Summary
이 보고서는 시각적 GPCR, 로도프신 및 mini-Go와그 복합체를 준비하기위한 다른 세제의 선별을 설명합니다. 정제 동안 다른 단계에서 복합체의 품질을 특성화하는 생화학적 방법이 입증되었습니다. 이 프로토콜은 그들의 미래 구조 연구를 위해 다른 막 단백질 복합체로 일반화될 수 있다.
Abstract
막 단백질 복합체의 결정 구조를 결정하는 열쇠는 결정화 전에 샘플의 품질입니다. 특히, 세제의 선택은 복합체의 안정성과 단분산 모두에 영향을 미치기 때문에 매우 중요하다. 우리는 최근 3.1 Å 분해능에서 엔지니어링 된 G 단백질, mini-Go에결합 된 소 rhodopsin의 활성 상태의 결정 구조를 결정했습니다. 여기서, 우리는 로도프신-미니-G 복합체의 제조를 최적화하기o 위한 절차를 상세히 설명한다. 다크 스테이트 로도프신은 고전 및 네오펜틸 글리콜(NPG) 세제에서 제조되었고, 이어서 빛 노출 하에서 mini-Go를 가진 복잡한 형성이 뒤따랐다. 로도프신의 안정성은 자외선 에 민감한 리간드, 9-시스 망막의 로도프신으로 재구성을 모니터링자외선 (UV-VIS) 분광법에 의해 평가되었다. 자동 크기 배제 크로마토그래피(SEC)는 로도신과 로도신-미니-G복합체의 단색퍼피성을 특성화하는 데 사용되었다. SDS-폴리아크릴아미드 전기영동(SDS-PAGE)은 쿠마시 블루로 겔을 염색한 후 로도프신과 미니-Go 사이의o 1:1 몰 비를 식별하여 복합체의 형성을 확인하였다. 이 모든 분석 데이터를 교차 검증한 후, 우리는 부적절한 세제를 제거하고 대규모 준비 및 결정화를 위한 최상의 후보 세제를 계속 했습니다. N-글리코실화의 이질성에서 추가 문제가 발생했습니다. 이종적으로 표현된 로도프신은 SDS-PAGE에서 두 개의 다른 N-글리코실화된 집단을 가지도록 관찰되었으며, 이는 아마도 결정체 발생을 방해했을 것이다. 따라서, 상이한 탈글리코실화 효소를 시험하였고, 엔도시다아제 F1(EndoF1)은 단일 종의 N-글리코실화를 가진 로도프신을 생산하였다. 단백질 품질을 특성화하기 위한 이 전략적 파이프라인을 통해 로도프신-미니-G복합체의 제조는 결정 구조를 전달하도록 최적화되었습니다. 이것은 GPCR-G 단백질 신호 복합체의 세 번째 결정 구조에 불과했습니다. 이 접근법은 또한 견본 준비 및 구조 결정을 용이하게 하기 위하여 그밖 막 단백질 및 그들의 복합체를 위해 일반화될 수 있습니다.
Introduction
막 단백질과 그 복합체의 결정 구조를 결정하는 것은 잘 회절하는 결정을 얻기에 있는 어려움 때문에 항상 도전적이었습니다. 수용성 단백질과는 대조적으로, 일체형 막 단백질은 세포막을 아우르는 소수성 코어를 포함한다. 세포막에서 막 단백질을 수성 완충액으로 제거하기 위해 세제는 세제-단백질 미셀을 형성하여 막 단백질의 소수성 코어 주변의 지질을 대체하는 데 사용되어야 합니다. 멤브레인 단백질의 안정성, 활성 및 무결성은 세제1의화학적 및 구조적 특성에 직접적으로 의존하며, 세제의 특성은 또한 미셀의 크기를 결정한다. 큰 세제 미셀은 작은 막 단백질의 친수성 표면을 폐색할 수 있으므로 증기 확산 방법을 사용할 때 결정 접촉이 부족하여 결정화를 방지할 수 있습니다. 작은 세제 미셀은 결정학에 유리하지만 짧은 사슬 세제는 일반적으로 더 가혹하므로 막 단백질의 불안정화 및 응집을 유발합니다. 따라서 결정화 전에 추가세제 스크리닝 절차가 필수적이며, 일반적으로 단백질 안정성을 유지하는 짧은 세제를 대상으로 합니다.
G 단백질 결합 수용체 (GPCRs)는 7 개의 막 횡단 a-나선포함 하는 일체형 막 단백질. GPCRs는 두 가지 주요 상태에 존재, 역 작용제 또는 길항제에 의해 안정화 비활성 상태, 또는 활성 상태는 작용제에 바인딩 및 G 단백질에 의해 안정화, 이 두 극단 사이에 하위 상태의 무리가 존재 할 가능성이 있지만. GPCRs의 구조 결정은 처음에 활성 상태 보다 더 높은 안정성으로 인해 역 작용제 및 길항제에 바인딩 된 비활성 상태에 초점을 맞춘2. GPCRs는 주 작동 근 바인딩에 활성화 될 때, 수용 체는 매우 동적, 그리고 G 단백질 커플링에 대 한 수용 체의 세포 질 얼굴에 일시적으로 갈라진 형태. 이 역동성은 주작동근에 묶인 GPCR이 종종 비활성 상태보다 더 불안정한 이유라고 생각됩니다. 따라서, 연구 중인 수용체의 형태 상태에 적합한 세제를 스크리닝하는 것이 필수적이며, 이는 비활성 상태에 비해 활성 상태를 연구하기 위해 온화한 세제가 요구될 가능성이 있기 때문이다.
본 보고서에서, 우리는 각각 비활성 상태 및 활성 상태를 나타내는 세제 스크리닝 실험을 위해 mini-Go 단백질4,,5를 가진 시각적 GPCR, 소 rhodopsin3및 그것의 복합체를 사용한다. 세제 검사는 고전적인 알킬 말토사이드 및 글루코사이드 세제와 네오펜틸 글리콜 (NPG) 세제에 초점을 맞췄습니다. 이러한 맥락에서, 고전적인 세제는 설탕 헤드 그룹과 알킬 사슬로 만들어졌으며, NPG 형 세제는 설탕과 알킬 사슬 사이의 계면에서 사분간 탄소에 의해 융합되는 두 개의 동일한 고전 세제를 포함합니다6,,7,,8.
실험 워크플로우는 상이한 세제에서 로도프신의 정제로부터 시작하여, 로도프신-미니-G복합체의 형성과 여러 가지 방법을 사용하여 복합체의 특성화로 끝나는 것으로 설계되었다(도1). 로도프신의 비활성 상태를 위해, 빛에 민감한 리간드 9-시스 망막의 재구성은 자외선-가시적(UV-VIS) 분광법에 의해 모니터링되었다. 스펙트럼은 망막의 물리 화학 상태를 나타내고 로도프신의 망막 결합 포켓에서 환경을 나타냅니다. 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)는 정제 된 로도프신의 단일화뿐만 아니라 로도신 -mini-G복합체의 형성을 평가하기 위해 사용되었습니다. SEC가 단백질 분자의 크기와 모양에 따라 단백질 분자를 구별함에 따라 응집된 단백질 집단은 공극 부피에서 용해될 때 식별될 수 있습니다. 복잡한 형성을 확인하기 위해, SEC로부터의 분획은 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에 의해 평가되어 로도신 과 미니-Go둘 다의 존재를 확인하였다.
고려될 필요가 있는 또 다른 요인은 막 단백질에 번역 후 수정 (PTM)입니다. N-글리코실화와 같은 PTM은 포유류 및 곤충 세포 발현 시스템에서 생성된 진핵막 단백질에서 종종 관찰된다. 인간 배아 신장 293(HEK293) 세포의 제한된 N-글리코실화 균주는 N-아세틸글루코시닐트랜스퍼라제 I(GnTI)을 코딩하는 유전자의 결실에 의해 개발되었으며, 이는 합의 부위 Asn-X-Ser/Thr에서 GlcNAc2Man5에 의한 균질성 N-글리코실화를 초래하였다. N-글리코실화는 합의 부위에서 아미노산 잔류물을 돌연변이시킴으로써 방지될 수 있지만, 이것은 또한 단백질의 기능 또는 접기의 효율을 변화시킬 수 있다. 소 로도프신에서, N-glycosylated 잔기 Asn15의 돌연변이는 잘못된 접이식 및 감소된 G 단백질 활성화9,,10을이끈다. 이 보고서에 사용된 로도프신은 HEK 293 GnTI 결핍 세포주에서 발현되었다. 그러나, SDS-PAGE는 두 종의 로도프신의 존재를 보여주었다. 이러한 이질성은 펩티드-N-글리코시다아제 F(PNGase F) 및 엔도코시다아제 F1(엔도 F1)을 사용하여 결정 형성 및 따라서 탈글리코실화를 방지할 수 있었다. 탈화 된 생성물은 당화의 수준과 그 균질성을 식별하기 위해 SDS-PAGE 및 액체 크로마토그래피 질량 분석법 (LC-MS)을 특징으로했습니다.
Protocol
참고 : 세제 스크리닝이 프로토콜은 시작 물질로 HEK293 세포 펠릿 의 30g에 대해 자세히 설명되어 있습니다.
1. 재료, 화학 물질 및 시약
참고: 모든 용액은 25°C에서 18.2 MΩ의 저항에 도달하기 위해 탈이온수에서 정제되는 분석 등급 시약과 초순수를 사용하여 제조됩니다.
- 버퍼 스톡 솔루션
- 10x 인산염 완충 식염수(10x PBS)를 준비합니다.
- HEPES 버퍼 준비: 1 M, NaOH와 함께 pH 7.5로 적정.
- 5 M NaCl을 준비합니다.
- 준비 2 M MgCl2.
참고: 모든 스톡 솔루션은 0.22 μm 필터를 통과하여 멸균성을 유지합니다.
- 세제 재고 솔루션
- 도데실 말토사이드(DDM), 10% (v/v)를 준비합니다.
- 데실 말토사이드(DM), 10% (v/v)를 준비합니다.
- 6-사이클로헥실-헥실 말토사이드(Cymal-6), 10% (v)를 준비합니다.
- 5-사이클로헥실-펜틸 말토사이드(Cymal-5), 10% (v)를 준비합니다.
- 비실 글루코사이드 (C9G), 10 % (v / v)를 준비하십시오.
- 라우릴 말토오스 네오펜틸 글리콜(LMNG), 5% (v/v)를 준비합니다.
- 데실 말토오스 네오펜틸 글리콜(DMNG), 10% (v/v)를 준비합니다.
- 시말-6 네오펜틸 글리콜 (C6NG), 10 % (v 포함)를 준비하십시오.
- 시말-5 네오펜틸 글리콜 (C5NG), 10 % (v 포함)를 준비하십시오.
- 옥틸 글루코스 네오펜틸 글리콜 (OGNG), 10 % (v 포함)을 준비하십시오.
