Summary
ここでは、幼虫ゼブラフィッシュの肝臓サイズを定量化する方法を実証し、肝臓の成長と発達に対する遺伝的および薬理学的操作の効果を評価する方法を提供する。
Abstract
肝細胞癌(HCC)のいくつかのトランスジェニックゼブラフィッシュモデルでは、肝腫は幼虫初期段階で観察することができる。ゼブラフィッシュHCCモデルにおける幼虫の肝臓のサイズを定量化することは、腫瘍遺伝子関連の表現型に対する薬物および他の操作の影響を迅速に評価する手段を提供する。ここでは、ゼブラフィッシュの幼虫を固定し、肝臓を取り巻く組織を解剖し、明視野顕微鏡を用いて肝臓を撮影し、肝臓面積を測定し、結果を分析する方法を示します。このプロトコルは、肝臓のサイズの迅速かつ正確な定量化を可能にします。この方法は、肝領域を測定することを含む, それは肝臓の体積の違いを過小評価可能性があります, そして、補完的な方法論は、細胞のサイズの変化と細胞数の変化を区別するために必要とされます.本明細書に記載される解剖技術は、免疫蛍光染色およびin situハイブリダイゼーションを含む無数の下流アプリケーションのための自然な位置で肝臓、腸、膵臓を視覚化するための優れたツールです。幼虫の肝臓のサイズを定量化するための説明された戦略は、肝臓の発達と再生の多くの側面に適用可能です。
Introduction
肝細胞癌(HCC)は、肝臓1の最も一般的な原発性悪性腫瘍であり、癌関連死亡率2の第3の主要な原因である。肝癌のメカニズムを理解し、潜在的なHCC治療薬を同定するために、我々および他の人々は、β-カテニン3、4、Kras(V12)5、6、Myc7、またはYap18のような腫瘍遺伝子の肝細胞特異的発現が成人動物のHCCにつながるトランスジェニックゼブラフィッシュを開発しました。これらのゼブラフィッシュでは、肝臓の拡大は受精後6日(dpf)に早くも注目され、腫瘍遺伝子駆動の肝臓過剰増殖に対する薬物および遺伝的変化の効果をテストするためのファシリティプラットフォームを提供する。幼虫の肝臓のサイズの正確かつ正確な測定は、これらの操作の効果を決定するために不可欠です。
肝臓の大きさと形状は、CY3-SA標識9または肝細胞特異的蛍光レポーターおよび蛍光分光顕微鏡顕微鏡法を用いた生きたゼブラフィッシュ幼虫で固定ゼブラフィッシュ幼虫で半定量的に評価することができる5,6。後者の方法は比較的速く、その精度の欠如は、画像処理ソフトウェア7、10を使用して各肝臓の面積を撮影して測定することによって対処することができる。しかし、2次元の肝臓領域が肝臓の大きさを正確に表すような実験で、すべての生きた幼虫を均一に配置することは技術的に困難である可能性があります。肝臓のサイズを定量する同様の技術は、幼虫肝容積8を定量するために光シート蛍光顕微鏡を使用することを含むが、これは肝臓が異なる次元で不均一に拡大された場合のサイズの違いを検出するためのより正確であるかもしれない。蛍光活性化細胞選別(FACS)は、幼虫肝臓における蛍光標識肝細胞および他の肝細胞タイプの数を数えるために使用することができる8、11。この方法では、幼虫の肝臓がプールされ、解き分け、個々の肝臓のサイズと形状に関する情報が失われます。他の肝サイズ決定方法と組み合わせて、FACSは増加した細胞数(過形成)と増加した細胞サイズ(肥大)との間の分化を可能にする。これらの方法はすべて高価な蛍光技術(顕微鏡または細胞選別器)を採用し、CY3-SA標識を除いて、蛍光レポーターによる肝細胞の標識を必要とする。
ここでは、明視野顕微鏡および画像処理ソフトウェア3、12、13、14を用いてゼブラフィッシュ幼虫の肝臓領域を定量する方法について詳細に説明する。このプロトコルは、蛍光顕微鏡を使用せずに、その場で個々の肝臓の面積を正確に定量化することができます。肝臓のサイズを分析しながら、我々は、研究者の偏見を低減し、科学的な厳しさを向上させるために画像のアイデンティティを盲目に15.
