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Biochemistry

सफल क्रिस्टलीकरण के लिए विजुअल जीपीसीआर-मिनी-जी प्रोटीन सिग्नलिंग कॉम्प्लेक्स की रणनीतिक स्क्रीनिंग और लक्षण वर्णन

Published: March 16, 2020 doi: 10.3791/60747
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 4, 4, 4, 1
1Laboratory of Biomolecular Research, Paul Scherrer Institute, 2Department of Biology, ETH Zürich, 3Center for Radiopharmaceutical Sciences, Paul Scherrer Institute, 4Laboratory of Molecular Biology, Medical Research Council

Summary

इस रिपोर्ट में विजुअल जीपीसीआर, रोडोप्सिन और मिनी-जीओके साथ इसके कॉम्प्लेक्स को तैयार करने के लिए विभिन्न डिटर्जेंट की स्क्रीनिंग का वर्णन किया गया है । शुद्धिकरण के दौरान विभिन्न चरणों में परिसर की गुणवत्ता की विशेषता वाले जैव रासायनिक तरीकों का प्रदर्शन किया जाता है। इस प्रोटोकॉल को उनके भविष्य के संरचनात्मक अध्ययनों के लिए अन्य झिल्ली प्रोटीन परिसरों में सामान्यीकृत किया जा सकता है।

Abstract

झिल्ली प्रोटीन परिसरों की क्रिस्टल संरचनाओं का निर्धारण करने की कुंजी क्रिस्टलीकरण से पहले नमूने की गुणवत्ता है। विशेष रूप से, डिटर्जेंट का चुनाव महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह परिसर की स्थिरता और मोनोफैलाव दोनों को प्रभावित करता है। हमने हाल ही में 3.1 Å संकल्प पर एक इंजीनियर जी प्रोटीन, मिनी-जीओके साथ-साथ गोजातीय रोडोप्सिन की सक्रिय स्थिति की क्रिस्टल संरचना निर्धारित की। यहां, हम रोडोप्सिन-मिनी-जीओ कॉम्प्लेक्स की तैयारी को अनुकूलित करने की प्रक्रिया का विस्तार करते हैं। डार्क-स्टेट रोडोप्सिन को शास्त्रीय और नेलोप्टाइल ग्लाइकोल (एनपीजी) डिटर्जेंट में तैयार किया गया था, जिसके बाद प्रकाश एक्सपोजर के तहत मिनी-जीओ के साथ जटिल गठन किया गया था। रोडोप्सिन की स्थिरता का आकलन पराबैंगनी-दृश्यमान (यूवी-विस) स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा किया गया था, जो प्रकाश-संवेदनशील लिगामेंट, 9-सीआईएस रेटिना के रोडोप्सिन में पुनर्गठन की निगरानी करता है। स्वचालित आकार-अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी (एसईसी) का उपयोग रोडोप्सिन और रोडोप्सिन-मिनी-जीओ कॉम्प्लेक्स की मोनोडिस्टिसिटी को चित्रित करने के लिए किया गया था। एसडीएस-पॉलीएक्रिलैमाइड इलेक्ट्रोफोरेसिस (एसडीएस-पेज) ने कूमासी नीले रंग के साथ जेल को धुंधला करने के बाद रोडोप्सिन और मिनी-जीओ के बीच 1:1 मोलर अनुपात की पहचान करके परिसर के गठन की पुष्टि की। इस सभी विश्लेषणात्मक डेटा को क्रॉस-मान्य करने के बाद, हमने अनुपयुक्त डिटर्जेंट को समाप्त कर दिया और बड़े पैमाने पर तैयारी और क्रिस्टलीकरण के लिए सर्वश्रेष्ठ उम्मीदवार डिटर्जेंट के साथ जारी रखा। एन-ग्लाइकोसिलेशन की विषमता से एक अतिरिक्त समस्या उत्पन्न हुई। विषमरूप से व्यक्त रोडोप्सिन को एसडीएस-पेज पर दो अलग-अलग एन-ग्लाइकोसिलेटेड आबादी के लिए मनाया गया था, जो शायद क्रिस्टलोजेनेसिस में रुकावट डालता था। इसलिए, विभिन्न डिग्लाइकोसिलेशन एंजाइमों का परीक्षण किया गया, और एन-ग्लाइकोसिलेशन की एक प्रजाति के साथ रोडोप्सिन का उत्पादन किया गया। प्रोटीन की गुणवत्ता की विशेषता के लिए इस रणनीतिक पाइपलाइन के साथ, क्रिस्टल संरचना देने के लिए रोडोप्सिन-मिनी-जीओ कॉम्प्लेक्स की तैयारी को अनुकूलित किया गया था। यह केवल जीपीसीआर-जी प्रोटीन सिग्नलिंग कॉम्प्लेक्स की तीसरी क्रिस्टल संरचना थी। नमूना तैयारी और संरचना निर्धारण की सुविधा के लिए अन्य झिल्ली प्रोटीन और उनके परिसरों के लिए भी इस दृष्टिकोण को सामान्यीकृत किया जा सकता है।

Introduction

झिल्ली प्रोटीन और उनके परिसरों की क्रिस्टल संरचनाओं का निर्धारण हमेशा अच्छी तरह से विवर्तित क्रिस्टल प्राप्त करने में कठिनाइयों के कारण चुनौतीपूर्ण रहा है। घुलनशील प्रोटीन के विपरीत, अभिन्न झिल्ली प्रोटीन में एक हाइड्रोफोबिक कोर शामिल है जो कोशिका झिल्ली तक फैला है। कोशिका झिल्ली से झिल्ली प्रोटीन को जलीय बफर में हटाने के लिए, डिटर्जेंट का उपयोग डिटर्जेंट-प्रोटीन मिसेल बनाने के लिए किया जाना चाहिए, इस प्रकार झिल्ली प्रोटीन के हाइड्रोफोबिक कोर के आसपास लिपिड की जगह। झिल्ली प्रोटीन की स्थिरता, गतिविधि और अखंडता सीधे डिटर्जेंट1के रासायनिक और संरचनात्मक गुणों पर निर्भर करती है, और डिटर्जेंट के गुण भी मिसेल के आकार को निर्धारित करते हैं। एक बड़ा डिटर्जेंट मिसेल एक छोटी झिल्ली प्रोटीन की हाइड्रोफिलिक सतहों को रोक सकता है, इस प्रकार वाष्प प्रसार विधि का उपयोग करते समय क्रिस्टल संपर्कों की कमी के कारण क्रिस्टलीकरण को रोक सकता है। एक छोटा डिटर्जेंट मिसेल क्रिस्टलोग्राफी के लिए फायदेमंद होता है, लेकिन शॉर्ट चेन डिटर्जेंट आमतौर पर कठोर होते हैं और इसलिए झिल्ली प्रोटीन के अस्थिरता और एकत्रीकरण का कारण बनते हैं। इसलिए, क्रिस्टलीकरण से पहले, एक अतिरिक्त डिटर्जेंट स्क्रीनिंग प्रक्रिया अपरिहार्य है, आमतौर पर छोटे डिटर्जेंट को लक्षित करती है जो अभी भी प्रोटीन स्थिरता बनाए रखती है।

जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स (जीपीसीआरएस) अभिन्न झिल्ली प्रोटीन होते हैं जिनमें सात ट्रांसमेम्ब्रेन ए-हेलिक्स होते हैं। GPCRs दो मुख्य राज्यों में मौजूद हैं, या तो एक निष्क्रिय राज्य विलोम agonists या विरोधी, या एक सक्रिय राज्य एक पीड़ावादी और एक जी प्रोटीन द्वारा स्थिर करने के लिए बाध्य द्वारा स्थिर है, हालांकि यह संभावना है कि उप राज्यों की एक भीड़ इन दो चरम सीमाओं के बीच मौजूद हैं । जीपीसीएर का संरचना निर्धारण शुरू में सक्रिय राज्यों की तुलना में अधिक स्थिरता के कारण नास्तिकों और विरोधियों को उलटा करने के लिए बाध्य निष्क्रिय राज्यों पर केंद्रित था। जब जीपीसीआरएस एगोनिस्ट बाइंडिंग पर सक्रिय होते हैं, तो रिसेप्टर्स अत्यधिक गतिशील होते हैं, और जी प्रोटीन युग्मन के लिए रिसेप्टर के साइटोप्लाज्मिक चेहरे पर एक फांक रूप क्षणिक रूप ों का रूप लेते हैं। यह सोचा जाता है कि यह गतिशीलता है क्यों पीड़ावादी-बाध्य GPCRs अक्सर निष्क्रिय राज्य की तुलना में अधिक अस्थिर हैं । इसलिए, अध्ययन के तहत रिसेप्टर की संरचना की स्थिति के लिए उपयुक्त डिटर्जेंट के लिए स्क्रीन करना आवश्यक हो जाता है, क्योंकि यह संभावना है कि निष्क्रिय स्थिति की तुलना में सक्रिय राज्य का अध्ययन करने के लिए मामूली डिटर्जेंट की आवश्यकता होगी।

इस रिपोर्ट में, हम दृश्य GPCR, गोजातीय रोडोपसिन3का उपयोग करें, और इसके जटिल मिनी जीओ प्रोटीन4,,5 डिटर्जेंट स्क्रीनिंग प्रयोगों के लिए, निष्क्रिय राज्य और सक्रिय राज्य का प्रतिनिधित्व, क्रमशः । डिटर्जेंट स्क्रीनिंग शास्त्रीय एल्किल माल्टोसाइड और ग्लूकोसाइड डिटर्जेंट और नेलोटिल ग्लाइकोल (एनपीजी) डिटर्जेंट पर केंद्रित थी। इस संदर्भ में, एक शास्त्रीय डिटर्जेंट एक चीनी सिर समूह और एक एल्किल श्रृंखला से बनाया गया है, जबकि एनपीजी प्रकार के डिटर्जेंट में दो समान शास्त्रीय डिटर्जेंट होते हैं जो शर्करा और एल्किल चेन6,7,7,8के बीच इंटरफेस पर एक क्वाटररी कार्बन से जुड़े होते हैं।

एक प्रयोगात्मक कार्यप्रवाह विभिन्न डिटर्जेंट में रोडोप्सिन की शुद्धि से शुरू किया गया था, जिसके बाद रोडोप्सिन-मिनी-जीओ कॉम्प्लेक्स का गठन किया गया था और कई तरीकों(चित्रा 1)का उपयोग करके परिसर के लक्षण वर्णन के साथ समाप्त हुआ था। रोडोप्सिन की निष्क्रिय स्थिति के लिए, प्रकाश संवेदनशील लिगामेंट और 9-सीआईएस रेटिना के पुनर्गठन की निगरानी पराबैंगनी-दृश्यमान (यूवी-विस) स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा की गई थी। स्पेक्ट्रम रेटिना की भौतिक रासायनिक स्थिति का पता चलता है और रोडोप्सिन की रेटिना बाध्यकारी जेब में अपने पर्यावरण का संकेत है । शुद्ध रोडोप्सिन की एकाफैलता का आकलन करने के साथ-साथ रोडोप्सिन-मिनी-जीओ कॉम्प्लेक्स के गठन के लिए आकार बहिष्कार क्रोमेटोग्राफी (एसईसी) नियोजित किया गया था। चूंकि एसईसी प्रोटीन अणुओं को उनके आकार और आकार से अलग करता है, इसलिए कुल मिश्रित प्रोटीन आबादी की पहचान की जा सकती है क्योंकि वे शून्य मात्रा में एकत्र ित होते हैं। जटिल गठन की पुष्टि करने के लिए, एसईसी के अंशों का मूल्यांकन सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलीएक्रिलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (एसडीएस-पेज) द्वारा किया गया था ताकि रोडोप्सिन और मिनी-जीओदोनों की उपस्थिति की पुष्टि की जा सके।

एक अन्य कारक जिस पर विचार करने की आवश्यकता है वह झिल्ली प्रोटीन पर ट्रांसलेशनल संशोधन (पीटीएम) है। पीटीएम जैसे एन-ग्लाइकोसिलेशन अक्सर स्तनधारी और कीट कोशिका अभिव्यक्ति प्रणालियों में उत्पादित यूकेरियोटिक झिल्ली प्रोटीन पर मनाया जाता है। मानव भ्रूणीय गुर्दे 293 (HEK293) कोशिकाओं का एक सीमित एन-ग्लाइकोसिलेशन तनाव जीन एन्कोडिंग एन-एसिटिलग्लूकोजेमिनेलट्रांसफरेज़ I (GnTI) को हटाने के द्वारा विकसित किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप आम सहमति स्थल Asn-X-Ser/Thr पर GlcNAc2Man5 द्वारा समरूप एन-ग्लाइकोसिलेशन हालांकि एन-ग्लाइकोसिलेशन को आम सहमति साइट में अमीनो एसिड अवशेषों को म्यूट करके रोका जा सकता है, यह प्रोटीन के कार्य या तह की दक्षता को भी बदल सकता है। गोजातीय रोडोप्सिन में, एन-ग्लाइकोसिलेटेड अवशेष Asn15 का उत्परिवर्तन गलत तह और कम जी प्रोटीन सक्रियण9,,10की ओर जाता है। इस रिपोर्ट में इस्तेमाल किए गए रोडोप्सिन को एचईके 293 जीएनपीआई-कमी सेल लाइन में व्यक्त किया गया था। हालांकि, एसडीएस-पेज ने रोडोप्सिन की दो प्रजातियों की उपस्थिति दिखाई । यह विषमता क्रिस्टल गठन को रोक सकती है और इसलिए पेप्टाइड-एन-ग्लाइकोसिडेस एफ (पीएनगास एफ) और एंडोग्लिकोसिडेस एफ 1 (एंडो एफ 1) का परीक्षण किया गया था। डिग्लाइकोसिलेटेड उत्पाद को ग्लाइकोसिलेशन के स्तर और इसकी एकरूपता की पहचान करने के लिए एसडीएस-पेज और लिक्विड क्रोमेटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस) की विशेषता थी।

Protocol

नोट: डिटर्जेंट स्क्रीनिंग के लिए यह प्रोटोकॉल शुरू सामग्री के रूप में HEK293 सेल पैलेट के 30 ग्राम के लिए विस्तृत है।

1. सामग्री, रसायन और अभिकर्मक

नोट: विश्लेषणात्मक ग्रेड अभिकर्मकों और अल्ट्राप्यूरी जल का उपयोग करके सभी समाधान तैयार किए जाते हैं, जो 25 डिग्री सेल्सियस पर 18.2 MΩ सेमी की प्रतिरोधकता तक पहुंचने के लिए डिओनाइज्ड पानी से शुद्ध होते हैं।

