Summary
Denna rapport beskriver screening av olika rengöringsmedel för att förbereda den visuella GPCR, rhodopsin, och dess komplex med mini-Go. Biokemiska metoder som kännetecknar komplexets kvalitet i olika skeden under rening visas. Detta protokoll kan generaliseras till andra membran proteinkomplex för deras framtida strukturella studier.
Abstract
Nyckeln till att bestämma kristallstrukturer av membranproteinkomplex är provets kvalitet före kristallisering. I synnerhet är valet av tvättmedel kritiskt, eftersom det påverkar både stabiliteten och monodispersity av komplexet. Vi fastställde nyligen kristallstrukturen hos ett aktivt tillstånd av bovin rhodopsin kopplat till ett konstruerat G-protein, mini-Go, vid 3.1 Å-upplösning. Här beskriver vi proceduren för att optimera beredningen av rhodopsin-mini-Go-komplexet. Dark-state rhodopsin var beredd i klassiska och neopentyl glykol (NPG) rengöringsmedel, följt av komplex bildning med mini-Go under ljusexponering. Stabiliteten i rhodopsin bedömdes av ultraviolett-synlig (UV-VIS) spektroskopi, som övervakar reconstitution i rhodopsin av ljuskänsliga ligand, 9-cis retinal. Automatiserad storlek-uteslutning kromatografi (SEC) användes för att karakterisera monodispersity av rhodopsin och rhodopsin-mini-Go komplex. SDS-polyakrylamid elektrofores (SDS-PAGE) bekräftade bildandet av komplexet genom att identifiera en 1:1 molar förhållandet mellan rhodopsin och mini-Go efter färgning gelen med Coomassie blå. Efter korsvalidering av alla dessa analysdata eliminerade vi olämpliga tvättmedel och fortsatte med det bästa datatvättmedlet för storskalig beredning och kristallisering. Ett ytterligare problem uppstod från heterogenitetn en N-glykosylering. Heterologously-uttryckt rhodopsin observerades på SDS-SIDA för att ha två olika N-glycosylated populationer, vilket förmodligen skulle ha hindrat kristalllogenesis. Därför testades olika deglycosylationenzymer, och endoglycosidase F1 (EndoF1) producerade rhodopsin med en enda art av N-glycosylation. Med denna strategiska pipeline för att karakterisera proteinkvalitet optimerades beredningen av rhodopsin-mini-Go-komplexet för att leverera kristallstrukturen. Detta var bara den tredje kristallstrukturen i en GPCR-G protein signalering komplex. Detta tillvägagångssätt kan också generaliseras för andra membranproteiner och deras komplex för att underlätta provberedning och strukturbestämning.
Introduction
Bestämma kristall strukturer av membran proteiner och deras komplex har alltid varit utmanande på grund av svårigheter att få väl diffracting kristaller. I motsats till lösliga proteiner, integrerad membran proteiner utgör en hydrofoba kärna som spänner över cellmembranet. För att avlägsna membranproteiner från cellmembranet till vattenbuffert måste rengöringsmedel användas för att bilda en tvättmedelsproteinmicelle, vilket ersätter lipiderna runt membranproteinernas hydrofoba kärna. Membranproteiners stabilitet, aktivitet och integritet är direkt beroende av tvättmedlets kemiska och strukturella egenskaper1, och tvättmedlets egenskaper bestämmer också mikrofonellens storlek. En stor tvättmedel micelle kan ocklude hydrofila ytor av ett litet membran protein, vilket förhindrar kristallisering på grund av bristen på kristall kontakter när du använder ånga diffusion metod. En liten tvättmedel micelle är fördelaktigt för kristallografi, men kort kedja rengöringsmedel är oftast hårdare och därför leda till destabilisering och aggregering av membranproteinet. Därför, före kristallisering, en ytterligare tvättmedel screening förfarande är oumbärlig, vanligtvis riktar kortare rengöringsmedel som fortfarande upprätthålla proteinstabilitet.
G proteinkopplade receptorer (GPCRs) är integrerade membranproteiner som innehåller sju transmembran a-helices. GPCRs finns i två huvudstater, antingen ett inaktivt tillstånd stabiliserat av omvända agonister eller antagonister, eller ett aktivt tillstånd bundet till en agonist och stabiliseras av ett G-protein, även om det är troligt att en mängd delstater finns mellan dessa två ytterligheter. Struktur bestämning av GPCRs fokuserade ursprungligen på inaktiva tillstånd bundna till omvända agonister och antagonister på grund av deras högre stabilitet än aktiva stater2. När GPCRs aktiveras vid agonistbindning är receptorerna mycket dynamiska och en kluven bildas övergående på receptorns cytoplasmatiska ansikte för G-proteinkopplingen. Man tror att denna dynamik är anledningen till agonist-bundna GPCRs är ofta mer instabila än det inaktiva tillståndet. Därför blir det viktigt att skärmen för rengöringsmedel som är lämpliga för konformationstillståndet hos den receptor som studeras, eftersom det är troligt att mildare rengöringsmedel kommer att krävas för att studera ett aktivt tillstånd jämfört med ett inaktivt tillstånd.
I denna rapport använder vi den visuella GPCR, nötkreatur rhodopsin3, och dess komplex med mini-Go protein4,5 för tvättmedel screening experiment, som representerar inaktivt tillstånd och aktivt tillstånd, respektive. Tvättmedelsscreeningen fokuserade på de klassiska alkylmaltoside- och glukostvättmedelen och naopentylglykolstvättmedel (NPG). I detta sammanhang är ett klassiskt tvättmedel byggt från en sockerhuvudgrupp och en alkylkedja, medan NPG-typ tvättmedel innehåller två identiska klassiska rengöringsmedel som smälts av ett kvartärt kol i gränssnittet mellan socker och alkylkedjorna6,,7,8.
