Summary
Questo rapporto descrive lo screening di diversi detergenti per la preparazione del GPCR visivo, rhodopsin, e il suo complesso con mini-Go. Sono dimostrati metodi biochimici che caratterizzano la qualità del complesso nelle diverse fasi durante la purificazione. Questo protocollo può essere generalizzato ad altri complessi proteici della membrana per i loro futuri studi strutturali.
Abstract
La chiave per determinare le strutture cristalline dei complessi proteici della membrana è la qualità del campione prima della cristallizzazione. In particolare, la scelta del detergente è fondamentale, perché influisce sia sulla stabilità che sulla monodispersità del complesso. Recentemente abbiamo determinato la struttura cristallina di uno stato attivo di rodopsina bovina accoppiata ad una proteina G ingegnerizzata, mini-Go, a risoluzione 3,1. Qui, abbiamo descritto in dettaglio la procedura per ottimizzare la preparazione del complesso rhodopsin-mini-Go. La rodopsina a stato scuro è stata preparata in detersivi classici e di glicole neopentyl (NPG), seguiti da una formazione complessa con mini-Go sotto esposizione alla luce. La stabilità della rodopsina è stata valutata dalla spettroscopia visibile all'ultravioletto (UV-VIS), che monitora la ricostituzione in rodopsina del ligando sensibile alla luce, 9-cis retina. La cromatografia automatizzata ad esclusione di dimensioni (SEC) è stata utilizzata per caratterizzare la monodisità della rodopsina e il rhodopsin–mini-Go complesso. L'elettroforesi SDS-polyacritilmide (SDS-PAGE) ha confermato la formazione del complesso identificando un rapporto molare 1:1 tra rodopsina e mini-Go dopo aver macchiato il gel con Coomassie blue. Dopo aver convalidato in modo incrociato tutti questi dati analitici, abbiamo eliminato i detergenti inadatti e abbiamo continuato con il miglior detergente candidato per la preparazione e la cristallizzazione su larga scala. Un ulteriore problema è sorto dall'eterogeneità della N-glycosylation. La rodopsina espressa eterologamente è stata osservata su SDS-PAGE per avere due diverse popolazioni N-glicosylalate, che probabilmente avrebbero ostacolato la cristallogenesi. Pertanto, sono stati testati diversi enzimi deglycosylation e l'endoglycosidase F1 (EndoF1) ha prodotto rodopsina con una singola specie di N-glycosylation. Con questa pipeline strategica per caratterizzare la qualità delle proteine, la preparazione delcomplesso rhodopsin-mini-G o è stata ottimizzata per fornire la struttura cristallina. Questa era solo la terza struttura cristallina di un complesso di segnalazione di proteine GPCR-G. Questo approccio può anche essere generalizzato per altre proteine della membrana e per i loro complessi per facilitare la preparazione del campione e la determinazione della struttura.
Introduction
Determinare le strutture cristalline delle proteine della membrana e dei loro complessi è sempre stato difficile a causa delle difficoltà nell'ottenere cristalli ben diffracting. A differenza delle proteine solubili, le proteine integrali della membrana comprendono un nucleo idrofobico che attraversa la membrana cellulare. Per rimuovere le proteine della membrana dalla membrana cellulare in un tampone acquoso, i detergenti devono essere utilizzati per formare una micelle detergente-proteina, sostituendo così i lipidi intorno al nucleo idrofobico delle proteine della membrana. La stabilità, l'attività e l'integrità delle proteine della membrana dipendono direttamente dalle proprietà chimiche e strutturali del detergente1e le proprietà del detergente determinano anche le dimensioni della micelle. Una grande micelle detergente può occlare le superfici idrofili di una piccola proteina membrana, impedendo così la cristallizzazione a causa della mancanza di contatti cristallini quando si utilizza il metodo di diffusione del vapore. Una piccola micelle detergente è vantaggiosa per la cristallografia, ma i detergenti a catena corta sono di solito più dure e quindi portano alla destabilizzazione e all'aggregazione della proteina della membrana. Pertanto, prima della cristallizzazione, è indispensabile una procedura aggiuntiva di screening del detersivo, in genere mirata a detergenti più corti che mantengono ancora la stabilità proteica.
I recettori accoppiati a proteine G (GPCR) sono proteine della membrana integrali contenenti sette eliche transmembrane. I GP esistono in due stati principali, o uno stato inattivo stabilizzato da agonisti inversi o antagonisti, o uno stato attivo legato ad un agonista e stabilizzato da una proteina G, anche se è probabile che tra questi due estremi esistano una moltitudine di sottostati. La determinazione della struttura dei GP si è inizialmente concentrata sugli stati inattivi legati agli agonisti inversi e agli antagonisti a causa della loro maggiore stabilità rispetto agli stati attivi2. Quando i GPCR sono attivati su un legame agonista, i recettori sono altamente dinamici e una fessura si forma transitoriamente sul volto citoplasmatico del recettore per l'accoppiamento proteico G. Si pensa che questo dinamismo sia il motivo per cui i GPCR legati agli agonisti sono spesso più instabili dello stato inattivo. Pertanto, diventa essenziale vagliare i detergenti appropriati per lo stato conformazionale del recettore in fase di studio, perché è probabile che saranno necessari detergenti più lievi per studiare uno stato attivo rispetto a uno stato inattivo.
In questo rapporto, utilizziamo il GPCR visivo, il rodopsina bovino3e il suo complesso con la proteina mini-Go 4,5 per gli esperimenti di screening del detersivo, che rappresentano rispettivamente lo stato inattivo e attivo. Lo screening del detersivo si è concentrato sui detergenti classici per maltoside e glucosio e sui detergenti alnetilo glicole (NPG). In questo contesto, un detergente classico è costruito da un gruppo di teste di zucchero e una catena alchino, mentre i detergenti di tipo NPG contengono due detergenti classici identici che vengono fusi da un carbonio quaternario all'interfaccia tra gli zuccheri e le catene alchil6,7,8.
