Summary
Здесь мы демонстрируем метод количественной оценки размера печени у личинок зебры, обеспечивая способ оценки влияния генетических и фармакологических манипуляций на рост и развитие печени.
Abstract
В нескольких трансгенных моделях зебры гепатоцеллюлярной карциномы (HCC) гепатомегалия может наблюдаться на ранних личиночных стадиях. Количественная оценка размера личинки печени в моделях HCC зебрафиш обеспечивает возможность быстрой оценки воздействия лекарств и других манипуляций на фенотип, связанный с онкогеном. Здесь мы покажем, как исправить личинки зебры, вскрыть ткани, окружающие печень, фотографировать печень с помощью ярко-поляной микроскопии, измерять область печени и анализировать результаты. Этот протокол обеспечивает быструю и точную количественную оценку размера печени. Поскольку этот метод включает в себя измерение площади печени, он может недооценивать различия в объеме печени, и дополнительные методологии необходимы для различать изменения в размере клеток и изменения в количестве клеток. Техника вскрытия, описанная здесь, является отличным инструментом для визуализации печени, кишечника и поджелудочной железы в их естественных положениях для множества приложений вниз по течению, включая оленивость иммунофлюоресценции и гибридизацию на месте. Описанная стратегия количественной оценки размеров личиночной печени применима ко многим аспектам развития и регенерации печени.
Introduction
Гепатоцеллюлярной карциномы (HCC) является наиболее распространенной первичной злокачественности печени1 и третьей ведущей причиной смертности, связанной с раком2. Чтобы лучше понять механизмы гепатокарциногенеза и определить потенциальные терапии HCC, мы и другие разработали трансгенные зебры, в которых гепатоцитов конкретных выражение онкогенов, таких как з-катенин3,4, Крас (V12)5,6, Myc7, или Yap18 приводит к HCC у взрослых животных. В этих зебры, увеличение печени отмечается уже в 6 дней после оплодотворения (dpf), обеспечивая поверхностную платформу для тестирования воздействия наркотиков и генетических изменений на онкогена инициативе печени разрастание. Точное и точное измерение размера личинки печени имеет важное значение для определения последствий этих манипуляций.
Размер и форма печени могут быть оценены полуколичественно в фиксированных личинок зебры по маркировке CY3-SA9 или в живых личинок зебры с использованием гепатоцитов конкретных флуоресцентных репортеров и флуоресценции вскрытия микроскопии5,6. Последний метод является относительно быстрым, и его отсутствие точности может быть решена путем фотографирования и измерения площади каждой печени с помощью программного обеспечения обработки изображений7,10. Тем не менее, это может быть технически сложным, чтобы равномерно положение всех живых личинок в эксперименте, так что двумерная область печени является точное представление размера печени. Аналогичный метод для количественной оценки размера печени включает в себя использование светлиста флуоресценции микроскопии для количественной личинки печени объем8, которые могут быть более точными для обнаружения различий в размерах, когда печень расширяется неравномерно в различных измерениях. Флуоресценция активированных клеток сортировки (FACS) может быть использован для подсчета числа флуоресцентно помечены гепатоцитов и других типов клеток печени в личиночных печени8,11. При этом методе личиночная печень объединяются и разобщены, поэтому теряется информация об отдельных размерах и форме печени. В сочетании с другим методом определения размера печени, FACS позволяет дифференцировать между увеличением количества клеток (гиперплазия) и увеличение размера клеток (гипертрофия). Все эти методы используют дорогие технологии флуоресценции (микроскоп или сортировка клеток) и, за исключением маркировки CY3-SA, требуют маркировки гепатоцитов флуоресцентным репортером.
Здесь мы подробно описываем метод количественной оценки личинки зебры области печени с использованием ярко-поля микроскопии и обработки изображений программного обеспечения3,12,13,14. Этот протокол позволяет точно определить область отдельных печени на месте без использования флуоресценции микроскопии. При анализе размера печени, мы слепых личности изображения, чтобы уменьшить предвзятость следователя и улучшить научную строгость15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Исследования на животных проводятся в соответствии с процедурами, утвержденными Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Университета штата
1. Фиксация лирва
- В 3-7 дней после оплодотворения (dpf), эвтаназии личинок с трикаин метанесульфонат (0,03%) и собирать до 15 личинок в трубку 2 мл с помощью стеклянной пипетки и пипетки насоса.