Ett experimentellt arbetsflöde utformades från rening av rhodopsin i olika rengöringsmedel, följt av bildandet av rhodopsin-mini-Go komplex och slutar med karakterisering av komplexet med flera metoder(bild 1). För det inaktiva tillståndet av rhodopsin övervakades reconstitution av den ljuskänsliga ligand9-cis retinal av ultraviolett-synlig (UV-VIS) spektroskopi. Spektrumet avslöjar det fysicokemiska tillståndet i retinal och är ett tecken på dess miljö i retinal bindande ficka av rhodopsin. Storlek utanförskap kromatografi (SEC) användes för att bedöma monodispersity av renade rhodopsin samt bildandet av rhodopsin-mini-Go komplex. Som SEC skiljer proteinmolekyler efter deras storlek och form, aggregerade proteinpopulationen kan identifieras som de elute i tomrummet volymen. För att bekräfta komplex bildning bedömdes fraktioner från SEC av natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) för att bekräfta närvaron av både rhodopsin och mini-Go.
En annan faktor som måste beaktas är posttranslationella modifieringar (PTM) på membranproteinerna. PTM såsom N-glykosylering observeras ofta på eukaryota membranproteiner som produceras i däggdjurs- och insektscelluttryckssystem. En begränsad N-glykosylering stam av mänskliga embryonala njure 293 (HEK293) celler utvecklades genom radering av genen kodning N-acetylglukosaminyltransferas E I (GnTI), vilket resulterar i homogen N-glycosylation av GlcNAc2Man5 på konsensus plats Asn-X-Ser /Thr. Även n-glykosylering kan förebyggas genom att mutera en aminosyra rester i konsensus webbplats, Detta kan också förändra funktionen av proteinet eller effektiviteten i vikning. I nötkreatur rhodopsin, mutation av N-glycosylated rester Asn15 leder till felaktig vikning och minskad G protein aktivering9,10. Den rhodopsin som används i denna rapport uttrycktes i HEK 293 GnTI-bristfällig cellinje. SDS-PAGE visade dock närvaron av två arter av rhodopsin. Denna heterogenitet kan förhindra kristallbildning och därför deglycosylation med peptid-N-glycosidase F (PNGase F) och endoglycosidase F1 (Endo F1) testades. Den deglycosylated produkten kännetecknades av SDS-PAGE och flytande kromatografi-massa pektrometri (LC-MS) för att identifiera nivån av glycosylation och dess homogenitet.
Protocol
OBS: Detta protokoll för tvättmedelscreening är detaljerat för 30 g HEK293 cellpellet som startmaterial.
1. Material, kemikalier och reagenser
OBS: Alla lösningar bereds med hjälp av analytiska reagenser av analytiskkvalitet och ultrarent vatten, som renas från avjoniserat vatten för att nå en resistivitet på 18,2 MΩ'cm vid 25 °C.
- Buffertlagerlösningar
- Förbered 10x fosfatbuffrad saline (10x PBS).
- Förbered HEPES buffert: 1 M, tibilerade till pH 7.5 med NaOH.
- Förbered 5 M NaCl.
- Förbered 2 M MgCl2.
OBS: Alla lagerlösningar passerar genom ett 0,22 μm filter för att bibehålla sin sterilitet.
- Lösningar för tvättmedelslager
- Förbered dodecyl maltoside (DDM), 10% (w/v).
- Förbered decyl maltoside (DM), 10% (w/v).
- Förbered 6-cyklohexyl-hexyl maltoside (Cymal-6), 10% (w / v).
- Förbered 5-cyklohexyl-pentyl maltoside (Cymal-5), 10% (w / v).
- Förbered nonyl glukosid (C9G), 10% (w/v).
- Förbered laurylmaltos neopentylglykol (LMNG), 5% (w/v).
- Förbered decyl maltose neopentyl glykol (DMNG), 10% (w/v).
- Förbered cymal-6 neopentylglykol (C6NG), 10% (w/v).
- Förbered cymal-5 neopentylglykol (C5NG), 10% (w/v).
- Förbered octylglukosneopentylglykol (OGNG), 10% (w/v).
OBS: För 10% tvättmedel slager lösning, lös 1 g tvättmedel pulver i ultrarent vatten med mild gungning, och sedan justera den slutliga volymen till 10 ml. Tvättmedelsstamlösning bör förvaras vid -20 °C för långtidsförvaring och på is under arbetet.
VARNING: Rengöringsmedel på flaska rekommenderas vanligtvis att förvaras vid -20 °C frys. Flaskorna som innehåller tvättmedelspulver bör värmas upp till rumstemperatur innan de öppnas. Tvättmedelspulver är hygroskopiskt, så temperaturekvivalenter förhindrar bildandet av kondens som kommer att blöta tvättmedlet.
- Andra kemikalier och reagenser
- Förbered 1D4 immunaffinitet agarose harts: 10 ml av 50% slurry.
OBS: 1D4 immunaffinitet agarose är agarose pärlor kopplade till monoklonala Rho1D4 antikroppar, som binder de sista 9 aminosyror av nötkreatur rhodopsin TETSQVAPA som epitop. Den 1D4 immunaffinitet agarose fungerar som affinitet rening material för att fånga proteiner som innehåller en C-terminal 1D4 sekvens. Detta reningsmaterial kan beredas9,,11 eller köpas. - Förbered 9-cis retinal lösning: 1 mM, upplöst i 100% etanol.
OBS: Förhindra ljusexponering för retinal under beredning och förvaring. - Förbered 1D4 peptid (sekvens TETSQVAPA): 800 μM, upplöst i vatten.
- Förbered 1D4 immunaffinitet agarose harts: 10 ml av 50% slurry.
