Summary
Här visar vi en metod för att kvantifiera leverstorlek i larv zebrafisk, vilket ger ett sätt att bedöma effekterna av genetiska och farmakologiska manipulationer på levertillväxt och utveckling.
Abstract
I flera transgena zebrafisk modeller av hepatocellulärcarcinom (HCC), hepatomegali kan observeras under tidiga larvstadier. Kvantifiera larval leverstorlek i zebrafisk HCC modeller ger ett sätt att snabbt bedöma effekterna av läkemedel och andra manipulationer på en onkogen-relaterade fenotyp. Här visar vi hur man fixar zebrafisklarver, dissekerar vävnaderna kring levern, fotograferar lever med hjälp av ljusfältsmikroskopi, mäter leverområdet och analyserar resultat. Detta protokoll möjliggör snabb, exakt kvantifiering av leverstorlek. Eftersom denna metod innebär att mäta leverområdet, Det kan underskatta skillnader i levervolym, och kompletterande metoder krävs för att skilja mellan förändringar i cellstorlek och förändringar i cellnummer. Den dissektion teknik som beskrivs häri är ett utmärkt verktyg för att visualisera lever, tarm och bukspottkörteln i sina naturliga positioner för otaliga nedströms applikationer inklusive immunofluorescens färgning och in situ hybridisering. Den beskrivna strategin för kvantifiering av larval leverstorlek är tillämplig på många aspekter av leverutveckling och förnyelse.
Introduction
Hepatocellulär karcinom (HCC) är den vanligaste primära maligniteten ilevern 1 och den tredje vanligaste orsaken till cancerrelaterad dödlighet2. För att bättre förstå mekanismer av hepatocarcinogenes och identifiera potentiella HCC therapeutics, vi och andra har utvecklat transgena zebrafisk där hepatocyte-specifika uttryck för onkogener såsom β-catenin3,4,Kras(V12)5,6, Myc7, eller Yap18 leder till HCC hos vuxna djur. I dessa zebrafisk noteras leverutvidgningen så tidigt som 6 dagar efter befruktning (dpf), vilket ger en facile plattform för att testa effekterna av läkemedel och genetiska förändringar på onkogendriven leveröverväxt. Exakt och exakt mätning av larval leverstorlek är viktigt för att fastställa effekterna av dessa manipulationer.
Leverstorlek och form kan bedömas semikvantitativt i fasta zebrafisklarver med CY3-SA med etiketten9 eller i levande zebrafisklarver med hepatocytespecifika fluorescerande reportrar och fluorescerande dissekering slemhinne imikroskopi 5,6. Den senare metoden är relativt snabb, och dess brist på precision kan åtgärdas genom att fotografera och mäta området för varje lever med hjälp av bildbehandling programvara7,10. Emellertid, Det kan vara tekniskt utmanande att enhetligt placera alla levande larver i ett experiment så att tvådimensionella leverområdet är en korrekt representation av leverstorlek. En liknande teknik för kvantifiering leverstorlek innebär att använda ljusblad fluorescens mikroskopi för att kvantifiera larv levervolym8, vilket kan vara mer exakt för att upptäcka storleksskillnader när levern utökas icke-enhetligt i olika dimensioner. Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) kan användas för att räkna antalet fluorescerande märkta hepatocyter och andra levercelltyper i larvallever8,11. I denna metod, larv lever är poolade och dissociated, så information om enskilda leverstorlek och form går förlorad. I kombination med en annan leverstorlek bestämningsmetod, FACS möjliggör differentiering mellan ökat cellantal (hyperplasi) och ökad cellstorlek (hypertrofi). Alla dessa metoder använder dyra fluorescensteknik (mikroskop eller cellsorterare) och, med undantag för CY3-SA-märkning, kräver märkning av hepatocyter med en fluorescerande reporter.
Här beskriver vi i detalj en metod för kvantifiering zebrafisk larv leverområde med hjälp av ljusa fält mikroskopi och bildbehandling programvara3,12,13,14. Detta protokoll möjliggör exakt kvantifiering av området för enskilda lever på plats utan användning av fluorescensmikroskopi. Medan analysera leverstorlek, blindvi bilden identitet för att minska utredare bias och förbättra vetenskaplig stringens15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurstudier utförs efter förfaranden som godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of Utah.
1. Fastställande Larver
- Vid 3–7 dagar efter befruktning (dpf) avliva eekterna med tricainmetensulfonat (0,03 %) och samla upp till 15 larver i ett 2 mL-rör med hjälp av en glaspipett- och pipettpump.
