. 77 (9), 2255-2265 (2017).
  2. Ghouri, Y. A., Mian, I., Rowe, J. H. Review of hepatocellular carcinoma: Epidemiology, etiology, and carcinogenesis. Journal of Carcinogenesis. 16, 1 (2017).
  3. Evason, K. J., et al. Identification of Chemical Inhibitors of β-Catenin-Driven Liver Tumorigenesis in Zebrafish. PLoS Genetics. 11 (7), 1005305 (2015).
  4. Kalasekar, S. M., et al. Heterogeneous beta-catenin activation is sufficient to cause hepatocellular carcinoma in zebrafish. Biology Open. 8 (10), (2019).
  5. Nguyen, A. T., et al. A high level of liver-specific expression of oncogenic Kras(V12) drives robust liver tumorigenesis in transgenic zebrafish. Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 801-813 (2011).
  6. Nguyen, A. T., et al. An inducible kras(V12) transgenic zebrafish model for liver tumorigenesis and chemical drug screening. Disease Models & Mechanisms. 5 (1), 63-72 (2012).
  7. Li, Z., et al. A transgenic zebrafish liver tumor model with inducible Myc expression reveals conserved Myc signatures with mammalian liver tumors. Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 414-423 (2013).
  8. Cox, A. G., et al. Yap reprograms glutamine metabolism to increase nucleotide biosynthesis and enable liver growth. Nature Cell Biology. 18 (8), 886-896 (2016).
  9. Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease. Development. 132 (15), Cambridge, England. 3561-3572 (2005).
  10. Huang, X., Zhou, L., Gong, Z. Liver tumor models in transgenic zebrafish: an alternative in vivo approach to study hepatocarcinogenes. Future Oncology. 8 (1), London, England. 21-28 (2012).
  11. Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. Tumor-Associated Neutrophils and Macrophages Promote Gender Disparity in Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish. Cancer Research. 77 (6), 1395-1407 (2017).
  12. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  13. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
  14. Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2012).
  15. Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
  16. Dai, W., et al. High fat plus high cholesterol diet lead to hepatic steatosis in zebrafish larvae: a novel model for screening anti-hepatic steatosis drugs. Nutrition & Metabolism. 12, 42 (2015).
  17. Kim, S. -H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin. Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 255-267 (2011).
  18. Delous, M., et al. Sox9b is a key regulator of pancreaticobiliary ductal system development. PLoS Genetics. 8 (6), 1002754 (2012).
  19. Shin, D., Lee, Y., Poss, K. D., Stainier, D. Y. R. Restriction of hepatic competence by Fgf signaling. Development. 138 (7), Cambridge, England. 1339-1348 (2011).
  20. Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. R. The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. 56 (5), Baltimore, Md. 1958-1970 (2012).

Tags

विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 156 जेब्राफिश लार्वा विच्छेदन यकृत आकार लार्वा विश्लेषण इमेजिंग
ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी का उपयोग करलारल जेब्राफिश में जिगर का आकार मात्रा
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kotiyal, S., Fulbright, A., O'Brien, More

Kotiyal, S., Fulbright, A., O'Brien, L. K., Evason, K. J. Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy. J. Vis. Exp. (156), e60744, doi:10.3791/60744 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter