Summary
Dieser Bericht beschreibt das Screening verschiedener Reinigungsmittel zur Herstellung des visuellen GPCR, Rhodopsins und seines Komplexes mit Mini-Go. Gezeigt werden biochemische Methoden, die die Qualität des Komplexes in verschiedenen Stadien während der Reinigung charakterisieren. Dieses Protokoll kann für ihre zukünftigen Strukturstudien auf andere Membranproteinkomplexe verallgemeinert werden.
Abstract
Der Schlüssel zur Bestimmung der Kristallstrukturen von Membranproteinkomplexen ist die Qualität der Probe vor der Kristallisation. Insbesondere die Wahl des Waschmittels ist entscheidend, da es sowohl die Stabilität als auch die Monodispersität des Komplexes beeinflusst. Kürzlich haben wir die Kristallstruktur eines aktiven Zustands von Rinderrhodopsin in Verbindung mit einem hergestellten G-Protein, Mini-Go,mit einer Auflösung von 3,1 ° bestimmt. Hier beschreiben wir das Verfahren zur Optimierung der Vorbereitung des Rhodopsin-Mini-G-o-Komplexes.o Dunkelzustand rhodopsin wurde in klassischen und Neopentylglycol (NPG) Waschmitteln hergestellt, gefolgt von einer komplexen Bildung mit Mini-Go unter Lichtexposition. Die Stabilität des Rhodopsins wurde durch ultraviolett-sichtbare (UV-VIS) Spektroskopie beurteilt, die die Rekonstitution des lichtempfindlichen Liganden, 9-cis Retinal, in Rhodopsin überwacht. Automatisierte Größenausschlusschromatographie (SEC) wurde verwendet, um die Monodisperität von Rhodopsin undo dem Rhodopsin-Mini-G-o-Komplex zu charakterisieren. SDS-Polyacrylamidelektrophorese (SDS-PAGE) bestätigte die Bildung des Komplexes, indem ein 1:1-Molar-Verhältnis zwischen Rhodopsin und Mini-Go nach Färbung des Gels mit Coomassie blue identifiziert wurde. Nach der Kreuzvalidierung all dieser analytischen Daten eliminierten wir ungeeignete Waschmittel und setzten das beste Kandidatenwaschmittel für die großflächige Aufbereitung und Kristallisation fort. Ein weiteres Problem ergab sich aus der Heterogenität der N-Glykosylierung. Heterologös exprimiertes Rhodopsin wurde auf SDS-PAGE beobachtet, um zwei verschiedene N-glykosylierte Populationen zu haben, die wahrscheinlich die Kristalllogenese behindert hätten. Daher wurden verschiedene Deglycosylierungsenzyme getestet, und Endoglycosidase F1 (EndoF1) produzierte Rhodopsin mit einer einzigen Art der N-Glykosylierung. Mit dieser strategischen Pipeline zur Charakterisierung der Proteinqualität wurde dieo Vorbereitung des Rhodopsin-Mini-G-O-Komplexes optimiert, um die Kristallstruktur zu liefern. Dies war erst die dritte Kristallstruktur eines GPCR-G-Proteinsignalkomplexes. Dieser Ansatz kann auch für andere Membranproteine und deren Komplexe verallgemeinert werden, um die Probenvorbereitung und Strukturbestimmung zu erleichtern.
Introduction
Die Bestimmung der Kristallstrukturen von Membranproteinen und deren Komplexen war schon immer eine Herausforderung, da es schwierig war, gut diffrierende Kristalle zu erhalten. Im Gegensatz zu löslichen Proteinen bestehen integrale Membranproteine aus einem hydrophoben Kern, der die Zellmembran überspannt. Um Membranproteine aus der Zellmembran in einen wässrigen Puffer zu entfernen, müssen Waschmittel verwendet werden, um eine Waschmittel-Protein-Micelle zu bilden und so die Lipide um den hydrophoben Kern von Membranproteinen zu ersetzen. Stabilität, Aktivität und Integrität von Membranproteinen sind direkt abhängig von den chemischen und strukturellen Eigenschaften des Waschmittels1, und die Eigenschaften des Waschmittels bestimmen auch die Größe der Micelle. Eine große Waschmittel-Micelle kann die hydrophilen Oberflächen eines kleinen Membranproteins verschließen und so eine Kristallisation aufgrund fehlender Kristallkontakte bei der Verwendung der Dampfdiffusionsmethode verhindern. Eine kleine Waschmittel-Micelle ist vorteilhaft für die Kristallographie, aber kurzkettige Waschmittel sind in der Regel rauer und führen daher zu Destabilisierung und Aggregation des Membranproteins. Daher ist vor der Kristallisation ein zusätzliches Waschmittel-Screening-Verfahren unerlässlich, das in der Regel auf kürzere Reinigungsmittel abzielt, die die Proteinstabilität erhalten.
G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind integrale Membranproteine, die sieben Transmembran-A-Helices enthalten. GPCRs existieren in zwei Hauptzuständen, entweder in einem inaktiven Zustand, der durch inverse Agonisten oder Antagonisten stabilisiert wird, oder in einem aktiven Zustand, der an einen Agonisten gebunden und durch ein G-Protein stabilisiert wird, obwohl es wahrscheinlich ist, dass zwischen diesen beiden Extremen eine Vielzahl von Unterstaaten existieren. Die Strukturbestimmung von GPCRs konzentrierte sich zunächst auf inaktive Zustände, die aufgrund ihrer höheren Stabilität an inverse Agonisten und Antagonisten gebunden waren2. Wenn GPCRs bei Agonistenbindung aktiviert werden, sind die Rezeptoren hochdynamisch, und ein Spaltenspalte bildet sich vorübergehend auf der zytoplasmatischen Fläche des Rezeptors für die G-Proteinkopplung. Es wird angenommen, dass diese Dynamik der Grund dafür ist, dass agonistisch gebundene GPCRs oft instabiler sind als der inaktive Zustand. Daher wird es wichtig, auf Detergenzien zu untersuchen, die für den Konformationszustand des untersuchten Rezeptors geeignet sind, da es wahrscheinlich ist, dass mildere Detergenzien für die Untersuchung eines aktiven Zustands im Vergleich zu einem inaktiven Zustand erforderlich sind.