Un flusso di lavoro sperimentale è stato progettato a partire dalla purificazione della rodopsina in diversi detergenti, seguita dalla formazione delcomplesso rodopessi-mini-G o e termina con la caratterizzazione del complesso utilizzando diversi metodi (Figura 1). Per lo stato inattivo della rodopsina, la ricostituzione del ligando sensibile alla luce 9-cis retina è stata monitorata dalla spettroscopia a visibile ultravioletta (UV-VIS). Lo spettro rivela lo stato fisicochimico della retina ed è indicativo del suo ambiente nella tasca legante retiico-retico della rodopsina. La cromatografia di esclusione delle dimensioni (SEC) è stata impiegata per valutare la monodispersità della rodopina purificata e la formazione del complesso rhodopsin–mini-Go. Poiché SEC differenzia le molecole proteiche per dimensioni e forma, la popolazione proteica aggregata può essere identificata man mano che si elilutano nel volume vuoto. Per confermare una formazione complessa, le frazioni della SEC sono state valutate dall'elettroforesi gel (SDS-PAGE) sodio dodecyl-polyacrilia per confermare la presenza sia di rodopsina che di mini-Go.
Un altro fattore che deve essere considerato sono le modifiche post-traduzionali (PTM) sulle proteine della membrana. PTM come l'N-glicosilazione sono spesso osservati sulle proteine della membrana eucabolica prodotte nei sistemi di espressione delle cellule di mammiferi e insetti. Un ceppo nilicoso limitato delle cellule del rene embrionale umano 293 (HEK293) è stato sviluppato dalla delezione della codifica genica N-acetylglucosinyltransferasas I (GnTI), con conseguente omogeneo N-glicosylation di GlcNAc2Man5 presso il sito di consenso Asn-X-Ser/Thr. Anche se N-glicosilazione può essere prevenuta mutando un residuo di aminoacido nel sito di consenso, questo può anche alterare la funzione della proteina o l'efficienza del ripiegamento. Nella rodopsina bovina, la mutazione del residuo N-glicosilato Asn15 porta a un ripiegamento errato e alla riduzione dell'attivazione della proteina G9,10. La rodopsina utilizzata in questa relazione è stata espressa nella linea cellulare HEK 293 GnTI-carente. Tuttavia, SDS-PAGE ha mostrato la presenza di due specie di rodopsina. Questa eterogeneità potrebbe impedire la formazione di cristalli e quindi è stato testato il deglycosylation usando peptidi-N-glycosidase F (PNGase F) e endoglycosidase F1 (Endo F1). Il prodotto declisco è stato caratterizzato da SDS-PAGE e spettrometria di massa di cromatografia liquida (LC-MS) per identificare il livello di glicosilazione e la sua omogeneità.
Protocol
NOTA: Questo protocollo per lo screening del detersivo è dettagliato per 30 g di pellet a cellule HEK293 come materiale di partenza.
1. Materiali, sostanze chimiche e reagenti
NOTA: Tutte le soluzioni sono preparate utilizzando reagenti di qualità analitica e acqua ultrapura, che viene purificata dall'acqua deionizzata per raggiungere una resistenza di 18,2 M .
- Soluzioni di riserva di buffer
- Preparare 10 volte la salina tampone di fosfato (10x PBS).
- Preparare il buffer HEPES: 1 M, titolato a pH 7.5 con NaOH.
- Preparare 5 M NaCl.
- Preparare 2 M MgCl2.
NOTA: Tutte le soluzioni azionarie vengono passate attraverso un filtro da 0,22 m per mantenere la loro sterilità.
- Soluzioni per il detersivo
- Preparare il maltoto dodecyl (DDM), 10% (w/v).
- Preparare decyl maltoside (DM), 10% (w/v).
- Preparare 6-cyclohexyl-hexyl maltoside (Cymal-6), 10% (w/v).
- Preparare 5-cyclohexyl-pentyl maltoside (Cymal-5), 10% (w/v).
- Preparare il glucosio non yl (C9G), 10% (w/v).
- Preparare lauryl maltose neopentyl glicol (LMNG), 5% (w/v).
- Preparare decyl maltose neopentyl glycol (DMNG), 10% (w/v).
- Preparare il glicole al di tipo cymal-6 neopentyl (C6NG), 10% (w/v).
- Preparare il glicole neopentyl cymal-5 (C5NG), 10% (w/v).
- Preparare il glucosio ottilo neopentyl glicol (OGNG), 10% (w/v).
NOTA: Per la soluzione di scorta di detersivo 10%, sciogliere 1 g di detersivo in acqua ultrapura con dondolo delicato, quindi regolare il volume finale a 10 mL. La soluzione per il detersivo deve essere mantenuta a -20 gradi centigradi per lo stoccaggio a lungo termine e sul ghiaccio durante il lavoro.
AVVISO: I detergenti in bottiglia sono di solito raccomandati per conservare al congelatore -20 gradi centigradi. Le bottiglie contenenti detersivo in polvere devono essere riscaldate a temperatura ambiente prima dell'apertura. La polvere detergente è igroscopica, quindi l'equilibratità della temperatura impedirà la formazione di condensa che somministra il detersivo.
- Altre sostanze chimiche e reagenti
- Preparare 1D4 immunoaffinità agarose resina: 10 mL del 50% di liquami.
NOTA: Le agarose di immunoaffinità 1D4 sono le perle di agarose collegate all'anticorpo Rho1D4 monoclonale, che lega gli ultimi 9 aminoacidi del rodopsina bovino TETSQVAPA come epitopo. L'agarose di immunoaffinità 1D4 funziona come materiale di purificazione dell'affinità per catturare le proteine che contengono una sequenza 1D4 terminale C. Questo materiale di purificazione può essere preparato9,11 o acquistato. - Preparare una soluzione retinica a 9 cis: 1 mM, disciolto al 100% di etanolo.
NOTA: Prevenire l'esposizione della luce alla retina durante la preparazione e lo stoccaggio. - Preparare il peptide 1D4 (sequenza TETSQVAPAPA): 800 M, disciolto in acqua.
