Summary
Qui dimostriamo un metodo per quantificare le dimensioni del fegato nel pesce zebra larvale, fornendo un modo per valutare gli effetti delle manipolazioni genetiche e farmacologiche sulla crescita e lo sviluppo del fegato.
Abstract
In diversi modelli transgenici di pesce zebra del carcinoma epatocellulare (HCC), l'epatomegalia può essere osservata durante le fasi precoci della larva. Quantificare le dimensioni del fegato larvale nei modelli HCC del pesce zebra fornisce un mezzo per valutare rapidamente gli effetti dei farmaci e di altre manipolazioni su un fenotipo relativo all'oncogene. Qui mostriamo come riparare le larve di pesce zebra, sezionare i tessuti che circondano il fegato, fotografare i fegati usando la microscopia a campo luminoso, misurare l'area del fegato e analizzare i risultati. Questo protocollo consente una quantificazione rapida e precisa delle dimensioni del fegato. Poiché questo metodo comporta la misurazione dell'area del fegato, può sottovalutare le differenze nel volume del fegato e sono necessarie metodologie complementari per distinguere tra i cambiamenti nelle dimensioni delle cellule e i cambiamenti nel numero di cellule. La tecnica di dissezione qui descritta è un ottimo strumento per visualizzare il fegato, l'intestino e il pancreas nelle loro posizioni naturali per una miriade di applicazioni a valle, tra cui la colorazione immunofluorescenza e l'ibridazione in situ. La strategia descritta per la quantificazione delle dimensioni del fegato larvale è applicabile a molti aspetti dello sviluppo e della rigenerazione epatica.
Introduction
Il carcinoma epatocellulare (HCC) è la malignità primaria più comune del fegato1 e la terza causa principale di mortalità correlata al cancro2. Per comprendere meglio i meccanismi dell'epatocarcinogenesi e identificare potenziali terapie HCC, noi e altri abbiamo sviluppato pesci zebra transgenici in cui l'espressione specifica dell'epatocite di oncogeni come3,4, Kras (V12)5,6, Myc7o Yap18 porta all'HCC negli animali adulti. In questi pesci zebra, l'allargamento del fegato è notato già 6 giorni dopo la fecondazione (dpf), fornendo una piattaforma facile per testare gli effetti dei farmaci e alterazioni genetiche sulla crescita eccessiva del fegato guidato dall'oncogene. Una misurazione accurata e precisa delle dimensioni del fegato larvale è essenziale per determinare gli effetti di queste manipolazioni.
Le dimensioni e la forma del fegato possono essere valutate in modo semi-quantitativo nelle larve fisse di pesce zebra da CY3-SA etichettatura9 o in larve di pesce zebra dal vivo utilizzando giornalisti fluorescenti epatociti specifici e microscopia sesicazione fluorescenza5,6. Quest'ultimo metodo è relativamente veloce, e la sua mancanza di precisione può essere affrontata fotografando e misurando l'area di ogni fegato utilizzando il software di elaborazione delle immagini7,10. Tuttavia, può essere tecnicamente difficile posizionare uniformemente tutte le larve vive in un esperimento tale che l'area epatica bidimensionale è una rappresentazione accurata delle dimensioni del fegato. Una tecnica simile per la quantificazione delle dimensioni del fegato prevede l'utilizzo della microscopia a fluorescenza leggera per quantificare il volume epatico larvale8, che può essere più accurata per rilevare le differenze di dimensioni quando il fegato viene espanso in modo non uniforme in diverse dimensioni. Lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) può essere utilizzato per contare il numero di epatociti fluorescenti e altri tipi di cellule epatiche nei fegati larve8,11. In questo metodo, i fegati larghi sono raggruppati e dissociati, quindi le informazioni sulle dimensioni e la forma del singolo fegato vengono perse. In combinazione con un altro metodo di determinazione delle dimensioni del fegato, FACS consente la differenziazione tra aumento del numero di cellule (iperplasia) e aumento delle dimensioni della cellula (ipertrofia). Tutti questi metodi impiegano una costosa tecnologia a fluorescenza (microscopio o selezionatrice cellulare) e, fatta eccezione per l'etichettatura CY3-SA, richiedono l'etichettatura degli epatociti con un reporter fluorescente.