In diesem Bericht verwenden wir den visuellen GPCR, Rinderrhodopsin3und seinen Komplex mit Mini-Go Protein4,5 für die Waschmittel-Screening-Experimente, die den inaktiven Zustand bzw. den aktiven Zustand darstellen. Das Waschmittel-Screening konzentrierte sich auf die klassischen Alkylmaltosid- und Glucosid-Waschmittel und die Neopentylglycol -Waschmittel (NPG). In diesem Zusammenhang wird ein klassisches Waschmittel aus einer Zuckerkopfgruppe und einer Alkylkette gebaut, während die Waschmittel vom Typ NPG zwei identische klassische Waschmittel enthalten, die durch einen quaternären Kohlenstoff an der Schnittstelle zwischen den Zuckern und den Alkylketten6,7,8verschmolzen werden.
Ein experimenteller Arbeitsablauf wurde von der Reinigung von Rhodopsin in verschiedenen Waschmitteln entwickelt, gefolgt von der Bildung des Rhodopsin-Mini-G-o-Komplexes und endete mit der Charakterisierung des Komplexes mit mehreren Methoden (Abbildung 1).o Für den inaktiven Zustand von Rhodopsin wurde die Rekonstitution der lichtempfindlichen Liganden 9-cis Netzhaut durch ultraviolett-sichtbare (UV-VIS) Spektroskopie überwacht. Das Spektrum zeigt den physikalisch-chemischen Zustand der Netzhaut und ist bezeichnend für ihre Umgebung in der retinalen Bindungstasche von Rhodopsin. Die Größenausschlusschromatographie (SEC) wurde eingesetzt, um die Monodisperität von gereinigtem Rhodopsin sowieo die Bildung des Rhodopsin-Mini-G-O-Komplexes zu bewerten. Da die SEC Proteinmoleküle nach ihrer Größe und Form unterscheidet, kann die aggregierte Proteinpopulation identifiziert werden, da sie im Hohlraumvolumen austreten. Zur Bestätigung der komplexen Bildung wurden Fraktionen aus der SEC durch Natriumdodezsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) untersucht, um das Vorhandensein von Rhodopsin und Mini-Gozu bestätigen.
Ein weiterer Faktor, der berücksichtigt werden muss, sind posttranslationale Modifikationen (PTM) an den Membranproteinen. PTM wie N-Glykosylierung werden oft auf eukaryotischen Membranproteinen beobachtet, die in Säugetier- und Insektenzellexpressionssystemen produziert werden. Ein begrenzter N-Glykosylierungsstamm der menschlichen embryonalen Nierenzellen 293 (HEK293) wurde durch Deletion des Gens entwickelt, das N-Acetylglucosaminyltransferase I (GnTI) kodiert, was zu einer homogenen N-Glykosylierung durch GlcNAc2Man5 an der Konsensstelle Asn-X-Ser/Thr führte. Obwohl die N-Glykosylierung durch Mutation eines Aminosäurerückstands in der Konsensstelle verhindert werden kann, kann dies auch die Funktion des Proteins oder die Effizienz der Faltung verändern. Bei Rinderrhodopsin führt die Mutation des N-glykosylierten Rückstands Asn15 zu einer falschen Faltung und reduzierter G-Proteinaktivierung9,10. Das in diesem Bericht verwendete Rhodopsin wurde in HEK 293 GnTI-mangelhafter Zelllinie ausgedrückt. SDS-PAGE zeigte jedoch das Vorhandensein von zwei Rhodopsinarten. Diese Heterogenität könnte die Kristallbildung verhindern und daher wurde die Deglycosylierung mit Peptid-N-Glykosidase F (PNGase F) und Endoglycosidase F1 (Endo F1) getestet. Das deglykosylierte Produkt wurde durch SDS-PAGE und Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) charakterisiert, um den Grad der Glykosylierung und ihre Homogenität zu identifizieren.
Protocol
HINWEIS: Dieses Protokoll für das Waschmittelscreening ist für 30 g HEK293 Zellpellet als Ausgangsmaterial detailliert.
1. Materialien, Chemikalien und Reagenzien
HINWEIS: Alle Lösungen werden mit analytischen Reagenzien und Reinstwasser hergestellt, das aus entionisiertem Wasser gereinigt wird, um bei 25 °C einen Widerstand von 18,2 Mio. cm zu erreichen.
- Pufferlagerlösungen
- 10x phosphatgepufferte Saline (10x PBS) vorbereiten.
- BEREITEN HePES Puffer: 1 M, titriert auf pH 7.5 mit NaOH.
- Bereiten Sie 5 M NaCl vor.
- Bereiten Sie 2 m mgCl2vor.
HINWEIS: Alle Lagerlösungen werden durch einen 0,22-m-Filter geleitet, um ihre Sterilität zu erhalten.
- Reinigungsmittel-Lagerlösungen
- Dodecylmaltosid (DDM), 10% (w/v) vorbereiten.
- Bereiten Sie Decylmaltoside (DM), 10% (w/v) vor.
- 6-Cyclohexyl-Hexyl-Maltosid (Cymal-6), 10% (w/v) vorbereiten.
- 5-Cyclohexyl-Pentyl-Maltosid (Cymal-5), 10% (w/v) vorbereiten.
- Nonylglucosid (C9G), 10% (w/v) vorbereiten.
- Bereiten Sie Lauryl Maltose Neopentylglycol (LMNG), 5% (w/v).
- Bereiten Sie Decylmaltose Neopentylglycol (DMNG), 10% (w/v).
- Bereiten Sie Cymal-6 Neopentylglycol (C6NG), 10% (w/v) vor.
- Bereiten Sie Cymal-5 Neopentylglycol (C5NG), 10% (w/v) vor.
- Bereiten Sie Octylglucoseneopentylglycol (OGNG), 10% (w/v) vor.