- Preparare 1D4 immunoaffinità agarose resina: 10 mL del 50% di liquami.
- Buffer
NOTA: tutti i buffer sono miscelati dalle soluzioni di stock alla concentrazione desiderata. Tutti i buffer vengono raffreddati fino a 4 gradi centigradi prima dell'uso.- Preparare il buffer A: PBS, 0,04% DDM.
- Preparare il buffer B: 20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.04% DDM.
- Preparare il buffer C: 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl e detergente alla loro concentrazione di lavoro elencata nella tabella 1.
- Preparare il buffer D: 20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl.
- Preparare il buffer di elution: 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 80 peptidi 1D4 E detergente alla loro concentrazione di lavoro.
- Preparare il buffer SEC: 20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.025% DDM; filtrato attraverso un filtro da 0,22 m.
- Solvente per LC-MS
- Preparare il solvente A: acetonitrile contenente lo 0,1% di acido formio.
- Preparare il solvente B: acqua ultrapura contenente lo 0,1% di acido formico.
- Preparare il solvente C: iso-propanol.
2. Soluttibilità della membrana cellulare ed estrazione di proteine
- Scongelo 30 g di HEK293 GnTI- pellet cellulare che esprime il mutante di rodopsina bovina N2C/M257Y/D282C3,9 a temperatura ambiente, aggiungere 120 mL di 1x PBS buffer contenente proteasi inibitore cocktail e omogeneizzare utilizzando un omogeneizzatore Dounce o un omociclologo elettrico (13,000 rpM per sm). Raccogliere la sospensione cellulare omogenea in un becher e regolare il volume a 150 mL.
NOTA: 30 g di pellet cellulare equivale a 3 L di coltura cellulare a 2 x 106 celle / mL densità. - Aggiungere delicatamente il 10% di DDM alle cellule omogeneizzate per dare una concentrazione finale dell'1,25%. Mescolare sul ghiaccio per 1 h.
- Centrifugare la lisata cellulare a 4 gradi centigradi e 150.000 x g per 45 min per rimuovere i detriti non solubiliti.
- Trasferire il supernatante in una bottiglia da 500 mL e aggiungere 10 mL della resina di agarose di immunoaffinità 1D4 (50% di liquami). Mescolare delicatamente la lisata e la resina solubilita per 4 h o peruna durante la notte a 4 gradi centigradi.
- Caricare la miscela di lisa/resina in una colonna aperta per raccogliere la resina.
- Lavare la resina con 10 volumi di colonne (CV) del lavaggio Buffer A.
NOTA: il volume della colonna è il volume del resina di agarose utilizzata. In questo caso, 1 CV è 5 mL. - Risospendere la resina con 2 CV del buffer A.
AVVISO: dal punto 2.8 in poi, i passi che devono essere eseguiti in condizioni di luce rossa fioca sono etichettati con "[Scuro]" all'inizio della descrizione. - [Scuro] Aggiungere la 9 cis retina alla resina risospesa alla concentrazione finale di 50 M. Mescolare delicatamente a 4 gradi centigradi per 4-16 h al buio.
NOTA: un tempo di incubazione più breve può portare a una ricostituzione incompleta della retina. - [Scuro] Rimuovere il flusso dalla colonna. Lavare la resina con 20 CV Buffer A, seguita da 15 CV Buffer B.
- [Scuro] Risospendere la resina in 2 CV Buffer B, quindi dividere equamente la sospensione della resina in 10 colonne di smaltimento da 10 mL.
- [Scuro] Rimuovere il flusso dalla colonna, quindi risospendere la resina in 1 mL Buffer C. Incubare per 1 h a 4 gradi centigradi.
- [Scuro] Ripetere il passaggio 2.11.
- [Scuro] Rimuovere il flusso dalla colonna e quindi sospendere nuovamente la resina nel buffer di eluzione di 0,8 mL per ogni colonna. Mescolare delicatamente per 2 h.
- [Scuro] Raccogliere l'eluizione dalla colonna in un tubo da 2 mL.
- [Scuro] Risospendere la resina in 0,7 mL di buffer di eluzione per ogni colonna. Mescolare delicatamente per 1 h.
- [Scuro] Raccogliere l'eluizione dalla colonna nello stesso tubo.
3. Spettroscopia UV-VIS
- Preparare lo spettrofotometro per coprire l'intervallo di misurazione di 250-650 nm. Registrare la linea di base utilizzando acqua o buffer di eluzione.
- [Scuro] Caricare la proteina elutata nella cuvette al quarzo. Misurare lo spettro del campione proteico.
- [Scuro] Illuminare la proteina direttamente nella cuvette per 2 min con la luce passata attraverso un filtro a passaggio lungo di 495 nm.
- Misurare lo spettro del campione illuminato.
- Eseguire la stessa misurazione per tutti i campioni di proteine purificati negli altri 9 detergenti, sia scuri che illuminati.
- Tracciare le curve (assorbimento e lunghezza d'onda) nel grafico a dispersione X-Y.
4. Cromatografia automatizzata di dimensioni-esclusione di rodopsina e rodopessi-mini-Go complesso
- [Scuro] Concentrare la proteina a 100 -L con la centrifugazione utilizzando un concentratore di spin con un taglio del peso molecolare (MWCO) di 30 kDa a 4 gradi centigradi. I campioni sovraconcentrati possono essere diluiti utilizzando il flusso dal concentratore o buffer C. Per determinare la concentrazione del campione proteico, misurare l'assorbimento a 280 nm utilizzando uno spettrofotometro.
NOTA: dal passaggio 4.2 in poi, l'esperimento non richiede un ambiente scuro e pertanto i campioni possono essere preparati sotto la luce normale. - Preparare 100 rhodopsin a 0,7 mg/mL per ogni condizione di detersivo.
- Preparare 100 l di rodopina (0,7 mg/mL) e mini-Go4,12 (0,2 mg/mL) miscela per ogni condizione di detersivo. Integrare la miscela con 1 mM MgCl2. Illuminare la miscela con la luce di un filtro long-pass di 495 nm e incubare per 30 min.