- Tvätta larver två gånger med 1 ml kallt (4 °C) 1x fosfatbuffrad saline (PBS) på is. För varje tvätt, ta bort så mycket vätska som möjligt från röret med en glaspipett och pipettpump, och tillsätt sedan 1 ml kall PBS till röret.
- Ta bort så mycket PBS som möjligt med hjälp av en glaspipett- och pipettpump och tillsätt 1 ml kallt (4 °C) 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS.
VARNING: PFA är en irriterande och misstänkt cancerframkallande. Handskar ska bäras vid hantering av PFA, och koncentrerade lösningar bör hanteras i en kemisk rökhuva. - Inkubera vid 4 °C minst över natten (men upp till flera månader) med mild gungning.
2. Dissekera vävnader kring levern
- Ta bort larver från PFA genom att skölja 3x med 1 ml kallt (4 °C) PBS och gunga i 5 min mellan sköljningar.
OBS: Det är okej att hålla sköljlarverna i PBS i en dag eller två vid 4 °C. - Pipette flera larver i PBS i en brunn av en 9-brunn runda-botten glasskålen.
- Ta bort huden som omger levern.
- Använd fina pincett för att hålla larver på ryggen (magen upp), gripande på vardera sidan av huvudet så försiktigt som möjligt. Använd sedan mycket fina pincett i din andra hand för att ta tag i huden bara överliggande hjärtat.
- Dra huden ner diagonalt mot svansen av fisken och botten av skålen på vänster eller höger sida av fisken. Upprepa för andra sidan (höger eller vänster sida).
- Fortsätt greppa klaffar av hud och dra ner / tillbaka tills all hud och melanophores överliggande eller nära levern har tagits bort.
- Ta bort äggula, om det finns.
- För 5–6 dpf larver, lyft äggula av i ett stycke genom att hålla fisken med fina pincett på ryggen och använda de mycket fina pincetten för att prod äggula försiktigt.
- För 3–4 dpf larver, skrapa äggula av i bitar. Håll fisken med fina pincett på ryggen och använd de mycket fina pincetten för att stroke äggula, från ventrala sidan.
- Placera dissekerade larver i färsk kall PBS med hjälp av en glaspipett och pipettpump.
3. Avbildning
- För att montera larver, häll några ml av 3% metylcellulosa på locket på en ren plast Petri skålen.
- Använd en glaspipett och pipettpump för att lägga till larver i metylcellulosa, lägga till så lite PBS med larverna som möjligt.
- Under ett dissekering mikroskop vid låg förstoring, använd fina pincett för att orientera fisken så att de lägger på sin högra sida, vänd åt vänster.
Obs! - Ta en bild av varje fisk.
- Bekräfta att fisken som ska fotograferas är i linje perfekt, med ett öga direkt ovanpå det andra ögat. Om det behövs, använd fina pincett för att trycka lätt på huvudet eller svansen av fisk för att justera orienteringen. Om fiskens svans böjs, ta bort svansen genom att nypa den kraftfullt med pinps att ta bort den så att fisken lägger platt.
- Zooma in till hög förstoring och fokusera på levern, se till att leverns kontur är tydligt synlig.
- Fäst en bild och spara filen.
- Upprepa för all fisk, se till att förstoringen är densamma för varje bild.
- Ta en bild av en mikrometer med samma förstoring (se figur 2H).
4. Bildanalys
- Mät området för varje fisklever med hjälp av bildbehandlingsprogram.
- Blinda alla lever bilder för att undvika potentiella utredare bias och främja vetenskaplig stringens15. Det här steget kan göras manuellt av en annan labbmedlem eller använda ett datorprogram (Kompletterande material). Byt namn på filer slumpmässigt och skapa en "randomiseringsfil" som innehåller en lista över de ursprungliga filnamnen och motsvarande förblindade filnamn.
- Öppna randomiserade filer i ordning, med början i fil 1.
- Välj frihandsval skissering varje lever.
- Tryck ctrl-M för att mäta området för varje lever.
- För alla lever som inte kan mätas exakt, sätt in en platshållarmätning (mycket liten eller mycket stor, så att den enkelt kan uteslutas senare).
- Spara måtten i en textfil ("måttfil").
- Ta bort blinda och analysera data
- Öppna "måttfil" och "randomiseringsfil" i ett kalkylbladsprogram.