- Buffertar
OBS: Alla buffertar blandas från lagerlösningar till önskad koncentration. Alla buffertar kyls till 4 °C före användning.- Förbered buffert A: PBS, 0,04% DDM.
- Förbered buffert B: 20 m HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,04% DDM.
- Förbered buffert C: 20 m HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl och tvättmedel vid deras arbetskoncentration som anges i tabell 1.
- Förbered buffert D: 20 m HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl.
- Förbered Elutionbuffert: 20 m HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 80 μM 1D4 peptid och tvättmedel vid arbetskoncentrationen.
- Förbered SEC-buffert: 20 m HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.025% DDM; filtreras genom ett 0,22 μm-filter.
- Lösningsmedel för LC-MS
- Förbered lösningsmedel A: acetonitril som innehåller 0,1% myrsyra.
- Förbered lösningsmedel B: ultrarent vatten som innehåller 0,1% myrsyra.
- Förbered lösningsmedel C: iso-propanol.
2. Cellmembranlösbilisering och proteinutvinning
- Tina 30 g HEK293 GnTI- cellpellet som uttrycker den bovinrhodopsinmuterade N2C/M257Y/D282C3,9 till rumstemperatur, tillsätt 120 ml 1x PBS-buffert som innehåller proteashämmarecocktail och homogenisera med hjälp av en Dounce-homogenisator eller en elektrisk homogenisator (13 000 rpm för 30 s). Samla den homogeniserade cellfjädringen i en bägare och justera volymen till 150 ml.
OBS: 30 g cellpellet motsvarar 3 L cellodling vid 2 x 106 cell/ml densitet. - Lägg försiktigt till 10% DDM till homogeniserade celler för att ge en slutlig koncentration på 1,25%. Rör om på is i 1 h.
- Centrifugera cellen lysate vid 4 °C och 150.000 x g i 45 min för att ta bort olösligt skräp.
- Överför supernatanten till en 500 ml flaska och tillsätt 10 ml av 1D4 immunaffina agarose harts (50% slurry). Blanda försiktigt den lösliga celllysen och harts i 4 timmar eller över natten vid 4 °C.
- Ladda lylysblandningen/hartsblandningen på en öppen kolumn för att samla in hartset.
- Tvätta hartset med 10 kolumnvolymer (CV) av tvättbuffert A.
OBS: Kolumnvolymen är volymen på den packade (100%) agarose harts används. I detta fall är 1 CV 5 ml. - Återupphäng hartsen med 2 CV buffert A.
VARNING: Från steg 2.8 och framåt är steg som måste utföras under svagt rött ljus märkta med "[Dark]" i början av beskrivningen. - - Jag vet inte vad du ska. Tillsätt 9-cis retinal till den återsuspenderade hartsen till den slutliga koncentrationen på 50 μM. Blanda försiktigt vid 4 °C i 4-16 h i mörkret.
OBS: En kortare inkubationstid kan leda till ofullständig reberedning av retinal. - - Jag vet inte vad du ska. Ta bort flödet från kolumnen. Tvätta harts med 20 CV Buffert A, följt av 15 CV Buffert B.
- - Jag vet inte vad du ska. Återupphäng hartset i 2 CV Buffert B och dela sedan upp hartssuspensionen lika till 10 10 ml-kassen.
- - Jag vet inte vad du ska. Ta bort flödet genom från kolonnen och sätt sedan tillbaka hartset i 1 ml buffert C. Inkubera i 1 h vid 4 °C.
- - Jag vet inte vad du ska. Upprepa steg 2.11.
- - Jag vet inte vad du ska. Ta bort flödet från kolumnen och sedan återupphäng hartsen i 0,8 ml Elution Buffer för varje kolumn. Blanda försiktigt i 2 h.
- - Jag vet inte vad du ska. Samla elution från kolonnen i ett 2 ml rör.
- - Jag vet inte vad du ska. Återupphäng hartsen i 0,7 ml Elution Buffer för varje kolumn. Blanda försiktigt i 1 h.
- - Jag vet inte vad du ska. Samla elution från kolonnen i samma rör.
3. UV-VIS spektroskopi
- Förbered spektrofotometern för att täcka mätområdet på 250-650 nm. Registrera baslinjen med vatten- eller Elutionsbuffert.
- - Jag vet inte vad du ska. Ladda det eluterade proteinet till kvartscuvett. Mät proteinprovets spektrum.
- - Jag vet inte vad du ska. Lys upp proteinet direkt i cuvett i 2 min med ljus som passerar genom ett 495 nm långpassfilter.
- Mät spektrumet för det belysta provet.
- Utför samma mätning för alla proteinprover renade i de övriga 9 tvättmedel, både mörka och upplysta tillstånd.
- Rita kurvorna (absorbans kontra våglängd) i X-Y-punktdiagram.
4. Automatiserad storlek-uteslutning kromatografi av rhodopsin och rhodopsin-mini-Go komplex
- - Jag vet inte vad du ska. Koncentrera proteinet till 100 μL genom centrifugering med hjälp av en spinkoncentrator med en molekylviktsavstängning (MWCO) på 30 kDa vid 4 °C. Överkoncentrerade prover kan spädas med hjälp av flödet genom från koncentratorn eller buffert C. För att bestämma proteinprovkoncentration mäter du absorbansen vid 280 nm med hjälp av en spektrofotometer.
OBS: Från steg 4.2 och framåt kräver experimentet inte en mörk miljö, och därför kan prover beredas under normalt ljus. - Förbered 100 μL rhodopsin vid 0,7 mg/ml för varje tvättmedelstillstånd.