- Montare una colonna di filtrazione gel da 24 mL con un intervallo di frazionamento di 10-600 kDa di una proteina globulare su un purificatore di cromatografia liquida. Equilibratha la colonna con buffer SEC.
NOTA: il depuratore di cromatografia liquida è dotato di un autocampione, di un rilevatore a lunghezza d'onda multipla e di un collettore di frazioni. - Trasferire i campioni nelle fiale autocampionatore e metterli nel vassoio del campione. Programmare un file di metodo per automatizzare le esecuzioni SEC sequenziali per ogni campione, con l'autocampionatore che carica 77 l dell'appesione nella colonna e il purificatore 24 mL di buffer SEC a una velocità di flusso di 0,5 mL/min per esecuzione. Registrare l'assorbimento a 280 nm e 380 nm.
- Raccogliere le frazioni massime di rodopina e rodopina-mini-Go complesso al volume di ritenzione intorno 12,9 mL.
- Analizzare i campioni di rodopsina sinistra dal passaggio 4.2 e le frazioni di picco di rodopina-mini-Go complesso su 4-12% gel sfumato SDS-denatura con coomassie blu colorazione.
- Tracciare il cromatogramma di eluizione (A280 o A380 rispetto al volume di ritenzione).
5. Deglycosylation e Studio LC-MS
- Per lo studio LC-MS, utilizzare solo il campione di rodopina purificato nel detersivo LMNG.
- Preparare una miscela di 200 litri di rodopsina a 1 mg/mL e PNGase F13 a 0,01 mg/mL. Mescolare bene e incubare a 4 gradi centigradi durante la notte.
- Preparare una miscela di 200 litri di rodopsina a 1 mg/mL ed Endo F113 a 0,01 mg/mL. Mescolare bene e incubare a 4 gradi centigradi durante la notte.
- Analizzare il risultato della digestione da SDS-PAGE e Coomassie colorazione blu.
- Concentrare campioni di rodopina non trattati ed Endo F1 e soggetti alla purificazione SEC nel Buffer D.
NOTA: Questo è quello di preparare il campione con una quantità minima di detersivo per lo studio LC-MS. Il buffer D non contiene detergenti, ma a causa della lentezza del GNL da una proteina di membrana14, la rodopsina non si aggreghe. - Raccogliere la frazione di picco al volume di ritenzione intorno a 12,9 mL. Concentrarsi su 1 mg/mL utilizzando un concentratore di spin (MWCO 30 kDa).
- Iniettate 10 g di proteine in una colonna Reprosil 200 C18-AQ ed elusela la colonna utilizzando il metodo del gradiente lineare con la composizione del solvente e le impostazioni elencate nella tabella 2. Il flusso è diviso al 25% per lo spettrometro di massa e al 75% per il rilevamento UV.
Representative Results
Il flusso di lavoro sperimentale per la preparazione e l'analisi dei campioni è riepilogato nella Figura 1. L'utilizzo di colonne aperte per la purificazione dell'affinità su piccola scala ci ha permesso di preparare i campioni in molte condizioni di detersivo diverse in parallelo (Figura 1A). Tale struttura di purificazione su piccola scala ha prodotto proteine sufficienti per ulteriori analisi utilizzando la spettroscopia UV-VIS, SEC e SDS-PAGE(Figura 1B-C).
La spettroscopia UV-VIS ha rivelato la stabilità della rodopsina
La stabilità della rodopina retina-ricostituita è stata valutata dalla sua assorbimento ottico (Figura 2). Nello stato oscuro, la retina 9 cis è covalente legata a Lys296 come base protonata Dischiff. Dopo l'illuminazione, il 9-cis retinale è isomerizzato all'isoforme all-trans e il collegamento di base Schiff è deprotonato. La retina protonata a 9 cis dà un picco di assorbimento a 488 nm, mentre la retina all-trans deprotonata ha un picco a 380 nm. Gli spettri UV-VIS della rodopsina nel DDM mostravano il tipico assorbimento di rodopina 9-cis legata alla retina e attivata dalla luce, dove si osservava chiaramente uno spostamento blu di 108 nm con all'incirca la stessa densità ottica(Figura 2A, pannello superiore sinistro). Quando la rodopsina è destabilizzata, e poi la tasca legante per i cambiamenti retinici, che si traduce in deprotonazione retinica e possibilmente dissociazione. Se questo accade, e poi lo spettro mostra il contributo dalla deprotonazione così come la forma libera di retieria15. Pertanto, abbiamo determinato l'efficienza della ricostituzione della retina in rodopsina dal rapporto di assorbimento tra la proteina (280 nm) e la retina (488 nm per la retinami a 9 cis protonato, 380 nm per la retina all-trans deprotonata) (Figura 2B). I campioni di rodopina purificati nei detergenti classici (DDM, DM, Cymal-6, Cymal-5, C9G) mostrano lo stesso profilo ottico. Tuttavia, i campioni purificati nei detergenti NPG (LMNG, DMNG, Cymal-6NG, Cymal-5NG) mostrano profili ottici che suggeriscono un ambiente di legame non ottimale per la retina, ad eccezione del campione OGNG, che ha dato lo stesso profilo ottico del campione DDM.
La cromatografia ad esclusione di dimensioni ha mostrato la purezza del campione e la monodità proteica.