Qui descriviamo in dettaglio un metodo per quantificare l'area del fegato larvale del pesce zebra utilizzando la microscopia a campo luminoso e il software di elaborazione delle immagini3,12,13,14. Questo protocollo consente una quantificazione precisa dell'area dei singoli fegati in situ senza l'uso della microscopia a fluorescenza. Durante l'analisi delle dimensioni del fegato, accechiamo l'identità dell'immagine per ridurre la distorsione degli sperimentatori e migliorare il rigore scientifico15.
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Protocol
Gli studi sugli animali sono effettuati seguendo le procedure approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università dello Utah.
1. Fissaggio larve
- A 3-7 giorni dopo la fecondazione (dpf), le larve di eutanasia con metanotrico tricaino (0,03%) e raccogliere fino a 15 larve in un tubo da 2 mL utilizzando una pipetta di vetro e una pompa pipetta.
- Lavare le larve due volte con 1 mL di freddo (4 gradi centigradi) 1x salina tampone di fosfato (PBS) sul ghiaccio. Per ogni lavaggio, rimuovere il più liquido possibile dal tubo con una pipetta di vetro e una pompa pipetta, quindi aggiungere 1 mL di PBS freddo al tubo.
- Rimuovere il più possibile PBS utilizzando una pipetta di vetro e una pompa pipetta, e aggiungere 1 mL di freddo (4 C) 4% paraformaldeide (PFA) in PBS.
AVVISO: il PFA è un cancerogeno irritante e sospetto. I guanti devono essere indossati durante la movimentazione di PFA e le soluzioni concentrate devono essere maneggiate in una cappa di fumi chimici. - Incubare a 4 gradi centigradi almeno durante la notte (ma fino a diversi mesi) con dondolo delicato.
2. Dissezionare i tessuti che circondano il fegato
- Rimuovere le larve dal PFA risciacquando 3x con 1 mL di PBS freddo (4 gradi centigradi) e dondolando per 5 min tra i risciacqui.
NOTA: È bene mantenere le larve sciacquate in PBS per un giorno o due a 4 gradi centigradi. - Pipette diverse larve in PBS in un pozzo di una teglia di vetro a fondo rotondo 9 pozzetto.
- Rimuovere la pelle che circonda il fegato.
- Utilizzare pinze sottili per trattenere la larva sulla schiena (pancia in su), afferrando su entrambi i lati della testa il più delicatamente possibile. Quindi utilizzare pinze molto sottili nell'altra mano per afferrare la pelle appena sopra il cuore.
- Tirare la pelle in diagonale verso la coda del pesce e il fondo del piatto sul lato sinistro o destro del pesce. Ripetere l'operazione per l'altro lato (destro o sinistro).
- Continuare a afferrare lembi di pelle e tirare verso il basso / indietro fino a quando tutta la pelle e melanofori sovrastanti o vicino al fegato sono stati rimossi.
- Rimuovere il tuorlo, se presente.
- Per 5-6 larve dpf, sollevare il tuorlo in un unico pezzo tenendo il pesce con pinze sottili sulla schiena e utilizzando le pinze molto sottili per spingere delicatamente il tuorlo.
- Per 3-4 larve dpf, raschiare il tuorlo a pezzi. Tenere il pesce con pinze sottili sulla schiena e utilizzare le pinze molto sottili per accarezzare il tuorlo, a partire dal lato ventrale.
- Mettere le larve sezionate in PBS freddo fresco utilizzando una pipetta di vetro e una pompa pipetta.
3. Imaging
- Per montare le larve, versare qualche mL di cellulosa metilica del 3% sul coperchio di un piatto di Petri di plastica pulita.
- Utilizzare una pipetta di vetro e una pompa pipetta per aggiungere larve alla cellulosa metile, aggiungendo il minor numero possibile di PBS alle larve.
- Sotto un microscopio sezionato a bassa ingrandimento, utilizzare pinze sottili per orientare i pesci in modo che siano posati sul loro lato destro, rivolto a sinistra.
NOTA: Assicurarsi che i pesci siano perfettamente orientati su un fianco o che le misurazioni del fegato non siano accurate. - Scatta una foto di ogni pesce.
- Verificare che il pesce da fotografare sia perfettamente allineato, con un occhio direttamente sopra l'altro occhio. Se necessario, utilizzare pinze sottili per toccare leggermente sulla testa o sulla coda dei pesci per regolare l'orientamento. Se la coda del pesce è piegata, rimuovere la coda pizzicandola con forza con pinze per rimuoverla in modo che il pesce si stende piatta.