- Förbered 100 μL rhodopsin (0,7 mg/ml) och mini-Go4,12 (0,2 mg/ml) blandning för varje tvättmedelstillstånd. Komplettera blandningen med 1 mM MgCl2. Lys upp blandningen med ljus från ett 495 nm långpassfilter och inkubera i 30 min.
- Montera en 24 ml gel filtrering kolumn med ett fraktionering spann på 10-600 kDa av ett klotformigt protein på en flytande kromatografi renare. Jämviktkolumnen med SEC-buffert.
OBS: Den flytande kromatografirenaren är utrustad med en autosampler, en multivåglängdsdetektor och en fraktionssamlare. - Överför proverna till autoprovflaskorna och placera dem i provfacket. Programmera en metodfil för att automatisera sek-körningar för varje prov, med autosampler som laddar 77 μL i provet till kolumnen, och renaren som alproducerar 24 ml SEK-buffert med en flödeshastighet på 0,5 ml/min per körning. Registrera absorbansen vid 280 nm och 380 nm.
- Samla de högsta fraktionerna av rhodopsin och rhodopsin-mini-Go komplex vid retentionsvolymen runt 12,9 ml.
- Analysera de vänstra rhodopsinproverna från steg 4.2 och toppfraktionerna av rhodopsin-mini-Go komplex på 4-12% SDS-denaturering gradientgeler med Coomassie blå färgning.
- Rita eluonkromatogrammet (A280 eller A380 jämfört med retentionsvolym).
5. Deglycosylation och LC-MS-studie
- För LC-MS-studie använder du endast rhodopsinprovet som renas i LMNG-tvättmedel.
- Förbered en blandning av rhodopsin på 200 μL vid 1 mg/ml och PNGase F13 vid 0,01 mg/ml. Blanda väl och inkubera vid 4 °C över natten.
- Förbered en blandning av rhodopsin på 200 μL vid 1 mg/ml och Endo F113 vid 0,01 mg/ml. Blanda väl och inkubera vid 4 °C över natten.
- Analysera matsmältningsresultatet av SDS-PAGE och Coomassie blå färgning.
- Koncentrera obehandlad och Endo F1-behandlade rhodopsin prover och föremål för SEC rening i buffert D.
OBS: Detta är att förbereda provet med minimal mängd tvättmedel för LC-MS-studie. Buffert D innehåller inget rengöringsmedel, men på grund av den långsamma avfrekvensen av LMNG från ett membranprotein14kommer rhodopsin inte att aggregeras. - Samla den högsta fraktionen vid retentionsvolymen runt 12,9 ml. Koncentrera dig till 1 mg/ml med hjälp av en spinnkoncentrator (MWCO 30 kDa).
- Injicera 10 μg protein i en Reprosil 200 C18-AQ-kolonn och elute kolonnen med hjälp av den linjära gradientmetoden med lösningsmedelssammansättning och inställningar som anges i tabell 2. Flödet är uppdelat till 25% för massspektrometer och 75% för UV-detektion.
Representative Results
Det experimentella arbetsflödet för provberedning och analys sammanfattas i figur 1. Genom att använda öppna kolumner för småskalig affinitetsrening kunde vi förbereda prover i många olika tvättmedelsförhållanden parallellt(figur 1A). En sådan småskalig reningsuppsättning gav tillräckligt med protein för ytterligare analyser med UV-VIS-spektroskopi, SEC och SDS-PAGE (figur 1B-C).
UV-VIS spektroskopi visade rhodopsin stabilitet
Stabiliteten hos retinalrekonstituerad rhodopsin bedömdes med dess optiska absorbans (figur 2). I mörkertillstånd är 9-cis retinal covalently kopplat till Lys296 som en protonerad Schiff bas. Efter belysningen är 9-cis retinal isomerized till all-trans isoform och Schiff bas länken deprotonated. Den protonerade 9-cis retinal ger en absorptionstopp på 488 nm, medan deprotonerade all-trans retinal har en topp på 380 nm. UV-VIS-spektraaven av rhodopsin i DDM visade den typiska absorptionen av 9-cis retinal-bunden och ljusaktiverad rhodopsin, där en blå förskjutning på 108 nm med ungefär samma optiska densitet observerades tydligt(figur 2A, övre vänstra panelen). När rhodopsin destabiliseras, och sedan den bindande fickan för retinal förändringar, vilket resulterar i retinal deprotonation och eventuellt dissociation. Om detta händer, och sedan spektrumet visar bidraget från deprotonation samt den fria formen av retinal15. Därför fastställde vi effektiviteten av retinal reconstitution i rhodopsin genom absorbansförhållandet mellan proteinet (280 nm) och näthinne (488 nm för protonerade 9-cis retinal, 380 nm för deprotonerade all-trans retinal) (figur 2B). Rhodopsin prover renas i de klassiska tvättmedel (DDM, DM, Cymal-6, Cymal-5, C9G) visar samma optiska profil. De prover som renas i NPG-tvätt- och rengöringsmedel (LMNG, DMNG, Cymal-6NG, Cymal-5NG) visar dock optiska profiler som tyder på en suboptimal bindningsmiljö för näthinne- med undantag för OGNG-provet, som gav samma optiska profil som DDM-provet.
Storlek-uteslutning kromatografi visade prov renhet och protein monodispersity.