SEC è uno strumento analitico efficiente e robusto per la valutazione dei campioni proteici durante la preparazione e lo screening. Convalida la purezza del campione dalla precedente fase di purificazione e la monodispersità delle molecole proteiche. Per il rodopsina e il suocomplesso mini-G, la qualità del campione è stata interpretata dalle curve di assorbimento a 280 nm e 380 nm (Figura 3A). Le tracce di 280 nm hanno mostrato la presenza di proteine, e la traccia di 380 nm ha mostrato la presenza di retini. Tutti i segnali che appaiono nel volume vuoto (circa 8 mL quando si utilizza questa colonna) sono stati attribuiti agli aggregati proteici. Pertanto, i risultati hanno mostrato che i campioni preparati nei detergenti classici erano in uno stato monodisperso ad eccezione del C9G, dove è apparsa una parte dell'aggregato. Al contrario, i campioni preparati utilizzando i detergenti di tipo NPG contenevano molto più aggregati rispetto al campione C9G; LMNG e Cymal-6NG hanno portato alla formazione più aggregata, ma sono stati osservati meno aggregati nel DMNG e nel Cymal-5NG. L'eccezione era OGNG, che ha mostrato un profilo simile a DDM. Gli aggregati proteici che si elatavano al volume vuoto avevano anche una minore occupazione della retina, come dimostrato dal rapporto A280/A380 che era aumentato rispetto al picco al volume di ritenzione di 12,9 mL corrispondente a 135 kDa. Un'altra caratteristica che abbiamo osservato è stata che sia rodopina e rodopina-mini-Go eluito intorno allo stesso volume di ritenzione (Figura 3B). Questo non sorprende, perché l'apparente peso molecolare della rodosopina legata al detergente era di 120 kDa e quello di rodopina-mini-Go 144 kDa. Non abbiamo quindi potuto accertare la formazione complessa solo dai dati SEC, quindi SDS-PAGE è stato utilizzato per analizzare ulteriormente il campione purificato dalla SEC.
SDS-PAGE ha confermato la formazione complessa
SDS-PAGE è un metodo standard per identificare i componenti proteici in un campione. La rodopsina concentrata (prima della purificazione DELLA SEC) è stata analizzata da SDS-PAGE per confermare la sua purezza, e ha mostrato due bande vicino a 37 kDa e una banda imbratta sopra 50 kDa(Figura 4A). Le due bande inferiori furono successivamente confermate di avere diversi stati di N-glycosylation. La banda sopra 50 kDa è stata interpretata come oligomeri rhodopsin aggregati indotti dal buffer campione SDS-PAGE perché questi aggregati non sono stati osservati in SEC o in altri metodi di rilevamento. Poiché i dati SEC non potevano confermare la formazione complessa, la SEC ha evitato frazioni da campioni di rodopina-mini-Go sono stati analizzati utilizzando SDS-PAGE. L'SDS-PAGE ha mostrato bande proteiche sia di rodopsina che dimini-G o in tutte le condizioni detergenti, suggerendo che il complesso si è formato indipendentemente dalla scelta del detersivo (Figura 4B).
La spettrometria LC-MS ha identificato il modello N-glicosylation nella rodopsina
I campioni di rodopina provenienti sia dalla purificazione dell'affinità che dalla SEC hanno mostrato due bande proteiche che migravano con un peso molecolare apparente di circa 37 kDa su un gel SDS-PAGE, che non poteva essere separato dalla SEC quando si utilizzava una colonna da 24 mL. Diversi modelli di N-glicosilazione sulla rodopsina etelogamente espressa da HEK 293 GnTI- le cellule è stata la spiegazione più probabile. Pertanto, due enzimi, PNGase F ed Endo F1, sono stati testati per la loro capacità di deglilio rodopsina. Dai dati SDS-PAGE, Endo F1 ha ridotto il peso molecolare di entrambe le bande proteiche in un unico prodotto, mentre la digestione di PNGase F ha dato ancora due popolazioni (Figura 5A). I campioni non digeriti e trattati con Endo F1 sono stati analizzati usando la spettrometria LC-MS per identificare le masse di specie diverse. I dati hanno mostrato che la rodopsina prodotta in HEK 293 GnTI- le cellule contenevano uno o due N-glicani, con una differenza di massa di 1014-1 Da. Endo F1-trattato rhodopsin non conteneva alcun N-glycans e aveva una differenza di massa di 2027 -1 Da rispetto alla rodopsina contenente due N-glycans. Questi risultati sono coerenti con l'assenza dell'enzima N-acetylglucoslayltransferase I nella linea cellulare utilizzata per esprimere rodopsina, che si traduce in tutti i N-glicani con la struttura GlcNAc2Man5, (massa 1014 Da).
Figura 1: Preparazione del campione e caratterizzazione per l'esperimento di screening del detersivo. (A) Preparazione di campioni di rodopsina in detergenti diversi durante la purificazione. (B) Metodi utilizzati nel protocollo: spettroscopia UV-VIS, cromatografia di esclusione delle dimensioni (SEC), SDS-PAGE e spettrometria di massa di cromatografia liquida (LC-MS). (C) Flusso di lavoro sperimentale per la caratterizzazione di rodopina, rodopina-mini-Goe prodotto deglycosylation di rodopessi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: spettroscopia UV-VIS della rodopsina. (A)Spettri UV-VIS di rodopsina. Gli spettri del rodopsino legato allo stato scuro, 9 cis retinal, sono mostrati in curve blu. Dopo l'illuminazione, la retina a 9 cioè viene deprotonizzata e isomerizza in retina tutta trans, e gli spettri del rodopsina illuminato sono mostrati come curve rosse. La struttura chimica di ciascun detergente è mostrata come un incasso. (B) I rapporti tra A280/A488 (barra blu) e280/A380 (barra rossa) rappresentano rispettivamente la stabilità della rodosopina nello stato scuro e nello stato chiaro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Profili cromatici di esclusione delle dimensioni di rodopsina e rodopsina–mini-Go complesso purificato in 10 detergenti diversi. (A) Il pannello sinistro mostra i profili SEC dei campioni purificati nei detergenti classici. Il pannello di destra rappresenta i profili SEC dei campioni purificati nei detergenti di tipo NPG. Il profilo delle proteine marcatore standard viene mostrato come sovrapposizione insieme al campione DDM. L'interpretazione dei profili di picco è mostrata per DMNG, con lo scenario ideale (senza aggregati) visto per DDM, DM, Cymal-6, Cymal-5 e OGNG. (B) Il profilo ingrandito del campione OGNG nel volume di ritenzione di 12-14 mL. Tutti i campioni sono stati analizzati utilizzando una colonna Superdex200 Increase 10/300 GL. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Analisi SDS-PAGE del complesso di rodopina e rodopsina/mini-Go. (A) Campioni di rodopsina purificati nei detergenti. La banda spalmata sopra 50 kDa è attribuita agli oligomeri rhodopsin aggregati indotti dal buffer del campione SDS-PAGE. (B) Campioni purificati dalla SEC del complesso di rodopina/mini-Go. Sono raffigurati rodopini con 1 e 2 N-glycan e mini-Go. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Identificazione della glicosilazione nella rodopsina. (A) Analisi SDS-PAGE del rodoso deglycosylated utilizzando PNGase F ed Endo F1. (B) Spettri LC-MS di rodopsina senza (pannello superiore) e con deglycosylation di Endo F1 (pannello inferiore). Per preparare ilcomplesso rhodopsin-mini-G per la cristallizzazione, abbiamo scelto Endo F1 rispetto a PNGase F perché Endo F1 ha consegnato una singola specie omogenea di rodopsina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Detergente | Concentrazione lavorativa (%) | Concentrazione critica di micelle (%) |
| Ddm | 0.025 | 0.0087 |
| Dm | 0.12 | 0.087 |
| Cimal 6 | 0.05 | 0.028 |
| Cimal-5 | 0.2 | 0.12 |
| C9G | 0.5 | 0.2 |
| LMNG | 0.01 | 0.001 |
| DMNG | 0.01 | 0.0034 |
| Cimal-6NG | 0.015 | Non disponibile; deve essere inferiore a 0,056 |
| Cimal-5NG | 0.02 | 0.0056 |
| OGNG | 0.15 | 0.058 |
Tabella 1: Concentrazioni di detergenti buffer C.
