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Genetics

实验进化方法中疟原虫介导抗生素耐药性的定量化

doi: 10.3791/60749 Published: December 14, 2019
* These authors contributed equally

Summary

我们的实验方法提供了一个策略,以跟踪质粒丰度和抗生素耐药性随着时间的推移在细菌种群。

Abstract

疟原虫作为微生物种群中横向基因转移和附属基因功能的储存器,在微生物生态学和进化中起着重要作用。在快速变化的环境中(如抗生素暴露波动)尤其如此。我们最近表明,质粒在大肠杆菌中维持抗生素抗性基因,而对质粒的存在没有阳性选择。在这里,我们描述了一个实验系统,允许在长期进化实验中同时遵循质粒基因型和表型。我们使用分子技术设计了一个模型质粒,随后引入大肠杆菌宿主的实验进化批处理系统方法。随着时间的推移,我们采用大肠杆菌种群的复制电镀,同时量化抗生素耐药性持久性,从而跟踪质粒频率。此外,通过通过质粒刻痕和阿加辛胶质电泳分析质粒多虫形成程度,监测宿主细胞中质粒的组成。这种方法不仅使我们能够可视化进化质粒的基因组大小,而且能够直观地显示其拓扑形态——这是质粒遗传非常重要的一个因素。我们的系统将分子策略与传统微生物学方法相结合,为长期跟踪细菌种群中的质粒提供了一套设置。该方法可用于未来对多种移动遗传元素的研究。

Introduction

疟原虫是循环的、自我复制的遗传元素,在原核生物中无处不在。它们是横向基因转移的病原体,因为它们可以在微生物种群之间转移特征,因此被认为在微生物进化中起着重要作用。疟原虫是在短时间内迅速适应生长限制条件的驱动力(例如,在抗生素或杀虫剂1的情况下),并负责向其他生活方式的长期过渡(例如,病原性出现2)。质粒对基因转移的影响最显著的例子,记录在暴露于抗生素水平波动水平的生态系统中,如医疗诊所或工业农场3。由于强烈的阳性选择,许多质粒编码为抗菌素耐药性基因,并经常发现赋予其细菌宿主多重抗药性。疟原虫能够在种群或细菌物种之间迁移,从而迅速繁殖多种抗菌素耐药性。在非选择性条件下,质粒对细胞不是必须的,甚至通常被称为寄生元素。然而,质粒在自然界中无处不在,其进化与细菌染色体的进化高度交织在一起。质原体在自然环境中的持久性(波动和非选择性)仍然缺乏理解,但它对于我们了解抗生素耐药性基因在自然界中的持久性非常重要。

实验进化是研究微生物种群的有力工具实验进化表明,对质粒维持进行强有力的选择会导致质粒或宿主染色体的补偿性(即适应性)进化,从而降低质粒的健身成本,进而促进质粒丰度(即质粒持久性)5、6、7因此,随着时间的推移,在质粒-宿主相互作用之后,可能揭示出两种元素适应的重要机制。此外,实验进化使人们能够量化在不同条件下,在8、9、10条件下,一段时间内携带质粒的细胞的丰度。

在进化实验中,疟原体持久性可以通过几种策略进行监测,包括荧光活细胞分拣(FACS)11、定量PCR(qPCR)11或基于培养的方法的流式细胞测定。流式细胞测量需要FACS机器,并在质粒上引入一个可检测的(荧光)标记基因,如绿色荧光蛋白(GFP)。然而,GFP表达可能改变几个细胞性质,并进一步影响细胞12中的质粒位置,进而影响细胞分裂过程中的质粒遗传。qPCR 测量质粒丰度的方法可能因质粒拷贝数而产生很大偏差,该数量可能随着细菌生长阶段和随时间而有很大差异13。最后,基于培养和电镀的方法需要引入一个可选择的标记基因。这可能是一个抗生素抗药性基因,它通常编码在天然质粒上;因此,不需要基因操作。抗生素耐药性之后可能采用传统的仿制电镀方法。因此,为了研究天然质粒动力学,复制电镀非常适合监测质粒编码的抗生素抗性14。

为了可视化质粒分子(例如,评估质粒大小),可以采用几种方法。使用基于PCR的方法可以扩增整个质粒。然而,这需要设计特定的引种,这在进化实验中可能具有挑战性,因为质粒序列可能会随时间而改变。此外,由于PCR引基器有多个结合位点,因此很难在基于PCR的方法中扩增质粒多子体。多体质粒分子在质粒复制终止后或通过质粒分子的重组而出现,并且大多朝向头对尾15。质粒可视化的另一种方法将质粒分子的酶消化与DNA内分酶相结合,DNA内分酶要么切开,要么与阿加罗斯凝胶电泳分析一起,将质粒DNA链切开或刻痕。不同尺寸的相同质粒(例如,单体与多体体)会产生不同的凝胶动员,在可视化质粒分子时可以观察到。这种方法能够可视化和量化不同的质粒构样(即多面化状态)。质粒构象可用作质粒稳定性的指标,因为质粒多体体在细胞分裂16期间经常丢失。