SEC är ett effektivt och robust analysverktyg för utvärdering av proteinprover under beredning och screening. Det validerar provrenhet från det tidigare reningssteget samt proteinmolekylernas monodispersity. För rhodopsin och dess mini-Go-komplex tolkades provkvaliteten från absorptionskurvorna vid 280 nm och 380 nm (figur 3A). De 280 nm spår visade förekomsten av protein, och 380 nm spår visade förekomsten av nätinal. Alla signaler som förekommer i den tomma volymen (ca 8 ml när du använder denna kolumn) tillskrevs proteinaggregat. Resultaten visade därför att prover som utarbetats i det klassiska tvätt- och rengöringsmedelt befann sig i ett monodispersetillstånd med undantag för C9G, där en del av aggregatet uppträdde. Däremot innehöll prover som utarbetats med hjälp av tvättmedel av NPG-typ mycket mer aggregat än C9G-provet. LMNG och Cymal-6NG ledde till den mest aggregerade bildandet, men mindre aggregat observerades i DMNG och Cymal-5NG. Undantaget var OGNG, som visade en liknande profil som DDM. Proteinaggregat som eluerade vid void-volymen hade också sämre retinalbeläggning, vilket framgår av Förhållandet A280/A380 som hade ökat jämfört med toppen vid retentionsvolymen på ~12,9 ml motsvarande 135 kDa. En annan funktion vi observerade var att både rhodopsin och rhodopsin-mini-Go eluted runt samma retention volym(figur 3B). Detta är föga förvånande, eftersom den uppenbara molekylvikten av tvättmedel-bundna rhodopsin var 120 kDa och rhodopsin-mini-Go 144 kDa. Vi kunde därför inte fastställa komplex bildning bara från SEC-data, så SDS-PAGE användes för att ytterligare analysera SEC-renade provet.
SDS-SIDA bekräftad komplex bildning
SDS-PAGE är en standardmetod för att identifiera proteinkomponenterna i ett prov. Koncentrerad rhodopsin (före SEC rening) analyserades av SDS-PAGE för att bekräfta dess renhet, och visade två band nära 37 kDa och ett utsmetad band över 50 kDa (figur 4A). De lägre två banden bekräftades senare ha olika N-glykosande tillstånd. Bandet över 50 kDa tolkades som aggregerade rhodopsin oligomers som framkallats av SDS-PAGE-provbufferten eftersom dessa aggregat inte observerades i SEC eller andra detektionsmetoder. Eftersom SEC-data inte kunde bekräfta komplex bildning analyserades SEC-elurerade fraktioner från rhodopsin-mini-Go-prover med Hjälp av SDS-PAGE. SDS-PAGE visade proteinband av både rhodopsin och mini-Go i alla tvättmedelsförhållanden, vilket tyder på att komplexet bildades oavsett valet av tvättmedel (figur 4B).
LC-MS-pektrometri identifierade N-glycosylationsmönstret i rhodopsin
Rhodopsin prover från både affinitet rening och SEC visade två proteinband som migrerade med en uppenbar molekylvikt på ca 37 kDa på en SDS-SIDA gel, som inte kunde separeras med SEC när du använder en 24-ml kolumn. Olika mönster av N-glykosylering på heterologly-uttryckt rhodopsin från HEK 293 GnTI- celler var den mest sannolika förklaringen. Därför testades två enzymer, PNGase F och Endo F1, för deras förmåga att deglycosylate rhodopsin. Från SDS-PAGE data, Endo F1 minskade molekylvikten av båda proteinband till en enda produkt, medan PNGase F matsmältningen fortfarande gav två populationer(figur 5A). De osmälta och Endo F1-behandlade proverna analyserades med LC-MS-pektrometri för att identifiera massorna av olika arter. Uppgifterna visade att rhodopsin som produceras i HEK 293 GnTI- celler innehöll antingen en eller två N-glykaner, med en skillnad i massa på 1014±1 Da. Endo F1-behandlade rhodopsin inte innehöll några N-glykaner och hade en massskillnad på 2027±1 Da jämfört med rhodopsin som innehåller två N-glykaner. Dessa resultat är förenliga med frånvaron av enzymet N-acetylglukosaminyltransferas jag i cellinjen som används för att uttrycka rhodopsin, vilket resulterar i att alla N-glykaner har strukturen GlcNAc2Man5, (massa 1014 Da).
Figur 1: Provberedning och karakterisering för tvättmedelsscreening. A)Beredning av rhodopsinprover i olika rengöringsmedel vid rening. (B)Metoder som används i protokollet: UV-VIS-spektroskopi, kromatografi för storlek(SEK), SDS-PAGE och flytande kromatografi-masspektrometri (LC-MS). (C) Experimentellt arbetsflöde för karakterisering av rhodopsin, rhodopsin-mini-Gooch deglycosylation produkt av rhodopsin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: UV-VIS spektroskopi av rhodopsin. (A)UV-VIS-spektra av rhodopsin. Spektra av mörk-state, 9-cis retinal-bundna rhodopsin visas i blå kurvor. Efter belysning en deprotonated 9-cis retinal och isomeriseras till alltransretinal, och spektraaven av upplyst rhodopsin visas som röda kurvor. Den kemiska strukturen hos varje tvättmedel visas som en invis. (B)Förhållandet mellan A280/A488 (blå stång) och A280/A380 (röd stapel) visar stabiliteten hos rhodopsin i mörkt tillstånd respektive ljustillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Storleksuteslutningskromatografiprofiler av rhodopsin och rhodopsin–mini-Go komplex renad i 10 olika rengöringsmedel. (A) Den vänstra panelen visar SEC-profilerna av prover renade i de klassiska tvättmedelen. Den högra panelen representerar SEC-profilerna för prover renade i NPG-typtvättmedel. Profilen för standardmarkörproteinerna visas som överlagring tillsammans med DDM-provet. Tolkningen av toppprofilerna visas för DMNG, med det ideala scenariot (inga aggregat) sett för DDM, DM, Cymal-6, Cymal-5 och OGNG. b)Ogng-provets förstorade profil i retentionsvolymen på 12–14 ml. Alla prover analyserades med hjälp av en Superdex200 Ökning 10/300 GL kolumn. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 4: SDS-SIDA analys av rhodopsin och rhodopsin/mini-Go komplex. A)Rhodopsinprover renade i tvättmedel. Det utsmetade bandet över 50 kDa tillskrivs de aggregerade rhodopsinoligomers som induceras av SDS-PAGE-provbufferten. (B)SEC-renade prover av rhodopsin/mini-Go-komplex. Rhodopsin med 1 och 2 N-glycan och mini-Go avbildas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 5: Identifiering av glykosylering i rhodopsin. (A)SDS-SIDA analys av deglycosylated rhodopsin med PNGase F och Endo F1. (B)LC-MS-spektra av rhodopsin utan (övre panelen) och med deglycosylation av Endo F1 (nedre panelen). För att förbereda rhodopsin-mini-Go komplex för kristallisering, valde vi Endo F1 över PNGase F eftersom Endo F1 levererade en enda homogen art av rhodopsin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Tvättmedel | Arbetskoncentration (%) | Kritisk micellekoncentration (%) |
| DDM (DDM) | 0.025 | 0.0087 |
| Dm | 0.12 | 0.087 |
| Cymal-6 | 0.05 | 0.028 |
| Cymal-5 | 0.2 | 0.12 |
| C9G (c9G) | 0.5 | 0.2 |
| LMNG (olika) | 0.01 | 0.001 |
| DMNG (olika) | 0.01 | 0.0034 |
| Cymal-6NG | 0.015 | Inte tillgängligt; bör vara lägre än 0,056 |
| Cymal-5NG | 0.02 | 0.0056 |
| OGNG (OLIKA) | 0.15 | 0.058 |
Tabell 1: Koncentration av tvättmedel spolning C.
