Summary
여기에서 우리는 애벌레 얼룩말어에 있는 간 크기를 정량화하는 방법을 보여줍니다, 간 성장 및 발달에 유전과 약리학 적인 조작의 효력을 평가하는 쪽을 제공하는.
Abstract
간세포 암종 (HCC)의 여러 형질 전환 제브라피시 모델에서, 간갈기는 초기 애벌레 단계 동안 관찰 될 수있다. zebrafish HCC 모델에서 애벌레 간 크기를 정량화하면 종양 유전자 관련 표현형에 대한 약물 및 기타 조작의 효과를 신속하게 평가할 수 있는 수단을 제공합니다. 여기에서 우리는 제브라피시 유충을 고치고, 간을 둘러싼 조직을 해부하고, 밝은 필드 현미경을 사용하여 간을 촬영하고, 간 면적을 측정하고, 결과를 분석하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 간 크기의 신속하고 정확한 정량화를 가능하게 합니다. 이 방법은 간 면적을 측정하는 것을 관련시키기 때문에, 간 양에 있는 다름을 과소평가할 수 있고, 상호 보완적인 방법론은 세포 크기에 있는 변경 및 세포 수에 있는 변경을 구별하기 위하여 요구됩니다. 본 명세서에 기재된 해부 기술은 면역형광 염색 및 내부 혼성화를 포함한 무수한 하류 응용을 위한 그들의 자연적인 위치에서 간, 창자 및 췌장을 시각화하는 훌륭한 도구이다. 애벌레 간 크기를 정량화하기 위한 기술된 전략은 간 발달 및 재생의 많은 양상에 적용가능하다.
Introduction
간세포암(HCC)은간1의 가장 흔한 1차 악성종양이며 암 관련사망률의세 번째 주요 원인2. 간암발생의 메커니즘을 더 잘 이해하고 잠재적인 HCC 치료제를 식별하기 위해, 당사와 다른 사람들은 β-카테닌3,4,Kras(V12)5,6,Myc7,또는 Yap18과 같은 종양유전자의 간세포 특이적 발현이 성인 동물의 HCC로 이어지는 형질전환 제브라피시를 개발했습니다. 이 제브라피시에서, 간 확대는 일찍 부터 지적된다 6 일 후 수정 (dpf), 종양 유전자 구동 간 과성장에 약물과 유전 변경의 효과를 테스트하기위한 허실 플랫폼을 제공. 애벌레 간 크기의 정확 하 고 정확한 측정은 이러한 조작의 효과 결정 하기 위해 필수적 이다.
간 크기 및 형상은 CY3-SA라벨링 9 또는 간세포 특이적 형광 리포터 및 형광 해부현미경5,6을사용하여 살아있는 제브라피시 유충에 의해 고정된 제브라피시 유충에서 반정량적으로 평가될 수 있다. 후자의 방법은 비교적 빠르며, 그 정밀도의 부족은 이미지 처리 소프트웨어7,10을사용하여 각 간 면적을 촬영하고 측정하여 해결할 수 있다. 그러나, 2차원 간 영역이 간 크기의 정확한 표현이 되도록 실험에서 모든 살아있는 애벌레를 균일하게 배치하는 것은 기술적으로 어려울 수 있다. 간 크기를 정량화하기위한 유사한 기술은 간이 다른 차원에서 비균일하게 확장 될 때 크기 차이를 검출하기 위해 더 정확 할 수있는 애벌레 간 볼륨8을정량화하기 위해 가벼운 시트 형광 현미경 을 사용하는 것을 포함한다. 형광 활성화 세포 선별(FACS)은 애벌레간에서형광표지된 간세포 및 기타 간 세포 유형의 수를 카운트하는데 사용할 수 있다8,11. 이 방법에서는 애벌레 간이 풀화되고 해리되므로 개별 간 크기와 모양에 대한 정보가 손실됩니다. 다른 간 크기 측정 방법과 함께, FACS 증가 세포 수 사이 분화를 가능 (증식) 그리고 증가 세포 크기 (비 대). 이러한 모든 방법은 고가의 형광 기술 (현미경 또는 세포 선별기)을 사용하며 CY3-SA 라벨링을 제외하고 형광 리포터로 간세포를 라벨링해야합니다.
여기서 우리는 밝은 필드 현미경 및 화상 처리 소프트웨어3,12,13,14를사용하여 제브라피시 애벌레 간 영역을 정량화하는 방법을 상세히 기술한다. 이 프로토콜은 형광 현미경 검사법의 사용없이 그 안에 있는 개별 간 의 지역의 정확한 정량화를 가능하게 합니다. 간 크기를 분석하는 동안, 우리는 조사자 편견을 줄이고 과학적 엄격을 개선하기 위해 이미지 정체성을 블라인드15.