참고: 10% 세제 스톡 용액의 경우, 1g의 세제 파우더를 부드러운 흔들림으로 초순수에 녹인 다음 최종 부피를 10 mL로 조정합니다. 세제 스톡 용액은 장기간 보관할 수 있도록 -20°C로 보관해야 하며, 작업 하는 동안 얼음위에 보관해야 합니다.
주의: 병에 든 세제는 일반적으로 -20 °C 냉동고에 보관하는 것이 좋습니다. 세제 분말이 들어있는 병은 개봉 하기 전에 실온으로 데워야합니다. 세제 분말은 흡습성이므로 온도 평형은 세제를 적시게 하는 응축형성을 방지합니다.
- 기타 화학 물질 및 시약
- 1D4 면역 상피성 아가로즈 수지: 50% 슬러리의 10 mL를 준비한다.
참고 : 1D4 면역 affinity 아가로스는 소 로도신 TETSQVAPA의 마지막 9 아미노산을 에피토프로 결합하는 단일 클론 Rho1D4 항체와 연결된 아가로즈 비드입니다. 1D4 면역상피닌성 아가로즈는 C 말단 1D4 서열을 포함하는 단백질을 포착하기 위해 친화도 정제 물질로서 작동한다. 이러한 정제 물질은9,,11을 제조하거나 구매할 수 있다. - 100 % 에탄올에 용해 된 1 mM : 9 시스 망막 용액을 준비하십시오.
참고: 준비 및 보관 중에 망막에 빛이 노출되는 것을 방지하십시오. - 1D4 펩티드(TETSQVAPA 서열)를 준비합니다: 물에 용해된 800 μM.
- 1D4 면역 상피성 아가로즈 수지: 50% 슬러리의 10 mL를 준비한다.
- 버퍼
참고: 모든 버퍼는 스톡 솔루션에서 원하는 농도로 혼합됩니다. 모든 버퍼는 사용하기 전에 4°C로 냉각됩니다.- 버퍼 A 준비: PBS, 0.04% DDM.
- 준비 버퍼 B: 20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.04% DDM.
- 준비 버퍼 C: 20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 및 세제는 표 1에열거된 작업 농도에서.
- 준비 버퍼 D: 20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl.
- 용출 완충제를 준비: 20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 80 μM 1D4 펩티드, 및 그들의 작업 농도에서 세제.
- SEC 버퍼 준비: 20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.025% DDM; 0.22 μm 필터를 통해 여과됩니다.
- LC-MS용 용매
- 용매 A : 0.1 % 포르믹 산을 함유 한 아세트 니트릴을 준비하십시오.
- 용매 B를 준비 : 0.1 % 포르믹 산을 포함하는 초순수.
- 용매 C를 준비 : 이소 프로판올.
2. 세포막 용해 및 단백질 추출
- HEK293GnTI 의 30 g- 소 로도셉신 돌연변이N2C/M257Y/D282C3,,9를 실온에 발현하는 세포 펠릿을 해동시키고, 프로테아제 억제제 칵테일을 함유하는 1x PBS 완충제의 120 mL을 추가하고 도운균질화또는 전기 균질화제를 사용하여 균질화(13,00r.00). 비커에서 균질화된 세포 현탁액을 수집하고 부피를 150 mL로 조절한다.
참고 : 30 g의 세포 펠릿은 2 x 106 세포 / mL 밀도에서 3 L의 세포 배양과 동일합니다. - 균질화된 세포에 10% DDM을 부드럽게 첨가하여 최종 농도를 1.25%로 지정합니다. 얼음을 1시간 동안 저어주세요.
- 세포가 4°C 및 150,000 x g에서 45분 동안 용해되어 용해되지 않은 이물질을 제거한다.
- 상급기를 500 mL 병에 옮기고 1D4 면역Affinity 아가로즈 수지 (50 % 슬러리)의 10 mL을 추가합니다. 용해된 세포를 용해시키고 수지를 4시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 부드럽게 섞는다.
- 수지 수집을 위해 열린 컬럼에 라세이트/수지 혼합물을 로드합니다.
- 세척 버퍼 A의 10 개의 열 부적 (CV)으로 수지세척하십시오.
참고: 열 볼륨은 포장된 볼륨(100%)입니다. 아가로즈 수지 사용. 이 경우 1 CV는 5 mL입니다. - 버퍼 A의 CV 2로 수지의 재중단.
주의: 2.8단계 이후부터 는 희미한 적색광 상태에서 수행해야 하는 단계는 설명 시작 부분에 "Dark]"로 표시됩니다. - [다크] 재중단된 수지에 9-시스 망막을 첨가하여 최종 농도인 50 μM을 첨가한다. 어둠 속에서 4-16 시간 동안 4 °C에서 부드럽게 섞습니다.
참고: 배양 시간이 짧을수록 망막의 재구성이 불완전할 수 있습니다. - [다크] 열에서 흐름을 제거합니다. 20 CV 버퍼 A로 수지 세척, 15 CV 버퍼 B 다음에.
- [다크] 2 CV 버퍼 B에서 수지를 다시 일시 중단한 다음 수지 현탁액을 10 mL 처리 컬럼으로 균등하게 나눕니다.
- [다크] 컬럼에서 흐르는 흐름을 제거한 다음, 1 mL 버퍼 C. 4°C에서 1시간 동안 인큐베이트하여 수지재를 다시 중단한다.
- [다크] 2.11단계를 반복합니다.
- [다크] 컬럼에서 흐름을 제거한 다음 각 열에 대해 0.8mL 용출 버퍼에서 수지를 다시 일시 중단합니다. 2시간 동안 부드럽게 섞으세요.
- [다크] 컬럼에서 용출을 2 mL 튜브로 수집합니다.