| Tempo (min) | Solvente A (%) | Solvente B (%) | Solvente C (%) | Velocità di flusso (ml/min) |
| 0 | 0 | 95 | 5 | 0.5 |
| 1 | 0 | 95 | 5 | 0.5 |
| 5 | 20 | 75 | 5 | 0.6 |
| 25 | 85 | 10 | 5 | 0.6 |
| 26 | 90 | 5 | 5 | 0.6 |
| 30 | 90 | 5 | 5 | 0.6 |
Tabella 2: Parametri di elusione delle colonne.
Discussion
Il successo nella cristallizzazione delle proteine si basa fortemente sul campione proteico, in particolare le proteine della membrana e i loro complessi a causa della complicazione causata dai detergenti. Questo rapporto dimostra lo screening del detersivo e la valutazione della qualità del campione per i complessi di segnalazione delle proteine GPCR-mini-G. Una varietà di metodi sono stati ampiamente utilizzati per studiare la proprietà biochimica delle proteine della membrana, ad esempio, l'analisi della termostabilità utilizzando coloranti fluorescenti16,17, analisi vincolante per rilevare la formazione complessa misurando il cambiamento nel segnale di fluorescenza del metaforo18 o il trasferimento di energia di risonanza con biosensori19. Tuttavia, gli ambienti chimici utilizzati in questi metodi sono molto diversi da quelli per la preparazione di un campione di cristallizzazione, o le proteine sono a una concentrazione più bassa di mille volte per la misurazione basata sulla fluorescenza, o le proteine sono incorporate nei bistrati lipidici o in una condizione detergente fissa. In questo protocollo, i metodi utilizzati sono standardizzati anche nella preparazione di campioni su larga scala prima della cristallizzazione. Pertanto, i parametri ottimizzati possono essere facilmente trasferiti per la preparazione in scala di cristallizzazione senza ulteriori ulteriori controlli e ottimizzazioni importanti.
L'obiettivo di questo protocollo è ottimizzare la preparazione di un complesso proteico stabile e omogeneo GPCR-mini-G per la cristallizzazione del vapore e la determinazione della struttura mediante cristallografia a raggi X. Il protocollo integra una serie di metodi per valutare qualitativamente l'impatto del detersivo e della deglycoslation durante la preparazione del rodopsino-mini-Go complesso. Rodopsina in stato inattivo e stato attivato dalla luce legato con e senza il peptide trasducina è stato cristallizzato quando purificato nei detergenti octil glucosio (C8G)20,21,22 e C9G23,24. Come il rhodopsin-mini-Go complesso purificato in C8G e C9G non produceva cristalli (dati non mostrati), abbiamo poi esplorato una più ampia gamma di altri detergenti utilizzando la strategia descritta (Figura 1). Sfruttando la sensibilità alla luce della rodopsina, potremmo molto seguire la ricostituzione della retina a lunghezze d'onda diverse da 280 nm. Sia nella spettroscopia UV-VIS che nella SEC, abbiamo rilevato una retina a 380 nm o 488 nm. Tuttavia, la maggior parte delle proteine della membrana non hanno un cromoforo così conveniente per seguire la funzionalità durante la purificazione. Altre opzioni potrebbero essere di rendere rilevabile un ligando aggiungendo un cromoforo rilevabile nella luce o utilizzando i sottosaggi di legame radioligando e termico25 .
La rodopsina ha un peso molecolare di 40 kDa. A causa della massa di detersivo che lega, il suo peso molecolare apparente sulla SEC è di circa 120 kDa. Non sorprende quindi che il legame di mini-Go (24 kDa) non sia stato facilmente rilevato sulla SEC, in quanto ciò richiederebbe la differenziazione delle proteine con masse apparenti di 120 kDa e 144 kDa. L'analisi delle frazioni SEC da parte di SDS-PAGE è stata quindi utilizzata per confermare la purezza del campione e la formazione complessa. Anche se i profili SEC mostrano un netto spostamento sulla formazione complessa, si raccomanda comunque di eseguire l'analisi SDS-PAGE per confermare la formazione complessa con partner di legame corretti piuttosto che altri contaminanti proteici compurificati.