HINWEIS: Für 10% Waschmittel-Lagerlösung 1 g Waschmittelpulver in Reinstwasser mit sanftem Schaukeln auflösen und dann das Endvolumen auf 10 ml einstellen. Die Reinigungsmittellagerlösung sollte bei -20 °C für die Langzeitlagerung und während der Arbeit auf Eis gehalten werden.
VORSICHT: Abgefüllte Reinigungsmittel werden in der Regel empfohlen, um sie bei -20 °C Gefrierschrank aufzubewahren. Die Flaschen, die Waschmittelpulver enthalten, sollten vor dem Öffnen auf Raumtemperatur erwärmt werden. Waschmittelpulver ist hygroskopisch, so dass Temperaturgleichgewicht die Bildung von Kondensation verhindern wird, die das Reinigungsmittel nass wird.
- Andere Chemikalien und Reagenzien
- 1D4 Immunoaffinitäts-Agaroseharz zubereiten: 10 ml der 50% Gülle.
HINWEIS: Die 1D4 Immunoaffinitätsagarose sind die Agaroseperlen, die mit dem monoklonalen Rho1D4-Antikörper verbunden sind, der die letzten 9 Aminosäuren von Rinderrhodopsin TETSQVAPA als Epitop bindet. Die 1D4-Immunoaffinitätsagarose arbeitet als Affinitätsreinigungsmaterial, um Proteine zu erfassen, die eine C-terminale 1D4-Sequenz enthalten. Dieses Reinigungsmaterial kann9,,11 oder gekauft werden. - Bereiten Sie 9-cis Netzhautlösung: 1 mM, gelöst in 100% Ethanol.
HINWEIS: Verhindern Sie die Lichtexposition gegenüber der Netzhaut während der Vorbereitung und Lagerung. - 1D4-Peptid (Sequenz TETSQVAPA) vorbereiten: 800 m, in Wasser gelöst.
- 1D4 Immunoaffinitäts-Agaroseharz zubereiten: 10 ml der 50% Gülle.
- Puffer
HINWEIS: Alle Puffer werden von den Lagerlösungen bis zur gewünschten Konzentration gemischt. Alle Puffer werden vor Gebrauch auf 4 °C gekühlt.- Puffer A vorbereiten: PBS, 0,04% DDM.
- Puffer B vorbereiten: 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,04% DDM.
- Puffer C vorbereiten: 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl und Waschmittel bei ihrer Arbeitskonzentration in Tabelle 1aufgeführt.
- Puffer D vorbereiten: 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl.
- Elutionspuffer vorbereiten: 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 80 M 1D4 Peptid und Waschmittel in ihrer Arbeitskonzentration.
- SEC-Puffer vorbereiten: 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,025% DDM; durch einen 0,22-m-Filter filtriert.
- Lösungsmittel für LC-MS
- Bereiten Sie Lösungsmittel A: Acetonitril mit 0,1% Ameisensäure vor.
- Bereiten Sie Lösungsmittel B: Reinstwasser mit 0,1% Ameisensäure vor.
- Bereiten Sie Lösungsmittel C: Iso-Propanol vor.
2. Zellmembranlöslichkeit und Proteinextraktion
- 30 g HEK293 GnTI- Zellpellet, das die Rinderrhodopsin-Mutation N2C/M257Y/D282C3,9 auf Raumtemperatur ausdrücken, 120 ml 1x PBS-Puffer mit Protease-Inhibitor-Cocktail hinzufügen und mit einem Dounce Homogenisator oder einem Homogenisator homogenisieren (13.000 Umdrehungen pro Minute für 30 s). Sammeln Sie die homogenisierte Zellsuspension in einem Becher und stellen Sie die Lautstärke auf 150 ml ein.
HINWEIS: 30 g Zellpellet entsprechen 3 L Zellkultur bei 2 x 106 Zellen/ml Dichte. - Fügen Sie den homogenisierten Zellen vorsichtig 10% DDM hinzu, um eine Endkonzentration von 1,25% zu ergeben. 1 H auf Eis rühren.
- Zentrifugieren Sie die Zelle bei 4 °C und 150.000 x g für 45 min, um die unlöslichen Ablagerungen zu entfernen.
- Den Überstand in eine 500 ml Flasche geben und 10 ml des 1D4 Immunoaffinity Agaroseharzes (50% Gülle) hinzufügen. Das lösliche Zelllysat und Harz 4 h vorsichtig oder über Nacht bei 4 °C mischen.
- Das Lysat/Harz-Gemisch in eine offene Säule laden, um das Harz zu sammeln.
- Waschen Sie das Harz mit 10 Säulenvolumina (CV) des Waschpuffers A.
ANMERKUNG: Das Spaltenvolumen ist das Volumen der verpackten (100%) Agaroseharz verwendet. In diesem Fall beträgt 1 CV 5 ml. - Setzen Sie das Harz mit 2 CV Puffer A aus.
VORSICHT: Ab Schritt 2.8 werden Schritte, die unter dunkelrotem Licht durchgeführt werden müssen, am Anfang der Beschreibung mit "[Dark]" gekennzeichnet. - [Dunkel] Fügen Sie dem resuspendierten Harz 9-cis-Retinal in die Endkonzentration von 50 m hinzu. Bei 4 °C für 4-16 h im Dunkeln sanft mischen.
HINWEIS: Eine kürzere Inkubationszeit kann zu einer unvollständigen Rekonstitution der Netzhaut führen. - [Dunkel] Entfernen Sie den Durchfluss aus der Spalte. Waschharz mit 20 CV Puffer A, gefolgt von 15 CV Puffer B.
- [Dunkel] Setzen Sie das Harz in 2 CV Puffer B aus, und teilen Sie die Harzsuspension gleichmäßig auf 10 10-ml-Entsorgungssäulen auf.
- [Dunkel] Entfernen Sie den Durchfluss aus der Säule, und setzen Sie das Harz dann in 1 ml Puffer C wieder auf. Inkubieren Sie für 1 h bei 4 °C.
- [Dunkel] Wiederholen Sie Schritt 2.11.