- [다크] 각 컬럼에 대해 0.7 mL의 용루 버퍼로 수지복원을 다시 중단합니다. 1시간 동안 부드럽게 섞으세요.
- [다크] 컬럼에서 동일한 튜브로 용출을 수집합니다.
3. UV-VIS 분광법
- 분광광도계를 준비하여 250-650 nm의 측정 범위를 커버합니다. 물 또는 용출 버퍼를 사용하여 기준선을 기록합니다.
- [다크] 용출된 단백질을 쿼츠 큐벳에 로드합니다. 단백질 샘플의 스펙트럼을 측정합니다.
- [다크] 495 nm 롱 패스 필터를 통과한 빛으로 2분 동안 큐벳에 직접 단백질을 비추습니다.
- 조명 된 샘플의 스펙트럼을 측정합니다.
- 어둡고 발광된 상태 모두에서 다른 9가지 세제에서 정제된 모든 단백질 샘플에 대해 동일한 측정을 수행합니다.
- X-Y 분산형 차트에서 곡선(흡수 대 파장)을 플로팅합니다.
4. 로도프신과 로도프신-미니-G 복합체의 자동 크기o 배제 크로마토그래피
- [다크] 4°C에서 30 kDa의 분자량 컷오프(MWCO)를 가진 스핀 농축기를 사용하여 원심분리에 의해 100 μL에 단백질을 농축한다. 과농축 된 샘플은 농축기 또는 버퍼 C에서 흐르는 흐름을 사용하여 희석 할 수 있습니다. 단백질 샘플 농도를 확인하려면 분광광도계를 사용하여 280 nm에서 흡광도를 측정합니다.
참고: 4.2단계 이후부터 실험에는 어두운 환경이 필요하지 않으므로 일반 조명 에서 샘플을 준비할 수 있습니다. - 각 세제 조건에 대해 0.7 mg/mL로 100 μL 로도프신을 준비합니다.
- 각 세제 조건에 대해 로도프신(0.7 mg/mL)과 미니 Go4,,12(0.2 mg/mL) 혼합물 100 μL을 준비합니다. 1 mM MgCl2로혼합물을 보충하십시오. 495 nm 롱 패스 필터에서 빛으로 혼합물을 조명하고 30 분 동안 배양하십시오.
- 액체 크로마토그래피 정화기에 구형 단백질의 분획 범위가 10-600 kDa인 24 mL 젤 여과 컬럼을 장착합니다. SEC 버퍼로 열을 평형화했습니다.
참고 : 액체 크로마토그래피 정화기에는 자동 샘플러, 다중 파장 검출기 및 분수 수집기가 장착되어 있습니다. - 샘플을 자동 샘플러 바이알로 옮기고 샘플 트레이에 놓습니다. 자동 샘플러가 샘플의 77 μL을 열에 로딩하고, 정수기가 실행당 0.5 mL/min의 유량으로 SEC 버퍼의 24mL를 용출하는 방식으로 각 샘플에 대해 순차SEC 실행을 자동화하는 메서드 파일을 프로그래밍합니다. 280 nm 및 380 nm에서 흡광도를 기록합니다.
- 약 12.9 mL의 유지 량에서 로도신 및o 로도신-미니-G 복합체의 피크 분획을 수집합니다.
- 4.2 단계에서 왼쪽 로도신 샘플을 분석하고 Coomassie 블루 염색을 사용하여 4-12 % SDS 분해 그라데이션 젤에서 로도신 - 미니- G 복합체의 피크 분획을 분석하십시오.
- 용출 크로마토그램을 플로팅합니다(A280 또는 A380 대 보존 볼륨).
5. 탈당화 및 LC-MS 연구
- LC-MS 연구의 경우, LMNG 세제에서 정제된 로도프신 샘플만 사용하십시오.
- 0.01 mg/mL에서 1 mg/mL 및 PNGase F13에서 로도프신의 200 μL 혼합물을 준비합니다. 잘 섞어서 밤새 4°C에서 배양합니다.
- 0.01 mg/mL에서 1 mg/mL 및 엔도 F113에서 로도프신의 200 μL 혼합물을 준비합니다. 잘 섞어서 밤새 4°C에서 배양합니다.
- SDS-PAGE 및 쿠마시 블루 염색으로 소화 결과를 분석합니다.
- 농축처리되지 않은 및 엔도 F1 처리 된 로도프신 샘플을 농축하고 완충D에서 SEC 정제를 받습니다.
참고: 이것은 LC-MS 연구를 위한 최소한의 세제로 샘플을 준비하는 것입니다. 완충제 D는 어떤 세제도 함유하지 않지만, 막단백질(14)으로부터의LMNG의 느린 오프레이트로 인해, 로도프신은 응집되지 않을 것이다. - 약 12.9 mL의 유지 량에서 피크 분율을 수집합니다. 스핀 농축기 (MWCO 30 kDa)를 사용하여 1 mg / mL에 집중하십시오.
- 단백질 10 μg를 Reprosil 200 C18-AQ 컬럼에 주입하고 표 2에열거된 용매 조성 및 설정을 사용하여 선형 그라데이션 방법을 사용하여 컬럼을 용출합니다. 유량은 질량 분석기의 경우 25%, UV 검출의 경우 75%로 분할됩니다.
Representative Results
샘플 준비 및 분석을 위한 실험 워크플로우는 그림 1에요약되어 있습니다. 소규모 친화도 정제를 위해 열린 컬럼을 사용하여 다양한 세제 조건에서 샘플을 병렬로 준비할 수있었습니다(그림 1A). 이러한 소규모 정제 설정은 UV-VIS 분광법, SEC 및 SDS-PAGE(그림1B-C)를사용하여 추가 분석을 위한 충분한 단백질을 산출하였다.