Sia il rodopsino che il mini-Go sono stati purificati in quantità di milligrammo, il che ha permesso l'uso di un rilevamento a bassa sensibilità dei complessi, come l'assorbimento UV-VIS durante la statterina DI SEC e Commassie Blue dei gel SDS-PAGE. Quando i campioni sono limitati, si dovrebbe utilizzare un rilevamento più sensibile, come un depuratore LC dotato di un rilevatore di fluorescenza per tracciare i segnali di orptofano dalla proteina (eccitazione 280 nm, 350 nm di emissione) e colorazione argento per i gel SDS-PAGE. Un altro approccio potrebbe essere quello di fondere una proteina fluorescente, come la proteina a fluorescenza verde (GFP) alla proteina di interesse, che consentirebbe anche il rilevamento anche durante l'espressione proteica26, ma dovrebbe essere rimossa prima della cristallizzazione.
È essenziale garantire che la proteina purificata sia anche priva di eterogeneità derivanti da PPM variabili. Nel caso qui descritto, le due popolazioni di rodopsina osservate sui gel SDS-PAGE sono state caratterizzate come aventi uno o due N-glicani. La modifica variabile di una proteina potrebbe impedire la formazione di cristalli ben diffranti, quindi abbiamo deglycosylated rhodopsin. L'endoglycosidase Endo F1 è stato l'effetto più efficace che l'endogidasi è stato testato e il trattamento ha portato a una singola specie di recettore unglycosylated, mentre PNGase F ha rimosso solo parzialmente i glicani sulla rodopsina e ha provocato una miscela di rodopsina completamente poco glycosylated o con un N-glycan è rimasto. Il rodopsina senza deglycosylase è stato cristallizzato con successo3,27,28, e il N-glycan su rodopsina Asn15 è importante formare il contatto cristallo in quei casi. Nel caso di rodopina-mini-Go, è necessario rimuovere N-glicani da Endo F1 per ottenere cristalli. Non esiste una regola standardizzata per deglilare le proteine di interesse prima della cristallizzazione, ma la rimozione delle PTM heteenose dovrebbe essere considerata quando le proteine non riescono a cristallizzarsi dopo lunghe prove di cristallizzazione.
I dati e la metodologia qui descritti ci hanno guidato a scegliere OGNG come il detergente preferito per la cristallizzazione del rodopsino-mini-Go complesso a causa delle sue piccole dimensioni micelle e della sua capacità di stabilizzare il complesso. Abbiamo anche usato Endo F1 per garantire che la rodopsina purificata fosse una specie omogenea. I cristalli sono stati successivamente ottenuti e abbiamo determinato la struttura cristallina a 3,1 x4dollari, che era solo la terza struttura cristallina di un complesso di segnalazione proteica GPCR-G14,29.
Per le proteine della membrana legate e senza una proteina partner, dovrebbero essere considerate come due proteine diverse. Una proteina in diversi stati funzionali ha conformazioni diverse ed è a diversi livelli di energia. Pertanto, si consiglia di ottimizzare il protocollo di preparazione per ogni stato funzionale in quanto il parametro per lo stato inattivo potrebbe non essere completamente trasferibile allo stato attivato. Inoltre, per non parlare del cambiamento nella proprietà della proteina complicato legando una proteina partner. Il protocollo utilizza metodi standardizzati per preparare un campione di cristallizzazione per preparare la proteina della membrana inattiva in diversi detergenti, seguita dall'attivazione delle proteine e dalla formazione complessa, e per caratterizzare la qualità delle proteine. Pertanto, questo protocollo può essere facilmente generalizzato ad altre proteine della membrana e ai loro complessi per studi strutturali con modifica minore.
Disclosures
CGT è consulente e membro del comitato consultivo scientifico di Sosei Heptares. Tutti gli altri autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo il Professor Gebhard F. X. Schertler per il suo sostegno a lungo termine in questo progetto, dr. Roger J.P. Dawson e Hoffmann La Roche per il supporto nella coltura cellulare. Questo lavoro è stato sponsorizzato dalla Fondazione nazionale svizzera per la scienza (concede 210030_153145 e 310030B_173335 a GFXS) e dal finanziamento alla CGT da parte del Consiglio europeo della ricerca (EMPSI, 339995) e del Consiglio per la ricerca medica (MRC U105197215). FP riconosce il Pfth srl attraverso il Centro Nazionale di Competenza nella Ricerca Molecular Ultrafast Science and Technology (NCCR MUST) e i programmi ETH Femtosecond e Attosecond Science and Technology (ETH FAST). FP, JM, AB e CJT riconoscono il sostegno finanziario a lungo termine dell'Istituto Paul Scherrer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1D4 peptide | Peptide2.0 | Under request | |
| 9-cis retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
| Autosampler A-900 | GE Healthcare | Discontinued | |
| C9G | Anatrace | N324 | |
| cOmplete, EDTA-free protease inhibitor coctail | Roche | 5056489001 | |
| Cymal-5 | Anatrace | C325 | |
| Cymal-5NG | Anatrace | NG325 | |
| Cymal-6 | Anatrace | C326 | |
| Cymal-6NG | Anatrace | NG326 | |
| DDM | Anatrace | D310 | |
| DM | Anatrace | D322 | |
| DMNG | Anatrace | NG322 | |
| Econo column | Bio-Rad | 7372512 | |
| Ettan LC | GE Healthcare | Discontinued | |
| FRAC-950 | GE Healthcare | Discontinued | |
| HPLC Water 2795 Separation Module | Waters AG | 720000358EN | |
| InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | |
| LCT Premier mass spectrometer (ESI-TOF) | Waters AG | - | |
| LMNG | Anatrace | NG310 | |
| Monitor UV-900 | GE Healthcare | 18110835 | |
| Nanodrop 1000 | Witec AG/ThermoFisher | Discontinued | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel 1.0 mm, 15 well | ThermoFisher | NP0323BOX | |
| NuPAGE MES SDS buffer (20x) | ThermoFisher | NP0002 | |
| OGNG | Anatrace | NG311 | |
| PAGEr Minigel Chamber | Lonza | 59905 | |
| Reprosil 200 C18-AQ column | Morvay Analytik GmbH | #s1503 | |
| Superdex 200 Increase GL column | GE Healthcare | 28990944 | |
| Tabletop centrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000413 | |
| Ultracentrifuge Optima XE-100 | Beckmann Coulter | A94516 | |
| ULTRA-TURRAX T25 | IKA WERKE | 0003725003 | |
| UV-VIS spectrophotometer | Shimadzu | UV-2401PC | |
| Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector | Waters AG | - |
References
- Tate, C. G. Practical considerations of membrane protein instability during purification and crystallisation. Methods in Molecular Biology. 601, Clifton, N.J. 187-203 (2010).