- Вымойте личинки дважды с 1 мл холода (4 КК) 1x фосфат-буфера солей (PBS) на льду. Для каждой стирки, удалить как можно больше жидкости из трубки со стеклянной пипеткой и пипеткой насоса, а затем добавить 1 мл холодного PBS в трубку.
- Удалите как можно больше PBS с помощью стеклянной пипетки и насоса пипетки, и добавьте 1 мл холодного (4 кВ) 4% параформальдегида (PFA) в PBS.
ВНИМАНИЕ: ПФА является раздражителем и подозреваемым канцерогеном. Перчатки следует носить при обращении с PFA, а концентрированные растворы должны быть обработаны в химическом капоте дыма. - Инкубировать при 4 градусах по крайней мере на ночь (но до нескольких месяцев) с нежным раскачиванием.
2. Рассекающие ткани, окружающие печень
- Удалите личинки из PFA, прополоскнив 3x с 1 мл холодного (4 кВ) PBS и качалки в течение 5 минут между полосками.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это нормально, чтобы держать промытые личинки в PBS в течение дня или двух при 4 градусах Цельсия. - Pipette несколько личинок в PBS в один колодец 9-хорошо круглых нижней стеклянной тарелке.
- Удалить кожу, окружающую печень.
- Используйте мелкие щипцы, чтобы держать личинки на спине (живот вверх), захватповав по обе стороны головы как можно мягче. Затем используйте очень тонкие щипки в другой руке, чтобы захватить кожу только над сердцем.
- Потяните кожу вниз по диагонали к хвосту рыбы и нижней части блюда на левой или правой стороне рыбы. Повторите для другой стороны (правая или левая сторона).
- Продолжить захвата лоскути кожи и потянув вниз / назад, пока все кожи и меланофоры над лежащими или вблизи печени были удалены.
- Удалите желток, если присутствует.
- Для 5-6 dpf личинок, снять желток в один кусок, держа рыбу с тонкими щипцы на спине и с помощью очень тонкой щипцы, чтобы подпрыгивая желток мягко.
- Для личинок dpf 3-4 dpf, соскребите желток на куски. Держите рыбу с тонкими щипками на спине и использовать очень тонкие щипцы, чтобы погладить желток, начиная с брюшной стороны.
- Поместите расчлененные личинки в свежий холодный PBS с помощью стеклянной пипетки и пипетки насоса.
3. Визуализация
- Чтобы смонтировать личинки, вылейте несколько мл 3% метилцеллюлозы на крышку чистой пластиковой чашки Петри.
- Используйте стеклянный пипетка и пипетка насос, чтобы добавить личинки в метил целлюлозы, добавив, как мало PBS с личинками, как это возможно.
- Под рассекающим микроскопом при низком увеличении, используйте тонкие щипцы, чтобы сориентировать рыбу, чтобы они лежали на правой стороне, лицом влево.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что рыба ориентирована идеально на их стороне или печени измерений не может быть точным. - Сфотографировать каждую рыбу.
- Подтвердите, что рыба, которую нужно сфотографировать, выровнена идеально, одним глазом прямо на другом глазу. При необходимости используйте тонкие щипцдляния, чтобы слегка наживать на голове или хвосте рыбы, чтобы отрегулировать ориентацию. Если хвост рыбы согнут, удалите хвост, защипывая его силой с щипцы, чтобы удалить его, чтобы рыба лежала плашмя.
- Увеличить до высокого увеличения и сосредоточиться на печени, убедившись, что контур печени хорошо видны.
- Прикрепите картинку и сохраните файл.
- Повторите для всех рыб, убедившись, что увеличение то же самое для каждой картины.
- Сфотографировать микрометр с помощью того же увеличения (см. Рисунок 2H).
4. Анализ изображений
- Измерьте область печени каждой рыбы с помощью программного обеспечения для обработки изображений.
- Слепой все фотографии печени, чтобы избежать потенциальных предубеждений следователя и содействовать научной строгости15. Этот шаг может быть сделан вручную другим членом лаборатории или с помощью компьютерной программы(Дополнительный материал). Переименуйте файлы случайным образом и создавайте «файл рандомизации», содержащий список исходных имен файлов и соответствующие ослепленные имена файлов.
- Откройте рандомизированные файлы по порядку, начиная с файла 1.
- Выберите инструмент выбора от руки и наброски каждой печени.
- Нажмите Ctrl-M для измерения площади каждой печени.