  1. बफर स्टॉक समाधान
    1. 10x फॉस्फेट बफरेड लवइन (10x पीबीएस) तैयार करें।
    2. HEPES बफर तैयार करें: 1 एम, NaOH के साथ पीएच 7.5 के लिए titrated।
    3. 5 एम नैसीएल तैयार करें।
    4. 2 एम एमजीसीएल2तैयार करें।
      नोट: सभी स्टॉक समाधान अपनी बंध्यता बनाए रखने के लिए 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से पारित किए जाते हैं।
  2. डिटर्जेंट स्टॉक समाधान
    1. डॉडेसिल माल्टोसाइड (डीडीएम), 10% (w/v) तैयार करें।
    2. डेसिल माल्टोसाइड (डीएम), 10% (w/v) तैयार करें।
    3. 6- साइक्लोहेक्सिल-हेक्सिल माल्टोसाइड (साइमल-6), 10% (w/v) तैयार करें।
    4. 5- साइक्लोहेक्सिल-पेंटिल माल्टोसाइड (सायमल-5), 10% (w/v) तैयार करें।
    5. नॉनिल ग्लूकोसाइड (C9G), 10% (w/v) तैयार करें ।
    6. लॉरिल माल्टोज नेलोटिल ग्लाइकोल (एलएमएनजी), 5% (w/v) तैयार करें।
    7. डेसिल माल्टोज नेलोटिल ग्लाइकोल (डीएमएनजी), 10% (w/v) तैयार करें।
    8. साइमल-6 नेलोटिल ग्लाइकोल (C6NG), 10% (w/v) तैयार करें ।
    9. साइमल-5 नेलोटिल ग्लाइकोल (C5NG), 10% (w/v) तैयार करें ।
    10. ओक्टाइल ग्लूकोज नेलोटिल ग्लाइकोल (ओजीएनजी), 10% (w/v) तैयार करें।
      नोट: 10% डिटर्जेंट स्टॉक समाधान के लिए, कोमल कमाल के साथ अल्ट्राप्ली पानी में 1 ग्राम डिटर्जेंट पाउडर भंग करें, और फिर अंतिम मात्रा को 10 मिलील में समायोजित करें। डिटर्जेंट स्टॉक समाधान को दीर्घकालिक भंडारण के लिए और काम करते समय बर्फ पर -20 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाना चाहिए।
      सावधानी: बोतलबंद डिटर्जेंट आमतौर पर -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर पर स्टोर करने की सिफारिश की जाती है। डिटर्जेंट पाउडर युक्त बोतलों को खोलने से पहले कमरे के तापमान पर गर्म किया जाना चाहिए। डिटर्जेंट पाउडर हाइग्रोस्कोपिक है, इसलिए तापमान समतुल्यता संघनन के गठन को रोकदेगी जो डिटर्जेंट को गीला कर देगी।
  3. अन्य रसायन और अभिकर्मक
    1. 1D4 इम्यूनोफिनिटी अगारोज रेसिन तैयार करें: 50% घोल का 10 एमएल।
      नोट: 1D4 इम्यूनोफिनिटी अगारोज मोनोक्लोनल Rho1D4 एंटीबॉडी के साथ जुड़े अगारोज मोतियों हैं, जो गोजातीय रोडोप्सिन TETSQVAPA के अंतिम 9 अमीनो एसिड को एपिटोप के रूप में बांधते हैं। 1D4 इम्यूनोफिनिटी अगारोज प्रोटीन को कैप्चर करने के लिए आत्मीयता शुद्धिकरण सामग्री के रूप में काम करता है जिसमें सी-टर्मिनल 1D4 अनुक्रम होता है। यह शुद्धिकरण सामग्री9,,11 या खरीदी जा सकती है।
    2. 9-सीआईएस रेटिना समाधान तैयार करें: 1 mM, 100% इथेनॉल में भंग।
      नोट: तैयारी और भंडारण के दौरान रेटिना के प्रकाश जोखिम को रोकें।
    3. 1D4 पेप्टाइड (अनुक्रम TETSQVAPA) तैयार करें: 800 माइक्रोन, पानी में भंग।
  4. बफ़र्स
    नोट: सभी बफ़र्स स्टॉक समाधान से वांछित एकाग्रता के लिए मिश्रित होते हैं। उपयोग से पहले सभी बफ़र्स को 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा किया जाता है।
    1. बफर ए तैयार करें: पीबीएस, 0.04% डीडीएम।
    2. बफर बी तैयार करें: 20 एमएम एचईपीपीएच 7.5, 150 एमएम एनआइसीएल, 0.04% डीडीएम।
    3. बफर सी तैयार करें: तालिका 1में सूचीबद्ध उनके काम करने की एकाग्रता पर 20 एम एम हेप्स पीएच 7.5, 150 एमएम एनएसीएल और डिटर्जेंट।
    4. बफर डी तैयार करें: 20 एमएम हेप्स पीएच 7.5, 150 एमएम एनआल।
    5. एल्यूशन बफर तैयार करें: 20 mM HEPES पीएच 7.5, 150 mM NaCl, 80 μM 1D4 पेप्टाइड, और डिटर्जेंट उनके काम एकाग्रता पर।
    6. एसईसी बफर तैयार करें: 20 एमएम एचईपीपीएच 7.5, 150 एमएम एनआल, 0.025% डीडीएम; 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से निस्पंद किया गया।
  5. एलसी-एमएस के लिए सॉल्वेंट
    1. सॉल्वेंट ए तैयार करें: 0.1% फोरिक एसिड युक्त एसीटोनिट्रिल।
    2. सॉल्वेंट बी तैयार करें: अल्ट्राप्योर पानी जिसमें 0.1% फोरमिक एसिड होता है।
    3. सॉल्वेंट सी तैयार करें: आईएसओ-प्रोपेनॉल।

2. सेल झिल्ली घुलनशीलता और प्रोटीन निष्कर्षण

  1. HEK293 GnTI के 30 ग्राम गल-सेल गोली गोजातीय rhodopsin उत्परिवर्ती N2C/M257Y/D282C3,,9 कमरे के तापमान को व्यक्त, 1x PBS बफर के १२० मीटर जोड़ने प्रोट अवरोधक कॉकटेल युक्त और एक Dounce समरूपता या एक बिजली होमोजन (30 एस के लिए १३,००० rpm) का उपयोग कर समरूप । बीकर में समरूप सेल निलंबन को एकत्र करें और वॉल्यूम को 150 मीटर तक समायोजित करें।
    नोट: सेल गोली के 30 ग्राम 2 x 106 सेल/mL घनत्व पर सेल संस्कृति के 3 एल के बराबर है ।
  2. धीरे-धीरे 1.25% की अंतिम एकाग्रता देने के लिए समरूप कोशिकाओं में 10% डीडीएम जोड़ें। 1 घंटे के लिए बर्फ पर हिलाओ ।
  3. बेसोल्यूबिलाइज्ड मलबे को हटाने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस और 45 मिन के लिए 150,000 x ग्राम पर सेल लाइसेट करें।
  4. एक 500 mL बोतल के लिए supernatant हस्तांतरण और 1D4 इम्यूनोफिनिटी अगारोज रेसिन (50% घोल) के 10 mL जोड़ें। धीरे-धीरे 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे या रात भर के लिए घुलित कोशिका लिसैट और रेसिन मिलाएं।
  5. लेज़/रेसिन मिश्रण को एक खुले कॉलम में लोड करें ताकि रेसिन इकट्ठा किया जा।
  6. वॉश बफर ए के 10 कॉलम वॉल्यूम (सीवी) के साथ रेसिन को धोएं।
    नोट: कॉलम वॉल्यूम पैक्ड (100%) की मात्रा है अगारोज राल का उपयोग किया जाता है। इस मामले में, 1 सीवी 5 mL है।
  7. बफर ए के 2 सीवी के साथ रेसिन को फिर से निलंबित करें।
    सावधानी: चरण 2.8 के बाद से, मंद लाल प्रकाश की स्थिति के तहत किए जाने वाले चरणों को विवरण की शुरुआत में "[डार्क]" के साथ चिह्नित किया जाता है।
  8. [डार्क] 50 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता के लिए पुनर्निलंबित रेसिन में 9-सीआईएस रेटिना जोड़ें। अंधेरे में 4-16 घंटे के लिए धीरे-धीरे 4 डिग्री सेल्सियस पर मिलाएं।
    नोट: एक छोटे ऊष्मायन समय रेटिना के अधूरे पुनर्गठन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।
  9. [डार्क] कॉलम से प्रवाह निकालें। 20 सीवी बफर ए के साथ रेसिन धोएं, इसके बाद 15 सीवी बफर बी ।
  10. [डार्क] 2 सीवी बफर बी में रेसिन को फिर से निलंबित करें, और फिर रेसिन निलंबन को समान रूप से 10 10-mL निपटान स्तंभों में विभाजित करें।
  11. [डार्क] कॉलम से प्रवाह निकालें, और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 1 mL बफर सी इनक्यूबेट में रेसिन को फिर से निलंबित करें।
  12. [डार्क] दोहराएं चरण 2.11।
  13. [डार्क] कॉलम से प्रवाह निकालें, और फिर प्रत्येक कॉलम के लिए 0.8 mL Elution बफर में रेसिन को फिर से निलंबित करें। धीरे से 2 घंटे के लिए मिश्रण ।
  14. [डार्क] कॉलम से एल्यूशन को 2 मिलील ट्यूब में एकत्र करें।
  15. [डार्क] प्रत्येक कॉलम के लिए एल्यूटियन बफर के 0.7 एमएएल में रेसिन को फिर से निलंबित करें। धीरे से 1 घंटे के लिए मिश्रण ।
  16. [डार्क] कॉलम से एल्यूशन को एक ही ट्यूब में इकट्ठा करें।