| Tid (min) | Lösningsmedel A (%) | Lösningsmedel B (%) | Lösningsmedel C (%) | Flöde (ml/min) |
| 0 | 0 | 95 | 5 | 0.5 |
| 1 | 0 | 95 | 5 | 0.5 |
| 5 | 20 | 75 | 5 | 0.6 |
| 25 | 85 | 10 | 5 | 0.6 |
| 26 | 90 | 5 | 5 | 0.6 |
| 30 | 90 | 5 | 5 | 0.6 |
Tabell 2: Parametrar för kolumnelution.
Discussion
Framgången i proteinkristallisering är starkt beroende av proteinprovet, särskilt membranproteiner och deras komplex på grund av den komplikation som orsakas av rengöringsmedel. Denna rapport visar tvättmedel screening och utvärdering av provkvalitet för GPCR-mini-G protein signalering komplex. En mängd olika metoder har använts i stor utsträckning för att studera den biokemiska egenskapen hos membranproteiner, till exempel termostabilitetsanalys med fluorescerande färgämnen16,,17, bindningsanalys för att upptäcka komplex bildning genom att mäta förändringen i tryptofanfluorescenssignal18 eller resonansenergiöverföringen med biosensorer19. De kemiska miljöer som används i dessa metoder skiljer sig dock helt från de för att förbereda ett kristalliseringsprov, antingen proteiner är på tusen gånger lägre koncentration för fluorescensbaserad mätning, eller proteiner bäddas in i lipidbilayers eller i ett fast tvättmedelstillstånd. I det här protokollet standardiseras de använda metoderna också i storskalig provberedning före kristallisering. Därför kan de optimerade parametrarna enkelt överföras för kristalliseringsskala förberedelse utan ytterligare större screening och optimering.
Syftet med detta protokoll är att optimera beredningen av ett stabilt och homogent GPCR-mini-G proteinkomplex för ångdiffusionskristallisering och strukturbestämning av röntgenkristallografi. Protokollet integrerar en uppsättning metoder för att kvalitativt utvärdera effekterna av tvättmedel och deglycosylation under beredningen av rhodopsin-mini-Go-komplexet. Rhodopsin vid inaktivt tillstånd och ljusaktiverat tillstånd bundet med och utan transducinpeptid har kristalliserats när renas i tvättmedel octyl glukosid (C8G)20,21,22 och C9G23,24. Som rhodopsin-mini-Go komplex renas i C8G och C9G inte gav kristaller (data visas inte), utforskade vi sedan ett bredare utbud av andra tvättmedel med hjälp av den strategi som beskrivs(figur 1). Genom att dra nytta av ljuskänslighetrhodopsin, kan vi mycket väl följa reconstitution av retinal vid våglängder än 280 nm. I både UV-VIS spektroskopi och SEC, upptäckte vi retinal på antingen 380 nm eller 488 nm. De flesta membranproteiner har dock inte en sådan bekväm kromofor att följa funktionaliteten under rening. Andra alternativ skulle vara att göra en ligand detekterbar genom att lägga till en ljus-detekterbar kromofor eller genom att använda radioligand-bindande och termiska skift analyser25.
Rhodopsin har en molekylvikt på 40 kDa. På grund av massan av tvättmedel det binder, dess uppenbara molekylvikt på SEC är ca 120 kDa. Det är därför ingen överraskning att bindningen av mini-Go (24 kDa) inte lätt upptäcktes på SEC, eftersom detta skulle kräva differentiering av proteiner med uppenbara massor av 120 kDa och 144 kDa. Analys av SEC-fraktioner av SDS-PAGE användes därför för att bekräfta provrenhet och komplex bildning. Även om SEC-profiler visar en tydlig förskjutning vid komplex bildning, rekommenderas det fortfarande att utföra SDS-PAGE-analys för att bekräfta den komplexa bildningen med korrekta bindningspartner snarare än andra co-purified proteinföroreningar.