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Protocol
動物研究は、ユタ大学の動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認された以下の手順を実施しています。
1. 幼虫の固定
- 受精後3~7日(dpf)で、幼虫をトリカインメタンスルホン酸で安楽死させる(0.03%)ガラスピペットとピペットポンプを使用して2 mLチューブに最大15個の幼虫を集めなさい。
- 幼虫を1mLの冷たい(4 °C)1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を氷上で2回洗浄する。洗浄ごとに、ガラスピペットとピペットポンプでチューブからできるだけ多くの液体を取り出し、冷たいPBSをチューブに1 mL加えます。
- ガラスピペットとピペットポンプを用いてできるだけ多くのPBSを取り出し、1 mLの低温(4°C)4%パラホルムアルデヒド(PFA)をPBSに加えます。
注意:PFAは刺激性であり、発がん性物質の疑いがあります。PFAを扱う際は手袋を着用し、濃縮溶液は化学ヒュームフードで取り扱う必要があります。 - 穏やかな揺れと4°Cで少なくとも一晩(しかし数ヶ月まで)インキュベートします。
2. 肝臓を取り巻く組織を解剖する
- 1 mLの冷たい(4 °C)PBSで3倍をすすい、リンスの間に5分間揺らすことでPFAから幼虫を取り除きます。
注:4°Cで1日か2日PBSですすい幼虫を保ちてもいいです。 - PBSのいくつかの幼虫を9ウェルの丸底ガラス皿の1つの井戸にピペット。
- 肝臓を取り巻く皮膚を取り除きます。
- 細かい鉗子を使って幼虫を背中に持ち(腹を上げ)、頭の両側をできるだけ穏やかにつかみます。その後、心臓の上に皮膚をつかむために、もう一方の手で非常に細かい鉗子を使用してください。
- 魚の尾に向かって斜めに皮を引き下げ、魚の左側または右側の皿の底に向かって、皮膚を斜めに引き下げます。反対側(右側または左側)に対して繰り返します。
- 皮膚のフラップをつかみ、肝臓の上または近くにあるすべての皮膚とメラノフォアが取り除かれるまで、引き下がったり後退したりします。
- もしあれば、黄身を取り除きます。
- 5~6dpf幼虫の場合は、魚を背中に細かい鉗子で持ち、非常に細かい鉗子を使って黄身を優しく突き出して黄身を一枚に持ち上げます。
- 3~4dpf幼虫の場合は、黄身を粉々に削り取ります。背中に細かい鉗子を持って魚を保持し、腹側から始めて黄身をなでるのに非常に細かい鉗子を使用します。
- ガラスピペットとピペットポンプを使用して、解剖された幼虫を新鮮な冷たいPBSに入れます。
3. イメージング
- 幼虫を取り付けるには、きれいなプラスチックペトリ皿の蓋に3%メチルセルロースのいくつかのmLを注ぎます。
- ガラスピペットとピペットポンプを使用して、メチルセルロースに幼虫を加え、幼虫をできるだけ少なくPBSを加えます。
- 低倍率の解剖顕微鏡の下で、彼らは左を向いて、彼らの右側に横たわっているように、魚の向きを細かい鉗子を使用します。
注:魚が彼らの側に完全に向かっていることを確認するか、肝臓の測定値が正確でない可能性があります。 - 各魚の写真を撮ります。
- 撮影する魚が、片方の目をもう一方の目の上に直接置いて、完全に整列していることを確認します。必要に応じて、魚の頭や尾を軽くタップして方向を調整するために細かい鉗子を使用してください。魚の尻尾が曲がった場合は、魚が平らに横たわるように取り除くために鉗子で強引につまんで尾を取り除きます。
- 高倍率にズームインし、肝臓に焦点を当て,肝臓の輪郭がはっきりと見えるようにします。
- 画像をスナップしてファイルを保存します。
- すべての魚について繰り返し、各画像の倍率が同じであることを確認します。
- 同じ倍率でマイクロメータの写真を撮ります(図2Hを参照)。
4. 画像解析
- 画像処理ソフトを使用して、各魚の肝臓の面積を測定します。
- 潜在的な研究者の偏見を回避し、科学的な厳しさ15を促進するために、すべての肝臓の写真を盲目にします。この手順は、他のラボ メンバによって手動で実行することも、コンピュータ プログラム (補足資料) を使用して実行することもできます。ファイルの名前をランダムに変更し、元のファイル名と対応するブラインドファイル名のリストを含む「ランダム化ファイル」を作成します。
- ランダム化されたファイルをファイル 1 から順番に開きます。
- フリーハンド選択ツールを選択し、各肝臓の輪郭を描きます。
- Ctrl+M を押して、各肝臓の面積を測定します。
- 正確に測定できない肝臓については、プレースホルダの測定値を挿入します (非常に小さいか、非常に大きいので、後で簡単に除外できます)。
- 測定値をテキストファイル(「測定ファイル」)に保存します。
- データの非ブラインドおよび分析
- スプレッドシートプログラムで「計測ファイル」と「ランダム化ファイル」を開きます。
- 「計測ファイル」に新しい列を挿入し、「ランダム化ファイル」を使用して、ブラインドファイルの元のファイル名を追加します。このファイルを「ブラインドなし測定ファイル」として保存します。
- データを元のファイル名で並べ替えます。
- 画像が不十分であった肝臓の測定値は必ず除外してください(図2A-Gを参照)。
- 必要に応じて、測定値を目的のスケール(mm2など)に変換します。
- 画像処理ソフトウェアでスケールバーを開きます。
- 直線ツールを使用して、スケールバー上で 1 mm を測定します。画像処理ソフトウェアは、変換係数を与え、肝臓(ピクセル)と同じ単位で測定します。
- 変換係数を使用して、「ブラインドなし測定ファイル」の測定値を変換します。