- Ingrandire l'ingrandimento elevato e concentrarsi sul fegato, facendo in modo che il contorno del fegato è chiaramente visibile.
- Scattare una foto e salvare il file.
- Ripetere l'operazione per tutti i pesci, assicurandosi che l'ingrandimento sia lo stesso per ogni immagine.
- Scattare una foto di un micrometro utilizzando lo stesso ingrandimento (vedere Figura 2H).
4. Analisi dell'immagine
- Misurare l'area del fegato di ogni pesce utilizzando il software di elaborazione delle immagini.
- Cieco tutte le immagini di fegato per evitare potenziali pregiudizi investigatori e promuovere il rigore scientifico15. Questo passaggio può essere eseguito manualmente da un altro membro del laboratorio o utilizzando un programma per computer (Supplementary Material). Rinominare i file in modo casuale e creare un "file di randomizzazione" contenente un elenco dei nomi di file originali e corrispondenti nomi di file accecati.
- Aprire i file randomizzati in ordine, a partire dal file 1.
- Scegliere lo strumento selezioni a mano libera e delineare ogni fegato.
- Premere Ctrl-M per misurare l'area di ogni fegato.
- Per tutti i fegati che non possono essere misurati con precisione, inserire una misura segnaposto (molto piccola o molto grande, quindi può essere facilmente esclusa in seguito).
- Salvare le misure in un file di testo ("file di misurazioni").
- Un-blind e analizzare i dati
- Aprire "file di misurazione" e "file di randomizzazione" in un foglio di calcolo.
- Inserire una nuova colonna nel "file di misurazione" e aggiungere i nomi dei file originali per i file accecati, utilizzando il "file di randomizzazione". Salvare il file come "file di misure non cieche".
- Ordinare i dati in base al nome file originale.
- Assicurarsi di escludere eventuali misurazioni epatiche per le quali le immagini erano inadeguate (vedere figura 2A–G).
- Se necessario, convertire i valori di misurazione nella scala desiderata (mm2, ad esempio).
- Aprire la barra della scala nel software di elaborazione delle immagini.
- Utilizzare lo strumento linea retta per misurare 1 mm sulla barra della scala. Il software di elaborazione delle immagini misurerà nelle stesse unità dei fegati (pixel), dando un fattore di conversione.
- Utilizzare il fattore di conversione per convertire le misurazioni nel "file di misure non cieche".
- Utilizzando il programma per fogli di calcolo o incollando i dati in un software scientifico di grafici e statistiche, determinare la media e la deviazione standard e calcolare i valori p.
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Representative Results
Pesci zebra transgenici che esprimono l'epatocite specifico attivato a z-catenina(Tg(fabp10a:pt-z-cat) pesce zebra)3 e i fratelli di controllo non transgenici sono stati eutanasiati a 6 dpf e l'area del fegato è stata quantificata utilizzando un software di microscopia e elaborazione delle immagini a campo luminoso. I pesci zebra transgenici hanno aumentato significativamente le dimensioni del fegato (0,0006 cm2) rispetto ai loro fratelli non transgenici (0,0004 cm2, p < 0.0001; Figura 1).