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Protocol
동물 연구는 유타 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 된 다음 절차에 따라 수행됩니다.
1. 애벌레 고정
- 3-7 일 후 수정 (dpf), 트리카인 메탄설포네이트 (0.03 %)와 애벌레를 안락사 유리 피펫 및 파이펫 펌프를 사용하여 2 mL 튜브에 최대 15 마리의 애벌레를 수집합니다.
- 얼음에 1 mL의 차가운 (4 °C) 1 x 인산완식염수 (PBS)로 애벌레를 두 번 씻으하십시오. 각 세척에 대해 유리 파이펫과 파이펫 펌프로 튜브에서 가능한 한 많은 액체를 제거한 다음 튜브에 1 mL의 차가운 PBS를 추가하십시오.
- 유리 파이펫 및 파이펫 펌프를 사용하여 가능한 한 많은 PBS를 제거하고 PBS에 1 mL의 냉기 (4 °C) 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 추가합니다.
주의: PFA는 자극적이고 발암물질로 의심됩니다. PFA를 취급할 때 장갑을 착용해야 하며 농축 된 솔루션은 화학 연기 후드에서 처리해야합니다. - 부드러운 흔들림으로 적어도 하룻밤 (하지만 몇 개월까지) 4 °C에서 배양.
2. 간을 둘러싼 조직 해부
- 1 mL의 차가운 (4 °C) PBS로 3x를 헹구고 헹구 사이에 5 분 동안 흔들어 서 PFA에서 유충을 제거하십시오.
참고 : 4 °C에서 하루 이틀 동안 PBS에 헹구는 애벌레를 유지하는 것이 괜찮습니다. - PBS의 여러 유충을 9웰 바닥 유리 접시의 한 우물에 피펫.
- 간 을 둘러싼 피부를 제거합니다.
- 미세 한 포셉을 사용 하 여 애벌레를 등 (배 위로) 잡고, 가능한 한 부드럽게 머리의 양쪽에 그립. 그런 다음 다른 손에 아주 미세한 집게를 사용하여 심장을 덮는 피부를 잡으십시오.
- 물고기를 꼬리쪽으로 대각선으로 내리고 물고기의 왼쪽 또는 오른쪽에있는 접시의 바닥을 당깁니다. 다른 쪽(오른쪽 또는 왼쪽)에서 반복합니다.
- 피부의 플랩을 잡고 아래로 당겨 계속 / 다시 모든 피부와 멜라 노 포어오버 또는 간 근처 제거 될 때까지.
- 노른자를 제거하십시오( 있는 경우).
- 5-6 dpf 애벌레의 경우, 생선을 등에 미세한 포셉으로 잡고 아주 미세한 집게를 사용하여 노른자를 부드럽게 프로핑하여 한 조각으로 노른자를 들어 올립니다.
- 3-4 dpf 애벌레의 경우 노른자를 조각으로 긁어냅니다. 생선을 등에 미세한 집게로 잡고 아주 미세한 집게를 사용하여 복부 쪽에서 시작하여 노른자를 쓰다듬습니다.
- 유리 피펫과 파이펫 펌프를 사용하여 해부 된 유충을 신선한 차가운 PBS에 넣습니다.
3. 이미징
- 애벌레를 장착하려면 깨끗한 플라스틱 페트리 접시뚜껑에 3 % 메틸 셀룰로오스 몇 mL을 붓습니다.
- 유리 피펫과 파이펫 펌프를 사용하여 메틸 셀룰로오스에 애벌레를 추가하고 가능한 한 애벌레로 적은 PBS를 추가하십시오.
- 낮은 배율에서 해부 현미경에서, 그들은 왼쪽을 향하고, 자신의 오른쪽에 누워 있도록 물고기의 방향을 미세 한 집게를 사용합니다.
참고: 물고기가 측면에 완벽하게 향하도록 하거나 간 측정이 정확하지 않을 수 있는지 확인하십시오. - 각 물고기의 사진을 찍는다.
- 촬영할 물고기가 한쪽 눈이 다른 눈 바로 위에 있는 것과 완벽하게 정렬되어 있는지 확인합니다. 필요한 경우 미세 한 집게를 사용하여 물고기의 머리 또는 꼬리를 가볍게 두드려 방향을 조정하십시오. 물고기의 꼬리가 구부러진 경우, 물고기가 평평하게 누워 있도록 그것을 제거하기 위해 집게로 강제로 꼬집어 꼬리를 제거합니다.