在最近的一项工作中,我们跟踪了质粒的持久性,这些条件对质粒丰度没有选择性(即,没有抗生素选择)。我们比较了两种不同温度(20°C和37°C)和三个种群(即稀释率)的质粒持久性。应用各种稀释率或种群瓶颈,可以调查种群规模对细菌和质粒进化的影响。根据我们的研究结果,我们建议质粒可以对其细菌宿主保持中性,并可能在没有任何选择压力的情况下形成稳定性8。进化的质粒稳定性通过减少质粒多虫形成8而得到。

在这里,我们提出了一个方案,用于定量质粒持久性和研究质粒进化在抗生素耐药性基因的维持。该方法有几个步骤,包括将抗生素耐药性基因插入到模型质粒(使用自然抗药性质粒时可以省略),然后使用实验进化来评估质粒持续存在的可能性在非选择性条件下,同时使用复制电镀确定质粒频率动态,并通过可视化分析质粒基因组。此处描述的方案旨在研究质粒的进化和持久性,但它也可用于跟踪染色体抗性基因(或其他标记基因)随时间的进化。

Protocol

1. 构建携带抗生素抗药性基因的质粒模型

注:大肠杆菌菌株K-12 MG1655在所有实验中用作模型有机体(DSM No. 18039,德国微生物和细胞培养集合,DSMZ)。大肠杆菌DH5®17菌株在质粒结构过程中使用。

  1. PCR通过PCR放大您选择的质粒主干,并扩增包括启动子区域在内的抗性基因(图1)。
    1. PCR使用高保真聚合酶和寡核苷酸pBBR1_for(5'-GCGGCCACCCTCTGCT-3')和pBBR1_rev(5'-TACGCGCGCGCGCGCGCCCC-3')在质粒模板pLC上放大质粒主干(GenBankc.no.MH238456)18.
    2. PCR扩增抗性基因nptII,包括原生Tn5启动剂19,使用高保真聚合酶和寡核苷酸nptII_gib_for(5'-GCGCCGATATATATATATATATATCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCGCCGCGCA-3')和nptII_gib_rev(5'-CGGGGCCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAGAAAAGAGAG-3)。nptII基因编码为新霉素磷酸转移酶,并赋予卡那霉素的抗药性。
      注:设计抗性基因的引源,其补充序列约为20 bp,与质粒主干进行融合。
  2. 使用您选择的套件清洁两个 PCR 片段。
  3. 将纯化抗生素抗性基因PCR产物(包括其启动子区域)加入纯化质粒骨干,并使用等温组装20将同源区融合,在50°C下60分钟。
  4. 将熔融产物电化到大肠杆菌DH5+菌株中。
    1. 在4°C和2.5 kV下,在2mm比色皿中引入2μL产品,从步骤1.3引入40μL电能电池。在1 mL的合温合意汤(LB)培养基中重新悬浮细胞。
    2. 将总体积转移到微电管,在37°C下在轨道摇床中以250rpm摇动孵育1小时,以允许在质粒上表达电阻标记。
    3. 含有适当抗生素(卡那霉素25微克/mL)的LB琼脂板上的细胞板100μL,用于选择抗生素抗性基因,从而选择携带质粒的细胞。向下旋转其余部分,去除上清液,将细胞重新悬浮在100 μL LB中,并在选择性琼脂板上固定。在37°C下孵育板24小时。
  5. 为了验证克隆,使用商业小型制备试剂盒通过碱性解结提取构建的质粒。
    1. 在室温下在12,000 x g下离心,收获5 mL的固定过夜培养物。在重新悬浮溶液中重新悬浮细胞,然后赖舍和中和细胞溶液。在12,000 x g下离心5分钟。
    2. 将上清液转移到试剂盒中提供的DNA结合柱上,用500μL洗涤溶液离心2倍洗涤柱两次,然后再用洗脱缓冲液洗脱柱膜。
    3. 对质粒执行桑格测序,以确认序列正确。
  6. 一旦质粒的有效性得到验证,电化质粒(现在pCON)到菌株大肠杆菌MG1655如上所述。这产生菌株大肠杆菌MG1655 pCON。