Figura 1: Analisi delle dimensioni del fegato di 6 dpf (giorni dopo la fecondazione) pesce zebra. (A-B) Rappresentante immagine campo luminoso di 6 dpf larva di pesce zebra non transgenica, che mostra la posizione naturale e la forma del fegato sovrastante l'intestino. L'area del fegato è stata delineata in (B). Barre di scala - 0,1 mm. (C-D) Rappresentante immagine campo luminoso di 6 larve di pesce zebra transgenici dpf che esprimono b-catenina (ABC) specifica dell'epatocite che esprime il fegato di epatocite (ABC), mostrando il fegato ingrandito. L'area del fegato è stata delineata in (D). Grafico di 0,1 mm((E)che mostra le misure delle dimensioni del fegato (media e deviazione standard) di 6 larve di pesce zebra non transgeniche (non-Tg) e le larve di pesce zebra transgeniche che esprimono le larve di b-catenina attivate specifiche per l'epatocite (ABC). I campioni sono stati confrontati utilizzando t test non accoppiato. p < 0.0001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Esempi di immagini e micrometro inadeguati. (A-G) Immagini rappresentative di fegati larve che dovrebbero essere esclusi dall'analisi. Barre di scala - 0,1 mm.(A)Larva con pelle che copre il fegato. (B) Larva con tuorlo che oscura il fegato. (C) Larva con parti del fegato pizzicate via. (D) Larva con fegato lussato e caduta. (E) Larva con fegato mancante. (F) Larva con contorno epatico che è difficile da identificare perché l'immagine è sfocata / fuori fuoco. (G) Larva con posizionamento improprio. I due occhi non sono allineati direttamente l'uno sopra l'altro. (H) Immagine del micrometro, utilizzato per generare barre di scala e convertire le misurazioni del software di elaborazione delle immagini da pixel a cm2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Quantificazione della dimensione del fegato è cruciale negli studi volti a comprendere lo sviluppo del fegato, rigenerazione, e oncogenesi. Il protocollo qui descritto è una tecnica relativamente rapida, facile ed economica per la quantificazione delle dimensioni del fegato nel pesce zebra larvale. L'esercizio di un'adeguata cautela durante l'esecuzione di determinati aspetti del protocollo può aiutare a migliorare la precisione dei risultati e a ridurre la frustrazione.
Una corretta fissazione delle larve è fondamentale per ottenere campioni biologici ben conservati e prevenirne la disintegrazione. La diluizione della soluzione PFA del 4% può verificarsi quando il PBS non viene rimosso completamente prima dell'aggiunta di PFA alle larve sciacquate. L'utilizzo di soluzioni PFA ben fatte e il pipettaggio di tutta o la maggior parte della soluzione PBS prima dell'aggiunta di PFA è utile per risolvere questo problema.
Anche se veloce e facile da eseguire dopo molta pratica, la tecnica di dissezione richiede sostanziale destrezza manuale. Durante la dissezione, è fondamentale rimuovere completamente la pelle e il tuorlo dall'alto del fegato in modo che l'intero fegato sia esposto. In caso contrario, la vista del contorno del fegato è oscurata (Figura 2A,B). Movimenti non qualificati e forzati durante la dissezione possono portare a pizzicare fuori di parti del fegato (Figura 2C) o allentare gli attacchi del fegato, con conseguente spostamento del fegato (Figura 2D) o mancanza del tutto (Figura 2E). Gli utenti dovrebbero mettere in un numero adeguato di ore per affinare le loro abilità di sezionamento su campioni di pratica prima di passare a campioni sperimentali.
Durante il montaggio, la pelle sopra il fegato è stata rimossa, aumentando la probabilità che il fegato cada durante i passaggi successivi. Per evitare tale possibilità, durante questo processo dovrebbero essere impiegati movimenti di pipettaggio delicati.
Durante l'approvvigionamento delle immagini al microscopio a campo luminoso, è fondamentale che vengano scattate immagini di buona qualità. Immagini sfocate e sfocate non focalizzate renderanno difficile valutare il vero confine del fegato (Figura 2F). Poiché questo metodo comporta la misurazione della superficie del lobo sinistro del fegato, è fondamentale che la larva sia orientata bene su un lato e non inclinata (Figura 2G). Assicurarsi che entrambi gli occhi della larva siano allineati (un occhio che copre la vista dell'altro). Durante la misurazione della superficie utilizzando un software di elaborazione delle immagini, è importante disegnare il contorno il più vicino possibile al contorno reale del fegato in modo da evitare discrepanze di misurazione. Escludere tutte le immagini in cui il fegato non può essere misurato con precisione (Figura 2A–G). Tuttavia, tenere a mente che l'esclusione di fegati può inclinare i dati, come fegati più grandi sono più probabilità di essere interrotto rispetto ai fegati più piccoli.