- Для любой печени, которые не могут быть точно измерены, вставьте измерение заполнителя (очень маленький или очень большой, так что это может быть легко исключено позже).
- Сохранить измерения в текстовом файле ("файл измерений").
- Оон-слепой и анализ данных
- Открыть "файл измерений" и "файл рандомизации" в программе электронной таблицы.
- Вставьте новую колонку в "файл измерений" и добавьте исходные имена файлов для ослепленных файлов, используя "файл рандомизации". Сохранить этот файл как "файл неслепых измерений".
- Сортировать данные по первоначальному имени файла.
- Не забудьте исключить любые измерения печени, для которых фотографии были недостаточными (см. Рисунок 2A-G).
- При необходимости преобразуйте значения измерений в желаемую шкалу (мм2,например).
- Откройте панель масштаба в программном обеспечении для обработки изображений.
- Используйте инструмент прямой линии для измерения 1 мм на панели масштаба. Программное обеспечение для обработки изображений будет измерять в тех же единицах, что и печень (пиксели), давая коэффициент конверсии.
- Используйте коэффициент преобразования для преобразования измерений в "файл неслепых измерений".
- Используя программу электронной таблицы или вставляя данные в программное обеспечение для графиков и статистики, определите среднее и стандартное отклонение и вычислите значение p(s).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Трансгенные зебрафиш, выражающие гепатоцитов конкретных активированный катенин (Tg (fabp10a:pt-й-кошка) зебры)3 и не-трансгенных братьев и сестер контроля были усыплена в 6 dpf и области печени была количественно с помощью яркого поля микроскопии и программного обеспечения для обработки изображений. Трансгенные зебры значительно увеличили размер печени (0,0006 см2) по сравнению с их нетрансгенными братьями и сестрами (0,0004 см2, р/з; 0,0001; Рисунок 1).
Рисунок 1: Анализ размера печени 6 dpf (дней после оплодотворения) зебры. (A-B) Представитель яркого поля изображение 6 dpf нетрансгенных личинки зебры, которая показывает естественное положение и форму печени над кишечником. Область печени была изложена в (B). Шкала баров 0,1 мм. (C-D) Представитель яркое поле изображение 6 dpf трансгенных личинки зебры, выражающие гепатоцитов конкретных активированный b-катенин (ABC), показывая увеличенную печень. Область печени была изложена в (D). Шкала баров 0,1 мм. (E) График, показывающий измерения размера печени (средний - стандартное отклонение) 6 dpf нетрансгенных личинок зебры (Non-Tg) и трансгенных личинок зебры, выражающих гепатоцитов конкретных активированный b-catenin (ABC). Образцы были сопоставлены с использованием непарного теста t. р Злт; 0.0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Примеры неадекватных изображений и микрометра. (A-G) Репрезентативные изображения личинок печени, которые должны быть исключены из анализа. Шкала баров 0,1 мм. (A) Ларва с кожей, покрывающей печень. (B) Larva с желтком заслоняя печенку. (C) Larva с частями печени ущипнул. (D) Larva с вывихнутой печени и падающей. (E) Ларва с отсутствующим печенью. (F) Larva с контуром печени, который трудно определить, потому что изображение размыто / вне фокуса. (G) Larva с неправильным позиционированием. Два глаза не выровнены непосредственно друг на друга. (H) Изображение микрометра, используемого для генерации баров масштаба и преобразования измерения программного обеспечения обработки изображений с пикселей на см2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Количественная оценка размера печени имеет решающее значение в исследованиях, направленных на понимание развития печени, регенерации и онкогенеза. Описанный здесь протокол является относительно быстрой, легкой и дешевой техникой количественной оценки размера печени у личинок зебры. Осуществление надлежащей осторожности при выполнении некоторых аспектов протокола может помочь в повышении точности результатов и снижении разочарования.
Правильная фиксация личинок имеет решающее значение для получения хорошо сохранившихся биологических образцов и предотвращения их распада. Разбавление 4% раствора PFA может произойти, когда PBS не удаляется полностью до добавления PFA к промытым личинок. Использование хорошо сделанных решений PFA и прокладка всех или большинства решений PBS до добавления PFA полезно решить эту проблему.