3. यूवी-विस स्पेक्ट्रोस्कोपी

  1. 250-650 एनएम की माप सीमा को कवर करने के लिए स्पेक्ट्रोफोटोमीटर तैयार करें। पानी या एल्यूटियन बफर का उपयोग करके बेसलाइन रिकॉर्ड करें।
  2. [डार्क] लुटा हुआ प्रोटीन को क्वार्ट्ज क्यूवेट में लोड करें। प्रोटीन नमूने के स्पेक्ट्रम को मापें।
  3. [डार्क] 495 एनएम लंबे पास फिल्टर के माध्यम से पारित प्रकाश के साथ 2 मिन के लिए क्यूवेट में सीधे प्रोटीन रोशन करें।
  4. प्रबुद्ध नमूने के स्पेक्ट्रम को मापें।
  5. अंधेरे और प्रबुद्ध दोनों राज्यों, अन्य 9 डिटर्जेंट में शुद्ध सभी प्रोटीन नमूनों के लिए एक ही माप प्रदर्शन करें।
  6. एक्स-वाई स्कैटर चार्ट में घटता (अवशोषण बनाम तरंगदैर्ध्य) प्लॉट करें।

4. रोडोप्सिन और रोडोप्सिन-मिनी-जीओ कॉम्प्लेक्स की स्वचालित आकार-बहिष्कार क्रोमेटोग्राफी

  1. [डार्क] 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 केडीए के आणविक वजन कट-ऑफ (एमडब्ल्यूसीओ) के साथ स्पिन कंसंट्रेटर का उपयोग करके केंद्रीकरण द्वारा 100 माइक्रोन तक प्रोटीन को केंद्रित करें। अति केंद्रित नमूनों को एकाग्रता या बफर सी से प्रवाह का उपयोग करके पतला किया जा सकता है। प्रोटीन नमूना एकाग्रता निर्धारित करने के लिए, स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके 280 एनएम पर अवशोषण को मापें।
    नोट: चरण 4.2 के बाद से, प्रयोग के लिए अंधेरे वातावरण की आवश्यकता नहीं होती है, और इसलिए नमूने सामान्य प्रकाश के तहत तैयार किए जा सकते हैं।
  2. प्रत्येक डिटर्जेंट स्थिति के लिए 07 मिलीग्राम/मिलीग्राम पर 100 माइक्रोन रोडोप्सिन तैयार करें।
  3. प्रत्येक डिटर्जेंट स्थिति के लिए रोडोप्सिन (0.7 मिलीग्राम/एमएल) और मिनी-जीओ4,,12 (0.2 मिलीग्राम/एमएल) मिश्रण के 100 माइक्रोन तैयार करें। मिश्रण को 1 mM एमजीसीएल2के साथ पूरक करें। मिश्रण को 495 एनएम लंबे पास फिल्टर से प्रकाश के साथ रोशन करें और 30 किमी के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. एक तरल क्रोमेटोग्राफी प्यूरीफायर पर गोलाकार प्रोटीन के 10-600 केडीए की एक अंश रेंज के साथ 24 मिलीग्राम जेल निस्पंदन कॉलम माउंट करें। एसईसी बफर के साथ कॉलम को समरूप किया।
    नोट: तरल क्रोमेटोग्राफी प्यूरीफायर एक ऑटोसैंपलर, एक बहु तरंगदैर्ध्य डिटेक्टर और एक अंश कलेक्टर से लैस है।
  5. नमूनों को ऑटोसैंपलर शीशियों में स्थानांतरित करें और उन्हें नमूना ट्रे में रखें। कार्यक्रम अनुक्रमिक सेकंड स्वचालित करने के लिए एक विधि फ़ाइल प्रत्येक नमूने के लिए चलाता है, ऑटोसैंपलर लोडिंग के साथ कॉलम के लिए नमूना के ७७ μL, और प्यूरीफायर 0.5 mL/min प्रति रन की प्रवाह दर पर सेकंड बफर के 24 mL eluting । 280 एनएम और 380 एनएम पर अवशोषण रिकॉर्ड करें।
  6. 12.9 mL के आसपास प्रतिधारण मात्रा में रोडोप्सिन और रोडोप्सिन-मिनी-जीओ कॉम्प्लेक्स के चरम अंशों को एकत्र करें।
  7. कदम 4.2 से बाएं रोडोप्सिन नमूनों और कूमासी नीले धुंधला के साथ 4-12% एसडी-डेनाट्यूरिंग ढाल जैल पर रोडोप्सिन-मिनी-जीओ कॉम्प्लेक्स के चोटी के अंशों का विश्लेषण करें।
  8. एल्यूटियन क्रोमेटोग्राम (ए280 या380 बनाम प्रतिधारण मात्रा) प्लॉट करें।

5. डेग्लिकोसिलेशन और एलसी-एमएस अध्ययन

  1. एलसी-एमएस अध्ययन के लिए, केवल एलएमएनजी डिटर्जेंट में शुद्ध रोडोप्सिन नमूने का उपयोग करें।
  2. 0.01 मिलीग्राम/एमएल पर 1 मिलीग्राम/mL और पीएनगैस एफ13 पर रोडोप्सिन का 200 माइक्रोन मिश्रण तैयार करें। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर अच्छी तरह से मिलाएं और इनक्यूबेट करें।
  3. 0.01 मिलीग्राम/एमएल पर 1 मिलीग्राम/mL और एंडो F113 पर रोडोप्सिन का 200 माइक्रोन मिश्रण तैयार करें। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर अच्छी तरह से मिलाएं और इनक्यूबेट करें।
  4. एसडीएस-पेज और कूमासी नीले धुंधला द्वारा पाचन परिणाम का विश्लेषण करें।
  5. अनुपचारित और एंडो F1-इलाज रोडोप्सिन नमूनों और बफर डी में एसईसी शुद्धि के अधीन ध्यान केंद्रित करें।
    नोट: यह एलसी-एमएस अध्ययन के लिए डिटर्जेंट की न्यूनतम मात्रा के साथ नमूना तैयार करने के लिए है। बफर डी में कोई डिटर्जेंट नहीं होता है, लेकिन झिल्ली प्रोटीन14से एलएमएनजी की धीमी ऑफ-रेट के कारण, रोडोप्सिन कुल नहीं होगा।
  6. 12.9 mL के आसपास प्रतिधारण मात्रा में चोटी अंश ले लीजिए। स्पिन कंसंट्रेटर (एमडब्ल्यूसीओ 30 केडीए) का उपयोग करके 1 मिलीग्राम/mL पर ध्यान केंद्रित करें।
  7. प्रोटीन के 10 μg को रेप्रोसिल 200 सी18-एक्यू कॉलम में इंजेक्ट करें और टेबल 2में सूचीबद्ध सॉल्वेंट संरचना और सेटिंग्स के साथ रैखिक ढाल विधि का उपयोग करके कॉलम को एलिट करें। प्रवाह बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर के लिए 25% और यूवी का पता लगाने के लिए ७५% तक विभाजित है ।