- [Dunkel] Entfernen Sie den Durchfluss aus der Spalte, und setzen Sie das Harz dann in 0,8 ml Elutionspuffer für jede Spalte wieder auf. Sanft für 2 h mischen.
- [Dunkel] Sammeln Sie die Elution aus der Säule in ein 2 ml Rohr.
- [Dunkel] Setzen Sie das Harz in 0,7 ml Elution Buffer für jede Säule wieder auf. Sanft für 1 h mischen.
- [Dunkel] Sammeln Sie die Elution aus der Säule in das gleiche Rohr.
3. UV-VIS-Spektroskopie
- Bereiten Sie das Spektralphotometer vor, um den Messbereich von 250-650 nm abzudecken. Zeichnen Sie die Basislinie mit Wasser oder Elution Buffer auf.
- [Dunkel] Das eluierte Protein in die Quarzküvette laden. Messen Sie das Spektrum der Proteinprobe.
- [Dunkel] Beleuchten Sie das Protein direkt in der Küvette für 2 min mit Licht, das durch einen 495 nm Langpassfilter geleitet wird.
- Messen Sie das Spektrum der beleuchteten Probe.
- Führen Sie die gleiche Messung für alle Proteinproben durch, die in den anderen 9 Reinigungsmitteln gereinigt werden, sowohl in dunklen als auch in beleuchteten Zuständen.
- Zeichnen Sie die Kurven (Absorption versus Wellenlänge) im X-Y-Diagramm.
4. Automatisierte Größenausschlusschromatographie von Rhodopsin und Rhodopsin-Mini-Go Komplex
- [Dunkel] Konzentratprotein durch Zentrifugation mit einem Spinkonzentrator mit einem Molekulargewichts-Cut-off (MWCO) von 30 kDa bei 4 °C auf 100 l. Überkonzentrierte Proben können mit Hilfe des Durchflusses vom Konzentrator oder Puffer C verdünnt werden. Um die Proteinprobenkonzentration zu bestimmen, messen Sie die Absorption bei 280 nm mit einem Spektralphotometer.
HINWEIS: Ab Schritt 4.2 erfordert das Experiment keine dunkle Umgebung, sodass Proben unter normalem Licht vorbereitet werden können. - Bereiten Sie 100 l Rhodopsin bei 0,7 mg/ml für jeden Waschmittelzustand vor.
- Bereiten Sie 100 l Rhodopsin (0,7 mg/ml) und Mini-Go4,,12 (0,2 mg/ml) Gemisch für jeden Waschmittelzustand vor. Ergänzen Sie die Mischung mit 1 mM MgCl2. Beleuchten Sie die Mischung mit Licht aus einem 495 nm Langpassfilter und brüten Sie 30 min.
- Montieren Sie eine 24 ml Gelfiltrationssäule mit einem Fraktionierungsbereich von 10-600 kDa eines Kugelproteins auf einem flüssigen Chromatographier. Gleicht die Spalte mit dem SEC-Puffer aus.
HINWEIS: Der Flüssigchromatographie-Reiniger ist mit einem Autosampler, einem Mehrfachwellenlängendetektor und einem Fraktionskollektor ausgestattet. - Übertragen Sie die Proben auf die Autosampler-Durchstechflaschen und legen Sie sie in das Probenfach. Programmieren Sie eine Methodendatei, um sequenzielle SEC-Läufe für jedes Sample zu automatisieren, wobei der Autosampler 77 L der Probe in die Spalte lädt und der Reiniger 24 ml SEC-Puffer mit einer Durchflussrate von 0,5 ml/min pro Durchlauf eluiert. Zeichnen Sie die Absorption bei 280 nm und 380 nm auf.
- Sammeln Sie die Spitzenfraktionen von Rhodopsin und Rhodopsin-Mini-Go-Komplex bei der Retentionsmenge um 12,9 ml.
- Analysieren Sie die linken Rhodopsin-Proben aus Schritt 4.2 und die Spitzenfraktionen von Rhodopsin-Mini-Go-Komplex auf 4-12% SDS-denaturing Gradientengelen mit Coomassie blauer Färbung.
- Zeichnen Sie das Elutionschromatogramm (A280 oder A380 versus Retentionsvolumen).
5. Deglycosylierung und LC-MS-Studie
- Verwenden Sie für die LC-MS-Studie nur die Rhodopsinprobe, die in LMNG-Waschmittel gereinigt wird.
- Bereiten Sie eine 200-L-Mischung aus Rhodopsin bei 1 mg/ml und PNGase F13 bei 0,01 mg/ml vor. Gut mischen und bei 4 °C über Nacht inkubieren.
- Bereiten Sie eine 200-L-Mischung aus Rhodopsin bei 1 mg/ml und Endo F113 bei 0,01 mg/ml vor. Gut mischen und bei 4 °C über Nacht inkubieren.
- Analysieren Sie das Verdauungsergebnis durch SDS-PAGE und Coomassie blau färben.
- Konzentrieren Sie unbehandelte und Endo F1-behandelte Rhodopsinproben und unterliegen der SEC-Reinigung in Puffer D.
HINWEIS: Dies dient der Vorbereitung der Probe mit minimaler Menge an Waschmittel für die LC-MS-Studie. Puffer D enthält kein Waschmittel, aber aufgrund der langsamen Absabfuhr von LMNG aus einem Membranprotein14aggregiert sich Rhodopsin nicht. - Sammeln Sie den Spitzenanteil bei Retentionsvolumen um 12,9 ml. Konzentrat auf 1 mg/ml mit einem Spinkonzentrator (MWCO 30 kDa).
- In jizieren Sie 10 g des Proteins in eine Reprosil 200 C18-AQ-Säule und werden Sie die Säule mit der linearen Gradientenmethode mit der Lösungsmittelzusammensetzung und den in Tabelle 2aufgeführten Einstellungen auswendig lassen. Der Durchfluss wird auf 25% für Massenspektrometer und 75% für die UV-Erkennung aufgeteilt.