- 높은 배율을 확대하고 간을 집중하여 간 윤곽이 선명하게 보이도록 합니다.
- 사진을 스냅하고 파일을 저장합니다.
- 모든 물고기에 대해 반복하여 각 그림에 대해 배율이 동일한지 확인합니다.
- 동일한 배율을 사용하여 마이크로미터의 사진을 찍습니다(그림 2H참조).
4. 이미지 분석
- 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 각 물고기의 간 면적을 측정합니다.
- 잠재적 인 조사자 편견을 피하고 과학적 엄격을 촉진하기 위해 모든 간 사진을 블라인드15. 이 단계는 다른 랩 멤버가 수동으로 수행하거나 컴퓨터프로그램(보충 자료)을사용하여 수행할 수 있습니다. 파일의 이름을 임의로 변경하고 원본 파일 이름과 해당 블라인드 파일 이름 목록이 포함된 "무작위 파일"을 만듭니다.
- 파일 1부터 순서대로 임의파일을 엽니다.
- 자유형 선택 도구를 선택하고 각 간을 윤곽을 잡습니다.
- 각 간 면적을 측정하려면 Ctrl-M을 누릅니다.
- 정확하게 측정할 수 없는 간은 자리 표시자 측정값을 삽입합니다(매우 작거나 매우 크므로 나중에 쉽게 제외할 수 있음).
- 측정값을 텍스트 파일("측정 파일")에 저장합니다.
- 블라인드 해제 및 데이터 분석
- 스프레드시트 프로그램에서 "측정 파일" 및 "무작위 파일"을 엽니다.
- "측정 파일"에 새 열을 삽입하고 "무작위 파일"을 사용하여 블라인드 파일의 원래 파일 이름을 추가합니다. 이 파일을 "눈이 멀지 않은 측정 파일"로 저장합니다.
- 원본 파일 이름으로 데이터를 정렬합니다.
- 사진이 부적절한 간 측정은 제외해야 합니다(그림 2A-G참조).
- 필요한 경우 측정 값을 원하는 축척(예: mm2,예:)으로 변환합니다.
- 이미지 처리 소프트웨어에서 축척 막대를 엽니다.
- 직선 도구를 사용하여 축척 막대에서 1mm를 측정합니다. 이미지 처리 소프트웨어는 간(픽셀)과 동일한 단위로 측정하여 변환 계수를 제공합니다.
- 변환 계수를 사용하여 "눈이 멀지 않은 측정 파일"에서 측정을 변환합니다.
- 스프레드시트 프로그램을 사용하거나 데이터를 과학 그래프 및 통계 소프트웨어에 붙여넣음으로 평균 및 표준 편차를 결정하고 p 값을 계산합니다.
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Representative Results
간세포 특이적 활성화된 β-카테닌(Tg(fabp10a:pt-β-cat)을 발현하는 형질전환 제브라피시3 및 비형질조절 형제는 6dpf에서 안락사되었고, 간부위는 브라이트필드 현미경 및 영상처리 소프트웨어를 사용하여 정량화하였다. 형질전환 제브라피쉬는 비형질전환형제(0.0004cm2,p< 0.0001)에 비해 간 크기(0.0006cm2)가현저히 증가하였다. 그림 1).
그림 1: 6 dpf의 간 크기 분석 (일 후 수정) 얼룩말. (A-B) 6 dpf 비 유전자 변형 제브라피시 유충의 대표적인 밝은 필드 이미지, 이는 장 위에 간 자연적인 위치와 모양을 보여줍니다. 간 영역은(B)에설명되어 있다. 스케일 바 = 0.1 mm.(C-D)육질성 제브라피시 유충6dpf의 대표적인 브라이트필드 이미지는 간세포 특이적 활성화 된 b-카테닌(ABC)을 발현하여 확대된 간을 나타냈다. 간 영역은(D)에설명되어 있다. 스케일 바 = 0.1 mm.(E)6 dpf 비-tpf 제브라피쉬 유충(Non-Tg) 및 형질전환 제브라피쉬 유충의 간 크기 측정(평균 ±표준 편차)을 나타내는 그래프는 간세포 특이적 활성화 된 b-카테닌(ABC)을 발현한다. 샘플은 페어링되지 않은 t 검정을 사용하여 비교하였다. p < 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 부적절한 이미지 및 마이크로미터의 예입니다. (A-G) 분석에서 제외되어야 하는 애벌레 간을 대표하는 심상. 스케일 바 = 0.1 mm.(A)간을 덮는 피부와 애벌레. (B)노른자를 가진 애벌레가 간을 가리는다. (C)간 일부를 꼬집은 애벌레. (D)간탈구와 떨어지는 애벌레. (E)간이 없는 유충. (F)이미지가 흐려져 초점이 바빠져 있기 때문에 식별하기 어려운 간 윤곽을 가진 애벌레. (G)애벌레가 부적절한 위치를 지정합니다. 두 눈은 서로 직접 정렬되지 않습니다. (H)스케일 바를 생성하고 이미지 처리 소프트웨어 측정을 픽셀에서cm2로 변환하는 데 사용되는 마이크로미터 의 이미지를 보려면 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 보십시오.