Representative Results

नमूना तैयारकरने और विश्लेषण के लिए प्रायोगिक कार्यप्रवाह को चित्र ा 1में संक्षेप में बताया गया है । छोटे पैमाने पर आत्मीयता शुद्धिकरण के लिए खुले स्तंभों का उपयोग करहमें समानांतर में कई अलग-अलग डिटर्जेंट स्थितियों में नमूने तैयार करने की अनुमति दी(चित्र 1ए)। इस तरह के छोटे पैमाने पर शुद्धिकरण सेट-अप ने यूवी-विस स्पेक्ट्रोस्कोपी, एसईसी और एसडीएस-पेज(चित्रा 1बी-सी)का उपयोग करके आगे विश्लेषण के लिए पर्याप्त प्रोटीन प्राप्त किया।

यूवी-विस स्पेक्ट्रोस्कोपी से रोडोप्सिन स्थिरता का पता चला
रेटिना पुनर्गठित रोडोप्सिन की स्थिरता का आकलन इसके ऑप्टिकल अवशोषक(चित्रा 2)द्वारा किया गया था। अंधेरे राज्य में, 9-सीआईएस रेटिना को एक प्रोटोनेट शिफ बेस के रूप में Lys296 से जोड़ा गया है। रोशनी के बाद, 9-सीआईएस रेटिना को ऑल-ट्रांस आइसोफॉर्म में आइसोरिज़ किया जाता है और शिफ बेस लिंक को डिप्रोटोनेट किया जाता है। प्रोटोनेटेड 9-सीआईएस रेटिना 488 एनएम पर अवशोषण चोटी देता है, जबकि डिप्रोटोनेटेड ऑल-ट्रांस रेटिना में 380 एनएम की चोटी होती है। डीडीएम में रोडोप्सिन के यूवी-विस स्पेक्ट्रा ने 9-सीस रेटिना-बाउंड और लाइट-एक्टिवेटेड रोडोप्सिन के विशिष्ट अवशोषण को दिखाया, जहां लगभग एक ही ऑप्टिकल घनत्व के साथ 108 एनएम का नीला बदलाव स्पष्ट रूप से देखा गया था(चित्र ा 2ए, ऊपरी बाएं पैनल)। जब रोडोप्सिन अस्थिर हो जाता है, और फिर रेटिना परिवर्तन के लिए बाध्यकारी जेब, जिसके परिणामस्वरूप रेटिना विवर्तन और संभवतः विसोशन होता है। यदि ऐसा होता है, और फिर स्पेक्ट्रम डिप्रोटोनेशन के साथ-साथ रेटिना15के मुक्त रूप से योगदान दिखाता है। इसलिए, हमने प्रोटीन (280 एनएम) और रेटिना (प्रोटोनटेड 9-सीआईएस रेटिना के लिए 488 एनएम, डिप्रोटोनटेड ऑल-ट्रांसरेटिनाल)(चित्रा 2बी)के बीच अवशोषण अनुपात द्वारा रोडोपसिन में रेटिना पुनर्गठन की दक्षता निर्धारित की। रोडोपसिन नमूने शास्त्रीय डिटर्जेंट (डीडीएम, डीएम, सायमल-6, सायमल-5, सी9जी) में शुद्ध एक ही ऑप्टिकल प्रोफाइल दिखाते हैं । हालांकि, एनपीजी डिटर्जेंट (एलएमएनजी, डीएमएनजी, साइमल-6एनजी, साइमल-5एनजी) में शुद्ध नमूने ऑप्टिकल प्रोफाइल दिखाते हैं, जिसमें ओएनजी नमूने को छोड़कर रेटिना के लिए एक उप-इष्टतम बाध्यकारी वातावरण का सुझाव दिया गया है, जिसने डीडीएम नमूने के रूप में एक ही ऑप्टिकल प्रोफाइल दिया था ।

आकार-बहिष्कार क्रोमेटोग्राफी में नमूना शुद्धता और प्रोटीन मोनोफैलाव दिखाया गया।
एसईसी तैयारी और स्क्रीनिंग के दौरान प्रोटीन नमूनों का मूल्यांकन करने के लिए एक कुशल और मजबूत विश्लेषणात्मक उपकरण है। यह पिछले शुद्धिकरण कदम के साथ-साथ प्रोटीन अणुओं की मोनोफैलावता से नमूना शुद्धता को मान्य करता है। रोडोप्सिन और इसके मिनी-जीओ कॉम्प्लेक्स के लिए, नमूना गुणवत्ता की व्याख्या अवशोषण घटता से 280 एनएम और 380 एनएम(चित्रा 3ए)पर की गई थी। 280 एनएम के निशान में प्रोटीन की मौजूदगी दिखाई दी और 380 एनएम ट्रेस में रेटिना की मौजूदगी दिखाई दी। शून्य मात्रा में प्रदर्शित होने वाले किसी भी संकेत (इस स्तंभ का उपयोग करते समय लगभग 8 मिलील) को प्रोटीन समुचित के लिए जिम्मेदार ठहराया गया था। इसलिए, परिणामों से पता चला है कि शास्त्रीय डिटर्जेंट में तैयार नमूने C9G के अलावा एक मोनोस्फेव राज्य में थे, जहां कुल का कुछ हिस्सा दिखाई दिया । इसके विपरीत, एनपीजी-प्रकार के डिटर्जेंट का उपयोग करके तैयार किए गए नमूनों में C9G नमूने की तुलना में बहुत अधिक समुच्चय निहित थे; एलएमएनजी और साइमल-6एनजी ने सबसे समग्र गठन का नेतृत्व किया, लेकिन डीएमएनजी और साइमल-5एनजी में कम समग्र देखे गए। अपवाद OGNG था, जो डीडीएम के लिए एक समान प्रोफ़ाइल दिखाया । शून्य मात्रा में प्रोटीन कुल भी गरीब रेटिना अधिभोग था, जैसा कि ए280/ए380 अनुपात द्वारा दिखाया गया है जो 135 केडीए के अनुरूप ~ 12.9 मीटर की प्रतिधारण मात्रा में चोटी की तुलना में बढ़ा था। एक अन्य विशेषता जो हमने देखी वह यह थी कि रोडोप्सिन और रोडोप्सिन-मिनी-जीओ दोनों एक ही अवधारण मात्रा(चित्रा 3बी)के आसपास परेशान हैं। यह आश्चर्य की बात है, क्योंकि डिटर्जेंट-बाउंड रोडोप्सिन का स्पष्ट आणविक वजन 120 केडीए था और रोडोप्सिन-मिनी-जीओ 144 केडीए था। इसलिए हम केवल एसईसी डेटा से जटिल गठन का पता नहीं लगा सके, इसलिए एसईसी-शुद्ध नमूने का विश्लेषण करने के लिए एसडीएस-पेज का उपयोग किया गया था।