Хотя быстро и легко выполнять после долгих практики, вскрытие техники требует существенной ловкости ручной. При вскрытии, очень важно, чтобы удалить кожу и желток полностью от выше печени, так что вся печень подвергается. Невыполнение этого требования может привести к изображениям, где вид границы печени заслоняется(рисунок 2A,B). Неквалифицированные и силовые движения при вскрытии могут привести к щипать части печени(рисунок 2C) или ослабление печеночной привязанности, в результате чего печень вытесняется(Рисунок 2D) или отсутствует полностью (Рисунок 2E). Пользователи должны положить в достаточное количество часов к оттачиванию своих навыков вскрытия на практике образцы, прежде чем перейти к экспериментальным образцам.
Во время монтажа, кожа над печенью была удалена, увеличивая вероятность выпадения печени во время последующих шагов. Чтобы избежать такой возможности, в ходе этого процесса следует использовать нежные движения трубачков.
При закупке изображений с помощью яркого микроскопа очень важно, чтобы были сделаны изображения хорошего качества. Размытые, вне фокуса изображения затруднят оценку истинной границы печени(рисунок 2F). Поскольку этот метод включает в себя измерение площади поверхности левой доли печени, очень важно, чтобы личинка хорошо ориентировалась на бок и не наклонялась(рисунок 2G). Убедитесь, что оба глаза личинки выровнены (один глаз, покрывающий вид другого). При измерении площади поверхности с помощью программного обеспечения для обработки изображений важно максимально приблизить границу к реальному контуру печени, с тем чтобы избежать расхождений в измерениях. Исключить любые изображения, где печень не может быть точно измерена(Рисунок 2A-G). Однако, имейте в виду, что исключение печени может исказить данные, так как большие печени, скорее всего, будет нарушена, чем меньше печени.
Одним из ограничений этого протокола является то, что он применяется только к фиксированным личинок. Альтернативные методы, такие как флуоресценция микроскопии могут быть использованы для измерения размера печени в живых личинок, выражающих гепатоцитов конкретных флуоресцентных репортеров5,7,10. Эти альтернативные методы позволяют последовательных измерений, которые будут сделаны на том же животном, и они также быстрее, так как они не требуют фиксации или вскрытия тканей над печенью. Преимущества этого протокола по сравнению с флуоресценцией микроскопии у живых животных: 1) больше гибкости по отношению к тому, когда печень измеряется, как зебрафиш может храниться в фиксаторе в течение нескольких недель или месяцев, прежде чем фотографировать их; 2) отсутствие требования для включения флуоресцентного репортера, который может быть громоздким при работе с гомозиготными мутантами; и 3) применимость шагов 1 и 2 для других экспериментов, включая окрашивание иммунофлюоресценции или исследования гибридизации на месте. Мы используем оба метода, в зависимости от конкретного приложения. Например, мы обычно используем живые изображения и гепатоцитов конкретных репортеров для высокой пропускной прослеживаемого скрининга3, и следить за потенциальными соединениями хит с помощью протокола, описанного здесь3.
Этот протокол учитывает только площадь поверхности для количественной оценки размера печени, поэтому он не обнаруживает изменений в клеточном метаболизме или морфологии, а также не проводит различия между увеличением числа клеток и увеличением размера клеток. Для того, чтобы решить это ограничение, дополнительные анализы для оценки стеатоза16, гистологии6, ячейки No8,11, размер ячейки3,17, пролиферации3,18, и / или апоптоз19 могут быть выполнены.
Еще одним ограничением этого протокола является то, что он предполагает, что увеличение или уменьшение площади поверхности левой доли печени отражает изменения площади поверхности и объема печени в целом. Это предположение не может применяться, когда рост печени является неоднородным. Для изучения формы печени и проверки несимметричного увеличения роста печени, мы обычно делаем светлистфлюесценции микроскопии8 или конфокальной микроскопии3 на наших трансгенных моделях. Свет лист флуоресценции микроскопии могут быть использованы для непосредственной количественной личинки печени объем8. В трансгенных зебрафиш, выражающих гепатоцитов конкретных Yap1, области печени и печени объем были аналогичным образом увеличены по сравнению с не-трансгенных контроль братьев и сестер8.