- スプレッドシートプログラムを使用するか、データを科学的なグラフ化および統計ソフトウェアに貼り付け、平均と標準偏差を決定し、p値を計算します。
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Representative Results
肝細胞特異的活性化βカテニン(Tg(fabp10a:pt-β-cat)ゼブラフィッシュ)3および非トランスジェニック対照兄弟を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュを6dpfで安楽死させ、肝臓領域を明熱域で明熱分析し、明視野顕微鏡および画像処理ソフトウェアを用いて肝臓領域を定量した。トランスジェニックゼブラフィッシュは、非トランスジェニック兄弟(0.0004 cm2、p<0.0001;0.0001;0.0001;0.0001;0.0001;0.0001;0.0001;0.0001;0.0001; 図 1を参照してください。
図1:ゼブラフィッシュの肝臓サイズ分析6dpf(受精後の日)(A-B)腸内に覆う肝臓の自然な位置と形状を示す6dpf非トランスジェニックゼブラフィッシュ幼虫の代表的な明視野画像。肝臓領域は、B で概説されています。スケールバー=0.1mm(C-D)肝細胞特異的活性化b-カテニン(ABC)を発現する6dpfトランスジェニックゼブラフィッシュ幼虫(ABC)の代表的な明視野画像は、肝臓の拡大を示す。肝臓領域は、 (D) で概説されています。スケールバー = 0.1 mm (E) 6 dpf非トランスフェクレンスゼブラフィッシュ幼虫(非Tg)およびトランスジェニックゼブラフィッシュ幼虫の肝臓サイズ測定値(平均±標準偏差)を示すグラフは、肝細胞特異的活性化b-カテニン(ABC)を発現する。サンプルは、非対のt検定を用いて比較した。p < 0.0001.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:不十分な画像とマイクロメータの例。(A-G)分析から除外されるべき幼虫の肝臓の代表的な画像。スケールバー = 0.1 mm(A) 肝臓を覆う皮膚を持つ幼虫。(B) 肝臓を隠す黄身を持つ幼虫。(C) 肝臓の一部を挟み込んだ幼虫。(D) 肝臓が脱臼して脱落した幼虫。(E) 肝臓が欠けている幼虫。(F) 画像がぼやけたり焦点が合っていないため、識別が困難な肝臓の輪郭を持つ幼虫。(G) 不適切な位置決めを伴う幼虫。2つの目は互いに直接整列していません。(H) マイクロメータの画像は、縮尺バーを生成し、画像処理ソフトウェアの測定値をピクセルからcm2に変換するために使用されます。
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Discussion
肝臓の発達、再生、および腫瘍形成を理解することを目的とした研究では、肝臓のサイズの定量化は重要です。ここで説明するプロトコルは、幼虫ゼブラフィッシュの肝臓サイズ定量のための比較的迅速かつ簡単で安価な技術です。プロトコルの特定の側面を実行しながら適切な注意を払うことは、結果の精度を高め、フラストレーションを減らすことに役立ちます。
幼虫の適切な固定は、よく保存された生物学的サンプルを取得し、その崩壊を防ぐために重要です。4%のPFA溶液の希釈は、PBSがリンス幼虫にPFAを添加する前に完全に除去されない場合に起こり得る。適切に作成された PFA ソリューションを使用し、PFA 追加前に PBS ソリューションのすべてまたは大部分をピペット化することは、この問題に対処するのに役立ちます。
速く、多くの練習の後に実行するのは簡単ですが、解剖技術は、かなりの手動の器用さを必要とします。解剖中、肝臓全体が露出するように、肝臓の上から皮膚と黄身を完全に取り除することが重要です。これを行わないと、肝臓の境界のビューが隠れた画像が生じることがあります (図 2A,B)。解剖中の未熟で力強い動きは、肝臓の一部をつまんだり(図2C)肝臓の付着物を緩めたり、肝臓が変位したり(図2D)、完全に欠落したりする可能性があります(図2E)。ユーザーは、実験サンプルに移る前に、練習サンプルで解剖スキルを磨くために十分な時間を置く必要があります。
取り付けの間、肝臓の上の皮膚は除去され、その後のステップ中に肝臓が脱落する確率が高まる。その可能性を避けるために、穏やかなピペッティングの動きをこのプロセスの間に採用するべきである。
ブライトフィールド顕微鏡を用いた画像調達では、良質な画像を撮影することが重要です。ぼやけた、焦点が合っていない画像は、肝臓の真の境界を評価することが困難になります (図 2F)。この方法は肝臓の左葉の表面積を測定することを含むので、幼虫がその側にうまく向き、傾いていないことが重要である(図2G)。幼虫の両眼が揃っていることを確認してください(片方の目が他方の目を覆っている)。画像処理ソフトを用いて表面積を測定する際には、測定の不一致を避けるために、肝臓の実輪郭にできるだけ近い境界を描く必要があります。肝臓を正確に測定できない画像は除外します(図2A-G)。しかし, 肝臓を除外するとデータをゆがめることができます, 大きな肝臓は、小さな肝臓よりも破壊される可能性が高いとして、.
このプロトコルの制限の1つは、固定幼虫にのみ適用されるということです。蛍光顕微鏡などの代替方法は、肝細胞特異的蛍光レポーター5、7、10を発現する生きた幼虫における肝臓のサイズを測定するために使用することができる。これらの代替方法は、同じ動物に対して逐次測定を行うことを可能にし、肝臓に覆われている組織の固定または解剖を必要としないため、より速い。生きている動物の蛍光顕微鏡と比較してこのプロトコルの利点は:1)ゼブラフィッシュはそれらを撮影する前に数週間または数ヶ月間固定に保つことができるので、肝臓が測定されるときに関してより柔軟性があります。2)ホモ接合体変異体を扱う際に面倒な蛍光レポーターを組み込むための要件はありません。そして3)他の実験に対するステップ1および2の適用性は、免疫蛍光染色またはその中のハイブリダイゼーション研究において含む。特定のアプリケーションに応じて、両方の方法を使用します。例えば、我々は通常、ハイスループットスクリーニング3にライブイメージングおよび肝細胞特異的レポーターを使用し、ここで説明するプロトコル3を使用して潜在的なヒット化合物をフォローアップする。