SDS-पेज जटिल गठन की पुष्टि की
एसडीएस-पेज एक नमूने में प्रोटीन घटकों की पहचान करने के लिए एक मानक विधि है। केंद्रित रोडोप्सिन (एसईसी शुद्धि से पहले) का विश्लेषण एसडीएस-पेज द्वारा इसकी शुद्धता की पुष्टि करने के लिए किया गया था, और 37 केडीए के पास दो बैंड और 50 केडीए(चित्रा 4ए)से ऊपर एक गंदा बैंड दिखाया गया था। बाद में निचले दो बैंडों को अलग-अलग एन-ग्लाइकोसिलेशन राज्यों की पुष्टि हुई। 50 केडीए से ऊपर के बैंड को एसडीएस-पेज नमूना बफर द्वारा प्रेरित समग्र रोडोप्सिन ओलिगोमर्स के रूप में समझा गया क्योंकि ये समग्र एसईसी या किसी अन्य पहचान विधियों में नहीं देखे गए थे। चूंकि एसईसी डेटा जटिल गठन की पुष्टि नहीं कर सका, इसलिए एसईसी ने एसडीएस-पेज का उपयोग करके रोडोप्सिन-मिनी-जीओ नमूनों से प्राप्त अंशों का विश्लेषण किया गया। एसडीएस-पेज ने सभी डिटर्जेंट स्थितियों में रोडोप्सिन और मिनी-जीओ दोनों के प्रोटीन बैंड दिखाए, जिसमें सुझाव दिया गया था कि डिटर्जेंट(चित्रा 4बी)की पसंद की परवाह किए बिना परिसर का गठन किया गया था।

एलसी-एमएस स्पेक्ट्रोमेट्री ने रोडोप्सिन में एन-ग्लाइकोसिलेशन पैटर्न की पहचान की
दोनों आत्मीयता शुद्धिकरण और एसईसी से Rhodopsin नमूनों दो प्रोटीन बैंड है कि एक SDS-पृष्ठ जेल, जो एसईसी द्वारा अलग नहीं किया जा सकता है जब एक 24-mL कॉलम का उपयोग कर पर लगभग ३७ केडीए के एक स्पष्ट आणविक वजन के साथ चले गए दिखाया । हेक 293 जीएनटीआई से विषमजीवी-व्यक्त रोडोप्सिन पर एन-ग्लाइकोसिलेशन के विभिन्न पैटर्न- कोशिकाएं सबसे अधिक संभावना स्पष्टीकरण थीं। इसलिए, दो एंजाइमों, पीएनगास एफ और एंडो एफ 1, को उनके डेग्लिकोसिलेट रोडोप्सिन की क्षमता के लिए परीक्षण किया गया था। एसडीएस-पेज डेटा से, एंडो F1 ने दोनों प्रोटीन बैंड के आणविक वजन को एक ही उत्पाद में कम कर दिया, जबकि पीएनगास एफ पाचन ने अभी भी दो आबादी(चित्रा 5ए)दी है। विभिन्न प्रजातियों की जनता की पहचान करने के लिए एलसी-एमएस स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करके अपाच्य और एंडो एफ1-उपचारित नमूनों का विश्लेषण किया गया । आंकड़ों से पता चला है कि हेक 293 GnTI में उत्पादित रोडोप्सिन- कोशिकाओं में या तो एक या दो एन-ग्लाइकान शामिल थे, जिसमें 1014 ± 1 डीए के द्रव्यमान में अंतर था। एंडो एफ 1-इलाज रोडोप्सिन में कोई एन-ग्लाइकान नहीं था और दो एन-ग्लिकन युक्त रोडोप्सिन की तुलना में 2027 ± 1 डीए का द्रव्यमान अंतर था। ये परिणाम रोडोप्सिन को व्यक्त करने के लिए उपयोग की जाने वाली सेल लाइन में एंजाइम एन-एसिटाइलकोस्कोचेक्साइडामेनलट्रांसफरेज़ I की अनुपस्थिति के अनुरूप हैं, जिसके परिणामस्वरूप सभी एन-ग्लिकन संरचना GlcNAc2Man5,(द्रव्यमान 1014 डीए) होते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: डिटर्जेंट स्क्रीनिंग प्रयोग के लिए नमूना तैयारी और लक्षण वर्णन। }Aशुद्धिकरण के दौरान विभिन्न डिटर्जेंट में रोडोप्सिन के नमूनों की तैयारी। (ख)प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले तरीके: यूवी-विस स्पेक्ट्रोस्कोपी, आकार-बहिष्कार क्रोमेटोग्राफी (एसईसी), एसडीएस-पेज और तरल क्रोमेटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस)। (ग)रोडोप्सिन, रोडोप्सिन-मिनी-जीओ,और रोडोप्सिन के डिग्लाइकोसिलेशन उत्पाद के लक्षण वर्णन के लिए प्रायोगिक कार्यप्रवाह। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: रोडोप्सिन की यूवी-विस स्पेक्ट्रोस्कोपी। (A)रोडोप्सिन का यूवी-विस स्पेक्ट्रा। डार्क स्टेट का स्पेक्ट्रा, 9-सीआईएस रेटिना बाउंड रोडोप्सिन नीले मोड़ों में दिखाया गया है। रोशनी के बाद, 9-सीआईएस रेटिना को डिप्रोटोनेट किया जाता है और सभी ट्रांस रेटिना में isomerizes होता है, और प्रबुद्ध रोडोप्सिन के स्पेक्ट्रा को लाल घटता के रूप में दिखाया जाता है। प्रत्येक डिटर्जेंट की रासायनिक संरचना को इनसेट के रूप में दिखाया गया है। (ख)ए280/ए488 (ब्लू बार) और ए280/ए380 (रेड बार) के अनुपात में क्रमशः अंधेरे राज्य और प्रकाश राज्य में रोडोप्सिन की स्थिरता को दर्शाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: रोडोप्सिन और रोडोप्सिन के आकार-बहिष्कार क्रोमोग्राफी प्रोफाइल-मिनी-जीओ जटिल 10 विभिन्न डिटर्जेंट में शुद्ध। (ए)बाएं पैनल शास्त्रीय डिटर्जेंट में शुद्ध नमूनों के एसईसी प्रोफाइल दिखाता है। सही पैनल एनपीजी प्रकार डिटर्जेंट में शुद्ध नमूनों के एसईसी प्रोफाइल का प्रतिनिधित्व करता है। मानक मार्कर प्रोटीन की प्रोफ़ाइल डीडीएम नमूने के साथ एक साथ ओवरले के रूप में दिखाया गया है। पीक प्रोफाइल की व्याख्या डीएमएनजी के लिए दिखाई गई है, जिसमें डीडीएम, डीएम, सायमल-6, सायमल-5 और ओजीएनजी के लिए आदर्श परिदृश्य (कोई समग्र) नहीं देखा गया है। (ख)12-14 मीटर की अवधारण मात्रा में ओएनजी नमूने का बढ़ाया प्रोफाइल। सभी नमूनों का विश्लेषण एक Superdex200 वृद्धि 10/300 जीएल कॉलम का उपयोग कर किया गया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: रोडोप्सिन और रोडोप्सिन/मिनी-गो कॉम्प्लेक्स का एसडी-पेज विश्लेषण । (A)रोडोप्सिन नमूनों डिटर्जेंट में शुद्ध । 50 केडीए से ऊपर के गंदा बैंड को एसडीएस-पेज नमूना बफर द्वारा प्रेरित एकत्रित रोडोप्सिन ओलिगोमर्स के लिए जिम्मेदार ठहराया गया है। (ख)रोडोप्सिन/मिनी-गो परिसर के एसईसी-शुद्ध नमूने । 1 और 2 एन-ग्लाइकन और मिनी-जीओ के साथ रोडोप्सिन को चित्रित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: रोडोप्सिन में ग्लाइकोसिलेशन की पहचान। (A)पीएनगास एफ और एंडो एफ 1 का उपयोग करके डेग्लिकोसिटेड रोडोप्सिन का एसडीएस-पेज विश्लेषण। (ख)एलसी-एमएस स्पेक्ट्रा बिना (ऊपरी पैनल) और एंडो एफ 1 (निचले पैनल) द्वारा डिग्लाइकोसिलेशन के साथ। क्रिस्टलीकरण के लिए रोडोप्सिन-मिनी-जीओ कॉम्प्लेक्स तैयार करने के लिए, हमने पीएनगैस एफ पर एंडो एफ 1 को चुना क्योंकि एंडो एफ 1 ने रोडोप्सिन की एक सजातीय प्रजातियां वितरित कीं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