- Infoga en ny kolumn i "måttfilen" och lägg till de ursprungliga filnamnen för de förblindade filerna med hjälp av "randomiseringsfilen". Spara den här filen som "oblindad måttfil".
- Sortera data efter ursprungligt filnamn.
- Var noga med att utesluta eventuella levermätningar för vilka bilderna var otillräckliga (se figur 2A–G).
- Om det behövs konverterar du mätvärdena till önskad skala (till exempel mm2).
- Öppna skalningsfältet i bildbehandlingsprogramvaran.
- Använd det raka linjens verktyg för att mäta 1 mm på skalstången. Bildbehandlingsprogrammen kommer att mäta i samma enheter som levern (pixlar), vilket ger en konverteringsfaktor.
- Använd konverteringsfaktorn för att konvertera mätningar i "oblindad måttfil".
- Använd kalkylbladsprogrammet eller klistra in data i en vetenskaplig graf- och statistikprogramvara, bestämma medelvärde och standardavvikelse och beräkna p-värde.Using the spreadsheet program or pasting data into a scientific graphing and statistics software, determine mean and standard deviation and calculate p value(s).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Transgena zebrafisk uttrycker hepatocyte-specifika aktiverade β-catenin (Tg (fabp10a: pt-β-katt) zebrafisk)3 och icke-transgena kontroll syskon avlivades vid 6 dpf och leverområde kvantifierades med brightfield mikroskopi och bildbehandling programvara. Transgena zebrafiskar har avsevärt ökat leverstorleken (0,0006 cm2) jämfört med deras icke-transgena syskon (0,0004 cm2, p < 0,0001; figur 1).
Figur 1: Analys av leverstorlek av 6 dpf (dagar efter befruktningen) zebrafisk. (A-B) Representativ brightfield bild av 6 dpf icke-transgena zebrafisk larva, som visar naturlig position och form av lever överliggande tarmen. Leverområdet har beskrivits i (B). Skalstänger = 0,1 mm. (C-D) Representativ brightfield bild av 6 dpf transgena zebrafisk larva uttrycker hepatocyte-specifika aktiverade b-catenin (ABC), visar förstorad lever. Leverområdet har beskrivits i (D). Skalstänger = 0,1 mm. (E) Diagram som visar mätningar av leverstorlek (medelvärde ± standardavvikelse) på 6 dpf icke-transgena zebrafisklarver (icke-Tg) och transgena zebrafisklarver som uttrycker hepatocytespecifik aktiverad b-katenin (ABC). Prover jämfördes med hjälp av oparade t-test. p < 0.0001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Exempel på otillräckliga bilder och mikrometer. - Jag är ledsen, men detär inte. Representativa bilder av larvlever som bör uteslutas från analys. Skalstänger = 0,1 mm. (A) Larver med hud som täcker levern. (B) Larver med äggula som skymmer levern. (C) Larver med delar av levern klämde av. (D)Larver med leverur led och faller av. (E)Larver med saknad lever. (F) Larver med leverkontur som är svår att identifiera eftersom bilden är suddig/out-of-focus. (G) Larver med felaktig positionering. De två ögonen är inte i linje direkt ovanpå varandra. (H) Bild av mikrometern, som används för att generera skalstänger och konvertera bildbearbetning programvara mätningar från pixlar till cm2. Klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kvantifiering av leverstorlek är avgörande i studier som syftar till att förstå leverutveckling, förnyelse och onkogenes. Protokollet beskrivs här är en relativt snabb, enkel och billig teknik för leverstorlek kvantifiering i larval zebrafisk. Att iaktta lämplig försiktighet när du utför vissa aspekter av protokollet kan hjälpa till att öka noggrannheten i resultaten och minskad frustration.
Korrekt fixering av larverna är avgörande för att få välbevarade biologiska prover och förhindra deras sönderfall. Utspädning av 4% PFA-lösningen kan uppstå när PBS inte avlägsnas helt före tillsats av PFA till sköljna larver. Använda välgjorda PFA-lösningar och pipetting ut hela eller de flesta av PBS-lösningen före PFA tillägg är användbart för att lösa detta problem.