- Lebon, G., Bennett, K., Jazayeri, A., Tate, C. G. Thermostabilisation of an agonist-bound conformation of the human adenosine A(2A) receptor. Journal of Molecular Biology. 409 (3), 298-310 (2011).
- Deupi, X., et al. Stabilized G protein binding site in the structure of constitutively active metarhodopsin-II. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (1), 119-124 (2012).
- Tsai, C. -J., et al. Crystal structure of rhodopsin in complex with a mini-G o sheds light on the principles of G protein selectivity. Science Advances. 4 (9), (2018).
- Carpenter, B., Tate, C. G. Engineering a minimal G protein to facilitate crystallisation of G protein-coupled receptors in their active conformation. Protein Engineering Design and Selection. 29 (12), 583-594 (2016).
- Chae, P. S., et al. Maltose-neopentyl glycol (MNG) amphiphiles for solubilization, stabilization and crystallization of membrane proteins. Nature Methods. 7 (12), 1003-1008 (2010).
- Loll, P. J. Membrane proteins, detergents and crystals: what is the state of the art. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 70 (12), 1576-1583 (2014).
- Chae, P. S., et al. Glucose-neopentyl glycol (GNG) amphiphiles for membrane protein study. Chemical communications. 49 (23), Cambridge, England. 2287-2289 (2013).
- Standfuss, J., Xie, G., Edwards, P. C., Burghammer, M., Oprian, D. D., Schertler, G. F. X. Crystal structure of a thermally stable rhodopsin mutant. Journal of Molecular Biology. 372 (5), 1179-1188 (2007).
- Kaushal, S., Ridge, K. D., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin: the role of asparagine-linked glycosylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (9), 4024-4028 (1994).
- Molday, L. L., Molday, R. S. 1D4: a versatile epitope tag for the purification and characterization of expressed membrane and soluble proteins. Methods in Molecular Biology. 1177 (604), Clifton, N.J. 1-15 (2014).
- Carpenter, B., Tate, C. G. Expression and Purification of Mini G Proteins from Escherichia coli. Bio-Protocol. 7 (8), (2017).
- Grueninger-Leitch, F., D'Arcy, A., D'Arcy, B., Chène, C. Deglycosylation of proteins for crystallization using recombinant fusion protein glycosidases. Protein Science. 5 (12), 2617-2622 (1996).
- Rasmussen, S. G. F., et al. Crystal structure of the β2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477 (7366), 549-555 (2011).
- Loginova, M. Y., Rostovtseva, Y. V., Feldman, T. B., Ostrovsky, M. A. Light damaging action of all-trans-retinal and its derivatives on rhodopsin molecules in the photoreceptor membrane. Biochemistry (Moscow). 73 (2), 130-138 (2008).
- Alexandrov, A. I., Mileni, M., Chien, E. Y. T., Hanson, M. A., Stevens, R. C. Microscale Fluorescent Thermal Stability Assay for Membrane Proteins. Structure. 16 (3), 351-359 (2008).
- Sonoda, Y., et al. Benchmarking Membrane Protein Detergent Stability for Improving Throughput of High-Resolution X-ray Structures. Structure. 19 (1), 17-25 (2011).
- Maeda, S., et al. Crystallization scale preparation of a stable GPCR signaling complex between constitutively active rhodopsin and G-protein. PloS One. 9 (6), 98714 (2014).
- Boute, N., Jockers, R., Issad, T. The use of resonance energy transfer in high-throughput screening: BRET versus FRET. Trends in Pharmacological Sciences. 23 (8), 351-354 (2002).
- Singhal, A., Guo, Y., Matkovic, M., Schertler, G., Deupi, X., Yan, E. C. Y. Structural role of the T 94 I rhodopsin mutation in congenital stationary night blindness. EMBO Report. 17 (10), 1-10 (2016).
- Choe, H. -W., et al. Crystal structure of metarhodopsin II. Nature. 471 (7340), 651-655 (2011).
- Mattle, D., et al. Ligand channel in pharmacologically stabilized rhodopsin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (14), 3640-3645 (2018).
- Okada, T., Fujiyoshi, Y., Silow, M., Navarro, J., Landau, E. M., Shichida, Y. Functional role of internal water molecules in rhodopsin revealed by X-ray crystallography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (9), 5982-5987 (2002).
- Blankenship, E., Vahedi-Faridi, A., Lodowski, D. T. The High-Resolution Structure of Activated Opsin Reveals a Conserved Solvent Network in the Transmembrane Region Essential for Activation. Structure. 23 (12), 2358-2364 (2015).
- Magnani, F., et al. A mutagenesis and screening strategy to generate optimally thermostabilized membrane proteins for structural studies. Nature Protocols. 11 (8), 1554-1571 (2016).
- Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), London, England: 1993 673-681 (2006).
- Standfuss, J., et al. The structural basis of agonist-induced activation in constitutively active rhodopsin. Nature. 471 (7340), 656-660 (2011).
- Singhal, A., et al. Insights into congenital stationary night blindness based on the structure of G90D rhodopsin. EMBO reports. 14 (6), 520-526 (2013).
- Carpenter, B., Nehmé, R., Warne, T., Leslie, A. G. W., Tate, C. G. Structure of the adenosine A(2A) receptor bound to an engineered G protein. Nature. 536 (7614), 104-107 (2016).