UV-VIS 분광법으로 로도프신 안정성 공개
망막-재구성된 로도프신의 안정성은 광학 흡광도에 의해평가되었다(도 2). 어두운 상태에서, 9-시스 망막은 프로톤 화 된 Schiff 베이스로 Lys296에 공유적으로 연결됩니다. 조명 후, 9-시스 망막은 모든 트랜스 이소폼으로 이소성화되고 Schiff 염저 링크는 탈보된다. 프로톤화 된 9-시스 망막은 488 nm에서 흡수 피크를 제공하며, deprotonated 모든 트랜스 망막은 380 nm에서 피크를 가합니다. DDM에서 로도프신의 UV-VIS 스펙트럼은 9-시스 망막 결합 및 광 활성화 로도프신의 전형적인 흡수를 나타내었으며, 여기서 대략 동일한 광학 밀도를 가진 108 nm의 청색 시프트가 명확하게 관찰되었다(그림2A, 왼쪽 상단 패널). 로도프신이 불안정해지면 망막 변화에 대한 바인딩 포켓이 변경되어 망막 탈보 및 해리가 발생합니다. 이 경우, 스펙트럼은 망막15의자유 형태뿐만 아니라 deprotonation에서 기여를 보여줍니다 . 따라서 단백질(280 nm)과 망막(프로톤화 된 9-시스 망막의 경우 488 nm, deprotonated all-trans 망막에 대한 380 nm)의 흡광도 비에 의해 로돕신으로의 망막 재구성의 효율을 결정하였다(그림2B). 고전적인 세제(DDM, DM, Cymal-6, Cymal-5, C9G)에서 정제된 로도신 샘플은 동일한 광학 프로파일을 보여준다. 그러나, NPG 세제(LMNG, DMNG, Cymal-6NG, Cymal-5NG)에서 정제된 샘플은 DDM 샘플과 동일한 광학 프로파일을 준 OGNG 샘플을 제외한 망막에 대한 최적 결합 환경을 제안하는 광학 프로파일을 보여준다.
크기 배제 크로마토그래피는 샘플 순도 및 단백질 단재도를 보였다.
SEC는 준비 및 스크리닝 중에 단백질 샘플을 평가하기 위한 효율적이고 강력한 분석 도구입니다. 그것은 단백질 분자의 단색화성 뿐만 아니라 이전 정제 단계에서 견본 순도를 검증합니다. 로도프신 및 미니-G오 복합체의 경우, 샘플 품질은 280 nm 및 380 nm(도3A)의흡수 곡선으로부터 해석되었다. 280 nm 의 흔적은 단백질의 존재를 보여주었고, 380 nm 의 흔적은 망막의 존재를 보여주었다. 공극 부피(이 컬럼을 사용할 때 약 8 mL)에 나타나는 모든 신호는 단백질 응집체에 기인했습니다. 따라서, 결과는 고전적인 세제에서 제조된 샘플이 응집물의 일부가 나타난 C9G를 제외한 단분산 상태에 있는 것으로 나타났다. 대조적으로, NPG 형 세제를 사용하여 제조된 샘플은 C9G 샘플보다 훨씬 더 많은 응집체를 함유하고 있습니다. LMNG 및 Cymal-6NG는 가장 골재 형성으로 이어졌지만, DMNG 및 Cymal-5NG에서 더 적은 응집체가 관찰되었다. 예외는 DDM과 유사한 프로파일을 보여 준 OGNG였습니다. 공극 부피에서 용출되는 단백질 응집체는 또한 135 kDa에 해당하는 ~ 12.9 mL의 유지 부피에서 피크에 비해 증가한 A280/A380 비율에 의해 도시된 바와 같이 망막 점유율이 하였다. 우리가 관찰한 또 다른 특징은 로돕신과 로돕신-미니-Go가 동일한 유지량 주위를 용출한다는 것이었다(도3B).o 세제 결합 로도프신의 명백한 분자량이 120 kDa이고 로도신-미니-Go 144 kDa의 명백한 분자량이 있었기 때문에 이것은 놀라운 일이 아니다. 따라서 우리는 단지 SEC 데이터에서 복잡한 형성을 확인할 수 없었기 때문에 SDS-PAGE는 SEC 정제 샘플을 추가로 분석하는 데 사용되었습니다.
SDS-PAGE 는 복잡한 형성을 확인했습니다.
SDS-PAGE는 샘플에서 단백질 성분을 식별하는 표준 방법입니다. 농축 된 로도프신 (SEC 정제 전)은 순도를 확인하기 위해 SDS-PAGE에 의해 분석되었으며, 37 kDa 근처의 두 밴드와 50 kDa 이상의 얼룩진 밴드를 보였다(그림 4A). 하부 2 밴드는 나중에 상이한 N-글리코실화 상태를 갖도록 확인되었다. 50 kDa 이상의 대역은 이러한 응집체가 SEC 또는 다른 검출 방법에서 관찰되지 않았기 때문에 SDS-PAGE 샘플 버퍼에 의해 유도된 응집된 로도신 올리고머로 해석되었다. SEC 데이터가 복잡한 형성을 확인할 수 없었기 때문에 SDS-PAGE를 사용하여 로도신-미니-G샘플의 SEC 용출 분획을 분석했습니다. SDS-PAGE는 모든 세제 조건에서 로돕신 및 미니-Go의 단백질 밴드를 나타내었으며, 이는 세제의 선택에 관계없이 복합체가 형성되었다는 것을시사한다(도 4B).