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Discussion
간 크기의 정량화는 간 발달, 재생 및 종양 발생을 이해하는 것을 목표로 하는 연구에서 매우 중요합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 라발 제브라피시의 간 크기 정량화를 위한 비교적 빠르고, 쉽고, 저렴한 기술입니다. 프로토콜의 특정 측면을 수행 하는 동안 적절 한 주의 행사 결과의 증가 정확도 및 감소 좌절에 도움이 될 수 있습니다.
유충의 적당한 고정은 잘 보존된 생물학 견본을 얻고 그들의 붕괴를 방지하는 쪽으로 중요합니다. 4% PFA 용액의 희석은 헹구된 유충에 PFA를 첨가하기 전에 PBS가 완전히 제거되지 않을 때 발생할 수 있다. 잘 만들어진 PFA 솔루션을 사용하고 PFA를 추가하기 전에 PBS 솔루션의 전부 또는 대부분을 파이펫팅하면 이 문제를 해결하는 데 도움이 됩니다.
많은 연습 후 빠르고 쉽게 수행 할 수 있지만, 해부 기술은 상당한 수동 손재주를 필요로한다. 해부하는 동안, 전체 간이 노출되도록 피부와 노른자를 간 위에서 완전히 제거하는 것이 중요합니다. 이렇게 하지 않으면 간 경계의 보기가 가려지는 이미지가 발생할 수있습니다(그림 2A,B). 해부하는 동안 숙련되지 않은 강제운동은 간 부분의 꼬집기(그림2C)또는 간 부착물의 느슨해지게 하여 간이 변위되거나(그림 2D)또는 완전히 누락될 수 있다(그림2E). 사용자는 실험 샘플로 이동하기 전에 연습 샘플에 자신의 해부 기술을 연마로 시간의 적절한 숫자에 넣어해야합니다.
장착 하는 동안, 간 위의 피부 제거 되었습니다., 후속 단계 동안 떨어지는 간의 확률을 증가. 이러한 가능성을 피하기 위해 이 과정에서 부드러운 파이펫팅 무브먼트를 사용해야 합니다.
브라이트필드 현미경을 사용하여 이미지 조달하는 동안 양질의 이미지를 촬영해야 합니다. 흐릿하고 초점이 벗어난 이미지는 간선의 실제 경계를 평가하기 어렵게만듭니다(그림 2F). 이 방법은 간 좌엽의 표면적을 측정하는 것을 포함하므로, 유충이 기울어지지 않고 측면에 잘 지향되는 것이 중요합니다(그림 2G). 애벌레의 두 눈이 정렬되어 있는지 확인하십시오 (한 쪽 눈은 다른 쪽 눈을 덮는). 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 표면적을 측정하는 동안 측정 불일치를 방지하기 위해 간장의 실제 윤곽선에 가능한 한 가깝게 경계를 그리는 것이 중요합니다. 간을 정확하게 측정할 수 없는 이미지는 제외합니다(그림2A-G). 그러나, 간을 제외 하면 데이터를 왜곡할 수 있습니다 명심 하십시오, 더 큰 간 은 더 작은 간 보다 중단 될 가능성이 더 높습니다.