Representative Results
Der experimentelle Workflow für die Probenvorbereitung und -analyse ist in Abbildung 1zusammengefasst. Die Verwendung offener Säulen zur kleinräumigen Affinitätsreinigung ermöglichte es uns, Proben unter vielen verschiedenen Waschmittelbedingungen parallel vorzubereiten (Abbildung 1A). Ein solches kleinräumiges Reinigungsset lieferte genügend Protein für weitere Analysen mit UV-VIS-Spektroskopie, SEC und SDS-PAGE (Abbildung 1B-C).
UV-VIS-Spektroskopie zeigte Rhodopsinstabilität
Die Stabilität des retinalen rekonstituierten Rhodopsins wurde anhand seiner optischen Absorption beurteilt (Abbildung 2). Im dunklen Zustand ist 9-cis Netzhaut kovalent mit Lys296 als protonierte Schiff-Basis verbunden. Nach der Beleuchtung wird die 9-cis-Retinal auf die All-Trans-Isoform isomerisiert und die Schiff-Basisverbindung deprotoniert. Die protonierte 9-cis-Retina gibt einen Absorptionsspitzenwert bei 488 nm, während die deprotonierte Alltrans-Retina leinen einen Peak bei 380 nm hat. Die UV-VIS-Spektren von Rhodopsin in DDM zeigten die typische Absorption von 9-cis retinalen gebundenen und lichtaktivierten Rhodopsin, wobei eine blaue Verschiebung von 108 nm mit ungefähr der gleichen optischen Dichte deutlich beobachtet wurde (Abbildung 2A, linkes obere Panel). Wenn Rhodopsin destabilisiert wird, und dann die Bindungstasche für Netzhautveränderungen, die zu Netzhautdeprotonation und möglicherweise Dissoziation führt. Wenn dies geschieht, und dann zeigt das Spektrum den Beitrag der Deprotonation sowie die freie Form der Netzhaut15. Daher haben wir die Effizienz der retinalen Rekonstitution in Rhodopsin durch das Absorptionsverhältnis zwischen dem Protein (280 nm) und der Netzhaut (488 nm für protonierte 9-cis Retinal, 380 nm für deprotonierte Alltrans-Retinal) bestimmt (Abbildung 2B). Rhodopsinproben, die in den klassischen Waschmitteln (DDM, DM, Cymal-6, Cymal-5, C9G) gereinigt werden, zeigen das gleiche optische Profil. Die in den NPG-Detergenzien gereinigten Proben (LMNG, DMNG, Cymal-6NG, Cymal-5NG) zeigen jedoch optische Profile, die auf eine suboptimale Bindungsumgebung für die Netzhaut mit Ausnahme der OGNG-Probe hindeuten, die das gleiche optische Profil wie die DDM-Probe ergab.
Die Größenausschlusschromatographie zeigte Probenreinheit und Proteinmonodispersität.
SEC ist ein effizientes und robustes Analyseinstrument zur Bewertung von Proteinproben während der Vorbereitung und des Screenings. Es validiert die Probenreinheit aus dem vorherigen Reinigungsschritt sowie die Monodispersität der Proteinmoleküle. Für Rhodopsin und seinen Mini-Go-Komplex wurde die Probenqualität aus den Absorptionskurven bei 280 nm und 380 nm interpretiert (Abbildung 3A). Die 280 nm Spuren zeigten das Vorhandensein von Protein, und die 380 nm-Spur zeigte das Vorhandensein von Netzhaut. Alle Signale, die im Leerraumvolumen (ca. 8 ml bei Verwendung dieser Spalte) erscheinen, wurden Proteinaggregaten zugeschrieben. Daher zeigten die Ergebnisse, dass sich die in den klassischen Detergenzien hergestellten Proben in einem monodispersen Zustand befanden, mit Ausnahme von C9G, wo ein Teil des Aggregats auftrat. Im Gegensatz dazu enthielten Proben, die mit den NPG-Detergenzien hergestellt wurden, viel mehr Aggregate als die C9G-Probe; LMNG und Cymal-6NG führten zur meisten Aggregatbildung, aber weniger Aggregate wurden in DMNG und Cymal-5NG beobachtet. Die Ausnahme war OGNG, das ein ähnliches Profil wie DDM zeigte. Proteinaggregate, die bei dem Hohlraumvolumen eluiert wurden, hatten auch eine schlechtere Netzhautbelegung, wie das Verhältnis A280/A380 zeigt, das im Vergleich zum Spitzenwert bei einem Retentionsvolumen von 12,9 ml, was 135 kDa entspricht, zugenommen hatte. Ein weiteres Merkmal beobachteten wir, dass sowohl Rhodopsin als auch Rhodopsin-Mini-Go um das gleiche Retentionsvolumen eluiert wurden (Abbildung 3B). Dies ist nicht überraschend, da das scheinbare Molekulargewicht von Waschmittel-gebundenem Rhodopsin 120 kDa und das von Rhodopsin-Mini-Go 144 kDa betrug. Wir konnten daher nicht nur aus den SEC-Daten eine komplexe Bildung feststellen, so dass SDS-PAGE zur weiteren Analyse der SEC-gereinigten Probe verwendet wurde.
SDS-PAGE bestätigte komplexe Formation
SDS-PAGE ist eine Standardmethode, um die Proteinkomponenten in einer Probe zu identifizieren. Konzentriertes Rhodopsin (vor der SEC-Reinigung) wurde von SDS-PAGE analysiert, um seine Reinheit zu bestätigen, und zeigte zwei Bänder in der Nähe von 37 kDa und ein verschmiertes Band über 50 kDa (Abbildung 4A). Die unteren beiden Bänder wurden später bestätigt, dass sie unterschiedliche N-Glykosylierungszustände haben. Das Band über 50 kDa wurde als aggregierte Rhodopsin-Oligomere interpretiert, die durch den SDS-PAGE-Probenpuffer induziert wurden, da diese Aggregate in SEC oder anderen Nachweismethoden nicht beobachtet wurden. Da die SEC-Daten die komplexe Bildung nicht bestätigen konnten, wurden dieo SEC-eluierten Fraktionen aus Rhodopsin-Mini-G-o-Proben mit SDS-PAGE analysiert. Die SDS-PAGE zeigte Proteinbänder von Rhodopsin und Mini-Go in allen Waschmittelbedingungen, was darauf hindeutet, dass der Komplex unabhängig von der Wahl des Waschmittels gebildet wurde (Abbildung 4B).