Både rhodopsin och mini-Go renades i milligram mängder, vilket gjorde det möjligt att använda låg känslighet upptäckt av komplex, såsom UV-VIS absorption under SEC och Commassie Blue färgning av SDS-SIDA geler. Om proverna är begränsade bör känsligare detektion användas, såsom en LC-renare utrustad med en fluorescensdetektor för att spåra tryptofansignaler från proteinet (280 nm excitation, 350 nm emission) och silverfärgning för SDS-PAGE-geler. Ett annat tillvägagångssätt skulle vara att smälta ett fluorescerande protein, såsom grönt fluorescensprotein (GFP) till proteinet av intresse, vilket också skulle möjliggöra detektion även under proteinuttryck26 men det bör tas bort före kristallisering.
Det är viktigt att se till att det renade proteinet också är fritt från heterogenitet som härrör från varierande PTMs. I det fall som beskrivs här, de två populationer av rhodopsin observerats på SDS-SIDA geler karakteriserades som har antingen en eller två N-glykaner. Variabel modifiering av ett protein skulle potentiellt förhindra bildandet av väl diffracting kristaller, så vi därför deglycosylated rhodopsin. Endoglycosidase Endo F1 var den mest effekt endoglycosidase testade och behandling ledde till en enda art av unglycosylated receptor, medan PNGase F endast delvis bort glykanerna på rhodopsin och resulterade i en blandning av rhodopsin helt unglycosylated eller med en N-glycan kvar. Rhodopsin utan deglycosylase behandling har framgångsrikt kristalliseras3,27,28, och N-glycan på rhodopsin Asn15 är viktigt att bilda kristall kontakt i dessa fall. När det gäller rhodopsin-mini-Goär det nödvändigt att ta bort N-glykaner av Endo F1 för att få kristaller. Det finns ingen standardiserad regel att deglycosylate proteiner av intresse före kristallisering, men avlägsnande av heterogena PTMs bör övervägas när proteiner misslyckas med att kristallisera efter omfattande kristallisering prövningar.
De data och den metod som beskrivs här vägledde oss att välja OGNG som det mest föredragna tvättmedlet för kristallisering av rhodopsin-mini-Go-komplexet på grund av dess lilla micellestorlek och dess förmåga att stabilisera komplexet. Vi använde också Endo F1 för att säkerställa att renad rhodopsin var en homogen art. Kristaller erhölls därefter och vi bestämde kristallstrukturen till ~3.1 Å4, vilket bara var den tredje kristallstrukturen i ett GPCR-G proteinsignaleringskomplex14,29.
För membranproteiner bundna med och utan partnerprotein bör de betraktas som två olika proteiner. Ett protein i olika funktionella tillstånd har olika konformationer och ligger på olika energinivå. Därför rekommenderas att förbereda protokollet för varje funktionellt tillstånd som parameter för inaktivt tillstånd kanske inte är helt överförbar till det aktiverade tillståndet. För att inte heller tala om förändringen i proteinegenskapen kompliceras av att binda ett partnerprotein. Protokollet använder metoder som är standardiserade för att förbereda ett kristalliseringsprov för att förbereda inaktivt membranprotein i olika rengöringsmedel, följt av proteinaktivering och komplex bildning, och för att karakterisera proteinkvaliteten. Således kan detta protokoll lätt generaliseras till andra membranproteiner och deras komplex för strukturstudier med mindre modifiering.
Disclosures
CGT är konsult och medlem av Sosei Heptares vetenskapliga råd. Alla andra författare har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar prof. Dr. Gebhard F. X. Schertler för hans långsiktiga stöd i detta projekt, Dr Roger J.P. Dawson och Hoffmann La Roche för stöd i cellkultur. Detta arbete sponsrades av Swiss National Science Foundation (bidrag 210030_153145 och 310030B_173335 till GFXS) och finansiering till CGT från Europeiska forskningsrådet (EMPSI, 339995) och Medical Research Council (MRC U105197215). FP erkänner ETH Zürich genom National Center of Competence in Research Molecular Ultrafast Science and Technology (NCCR MUST) och ETH Femtosecond och Attosecond Science and Technology (ETH FAST) program. FP, JM, AB och CJT erkänner långsiktigt ekonomiskt stöd från Paul Scherrer-institutet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1D4 peptide | Peptide2.0 | Under request | |
| 9-cis retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
| Autosampler A-900 | GE Healthcare | Discontinued | |
| C9G | Anatrace | N324 | |
| cOmplete, EDTA-free protease inhibitor coctail | Roche | 5056489001 | |
| Cymal-5 | Anatrace | C325 | |
| Cymal-5NG | Anatrace | NG325 | |
| Cymal-6 | Anatrace | C326 | |
| Cymal-6NG | Anatrace | NG326 | |
| DDM | Anatrace | D310 | |
| DM | Anatrace | D322 | |
| DMNG | Anatrace | NG322 | |
| Econo column | Bio-Rad | 7372512 | |
| Ettan LC | GE Healthcare | Discontinued | |
| FRAC-950 | GE Healthcare | Discontinued | |
| HPLC Water 2795 Separation Module | Waters AG | 720000358EN | |
| InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | |
| LCT Premier mass spectrometer (ESI-TOF) | Waters AG | - | |
| LMNG | Anatrace | NG310 | |
| Monitor UV-900 | GE Healthcare | 18110835 | |
| Nanodrop 1000 | Witec AG/ThermoFisher | Discontinued | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel 1.0 mm, 15 well | ThermoFisher | NP0323BOX | |
| NuPAGE MES SDS buffer (20x) | ThermoFisher | NP0002 | |
| OGNG | Anatrace | NG311 | |
| PAGEr Minigel Chamber | Lonza | 59905 | |
| Reprosil 200 C18-AQ column | Morvay Analytik GmbH | #s1503 | |
| Superdex 200 Increase GL column | GE Healthcare | 28990944 | |
| Tabletop centrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000413 | |
| Ultracentrifuge Optima XE-100 | Beckmann Coulter | A94516 | |
| ULTRA-TURRAX T25 | IKA WERKE | 0003725003 | |
| UV-VIS spectrophotometer | Shimadzu | UV-2401PC | |
| Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector | Waters AG | - |
References
- Tate, C. G. Practical considerations of membrane protein instability during purification and crystallisation. Methods in Molecular Biology. 601, Clifton, N.J. 187-203 (2010).