Även om snabb och lätt att utföra efter mycket övning, dissekering snuten kräver betydande manuell fingerfärdighet. Medan dissekera, Det är viktigt att ta bort huden och äggula helt bort från ovanför levern så att hela levern utsätts. Underlåtenhet att göra detta kan resultera i bilder där synen på levergränsen är dold(figur 2A, B). Okvalificerade och kraftfulla rörelser samtidigt som dissekering kan leda till att man klämmer av delar av levern (figur 2C) eller lossning av levertillbehör, vilket leder till att levern förflyttas (figur 2D) eller saknas helt (figur 2E). Användarna bör lägga in tillräckligt många timmar för att finslipa sina dissekerande färdigheter på övningsprover innan de går vidare till experimentella prover.
Under monteringen har huden ovanför levern avlägsnats, vilket ökar sannolikheten för att levern faller ut under efterföljande steg. För att undvika denna möjlighet bör milda rörledningar användas under denna process.
Under bildupphandling med hjälp av brightfield mikroskop, är det viktigt att god kvalitet bilder tas. Suddiga, out-of-focus bilder kommer att göra det svårt att bedöma den verkliga gränsen för levern(Figur 2F). Eftersom denna metod innebär att mäta ytan av den vänstra loben i levern, är det viktigt att larven är orienterad väl på sin sida och inte lutas (figur 2G). Se till att båda ögonen på larven är i linje (ett öga som täcker synen på den andra). När du mäter ytan med hjälp av bildbehandlingsprogram är det viktigt att dra gränsen så nära som möjligt till den verkliga konturen av levern för att undvika mätavvikelser. Uteslut alla bilder där levern inte kan mätas korrekt (figur 2A–G). Men kom ihåg att utesluta lever kan skeva data, eftersom större lever är mer benägna att störas än mindre lever.
En av begränsningarna i detta protokoll är att det gäller endast fasta larver. Alternativa metoder såsom fluorescensmikroskopi kan användas för att mäta leverstorlek i levande larver som uttrycker hepatocyte-specifika fluorescerande reportrar5,7,10. Dessa alternativa metoder gör det möjligt att göra sekventiella mätningar på samma djur, och de är också snabbare, eftersom de inte kräver fixering eller dissekering av vävnaderna som överdriver levern. Fördelarna med detta protokoll jämfört med fluorescensmikroskopi hos levande djur är: 1) större flexibilitet när det gäller när lever mäts, eftersom zebrafiskar kan hållas i fixativt i veckor eller månader innan de fotograferas; 2) inget krav på att införliva en fluorescerande reporter, som kan vara besvärligt när det handlar om homozygota mutanter; och 3) tillämplighet av steg 1 och 2 för andra experiment, inklusive immunofluorescens färgning eller in situ hybridisering studier. Vi använder båda metoderna, beroende på den specifika applikationen. Till exempel använder vi vanligtvis levande avbildning och hepatocyte-specifika reportrar för hög genomströmning screening3, och följa upp potentiella hit föreningar med hjälp av protokollet beskrivs här3.
Detta protokoll tar endast hänsyn till ytan för kvantifiering av leverstorlek, så det inte upptäcka förändringar i cellmetabolism eller morfologi, inte heller skiljer mellan ökningar i cellantal och ökningar i cellstorlek. För att åtgärda denna begränsning, kompletterande analyser för att bedöma steatosis16, histologi6, cell nummer8,11, cellstorlek3,17, spridning3,18och / eller apoptos19 kan utföras.
En annan begränsning av detta protokoll är att det förutsätter att ökningar eller minskningar i ytan av den vänstra leverloben återspeglar förändringarna i ytan och volymen av lever som helhet. Detta antagande kan inte gälla när levertillväxt är icke-enhetlig. För att undersöka leverform och kontrollera om det inte är symmetriska ökningar av levertillväxten gör vi rutinmässigt ljusbladsfluorescensmikroskopi8 eller konfokal mikroskopi3 på våra transgena modeller. Ljusark fluorescens mikroskopi kan användas för att direkt kvantifiera larvlever volym8. I transgena zebrafiskar som uttrycker hepatocytespecifika Yap1 ökade leverområdet och levervolymen på liknande sätt jämfört med icke-transgena kontrollsyskon8.