LC-MS-Spektrometrie identifizierte das N-Glykosylierungsmuster in Rhodopsin
Rhodopsinproben sowohl aus Deraffinitätsreinigung als auch sec zeigten zwei Proteinbänder, die mit einem scheinbaren Molekulargewicht von etwa 37 kDa auf einem SDS-PAGE-Gel migrierten, das von sec bei Verwendung einer 24-ml-Säule nicht getrennt werden konnte. Verschiedene Muster der N-Glykosylierung auf dem heterologös exprimierenden Rhodopsin aus HEK 293 GnTI- Zellen waren die wahrscheinlichste Erklärung. Daher wurden zwei Enzyme, PNGase F und Endo F1, auf ihre Fähigkeit getestet, Rhodopsin zu deglykosylieren. Aus den SDS-PAGE-Daten reduzierte Endo F1 das Molekulargewicht beider Proteinbänder in einem einzigen Produkt, während die PNGase-F-Verdauung noch zwei Populationen ergab(Abbildung 5A). Die unverdauten und Endo F1-behandelten Proben wurden mit HILFE der LC-MS-Spektrometrie analysiert, um die Massen verschiedener Arten zu identifizieren. Die Daten zeigten, dass Rhodopsin, das in HEK 293 GnTI-Zellen produziert wurde, entweder ein oder zwei N-Glykane enthielt, mit einem Massenunterschied von 1014 x 1 Da. Endo F1-behandeltes Rhodopsin enthielt keine N-Glykane und hatte einen Massenunterschied von 2027-1 Da im Vergleich zu Rhodopsin, das zwei N-Glykane enthielt. Diese Ergebnisse stimmen mit dem Fehlen des Enzyms N-Acetylglucosaminyltransferase I in der Zelllinie überein, die verwendet wird, um Rhodopsin auszudrücken, was dazu führt, dass alle N-Glykane die Struktur GlcNAc2Man5(Masse 1014 Da) haben.
Abbildung 1: Probenvorbereitung und Charakterisierung für Waschmittel-Screening-Experimente. (A) Herstellung von Rhodopsinproben in verschiedenen Reinigungsmitteln während der Reinigung. (B) Im Protokoll verwendete Methoden: UV-VIS-Spektroskopie, Größenausschlusschromatographie (SEC), SDS-PAGE und Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS). (C) Experimenteller Arbeitsablauf zur Charakterisierung von Rhodopsin, Rhodopsin-Mini-Gound Deglycosylierungsprodukt von Rhodopsin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: UV-VIS-Spektroskopie von Rhodopsin. (A) UV-VIS-Spektren von Rhodopsin. Die Spektren des dunklen, 9-cis retinalen Rhodopsins werden in blauen Kurven dargestellt. Nach der Beleuchtung wird 9-cis Retinal deprotoniert und isomerisiert in All-Trans-Retinal, und die Spektren des beleuchteten Rhodopsin werden als rote Kurven angezeigt. Die chemische Struktur jedes Waschmittels wird als Einbau dargestellt. (B) Die Verhältnisse von A280/A488 (blauer Balken) und A280/A380 (roter Balken) stellen die Stabilität von Rhodopsin im dunklen zustand bzw. Lichtzustand dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Größenausschlusschromatographieprofile von Rhodopsin und Rhodopsin–Mini-G-o-Komplex, der in 10 verschiedenen Waschmitteln gereinigt wird.o (A) Das linke Panel zeigt die SEC-Profile von Proben, die in den klassischen Waschmitteln gereinigt werden. Das rechte Panel stellt die SEC-Profile von Proben dar, die in den NPG-Waschmitteln gereinigt werden. Das Profil der Standard-Markerproteine wird zusammen mit der DDM-Probe als Overlay dargestellt. Die Interpretation der Spitzenprofile wird für DMNG gezeigt, wobei das ideale Szenario (keine Aggregate) für DDM, DM, Cymal-6, Cymal-5 und OGNG zu sehen ist. (B) Das vergrößerte Profil der OGNG-Probe im Retentionsvolumen von 12-14 ml. Alle Proben wurden mit einer Superdex200 Increase 10/300 GL-Säule analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: SDS-PAGE-Analyse von Rhodopsin und Rhodopsin/Mini-Go-Komplex. (A) Rhodopsinproben, die in Detergenzien gereinigt werden. Das verschmierte Band über 50 kDa wird den aggregierten Rhodopsin-Oligomeren zugeschrieben, die durch den SDS-PAGE-Probenpuffer induziert werden. (B) SEC-gereinigte Proben von Rhodopsin/Mini-Go-Komplex. Rhodopsin mit 1 und 2 N-Glykan und Mini-Go sind abgebildet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Identifizierung der Glykosylierung in Rhodopsin. (A) SDS-PAGE Analyse von deglycosylated rhodopsin mit PNGase F und Endo F1. (B) LC-MS-Spektren von Rhodopsin ohne (obere Platte) und mit Deglycosylierung durch Endo F1 (unteres Panel). Für die Vorbereitung des Rhodopsin-Mini-G-o-Komplexes für die Kristallisation haben wir uns für Endo F1 gegenüber PNGase F entschieden, da Endo F1 eine einzige homogene Rhodopsin-Art lieferte.o Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Waschmittel | Arbeitskonzentration (%) | Kritische Micelle-Konzentration (%) |
| Ddm | 0.025 | 0.0087 |
| Dm | 0.12 | 0.087 |
| Cymal-6 | 0.05 | 0.028 |
| Cymal-5 | 0.2 | 0.12 |
| C9G | 0.5 | 0.2 |
| LMNG | 0.01 | 0.001 |
| DMNG | 0.01 | 0.0034 |
| Cymal-6NG | 0.015 | Nicht verfügbar; sollte niedriger als 0,056 sein |
| Cymal-5NG | 0.02 | 0.0056 |
| OGNG | 0.15 | 0.058 |
Tabelle 1: Puffer-C-Waschmittelkonzentrationen.
| Zeit (min) | Lösungsmittel A (%) | Lösungsmittel B (%) | Lösungsmittel C (%) | Durchfluss (ml/min) |
| 0 | 0 | 95 | 5 | 0.5 |
| 1 | 0 | 95 | 5 | 0.5 |
| 5 | 20 | 75 | 5 | 0.6 |
| 25 | 85 | 10 | 5 | 0.6 |
| 26 | 90 | 5 | 5 | 0.6 |
| 30 | 90 | 5 | 5 | 0.6 |
Tabelle 2: Spaltenelutionsparameter.