Uno dei limiti di questo protocollo è che si applica solo alle larve fisse. Metodi alternativi come la microscopia a fluorescenza possono essere utilizzati per misurare le dimensioni del fegato nelle larve vive che esprimono i giornalisti fluorescenti specifici per l'epatocite5,7,10. Questi metodi alternativi consentono di effettuare misurazioni sequenziali sullo stesso animale, e sono anche più veloci, poiché non richiedono fissazione o dissezione dei tessuti che sovrasmettono il fegato. I vantaggi di questo protocollo rispetto alla microscopia a fluorescenza negli animali vivi sono: 1) maggiore flessibilità rispetto a quando si misurano i fegati, poiché il pesce zebra può essere mantenuto in fissativo per settimane o mesi prima di fotografarli; 2) nessun obbligo di incorporare un reporter fluorescente, che può essere ingombrante quando si tratta di mutanti omozionali; e 3) l'applicabilità dei passaggi 1 e 2 per altri esperimenti, compresi gli studi di colorazione immunofluorescenza o di ibridazione in situ. Utilizziamo entrambi i metodi, a seconda dell'applicazione specifica. Ad esempio, in genere utilizziamo l'imaging dal vivo e i reporter specifici degli epatociti per lo screening ad alta velocità3e il follow-up sui potenziali composti colpiti utilizzando il protocollo descritto qui3.
Questo protocollo prende in considerazione solo la superficie per la quantificazione delle dimensioni del fegato, quindi non rileva cambiamenti nel metabolismo cellulare o morfologia, né distingue tra aumenti nel numero di cellule e aumenti nella dimensione delle cellule. Per affrontare questa limitazione, possono essere eseguiti saggi complementari per valutare la steatosi16, l'istologia6,il numero di celle8,11, la dimensione della cella3,17, la proliferazione3,18e/o l'apoptosi19.
Un'altra limitazione di questo protocollo è che assume che aumenta o diminuisce nella superficie del lobo epatico sinistro riflettono i cambiamenti nella superficie e volume del fegato nel suo complesso. Questa ipotesi potrebbe non applicarsi quando la crescita del fegato non è uniforme. Per esaminare la forma del fegato e verificare la presenza di aumenti non simmetrici nella crescita del fegato, facciamo regolarmente microscopia a fluorescenza del foglio di luce8 o microscopia confocale3 sui nostri modelli transgenici. La microscopia a fluorescenza a foglio di luce può essere utilizzata per quantificare direttamente il volume del fegato larvale8. Nel pesce zebra transgenico che esprime Yap1 specifico per l'epatocite, l'area epatica e il volume del fegato sono stati aumentati in modo analogo rispetto ai fratelli di controllo non transgenici8.
La tecnica di dissezione qui descritta può essere combinata con l'immunofluorescenza, le linee di reporter fluorescenti specifiche per le cellule e/o altre tecniche di etichettatura per studiare altri aspetti dello sviluppo epatico oltre alla dimensione del fegato3,19,20. Poiché questo protocollo di dissezione espone anche l'intestino e il pancreas, può essere utile anche per gli studi di altri organi viscerali.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo riconoscere Maurine Hobbs e la Centralit zebrefish Animal Resource dell'Università dello Utah per aver fornito allevamento di pesci zebra, spazi di laboratorio e attrezzature per svolgere porzioni di questa ricerca. L'espansione del cSAR è supportata in parte dalla sovvenzione NIH - 1G20OD018369-01. Ringraziamo anche Rodney Stewart, Chloe Lim, Lance Graham, Cody James, Garrett Nickum e il Huntsman Cancer Institute (HCI) zebrefish Facility per la cura del pesce zebra. Vorremmo ringraziare Kenneth Kompass per l'aiuto con la programmazione R. Questo lavoro è stato finanziato in parte dalle sovvenzioni della Huntsman Cancer Foundation (in collaborazione con la sovvenzione P30 CA042014 assegnata al Huntsman Cancer Institute) (KJE) e NIH/NCI R01CA222570 (KJE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Camera for dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Fine (Dumont #5) forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Glass pipets | VWR | 14672-608 | |
| Image analysis software | Image J/FIJI | ImageJ/FIJI can be dowloaded for free: https://imagej.net/Welcome | |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phosphate-buffered saline | Various suppliers | ||
| Pipette pump | VWR | 53502-233 | |
| Plastic Petri dishes | USA Scientific Inc | 2906 | |
| Pyrex 9-well round-bottom glass dish | VWR | 89090-482 | |
| Software for blinding files | R project | R can be downloaded for free: https://www.r-project.org/ | |
| Scientific graphing and statistics software | GraphPad Prism | ||
| Spreadsheet program | Microsoft Excel | ||
| Tricaine methanesulfonate (Tricaine-S) | Western Chemical | 200-226 | |
| Very fine (Dumont #55) forceps | Fine Science Tools | 11255-20 |
References
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