このプロトコルは、肝サイズの定量のために表面積のみを考慮に入れ、細胞代謝や形態の変化を検出せず、細胞数の増加と細胞サイズの増加を区別しません。この制限に対処するために、ステアトーシス16、ヒストロジー6、細胞番号8、11、細胞サイズ3、17、増殖3、18、および/またはアポトーシス19を評価するための相補アッセイが行われ得る。
このプロトコルのもう一つの制限は、左肝葉の表面積の増加または減少が全体としての肝臓の表面積および体積の変化を反映していると仮定することです。この仮定は、肝臓の成長が不均一である場合には適用されない場合があります。.肝臓の形状を調べ、肝臓の成長の不対称増加を調べるために、トランスジェニックモデルで光シート蛍光顕微鏡8または共焦点顕微鏡3を日常的に行います。蛍光顕微鏡の光シートは、幼虫肝量8を直接定量するために使用することができる。肝細胞特異的Yap1を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュでは、肝臓面積および肝臓容積は、非トランスジェニック対照兄弟8と比較して同様に増加した。
ここで説明する解剖技術は、免疫蛍光染色、細胞特異的蛍光レポーターライン、および/または肝臓サイズ3、19、20以外の肝臓発達の他の側面を研究する他の標識技術と組み合わせることができる。この解剖プロトコルはまた、腸および膵臓を露出するので、他の内臓器官の研究にも役立つかもしれません。
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Disclosures
著者たちは開示するものは何もない。
Acknowledgments
ユタ大学のマリン・ホッブスと中央集権ゼブラフィッシュ動物資源(CZAR)が、この研究の一部を行うためのゼブラフィッシュの畜産、実験室スペース、および機器を提供することを認めたい。CZARの拡張は、NIH助成金#1G20OD018369-01によって部分的にサポートされています。また、ロドニー・スチュワート、クロエ・リム、ランス・グラハム、コーディ・ジェームズ、ギャレット・ニックム、ハンツマンがん研究所(HCI)ゼブラフィッシュ・ファシリティに感謝したいと思います。R プログラミングの支援を受けてくださったケネス・コンパスに感謝します。この研究は、ハンツマンがん財団(ハンツマンがん研究所に授与された助成金P30 CA042014)(KJE)とNIH / NCI R01CA222570(KJE)からの助成金の一部によって資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Camera for dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Fine (Dumont #5) forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Glass pipets | VWR | 14672-608 | |
| Image analysis software | Image J/FIJI | ImageJ/FIJI can be dowloaded for free: https://imagej.net/Welcome | |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phosphate-buffered saline | Various suppliers | ||
| Pipette pump | VWR | 53502-233 | |
| Plastic Petri dishes | USA Scientific Inc | 2906 | |
| Pyrex 9-well round-bottom glass dish | VWR | 89090-482 | |
| Software for blinding files | R project | R can be downloaded for free: https://www.r-project.org/ | |
| Scientific graphing and statistics software | GraphPad Prism | ||
| Spreadsheet program | Microsoft Excel | ||
| Tricaine methanesulfonate (Tricaine-S) | Western Chemical | 200-226 | |
| Very fine (Dumont #55) forceps | Fine Science Tools | 11255-20 |
References
- Lin, D. -C., et al. Genomic and Epigenomic Heterogeneity of Hepatocellular Carcinoma. Cancer Research. 77 (9), 2255-2265 (2017).
- Ghouri, Y. A., Mian, I., Rowe, J. H. Review of hepatocellular carcinoma: Epidemiology, etiology, and carcinogenesis. Journal of Carcinogenesis. 16, 1 (2017).