LC-MS 분광법은 로도프신에서 N-글리코실화 패턴을 확인했습니다.
친화도 정제 및 SEC 모두에서 Rhodopsin 샘플은 24 mL 컬럼을 사용할 때 SEC에 의해 분리 될 수없는 SDS-PAGE 젤에 약 37 kDa의 명백한 분자량으로 마이그레이션 된 두 개의 단백질 밴드를 보여주었습니다. HEK 293 GnTI로부터 이종적으로 발현된 로도프신상에서의 N-글리코실화의 상이한패턴-세포가 가장 가능성이 높은 설명이었다. 따라서, 두 가지 효소, PNGase F 및 엔도 F1, 로도프신을 탈구하는 그들의 능력에 대한 테스트되었다. SDS-PAGE 데이터에서 엔도 F1은 두 단백질 밴드의 분자량을 단일 제품으로 감소시켰으며, PNGase F 소화는 여전히 두 개체군을주었다(그림 5A). 소화되지 않은 엔도 F1 처리 된 샘플은 LC-MS 분광법을 사용하여 다른 종의 질량을 식별하기 위해 분석되었습니다. 데이터는 HEK 293GnTI에서 생성된 로도프신이 1014±1 Da. Endo F1 처리 된 로도프신의 질량 차이와 함께 하나 또는 두 개의 N-글리칸을 함유하고 있으며, N-글리칸을 포함하지 않았으며 2027±1 Da의 질량 차이를 두 개의 N-글리칸을 함유한 로도프신과 비교하여 질량 차이가 있음을 보여주었다. 이러한 결과는 로도프신을 발현하는 데 사용되는 세포주에서 N-아세틸글루코사미닐트랜스파제 I효소의 부재와 일치하며, 이는 GlcNAc2Man5,(질량 1014 Da) 구조를 갖는 모든 N-글리칸을 초래한다.
도 1: 세제 스크리닝 실험을 위한 시료 제제 및 특성화. (A)정제 시 다른 세제에서 로도프신 시료의 제조. (B)프로토콜에 사용되는 방법 : UV-VIS 분광법, 크기 배제 크로마토그래피 (SEC), SDS-PAGE 및 액체 크로마토그래피 질량 분광법 (LC-MS). (C)로도프신, 로도프신-미니-Go, 및 로도프신의 탈당실화 생성물의 특성화를 위한 실험워크플로우.o 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 로도프신의 UV-VIS 분광법. (A)로도프신의 UV-VIS 스펙트럼. 어두운 상태의 스펙트럼, 9-시스 망막 바인딩 로도신은 파란색 곡선으로 표시됩니다. 조명 후, 9-시스 망막은 모든 트랜스 망막으로 deprotonated 및 이섬, 그리고 조명 로도프신의 스펙트럼은 빨간색 곡선으로 표시됩니다. 각 세제의 화학적 구조는 인세트로 표시됩니다. (B)A280/A488(파란색 막대)과 A280/A380(빨간색 막대)의 비율은 각각 어두운 상태와 밝은 상태에서 로돕신의 안정성을 나타남을 나타남이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 로도프신 및 로도프신의 크기 배제 크로마토그래피 프로파일–10가지 세제로 정제된 mini-Go 복합체. (A)왼쪽 패널은 고전적인 세제에서 정제된 샘플의 SEC 프로파일을 보여줍니다. 오른쪽 패널은 NPG 형 세제에서 정제 된 샘플의 SEC 프로파일을 나타냅니다. 표준 마커 단백질의 프로파일은 DDM 샘플과 함께 오버레이로 나타내고 있다. 피크 프로파일의 해석은 DDM, DM, Cymal-6, Cymal-5 및 OGNG에 대해 표시되는 이상적인 시나리오(집계 없음)와 함께 DMNG에 대해 표시됩니다. (B)12-14 mL의 보존 부피에서 OGNG 샘플의 확대 프로파일. 모든 샘플은 Superdex200 증가 10/300 GL 컬럼을 사용하여 분석하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 로도프신 및 로도프신/미니고 복합체의 SDS-PAGE 분석. (A)세제에서 정제 된 로도신 샘플. 50 kDa 이상의 얼룩진 밴드는 SDS-PAGE 샘플 버퍼에 의해 유도된 응집된 로도신 올리고머에 기인한다. (B)로돕신/미니고 복합체의 SEC 정제 샘플. 1, 2 N-글리칸 및 미니 Go가 있는 로도프신이 묘사됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 로도프신에서 당화의 식별. (A)PNGase F 및 엔도 F1을 사용하여 탈교된 로도프신의 SDS-PAGE 분석. (B)로돕신의 LC-MS 스펙트럼(상부 패널)이 없고 엔도 F1(하부 패널)에 의한 탈당화. 결정화를 위한 로도신-미니-G-O 복합체를 제조하기 위해 엔도 F1은 하나의 균일한 로도프신 종을 전달했기 때문에 PNGase F보다 엔도 F1을 선택했습니다.o 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 세제 | 작업 농도 (%) | 임계 미셀 농도(%) |
| Ddm | 0.025 | 0.0087 |
| Dm | 0.12 | 0.087 |
| 시말-6 | 0.05 | 0.028 |
| 시말-5 | 0.2 | 0.12 |
| C9G | 0.5 | 0.2 |
| LMNG | 0.01 | 0.001 |
| DMNG | 0.01 | 0.0034 |
| 시말-6NG | 0.015 | 사용할 수 없습니다. 0.056보다 낮아야 합니다. |
| 시말-5NG | 0.02 | 0.0056 |
| 오구 (동음이의) | 0.15 | 0.058 |
표 1: 버퍼 C 세제 농도.
| 시간(최소) | 용매 A (%) | 용매 B (%) | 용매 C (%) | 유량(ml/분) |
| 0 | 0 | 95 | 5 | 0.5 |
| 1 | 0 | 95 | 5 | 0.5 |
| 5 | 20 | 75 | 5 | 0.6 |
| 25 | 85 | 10 | 5 | 0.6 |
| 26 | 90 | 5 | 5 | 0.6 |
| 30 | 90 | 5 | 5 | 0.6 |
표 2: 열 용출 매개변수.