Техника вскрытия, описанная здесь, может быть объединена с иммунофлюоресценцией окрашивания, клеток конкретных флуоресцентных репортер линий, и / или другие методы маркировки для изучения других аспектов развития печени, кроме размера печени3,19,20. Как это вскрытие протокола также подвергает кишечника и поджелудочной железы, это может быть полезно для исследований других висцеральных органов, а также.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы хотели бы отметить Моурин Хоббс и централизованный ресурс животных зебрафиш (КЗАР) в Университете штата юта за предоставление зебры, лабораторное пространство и оборудование для проведения части этого исследования. Расширение ЦАР частично поддерживается грантом NIH No 1G20OD018369-01. Мы также хотели бы поблагодарить Родни Стюарт, Хлоя Лим, Лэнс Грэм, Коди Джеймс, Гарретт Никум, и Хантсман институт рака (HCI) Зебрафиш фонда для лечения зебры. Мы хотели бы поблагодарить Кеннета Компасса за помощь в программировании R. Эта работа была частично профинансирована грантами Фонда рака Хантсмана (в сочетании с грантом P30 CA042014, присужденным Институту рака Хантсмана) (KJE) и NIH/NCI R01CA222570 (KJE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Camera for dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Fine (Dumont #5) forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Glass pipets | VWR | 14672-608 | |
| Image analysis software | Image J/FIJI | ImageJ/FIJI can be dowloaded for free: https://imagej.net/Welcome | |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phosphate-buffered saline | Various suppliers | ||
| Pipette pump | VWR | 53502-233 | |
| Plastic Petri dishes | USA Scientific Inc | 2906 | |
| Pyrex 9-well round-bottom glass dish | VWR | 89090-482 | |
| Software for blinding files | R project | R can be downloaded for free: https://www.r-project.org/ | |
| Scientific graphing and statistics software | GraphPad Prism | ||
| Spreadsheet program | Microsoft Excel | ||
| Tricaine methanesulfonate (Tricaine-S) | Western Chemical | 200-226 | |
| Very fine (Dumont #55) forceps | Fine Science Tools | 11255-20 |
References
- Lin, D. -C., et al. Genomic and Epigenomic Heterogeneity of Hepatocellular Carcinoma. Cancer Research. 77 (9), 2255-2265 (2017).
- Ghouri, Y. A., Mian, I., Rowe, J. H. Review of hepatocellular carcinoma: Epidemiology, etiology, and carcinogenesis. Journal of Carcinogenesis. 16, 1 (2017).
- Evason, K. J., et al. Identification of Chemical Inhibitors of β-Catenin-Driven Liver Tumorigenesis in Zebrafish. PLoS Genetics. 11 (7), 1005305 (2015).
- Kalasekar, S. M., et al. Heterogeneous beta-catenin activation is sufficient to cause hepatocellular carcinoma in zebrafish. Biology Open. 8 (10), (2019).
- Nguyen, A. T., et al. A high level of liver-specific expression of oncogenic Kras(V12) drives robust liver tumorigenesis in transgenic zebrafish. Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 801-813 (2011).
- Nguyen, A. T., et al. An inducible kras(V12) transgenic zebrafish model for liver tumorigenesis and chemical drug screening. Disease Models & Mechanisms. 5 (1), 63-72 (2012).
- Li, Z., et al. A transgenic zebrafish liver tumor model with inducible Myc expression reveals conserved Myc signatures with mammalian liver tumors. Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 414-423 (2013).
- Cox, A. G., et al. Yap reprograms glutamine metabolism to increase nucleotide biosynthesis and enable liver growth. Nature Cell Biology. 18 (8), 886-896 (2016).
- Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease. Development. 132 (15), Cambridge, England. 3561-3572 (2005).
- Huang, X., Zhou, L., Gong, Z. Liver tumor models in transgenic zebrafish: an alternative in vivo approach to study hepatocarcinogenes. Future Oncology. 8 (1), London, England. 21-28 (2012).
- Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. Tumor-Associated Neutrophils and Macrophages Promote Gender Disparity in Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish. Cancer Research. 77 (6), 1395-1407 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2012).
- Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
- Dai, W., et al. High fat plus high cholesterol diet lead to hepatic steatosis in zebrafish larvae: a novel model for screening anti-hepatic steatosis drugs. Nutrition & Metabolism. 12, 42 (2015).
- Kim, S. -H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin. Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 255-267 (2011).
- Delous, M., et al. Sox9b is a key regulator of pancreaticobiliary ductal system development. PLoS Genetics. 8 (6), 1002754 (2012).
- Shin, D., Lee, Y., Poss, K. D., Stainier, D. Y. R. Restriction of hepatic competence by Fgf signaling. Development. 138 (7), Cambridge, England. 1339-1348 (2011).
- Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. R. The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. 56 (5), Baltimore, Md. 1958-1970 (2012).