- Lebon, G., Bennett, K., Jazayeri, A., Tate, C. G. Thermostabilisation of an agonist-bound conformation of the human adenosine A(2A) receptor. Journal of Molecular Biology. 409 (3), 298-310 (2011).
- Deupi, X., et al. Stabilized G protein binding site in the structure of constitutively active metarhodopsin-II. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (1), 119-124 (2012).
- Tsai, C. -J., et al. Crystal structure of rhodopsin in complex with a mini-G o sheds light on the principles of G protein selectivity. Science Advances. 4 (9), (2018).
- Carpenter, B., Tate, C. G. Engineering a minimal G protein to facilitate crystallisation of G protein-coupled receptors in their active conformation. Protein Engineering Design and Selection. 29 (12), 583-594 (2016).
- Chae, P. S., et al. Maltose-neopentyl glycol (MNG) amphiphiles for solubilization, stabilization and crystallization of membrane proteins. Nature Methods. 7 (12), 1003-1008 (2010).
- Loll, P. J. Membrane proteins, detergents and crystals: what is the state of the art. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 70 (12), 1576-1583 (2014).
- Chae, P. S., et al. Glucose-neopentyl glycol (GNG) amphiphiles for membrane protein study. Chemical communications. 49 (23), Cambridge, England. 2287-2289 (2013).
- Standfuss, J., Xie, G., Edwards, P. C., Burghammer, M., Oprian, D. D., Schertler, G. F. X. Crystal structure of a thermally stable rhodopsin mutant. Journal of Molecular Biology. 372 (5), 1179-1188 (2007).
- Kaushal, S., Ridge, K. D., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin: the role of asparagine-linked glycosylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (9), 4024-4028 (1994).
- Molday, L. L., Molday, R. S. 1D4: a versatile epitope tag for the purification and characterization of expressed membrane and soluble proteins. Methods in Molecular Biology. 1177 (604), Clifton, N.J. 1-15 (2014).
- Carpenter, B., Tate, C. G. Expression and Purification of Mini G Proteins from Escherichia coli. Bio-Protocol. 7 (8), (2017).
- Grueninger-Leitch, F., D'Arcy, A., D'Arcy, B., Chène, C. Deglycosylation of proteins for crystallization using recombinant fusion protein glycosidases. Protein Science. 5 (12), 2617-2622 (1996).
- Rasmussen, S. G. F., et al. Crystal structure of the β2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477 (7366), 549-555 (2011).
- Loginova, M. Y., Rostovtseva, Y. V., Feldman, T. B., Ostrovsky, M. A. Light damaging action of all-trans-retinal and its derivatives on rhodopsin molecules in the photoreceptor membrane. Biochemistry (Moscow). 73 (2), 130-138 (2008).
- Alexandrov, A. I., Mileni, M., Chien, E. Y. T., Hanson, M. A., Stevens, R. C. Microscale Fluorescent Thermal Stability Assay for Membrane Proteins. Structure. 16 (3), 351-359 (2008).
- Sonoda, Y., et al. Benchmarking Membrane Protein Detergent Stability for Improving Throughput of High-Resolution X-ray Structures. Structure. 19 (1), 17-25 (2011).
- Maeda, S., et al. Crystallization scale preparation of a stable GPCR signaling complex between constitutively active rhodopsin and G-protein. PloS One. 9 (6), 98714 (2014).
- Boute, N., Jockers, R., Issad, T. The use of resonance energy transfer in high-throughput screening: BRET versus FRET. Trends in Pharmacological Sciences. 23 (8), 351-354 (2002).
- Singhal, A., Guo, Y., Matkovic, M., Schertler, G., Deupi, X., Yan, E. C. Y. Structural role of the T 94 I rhodopsin mutation in congenital stationary night blindness. EMBO Report. 17 (10), 1-10 (2016).
- Choe, H. -W., et al. Crystal structure of metarhodopsin II. Nature. 471 (7340), 651-655 (2011).
- Mattle, D., et al. Ligand channel in pharmacologically stabilized rhodopsin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (14), 3640-3645 (2018).
- Okada, T., Fujiyoshi, Y., Silow, M., Navarro, J., Landau, E. M., Shichida, Y. Functional role of internal water molecules in rhodopsin revealed by X-ray crystallography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (9), 5982-5987 (2002).
- Blankenship, E., Vahedi-Faridi, A., Lodowski, D. T. The High-Resolution Structure of Activated Opsin Reveals a Conserved Solvent Network in the Transmembrane Region Essential for Activation. Structure. 23 (12), 2358-2364 (2015).
- Magnani, F., et al. A mutagenesis and screening strategy to generate optimally thermostabilized membrane proteins for structural studies. Nature Protocols. 11 (8), 1554-1571 (2016).
- Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), London, England: 1993 673-681 (2006).
- Standfuss, J., et al. The structural basis of agonist-induced activation in constitutively active rhodopsin. Nature. 471 (7340), 656-660 (2011).
- Singhal, A., et al. Insights into congenital stationary night blindness based on the structure of G90D rhodopsin. EMBO reports. 14 (6), 520-526 (2013).
- Carpenter, B., Nehmé, R., Warne, T., Leslie, A. G. W., Tate, C. G. Structure of the adenosine A(2A) receptor bound to an engineered G protein. Nature. 536 (7614), 104-107 (2016).