डिटर्जेंट काम कर रहे एकाग्रता (%) क्रिटिकल मिसेल एकाग्रता (%)
Ddm 0.025 0.0087
डीएम 0.12 0.087
सायमल-6 0.05 0.028
सायमल-5 0.2 0.12
C9G 0.5 0.2
एलएमएनजी 0.01 0.001
डीएमएनजी 0.01 0.0034
सायमल-6एनजी 0.015 उपलब्ध नहीं है; 0.056 से कम होना चाहिए
सायमल-5एनजी 0.02 0.0056
ओएनजी 0.15 0.058

तालिका 1: बफर सी डिटर्जेंट सांद्रता।

समय (मिन) सॉल्वेंट ए (%) सॉल्वेंट बी (%) सॉल्वेंट सी (%) प्रवाह दर (एमएल/मिन)
0 0 95 5 0.5
1 0 95 5 0.5
5 20 75 5 0.6
25 85 10 5 0.6
26 90 5 5 0.6
30 90 5 5 0.6

तालिका 2: कॉलम एल्यूशन पैरामीटर।

Discussion

प्रोटीन क्रिस्टलीकरण में सफलता दृढ़ता से प्रोटीन के नमूने, विशेष रूप से झिल्ली प्रोटीन और डिटर्जेंट की वजह से जटिलता के कारण उनके परिसरों पर निर्भर करती है। यह रिपोर्ट जीपीसीआर-मिनी-जी प्रोटीन सिग्नलिंग परिसरों के लिए डिटर्जेंट स्क्रीनिंग और नमूना गुणवत्ता के मूल्यांकन को दर्शाती है। झिल्ली प्रोटीन की जैव रासायनिक संपत्ति का अध्ययन करने के लिए विभिन्न तरीकों का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है, उदाहरण के लिए, फ्लोरोसेंटरंगों 16,,17का उपयोग करके थर्मोस्टेबिलिटी परख, ट्रिप्टोफान फ्लोरेसेंस सिग्नल18 या बायोसेंसर19के साथ अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण में परिवर्तन को मापने के द्वारा जटिल गठन का पता लगाने के लिए बाध्यकारी परख। हालांकि, उन तरीकों में उपयोग किए जाने वाले रासायनिक वातावरण क्रिस्टलीकरण नमूना तैयार करने के लिए उन लोगों से काफी अलग हैं, या तो प्रोटीन फ्लोरेसेंस-आधारित माप के लिए एक हजार गुना कम एकाग्रता पर होते हैं, या प्रोटीन लिपिड बाइलेयर में या एक निश्चित डिटर्जेंट स्थिति में एम्बेडेड होते हैं। इस प्रोटोकॉल में, क्रिस्टलीकरण से पहले बड़े पैमाने पर नमूना तैयारकरने में उपयोग किए गए तरीकों को भी मानकीकृत किया जाता है। इसलिए, अनुकूलित मापदंडों को आगे की बड़ी स्क्रीनिंग और अनुकूलन के बिना क्रिस्टलीकरण-पैमाने की तैयारी के लिए आसानी से स्थानांतरित किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी द्वारा वाष्प प्रसार क्रिस्टलीकरण और संरचना निर्धारण के लिए एक स्थिर और सजातीय जीपीसीआर-मिनी-जी प्रोटीन परिसर की तैयारी को अनुकूलित करना है। प्रोटोकॉल रोडोप्सिन-मिनी-जीओ कॉम्प्लेक्स की तैयारी के दौरान डिटर्जेंट और डिग्लाइकोसिलेशन के प्रभाव का गुणात्मक रूप से मूल्यांकन करने के लिए तरीकों का एक सेट एकीकृत करता है। डिटर्जेंट ऑक्टाइल ग्लूकोसाइड (सी8जी)20,,21,,22 और सी9जी23,,24में शुद्ध होने पर निष्क्रिय अवस्था और प्रकाश सक्रिय राज्य में रोडोप्सिन को सघन किया गया है । चूंकि C8G और C9G में शुद्ध रोडोप्सिन-मिनी-जीओ कॉम्प्लेक्स क्रिस्टल (डेटा नहीं दिखाया गया) का परिणाम नहीं था, इसलिए हमने वर्णित रणनीति(चित्र ा 1)का उपयोग करके अन्य डिटर्जेंट की एक व्यापक श्रृंखला का पता लगाया। रोडोप्सिन की हल्की संवेदनशीलता का लाभ उठाकर, हम बहुत अच्छी तरह से 280 एनएम के अलावा तरंगदैर्ध्य में रेटिना के पुनर्गठन का पालन कर सकते हैं। यूवी-विस स्पेक्ट्रोस्कोपी और एसईसी दोनों में, हमने 380 एनएम या 488 एनएम पर रेटिना का पता लगाया। हालांकि, अधिकांश झिल्ली प्रोटीन में शुद्धिकरण के दौरान कार्यक्षमता का पालन करने के लिए इतना सुविधाजनक गुणसूत्र नहीं होता है। अन्य विकल्प यह होगा कि हल्के-सेक्ट्रेट क्रोमोफोर जोड़कर या रेडियोलिगलैंड-बाइंडिंग और थर्मल शिफ्ट परख25का उपयोग करके एक लिगामेंट का पता लगाने योग्य बनाया जाए ।

रोडोप्सिन का आणविक वजन 40 केडीए है। डिटर्जेंट के द्रव्यमान के कारण यह बांधता है, एसईसी पर इसका स्पष्ट आणविक वजन लगभग 120 केडीए है। इस प्रकार यह कोई आश्चर्य की बात नहीं है कि एसईसी पर मिनी-जीओ (24 केडीए) की बाध्यकारी का आसानी से पता नहीं चला था, क्योंकि इससे 120 केडीए और 144 केडीए की स्पष्ट जनता के साथ प्रोटीन के अंतर की आवश्यकता होगी। इसलिए एसडीएस-पेज द्वारा एसईसी अंशों का विश्लेषण नमूना शुद्धता और जटिल गठन की पुष्टि करने के लिए किया गया था। यहां तक कि अगर एसईसी प्रोफाइल जटिल गठन पर स्पष्ट बदलाव दिखाते हैं, तो भी अन्य सह-शुद्ध प्रोटीन संदूषकों के बजाय सही बाध्यकारी भागीदारों के साथ जटिल गठन की पुष्टि करने के लिए एसडी-पेज विश्लेषण करने की सिफारिश की जाती है।

रोडोप्सिन और मिनी-जीओ दोनों को मिलीग्राम मात्रा में शुद्ध किया गया था, जिसने परिसरों के कम संवेदनशीलता का पता लगाने की अनुमति दी, जैसे एसईसी के दौरान यूवी-विज़ अवशोषण और एसडीएस-पेज जैल के कॉममासी ब्लू धुंधला। जहां नमूने सीमित हैं, अधिक संवेदनशील पता लगाने का उपयोग किया जाना चाहिए, जैसे कि प्रोटीन (280 एनएम उत्तेजना, 350 एनएम उत्सर्जन) और एसडीएस-पेज जैल के लिए चांदी के धुंधला होने से ट्रिप्टोफान संकेतों का पता लगाने के लिए फ्लोरेसेंस डिटेक्टर से लैस एलसी प्यूरीफायर। एक अन्य दृष्टिकोण यह होगा कि ब्याज के प्रोटीन के लिए ग्रीन फ्लोरेसेंस प्रोटीन (जीएफपी) जैसे फ्लोरोसेंट प्रोटीन को फ्यूज किया जाए, जो प्रोटीन अभिव्यक्ति26 के दौरान भी पता लगाने की अनुमति देगा लेकिन इसे क्रिस्टलीकरण से पहले हटा दिया जाना चाहिए ।