Discussion
Der Erfolg bei der Proteinkristallisation hängt stark von der Proteinprobe ab, insbesondere von Membranproteinen und deren Komplexen aufgrund der Komplikation durch Waschmittel. Dieser Bericht zeigt das Waschmittelscreening und die Bewertung der Probenqualität für GPCR-Mini-G-Proteinsignalanlagen. Eine Vielzahl von Methoden wurden weit verbreitet verwendet, um die biochemische Eigenschaft von Membranproteinen zu untersuchen, zum Beispiel Thermostabilitätstest mit Fluoreszenzfarbstoffen16,17, Bindungstest, um komplexe Bildung zu erkennen, indem die Veränderung des Tryptophan-Fluoreszenzsignals18 oder die Resonanzenergieübertragung mit Biosensoren19gemessen wird. Die bei diesen Methoden verwendeten chemischen Umgebungen unterscheiden sich jedoch deutlich von denen für die Herstellung einer Kristallisationsprobe, entweder sind Proteine bei einer tausendfach niedrigeren Konzentration für fluoreszenzbasierte Messungen oder Proteine sind in Lipid-Doppelschichten oder in einem festen Waschmittelzustand eingebettet. In diesem Protokoll werden die verwendeten Methoden auch in der großflächigen Probenvorbereitung vor der Kristallisation standardisiert. So lassen sich die optimierten Parameter ohne weitere größere Abschirmung und Optimierung einfach zur Kristallisationswaagenvorbereitung übertragen.
Ziel dieses Protokolls ist es, die Herstellung eines stabilen und homogenen GPCR-Mini-G-Proteinkomplexes zur Dampfdiffusionskristallisation und Strukturbestimmung durch Röntgenkristallographie zu optimieren. Das Protokoll integriert eine Reihe von Methoden zur qualitativen Bewertung der Auswirkungen von Reinigungsmittel und Deglycosylierung während der Herstellung des Rhodopsin-Mini-Go o-Komplexes. Rhodopsin im inaktiven Zustand und lichtaktivierten Zustand, gebunden mit und ohne das Transducinpeptid, wurde kristallisiert, wenn in den Waschmitteln Octylglucosid (C8G)20,21,22 und C9G23,24gereinigt wurde. Da der in C8G und C9G gereinigte Rhodopsin-Mini-G-O-Komplex keine Kristalle lieferte (Daten nicht gezeigt), untersuchten wir dann eine breitere Palette anderer Detergenzien mit der beschriebenen Strategie(Abbildung 1).o Durch die Nutzung der Lichtempfindlichkeit von Rhodopsin könnten wir sehr gut der Rekonstitution der Netzhaut bei anderen Wellenlängen als 280 nm folgen. Sowohl in der UV-VIS-Spektroskopie als auch in der SEC haben wir eine Netzhaut bei 380 nm oder 488 nm nachgewiesen. Allerdings haben die meisten Membranproteine nicht so ein bequemes Chromophor, um die Funktionalität während der Reinigung zu folgen. Andere Optionen wären, einen Liganden durch Hinzufügen eines lichtnachweisbaren Chromophors oder durch die Verwendung von Radioligand-Bindungs- und thermischen Schalttests25nachweisbar zu machen.
Rhodopsin hat ein Molekulargewicht von 40 kDa. Aufgrund der Masse des Waschmittels, das es bindet, beträgt sein scheinbares Molekulargewicht auf SEC etwa 120 kDa. So ist es nicht verwunderlich, dass die Bindung von Mini-Go (24 kDa) auf SEC nicht leicht zu erkennen war, da dies eine Differenzierung von Proteinen mit scheinbaren Massen von 120 kDa und 144 kDa erfordern würde. Die Analyse von SEC-Fraktionen durch SDS-PAGE wurde daher verwendet, um die Probenreinheit und komplexe Bildung zu bestätigen. Auch wenn SEC-Profile bei komplexer Bildung eine deutliche Verschiebung aufweisen, wird dennoch empfohlen, Eine SDS-PAGE-Analyse durchzuführen, um die komplexe Bildung mit korrekten Bindungspartnern zu bestätigen und nicht mit anderen mitgereinigten Proteinkontaminanten.
Sowohl Rhodopsin als auch Mini-Go wurden in Milligramm-Mengen gereinigt, was die Verwendung von Niedrigempfindlichkeitsdetektion der Komplexe, wie UV-VIS Absorption während SEC und Commassie Blue Färbung von SDS-PAGE Gelen ermöglichte. Wenn Proben begrenzt sind, sollte eine empfindlichere Detektion verwendet werden, wie z. B. ein LC-Reiniger, der mit einem Fluoreszenzdetektor ausgestattet ist, um Tryptophansignale aus dem Protein (280 nm Anregung, 350 nm Emission) und Silberfärbung für SDS-PAGE-Gele zu verfolgen. Ein anderer Ansatz wäre die Verschmelzung eines fluoreszierenden Proteins, wie z. B. eines grünen Fluoreszenzproteins (GFP), mit dem Protein von Interesse, das auch während der Proteinexpression26 den Nachweis ermöglichen würde, aber vor der Kristallisation entfernt werden sollte.