이 프로토콜의 제한 사항 중 하나는 고정 된 애벌레에만 적용 된다는 것입니다. 형광 현미경 검사법과 같은 대체 방법은 간세포 특이적 형광 리포터5,7,10을발현하는 살아있는 유충에서 간 크기를 측정하는데 사용될 수 있다. 이 대체 방법은 동일 동물에 순차적인 측정이 가능하게 하고, 또한 간 을 덮는 조직의 고정 또는 해부를 요구하지 않기 때문에, 또한 더 빠릅니다. 살아있는 동물에 있는 형광 현미경 검사법에 비교된 이 프로토콜의 이점은: 1) 간이 측정될 때에 관하여 더 많은 융통성, zebrafish는 그(것)들을 촬영하기 전에 주 또는 달 동안 고정에 보관될 수 있기 때문에; 2) 형광 리포터를 통합할 필요가 없으며, 동형형 균 돌연변이를 다룰 때 번거로울 수 있습니다. 및 3) 면역형광 염색 또는 시투 혼성화 연구를 포함한 다른 실험에 대한 1 단계 및 2단계의 적용가능성. 특정 응용 프로그램에 따라 두 방법을 모두 사용합니다. 예를 들어, 우리는 전형적으로 고처리량 스크리닝3을위해 라이브 이미징 및 간세포 특이적 리포터를 사용하고, 여기에 설명된 프로토콜을 사용하여 잠재적 히트 화합물에 대한 후속 조치를3.
이 프로토콜은 간 크기의 정량화를 고려하여 표면적만을 취하므로 세포 대사 또는 형태학의 변화를 감지하지 않으며 세포 수의 증가와 세포 크기의 증가를 구별하지 않습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해, 상보성 세포증16,세포학6,세포 번호8,11,세포 크기3,17,증식3,18,및/또는 세포자멸19를 평가하기 위한 상보적 인 세포가 수행 될 수있다.
이 프로토콜의 또 다른 한계는 좌간 엽의 표면적의 증가 또는 감소가 전체적으로 간 표면적 및 부피의 변화를 반영한다고 가정한다는 것입니다. 이 가정은 간 성장은 불균일 한 경우 적용되지 않을 수 있습니다. 간 모양을 검사하고 간 성장에 있는 비 대칭 증가를 검사하기 위하여는, 우리는 일상적으로 우리의 형질전환 모형에 가벼운 시트 형광 현미경 검사법8 또는 공초점 현미경3를 합니다. 가벼운 시트 형광 현미경 검사법은 애벌레 간 부피를 직접 정량화하는 데 사용할 수 있습니다8. 간세포 특이적 Yap1을 발현하는 형질전환 제브라피쉬에서, 간면적 및 간부피는 비형질전환 대조군 형제자매에 비해 유사하게 증가하였고8.
여기서 설명된 해부 기술은 면역형광 염색, 세포 특이적 형광 리포터 라인 및/또는 간 크기3,19,20외에 간 발달의 다른 측면을 연구하기 위한 다른 라벨링 기술과 결합될 수 있다. 이 해부 프로토콜은 또한 창 자 및 췌 장을 노출, 그것은 뿐만 아니라 다른 내장 장기의 연구에 대 한 도움이 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
우리는 이 연구의 일부를 수행하기 위해 제브라피시 축산, 실험실 공간 및 장비를 제공한 유타 대학교의 Maurine Hobbs와 중앙 집중식 Zebrafish 동물 자원(CZAR)을 인정하고 싶습니다. CZAR의 확장은 NIH 교부금 # 1G20OD018369-01에 의해 부분적으로 지원된다. 우리는 또한 로드니 스튜어트, 클로이 림, 랜스 그레이엄, 코디 제임스, 개럿 니쿰, 그리고 헌츠맨 암 연구소 (HCI) 제브라피시 치료에 대한 제브라피시 시설에 감사드립니다. 우리는 R 프로그래밍에 도움을 케네스 콤파스에게 감사드립니다. 이 작품은 헌츠맨 암 재단 (헌츠맨 암 연구소에 수여 된 보조금 P30 CA042014와 함께) 및 NIH / NCI R01CA22570 (KJE)의 보조금에 의해 부분적으로 지원되었다.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Camera for dissecting microscope | Leica, for example | ||
Dissecting microscope | Leica, for example | ||
Fine (Dumont #5) forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
Glass pipets | VWR | 14672-608 | |
Image analysis software | Image J/FIJI | ImageJ/FIJI can be dowloaded for free: https://imagej.net/Welcome | |
Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
Phosphate-buffered saline | Various suppliers | ||
Pipette pump | VWR | 53502-233 | |
Plastic Petri dishes | USA Scientific Inc | 2906 | |
Pyrex 9-well round-bottom glass dish | VWR | 89090-482 | |
Software for blinding files | R project | R can be downloaded for free: https://www.r-project.org/ | |
Scientific graphing and statistics software | GraphPad Prism | ||
Spreadsheet program | Microsoft Excel | ||
Tricaine methanesulfonate (Tricaine-S) | Western Chemical | 200-226 | |
Very fine (Dumont #55) forceps | Fine Science Tools | 11255-20 |
References
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