यह सुनिश्चित करना आवश्यक है कि शुद्ध प्रोटीन भी चर पीटीएमएस से उत्पन्न विषमता से मुक्त हो। यहां वर्णित मामले में, एसडीएस-पेज जैल पर देखे गए रोडोप्सिन की दो आबादी को या तो एक या दो एन-ग्लाइकान होने के रूप में चिह्नित किया गया था। प्रोटीन का परिवर्तनीय संशोधन संभावित रूप से अच्छी तरह से विवर्तित क्रिस्टल के गठन को रोकदेगा, इसलिए हम इसलिए रोडलाइकोसिन को डिग्लाइकोसिलेटेड करदेंगे। एंडोग्लाइकोसिदास एंडो एफ 1 सबसे अधिक प्रभाव था एंडोग्लिकोसिडास परीक्षण और उपचार के कारण अनलाइकोसिडेनेटेड रिसेप्टर की एक प्रजाति हुई, जबकि पीएनगासे एफ ने केवल आंशिक रूप से रोडोप्सिन पर ग्लाइकान हटा दिया और इसके परिणामस्वरूप रोडोप्सिन का मिश्रण पूरी तरह से अनलाइकोसिलेटेड या एक एन-ग्लाइकैन के साथ बना रहा। डेग्लिकोसिलाज़ उपचार के बिना रोडोप्सिन को सफलतापूर्वक3,,27,,28को सघन किया गया है, और रोडोप्सिन Asn15 पर एन-ग्लाइकन उन मामलों में क्रिस्टल संपर्क बनाने के लिए महत्वपूर्ण है। रोडोप्सिन-मिनी-जीओके मामले में, क्रिस्टल प्राप्त करने के लिए एंडो एफ 1 द्वारा एन-ग्लाइकान को हटाना आवश्यक है। क्रिस्टलीकरण से पहले ब्याज के प्रोटीन को डिग्लाइकोसिलेट करने के लिए कोई मानकीकृत नियम नहीं है, लेकिन जब प्रोटीन व्यापक क्रिस्टलीकरण परीक्षणों के बाद क्रिस्टलाइज करने में विफल हो जाते हैं तो विषम पीटीएमएस को हटाने पर विचार किया जाना चाहिए ।

यहां वर्णित डेटा और कार्यप्रणाली ने हमें अपने छोटे मिसेल आकार और परिसर को स्थिर करने की क्षमता के कारण रोडोप्सिन-मिनी-जीओ कॉम्प्लेक्स के क्रिस्टलीकरण के लिए सबसे पसंदीदा डिटर्जेंट के रूप में ओएनजी को चुनने के लिए निर्देशित किया। हमने यह सुनिश्चित करने के लिए एंडो एफ1 का भी उपयोग किया कि शुद्ध रोडोप्सिन एक सजातीय प्रजाति थी। क्रिस्टल बाद में प्राप्त किए गए और हमने क्रिस्टल संरचना को ~ 3.1 Å4तक निर्धारित किया, जो केवल जीपीसीआर-जी प्रोटीन सिग्नलिंग कॉम्प्लेक्स14,,29की तीसरी क्रिस्टल संरचना थी।

एक साथी प्रोटीन के साथ और बिना बंधे झिल्ली प्रोटीन के लिए, उन्हें दो अलग-अलग प्रोटीन माना जाना चाहिए। विभिन्न कार्यात्मक राज्यों में एक प्रोटीन अलग-अलग संरचनाएं हैं और विभिन्न ऊर्जा स्तर पर हैं। इसलिए, प्रत्येक कार्यात्मक राज्य के लिए तैयारी प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने की सिफारिश की जाती है क्योंकि निष्क्रिय-राज्य के लिए पैरामीटर सक्रिय राज्य में पूरी तरह से स्थानांतरित नहीं हो सकता है। इसके अलावा, एक साथी प्रोटीन बाध्यकारी द्वारा जटिल प्रोटीन संपत्ति में परिवर्तन का उल्लेख नहीं है । प्रोटोकॉल उन तरीकों का उपयोग करता है जो विभिन्न डिटर्जेंट में निष्क्रिय झिल्ली प्रोटीन तैयार करने के लिए क्रिस्टलीकरण नमूना तैयार करने के लिए मानकीकृत हैं, इसके बाद प्रोटीन सक्रियण और जटिल गठन, और प्रोटीन की गुणवत्ता की विशेषता है। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल को मामूली संशोधन के साथ संरचनात्मक अध्ययन ों के लिए अन्य झिल्ली प्रोटीन और उनके परिसरों को आसानी से सामान्यीकृत किया जा सकता है।

Disclosures

सीजीटी एक सलाहकार और सोसेई हेप्टरेस के वैज्ञानिक सलाहकार बोर्ड के सदस्य हैं। अन्य सभी लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है ।

Acknowledgments

हम इस परियोजना में दीर्घकालिक समर्थन के लिए प्रो डॉ गेभर्ड एफ एक्स शेरलर, डॉ रोजर जेपी डासन और हॉफमैन ला रोशे को सेल कल्चर में समर्थन के लिए धन्यवाद देते हैं । यह काम स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन (अनुदान 210030_153145 और GFXS को 310030B_173335 अनुदान) द्वारा प्रायोजित किया गया था, और यूरोपीय अनुसंधान परिषद (EMPSI, ३३९९९५) और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (MRC U105197215) से CGT के लिए धन । एफपी अनुसंधान आणविक अल्ट्राफास्ट विज्ञान और प्रौद्योगिकी (एनसीसीआर MUST) और ETH Femtosecond और Attosecond विज्ञान और प्रौद्योगिकी (ETH फास्ट) कार्यक्रमों में क्षमता के राष्ट्रीय केंद्र के माध्यम से ETH Zürich स्वीकार करते हैं । एफपी, जेएम, एबी और सीजेटी पॉल शेहेर इंस्टीट्यूट से दीर्घकालिक वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1D4 peptide Peptide2.0 Under request
9-cis retinal Sigma-Aldrich R5754
Autosampler A-900 GE Healthcare Discontinued
C9G Anatrace N324
cOmplete, EDTA-free protease inhibitor coctail Roche 5056489001
Cymal-5 Anatrace C325
Cymal-5NG Anatrace NG325
Cymal-6 Anatrace C326
Cymal-6NG Anatrace NG326
DDM Anatrace D310
DM Anatrace D322
DMNG Anatrace NG322
Econo column Bio-Rad 7372512
Ettan LC GE Healthcare Discontinued
FRAC-950 GE Healthcare Discontinued
HPLC Water 2795 Separation Module Waters AG 720000358EN
InstantBlue Protein Stain Expedeon ISB1L
LCT Premier mass spectrometer (ESI-TOF) Waters AG -
LMNG Anatrace NG310
Monitor UV-900 GE Healthcare 18110835
Nanodrop 1000 Witec AG/ThermoFisher Discontinued
NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel 1.0 mm, 15 well ThermoFisher NP0323BOX
NuPAGE MES SDS buffer (20x) ThermoFisher NP0002
OGNG Anatrace NG311
PAGEr Minigel Chamber Lonza 59905
Reprosil 200 C18-AQ column Morvay Analytik GmbH #s1503
Superdex 200 Increase GL column GE Healthcare 28990944
Tabletop centrifuge 5424R Eppendorf 5404000413
Ultracentrifuge Optima XE-100 Beckmann Coulter A94516
ULTRA-TURRAX T25 IKA WERKE 0003725003
UV-VIS spectrophotometer Shimadzu UV-2401PC
Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector Waters AG -

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References

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Pamula, F., Mühle, J., Blanc, A., Nehmé, R., Edwards, P. C., Tate, C. G., Tsai, C. J. Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization. J. Vis. Exp. (157), e60747, doi:10.3791/60747 (2020).

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