Discussion
단백질 결정화의 성공은 세제에 의한 합병증으로 인해 단백질 샘플, 특히 막 단백질과 복합체에 강하게 의존합니다. 이 보고서는 GPCR-mini-G 단백질 신호 복합체에 대한 샘플 품질의 세제 스크리닝 및 평가를 보여줍니다. 다양한 방법은 멤브레인 단백질의 생화학적 특성을 연구하기 위해 널리 사용되어 왔으며, 예를 들어 형광 염료16,,17,결합 분석법으로 트립토판 형광신호(18) 또는 바이오센서(19)를 이용한 공진 에너지 전달의 변화를 측정하여 복합형성을 검출하는 열성성 분석법19.19 그러나, 그 방법에 사용된 화학 환경은 결정화 견본을 준비하기 위한 것과 아주 다릅니다, 단백질은 형광 기지를 둔 측정을 위한 천배 더 낮은 농도에, 또는 단백질은 지질 이중층 또는 1개의 고정된 세제 조건에 매립됩니다. 이 프로토콜에서 사용된 방법은 결정화 전에 대규모 시료 전처리에서도 표준화됩니다. 따라서, 최적화된 파라미터는 추가적인 주요 스크리닝 및 최적화 없이 결정화 스케일 준비를 위해 쉽게 이송될 수 있다.
이 프로토콜의 목적은 X선 결정학에 의한 증기 확산 결정화 및 구조 측정을 위한 안정적이고 균일한 GPCR-mini-G 단백질 복합체의 제조를 최적화하는 것입니다. 프로토콜은 로돕신-미니-G복합체의 제조 동안 세제 및 탈당화의 영향을 질적으로 평가하는 일련의 방법을 통합한다. 트랜스듀신 펩티드의 유무에 관계없이 비활성 상태 및 광 활성화 상태에서 로도프신은 세제 옥틸 글루코시드(C8G)에서 정제될 때 결정화되어20,,21,22 및C9G23,,24. C8G 및 C9G에서 정제된 로독신-미니-G복합체가 결정(나타내지 않은 데이터)을 산출하지 않았기 때문에, 우리는 설명된 전략을 사용하여 더 넓은 범위의 다른 세제를 탐구하였다(도1). 로도프신의 광 감도를 활용함으로써, 우리는 아주 잘 280 nm 이외의 파장에서 망막의 재구성을 따를 수 있었다. UV-VIS 분광법과 SEC 모두에서 380 nm 또는 488 nm에서 망막을 검출했습니다. 그러나, 대부분의 막 단백질은 정제 동안 기능을 따르는 편리한 염색체를 갖지 않는다. 다른 옵션은 빛을 감지가능한 염색체를 추가하거나 방사성 기결합 및 열 시프트검정(25)을사용하여 리간드를 검출할 수 있도록 하는 것이다.
로도프신은 40 kDa의 분자량을 가지고 있습니다. 세제의 질량으로 인해 SEC의 명백한 분자량은 약 120 kDa입니다. 따라서 120 kDa 및 144 kDa의 명백한 질량을 가진 단백질의 분화를 필요로 하기 때문에, SEC에 mini-Go (24 kDa)의 결합이 쉽게 검출되지 않았다는 것은 놀라운 일이 아닙니다. 따라서 SDS-PAGE에 의한 SEC 분획의 분석은 시료 순도와 복잡한 형성을 확인하기 위해 사용되었다. SEC 프로파일이 복잡한 형성시 명확한 변화를 보여 주더라도, 여전히 SDS-PAGE 분석을 수행하여 다른 공정제 단백질 오염 물질보다는 올바른 결합 파트너와 함께 복잡한 형성을 확인하는 것이 좋습니다.
로도프신과 mini-Go는 모두 밀리그램 수량으로 정제되었으며, 이는 SEC 동안 UV-VIS 흡수와 SDS-PAGE 젤의 컴마시 블루 염색과 같은 복합체의 낮은 감도 검출을 사용할 수 있게 하였다. 시료가 제한되는 경우, 단백질(280 nm 여기, 350 nm 방출)에서 트립토판 신호를 추적하는 형광 검출기가 장착된 LC 정화기와 SDS-PAGE 젤의 은 염색과 같은 보다 민감한 검출을 사용해야 합니다. 또 다른 접근법은 녹색 형광 단백질(GFP)과 같은 형광 단백질을 관심 있는 단백질에 융합하는 것이며, 이는 또한 단백질발현(26) 동안에도 검출을 허용할 것이지만 결정화 전에 제거되어야 한다.