Es muss unbedingt sichergestellt werden, dass das gereinigte Protein auch frei von Heterogenität ist, die sich aus variablen PTMs ergibt. In dem hier beschriebenen Fall wurden die beiden populationen von Rhodopsin, die auf SDS-PAGE-Gelen beobachtet wurden, als entweder ein oder zwei N-Glykane charakterisiert. Eine variable Modifikation eines Proteins würde potenziell die Bildung von gut diffrierenden Kristallen verhindern, daher deglycosylated Rhodopsin. Die Endoglycosidase Endo F1 war die wirksamste Endoglycosidase getestet und Die Behandlung führte zu einer einzigen Art von unglykosylierten Rezeptor, während PNGase F entfernte die Glykone auf Rhodopsin nur teilweise und führte zu einer Mischung aus Rhodopsin vollständig unglykosyliert oder mit einem N-Glykan blieb. Rhodopsin ohne Deglykosylalase-Behandlung wurde erfolgreich kristallisiert3,27,28, und die N-Glykan auf Rhodopsin Asn15 ist wichtig, um Kristallkontakt in diesen Fällen zu bilden. Im Falle von Rhodopsin-Mini-Goist es notwendig, N-Glykane von Endo F1 zu entfernen, um Kristalle zu erhalten. Es gibt keine standardisierte Regel, um Proteine von Interesse vor der Kristallisation zu deglykosylieren, aber die Entfernung von heterogenen PTMs sollte in Betracht gezogen werden, wenn Proteine nach umfangreichen Kristallisationsversuchen nicht kristallisieren.
Die hier beschriebenen Daten und Methoden führten uns dazu, OGNG aufgrund seiner geringen Micelle-Größe und seiner Fähigkeit, den Komplex zu stabilisieren, als bevorzugtes Reinigungsmittel für die Kristallisation des Rhodopsin-Mini-G-O-Komplexes zu wählen.o Wir haben auch Endo F1 verwendet, um sicherzustellen, dass das gereinigte Rhodopsin eine homogene Art ist. In der Folge wurden Kristalle gewonnen, und wir ermittelten die Kristallstruktur auf 3,1 ,4, was nur die dritte Kristallstruktur eines GPCR-G-Proteinsignalkomplexes14,29war.
Bei Membranproteinen, die mit und ohne Partnerprotein gebunden sind, sollten sie als zwei verschiedene Proteine betrachtet werden. Ein Protein in verschiedenen Funktionszuständen hat unterschiedliche Konformationen und ist auf unterschiedlichem Energieniveau. Daher wird empfohlen, das Vorbereitungsprotokoll für jeden Funktionszustand zu optimieren, da der Parameter für den inaktiven Zustand möglicherweise nicht vollständig in den aktivierten Zustand übertragen werden kann. Ganz zu schweigen von der Veränderung der Proteineigenschaft, die durch die Bindung eines Partnerproteins erschwert wird. Das Protokoll verwendet Methoden, die für die Herstellung einer Kristallisationsprobe standardisiert sind, um inaktives Membranprotein in verschiedenen Waschmitteln herzustellen, gefolgt von Proteinaktivierung und komplexer Bildung, und um die Proteinqualität zu charakterisieren. So kann dieses Protokoll leicht auf andere Membranproteine und deren Komplexe für Strukturstudien mit geringfügiger Modifikation verallgemeinert werden.
Disclosures
CGT ist Berater und Mitglied des Wissenschaftlichen Beirats von Sosei Heptares. Alle anderen Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Prof. Dr. Gebhard F. X. Schertler für seine langjährige Unterstützung in diesem Projekt, Dr. Roger J.P. Dawson und Hoffmann La Roche für die Unterstützung in der Zellkultur. Diese Arbeit wurde vom Schweizerischen Nationalfonds (Stipendien 210030_153145 und 310030B_173335 an GFXS) und der Finanzierung von CGT durch den Europäischen Forschungsrat (EMPSI, 339995) und den Medical Research Council (MRC U105197215) gefördert. FP würdigt die ETH Zürich durch das National Center of Competence in Research Molecular Ultrafast Science and Technology (NCCR MUST) und die ETH Femtosecond and Attosecond Science and Technology (ETH FAST). FP, JM, AB und CJT erkennen langfristige finanzielle Unterstützung durch das Paul Scherrer Institut an.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1D4 peptide | Peptide2.0 | Under request | |
| 9-cis retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
| Autosampler A-900 | GE Healthcare | Discontinued | |
| C9G | Anatrace | N324 | |
| cOmplete, EDTA-free protease inhibitor coctail | Roche | 5056489001 | |
| Cymal-5 | Anatrace | C325 | |
| Cymal-5NG | Anatrace | NG325 | |
| Cymal-6 | Anatrace | C326 | |
| Cymal-6NG | Anatrace | NG326 | |
| DDM | Anatrace | D310 | |
| DM | Anatrace | D322 | |
| DMNG | Anatrace | NG322 | |
| Econo column | Bio-Rad | 7372512 | |
| Ettan LC | GE Healthcare | Discontinued | |
| FRAC-950 | GE Healthcare | Discontinued | |
| HPLC Water 2795 Separation Module | Waters AG | 720000358EN | |
| InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | |
| LCT Premier mass spectrometer (ESI-TOF) | Waters AG | - | |
| LMNG | Anatrace | NG310 | |
| Monitor UV-900 | GE Healthcare | 18110835 | |
| Nanodrop 1000 | Witec AG/ThermoFisher | Discontinued | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel 1.0 mm, 15 well | ThermoFisher | NP0323BOX | |
| NuPAGE MES SDS buffer (20x) | ThermoFisher | NP0002 | |
| OGNG | Anatrace | NG311 | |
| PAGEr Minigel Chamber | Lonza | 59905 | |
| Reprosil 200 C18-AQ column | Morvay Analytik GmbH | #s1503 | |
| Superdex 200 Increase GL column | GE Healthcare | 28990944 | |
| Tabletop centrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000413 | |
| Ultracentrifuge Optima XE-100 | Beckmann Coulter | A94516 | |
| ULTRA-TURRAX T25 | IKA WERKE | 0003725003 | |
| UV-VIS spectrophotometer | Shimadzu | UV-2401PC | |
| Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector | Waters AG | - |
References
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