Den dissektion teknik som beskrivs här kan kombineras med immunofluorescens färgning, cell-specifika fluorescerande reporter linjer, och / eller andra märkning tekniker för att studera andra aspekter av leverutveckling förutom leverstorlek3,19,20. Eftersom detta dissekeringsprotokoll också exponerar tarmen och bukspottkörteln, kan det vara till hjälp för studier av andra viscerala organ också.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill erkänna Maurine Hobbs och centraliserad zebrafisk Animal Resource (CZAR) vid University of Utah för att tillhandahålla zebrafisk hållning, laboratorieutrymme och utrustning för att utföra delar av denna forskning. Utbyggnaden av CZAR stöds delvis av NIH-bidrag # 1G20OD018369-01. Vi vill också tacka Rodney Stewart, Chloe Lim, Lance Graham, Cody James, Garrett Nickum och Huntsman Cancer Institute (HCI) Zebrafish Facility för zebrafisk vård. Vi vill tacka Kenneth Kompass för hjälp med R programmering. Detta arbete finansierades delvis genom bidrag från Huntsman Cancer Foundation (i samband med bidrag P30 CA042014 tilldelas Huntsman Cancer Institute) (KJE) och NIH/NCI R01CA222570 (KJE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Camera for dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Fine (Dumont #5) forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Glass pipets | VWR | 14672-608 | |
| Image analysis software | Image J/FIJI | ImageJ/FIJI can be dowloaded for free: https://imagej.net/Welcome | |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phosphate-buffered saline | Various suppliers | ||
| Pipette pump | VWR | 53502-233 | |
| Plastic Petri dishes | USA Scientific Inc | 2906 | |
| Pyrex 9-well round-bottom glass dish | VWR | 89090-482 | |
| Software for blinding files | R project | R can be downloaded for free: https://www.r-project.org/ | |
| Scientific graphing and statistics software | GraphPad Prism | ||
| Spreadsheet program | Microsoft Excel | ||
| Tricaine methanesulfonate (Tricaine-S) | Western Chemical | 200-226 | |
| Very fine (Dumont #55) forceps | Fine Science Tools | 11255-20 |
References
- Lin, D. -C., et al. Genomic and Epigenomic Heterogeneity of Hepatocellular Carcinoma. Cancer Research. 77 (9), 2255-2265 (2017).
- Ghouri, Y. A., Mian, I., Rowe, J. H. Review of hepatocellular carcinoma: Epidemiology, etiology, and carcinogenesis. Journal of Carcinogenesis. 16, 1 (2017).
- Evason, K. J., et al. Identification of Chemical Inhibitors of β-Catenin-Driven Liver Tumorigenesis in Zebrafish. PLoS Genetics. 11 (7), 1005305 (2015).
- Kalasekar, S. M., et al. Heterogeneous beta-catenin activation is sufficient to cause hepatocellular carcinoma in zebrafish. Biology Open. 8 (10), (2019).
- Nguyen, A. T., et al. A high level of liver-specific expression of oncogenic Kras(V12) drives robust liver tumorigenesis in transgenic zebrafish. Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 801-813 (2011).
- Nguyen, A. T., et al. An inducible kras(V12) transgenic zebrafish model for liver tumorigenesis and chemical drug screening. Disease Models & Mechanisms. 5 (1), 63-72 (2012).
- Li, Z., et al. A transgenic zebrafish liver tumor model with inducible Myc expression reveals conserved Myc signatures with mammalian liver tumors. Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 414-423 (2013).
- Cox, A. G., et al. Yap reprograms glutamine metabolism to increase nucleotide biosynthesis and enable liver growth. Nature Cell Biology. 18 (8), 886-896 (2016).
- Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease. Development. 132 (15), Cambridge, England. 3561-3572 (2005).
- Huang, X., Zhou, L., Gong, Z. Liver tumor models in transgenic zebrafish: an alternative in vivo approach to study hepatocarcinogenes. Future Oncology. 8 (1), London, England. 21-28 (2012).
- Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. Tumor-Associated Neutrophils and Macrophages Promote Gender Disparity in Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish. Cancer Research. 77 (6), 1395-1407 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2012).
- Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
- Dai, W., et al. High fat plus high cholesterol diet lead to hepatic steatosis in zebrafish larvae: a novel model for screening anti-hepatic steatosis drugs. Nutrition & Metabolism. 12, 42 (2015).
- Kim, S. -H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin. Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 255-267 (2011).
- Delous, M., et al. Sox9b is a key regulator of pancreaticobiliary ductal system development. PLoS Genetics. 8 (6), 1002754 (2012).
- Shin, D., Lee, Y., Poss, K. D., Stainier, D. Y. R. Restriction of hepatic competence by Fgf signaling. Development. 138 (7), Cambridge, England. 1339-1348 (2011).
- Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. R. The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. 56 (5), Baltimore, Md. 1958-1970 (2012).