정제된 단백질이 또한 가변 PTM에서 발생하는 이질성이 없는지 확인하는 것이 필수적입니다. 여기서 설명된 경우, SDS-PAGE 겔에서 관찰된 로도프신의 2개 집단은 하나 또는 2개의 N-글리칸을 갖는 것으로 특징지어졌다. 단백질의 가변 적인 수정은 잠재적으로 잘 diffracting 결정의 대형을 방지할 것입니다, 그래서 우리는 그러므로 deglycosylated rhodopsin. Endoglycosidase Endo F1은 가장 효과 endoglycosidase 테스트 및 치료는 unglycosylated 수용체의 단일 종을 주도, PNGase F는 부분적으로 로도프신에 글리칸을 제거하고 로도신의 혼합물을 초래하는 동안 완전히 비정형 또는 하나의 N-글리칸 남아. 로도프신은 deglycosylase 처리가 없는 성공적으로 결정화되어27,28왔으며,로도신Asn15에 대한 N-글리칸은 이러한 경우에 결정 접촉을 형성하는 것이 중요하다. 로독신-미니-Go의경우, 결정을 얻기 위해 엔도 F1에 의한 N-글리칸을 제거할 필요가 있다. 결정화 전에 관심 있는 단백질을 deglycosylate하는 표준화된 규칙은 없지만, 광범위한 결정화 시험 후에 단백질이 결정화되지 않을 때 이기종 PTM의 제거를 고려해야 합니다.
여기에 설명된 데이터 및 방법론은 작은 미셀 크기와 복합체를 안정화시키는 능력으로 인해 로도신-미니-G복합체의 결정화를 위한 가장 바람직한 세제로서 OGNG를 선택하도록 이끌었습니다. 우리는 또한 정제 된 로도프신이 균일 한 종이었다 보장하기 위해 엔도 F1을 사용했다. 결정은 이어서 얻어지고 ~ 3.1Å4로결정된 결정 구조를 결정하였고, 이는 GPCR-G 단백질 신호화복합체(14,,29)의제3 결정 구조에 불과하였다.
파트너 단백질과 결합된 막 단백질의 경우 두 가지 다른 단백질로 간주되어야 합니다. 상이한 기능 적 상태의 단백질은 서로 다른 적합성을 가지며 에너지 수준이 다릅니다. 따라서, 비활성 상태에 대한 파라미터가 활성화된 상태로 완전히 전송되지 않을 수 있으므로 각 기능 상태에 대한 준비 프로토콜을 최적화하는 것이 좋습니다. 또한, 파트너 단백질을 결합시킴으로써 복잡한 단백질 성질의 변화는 말할 것도 없다. 이 프로토콜은 결정화 시료를 준비하기 위해 다른 세제에서 비활성 막 단백질을 준비하고 단백질 활성화 및 복합 형성을 거쳐 단백질 품질을 특성화하는 방법을 사용합니다. 따라서, 이 프로토콜은 사소한 변형으로 구조 연구를 위해 다른 막 단백질 및 이들의 복합체로 용이하게 일반화될 수 있다.
Disclosures
CGT는 소세이 헵타레스의 과학 자문위원회의 컨설턴트이자 회원입니다. 다른 모든 저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 이 프로젝트에서 장기적인 지원을 해준 게하르트 F. X. 셰틀러 박사에게 감사를 표하며, 로저 J.P. 도슨 박사와 호프만 라 로슈 박사가 세포 배양에 대한 지원을 해주신 것에 대해 감사드립니다. 이 작품은 스위스 국립 과학 재단 (보조금 210030_153145 및 GFXS에 310030B_173335), 유럽 연구 위원회 (EMPSI, 339995)와 의료 연구위원회 (MRC U105197215)에서 CGT에 자금을 후원했다. FP는 연구 분자 초고속 과학 기술 (NCCR MUST)와 ETH 펨토초 및 아토초 과학 기술 (ETH FAST) 프로그램의 능력의 국립 센터를 통해 ETH 취리히를 인정합니다. FP, JM, AB 및 CJT는 폴 셔러 연구소의 장기적인 재정 지원을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1D4 peptide | Peptide2.0 | Under request | |
| 9-cis retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
| Autosampler A-900 | GE Healthcare | Discontinued | |
| C9G | Anatrace | N324 | |
| cOmplete, EDTA-free protease inhibitor coctail | Roche | 5056489001 | |
| Cymal-5 | Anatrace | C325 | |
| Cymal-5NG | Anatrace | NG325 | |
| Cymal-6 | Anatrace | C326 | |
| Cymal-6NG | Anatrace | NG326 | |
| DDM | Anatrace | D310 | |
| DM | Anatrace | D322 | |
| DMNG | Anatrace | NG322 | |
| Econo column | Bio-Rad | 7372512 | |
| Ettan LC | GE Healthcare | Discontinued | |
| FRAC-950 | GE Healthcare | Discontinued | |
| HPLC Water 2795 Separation Module | Waters AG | 720000358EN | |
| InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | |
| LCT Premier mass spectrometer (ESI-TOF) | Waters AG | - | |
| LMNG | Anatrace | NG310 | |
| Monitor UV-900 | GE Healthcare | 18110835 | |
| Nanodrop 1000 | Witec AG/ThermoFisher | Discontinued | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel 1.0 mm, 15 well | ThermoFisher | NP0323BOX | |
| NuPAGE MES SDS buffer (20x) | ThermoFisher | NP0002 | |
| OGNG | Anatrace | NG311 | |
| PAGEr Minigel Chamber | Lonza | 59905 | |
| Reprosil 200 C18-AQ column | Morvay Analytik GmbH | #s1503 | |
| Superdex 200 Increase GL column | GE Healthcare | 28990944 | |
| Tabletop centrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000413 | |
| Ultracentrifuge Optima XE-100 | Beckmann Coulter | A94516 | |
| ULTRA-TURRAX T25 | IKA WERKE | 0003725003 | |
| UV-VIS spectrophotometer | Shimadzu | UV-2401PC | |
| Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector | Waters AG | - |
References
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