- Evason, K. J., et al. Identification of Chemical Inhibitors of β-Catenin-Driven Liver Tumorigenesis in Zebrafish. PLoS Genetics. 11 (7), 1005305 (2015).
- Kalasekar, S. M., et al. Heterogeneous beta-catenin activation is sufficient to cause hepatocellular carcinoma in zebrafish. Biology Open. 8 (10), (2019).
- Nguyen, A. T., et al. A high level of liver-specific expression of oncogenic Kras(V12) drives robust liver tumorigenesis in transgenic zebrafish. Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 801-813 (2011).
- Nguyen, A. T., et al. An inducible kras(V12) transgenic zebrafish model for liver tumorigenesis and chemical drug screening. Disease Models & Mechanisms. 5 (1), 63-72 (2012).
- Li, Z., et al. A transgenic zebrafish liver tumor model with inducible Myc expression reveals conserved Myc signatures with mammalian liver tumors. Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 414-423 (2013).
- Cox, A. G., et al. Yap reprograms glutamine metabolism to increase nucleotide biosynthesis and enable liver growth. Nature Cell Biology. 18 (8), 886-896 (2016).
- Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease. Development. 132 (15), Cambridge, England. 3561-3572 (2005).
- Huang, X., Zhou, L., Gong, Z. Liver tumor models in transgenic zebrafish: an alternative in vivo approach to study hepatocarcinogenes. Future Oncology. 8 (1), London, England. 21-28 (2012).
- Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. Tumor-Associated Neutrophils and Macrophages Promote Gender Disparity in Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish. Cancer Research. 77 (6), 1395-1407 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2012).
- Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
- Dai, W., et al. High fat plus high cholesterol diet lead to hepatic steatosis in zebrafish larvae: a novel model for screening anti-hepatic steatosis drugs. Nutrition & Metabolism. 12, 42 (2015).
- Kim, S. -H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin. Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 255-267 (2011).
- Delous, M., et al. Sox9b is a key regulator of pancreaticobiliary ductal system development. PLoS Genetics. 8 (6), 1002754 (2012).
- Shin, D., Lee, Y., Poss, K. D., Stainier, D. Y. R. Restriction of hepatic competence by Fgf signaling. Development. 138 (7), Cambridge, England. 1339-1348 (2011).
- Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. R. The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. 56 (5), Baltimore, Md. 1958-1970 (2012).