2. 监测不同条件下携带质粒的细菌

注:在两种温度(37°C和20°C)和三个种群瓶颈尺寸下,在非选择性条件下(LB介质)下进行质粒携带菌株的进化实验。实验设计用于研究各种条件下的质粒持久性。

  1. 设计一个进化实验,以随时间变化来跟踪质粒频率 (图2
    1. 在LB琼脂板上将构建的质粒携带菌株(大肠杆菌MG1655 pCON)板板,辅以抗生素(卡那霉素25微克/mL),并在37°C孵育过夜。
    2. 在每口井中准备 96 个深孔板,每口孔中具有 1 mL 的 LB 介质。作为细菌祖先,从独立井中的琼脂板中随机分离的菌落。在板摇架上以37°C和450rpm的速度孵育板24小时。制备祖传克隆的冷冻甘油库存。
    3. 第二天,根据实验设计,将8个复制种群转移到新的深井板中(图2)。培养物被稀释 1:100 (大瓶颈, L), 1:1,000 (中等瓶颈, M), 或 1:10,000 (小瓶颈, S) 的总体积 1 mL LB 使用 PBS 稀释.稀释的培养物在37°C和20°C孵育。
      注:控制 96 深孔板中的交叉污染非常重要。因此,使用棋盘板设计,使用无细菌LB介质中插气孔。在整个进化实验中使用此模式。
    4. 在37°C孵育的培养物每12小时转移一次,20°C的培养物每24小时转移一次。
      注:在每个传输事件中,将应用瓶颈大小处理,并在总共 98 次传输中重复进行串行传输。传输的数量将取决于读者的实验设计。
    5. 定期准备所有人群的冷冻甘油库存,每周2次。
  2. 通过复制电镀监测质粒频率 (图 3
    注:在进化实验中,从宿主的比例估计种群中携带质粒的细胞频率。复制电镀协议如图3所示。
    1. 为了确定进化实验期间种群中的质粒频率,固定培养物被连续稀释,并在非选择性LB琼脂板上镀上。根据每盘250-500个菌落的收率调整稀释。
      注:在电镀之前准备厚LB琼脂板(±30 mL琼脂)。
    2. 在实验中,镀层人群根据生长温度孵育一夜生长。
      注:菌落需要小,因此在37°C下孵育<24 h。
    3. 在一夜的生长后,使用手动或自动菌落计数站计算所有菌落,并计算培养物中细菌总种群大小。
      注:琼脂板边缘的菌落不应包含在细菌细胞总数中。
    4. 通过高压灭菌对棉绒的方形件(约20 x 20厘米)进行消毒。
      注:天鹅绒布需要100%棉才能高压灭。消毒后干燥布很重要。
    5. 对天鹅绒布进行灭菌后,将布放在圆块上,用金属环固定。避免皱纹至关重要。小心地将种植的菌落(琼脂朝下)放在固定天鹅绒布表面上。通过小心地按圆形敲击培养皿,确保所有菌落接触天鹅绒表面。
    6. 小心地取出 LB 琼脂板,并将一个辅以抗生素(卡那霉素 25 μg/mL)的选择性板放在天鹅绒布上。确保盘子接触所有的天鹅绒,仔细敲击培养皿,如前所述。之后,取出板。将盘子放在室温下,进行过夜生长。
    7. 第二天,评估LB琼脂板和选择性板。在选择性培养基上生长的菌落被计为质粒宿主(即抗生素耐药),而无菌落的菌落是无质粒的菌落,因此对抗生素没有抗药性(即,失去质粒)。这是通过将盘子放在彼此上,并比较生长(即标记任何丢失的殖民地)和计算两个板块上的菌群编号来完成的。这会产生在进化实验中失去质粒的细胞数量。
    8. 定期对整个进化实验重复此过程(例如,每 14 次传输)。

3. 使用凝胶电泳对质粒多体体的可视化

注:低拷贝质粒的质粒提取通常会导致宿主染色体DNA的污染,在可视化之前需要酶消化。

  1. 使用碱性解结从5 mL固定过夜细胞培养中提取质粒DNA,如步骤1.5所述。
  2. 之后,使用ATP依赖的DNase处理提取的质粒DNA,这种DNA只切割染色体DNA,以消除染色体DNA污染(见材料表)。在37°C孵育30分钟。之后,使用您选择的试剂盒清洁DNA。
  3. 要创建所有质粒合构体的开放圆分子(单体或多子体),使用刻痕酶(Nb.BsrDI)孵育质粒DNA样本,并在65°C孵育30分钟。
  4. 同时,要创建线性质粒分子(即,用于质粒大小比较),请使用您所选择的限制酶(例如 HindIII),将质粒切割一次。
    注:这导致线性DNA质粒单体。开放圆分子不会以线性方式迁移。
  5. 为了可视化质粒的大小和构象,电噬120分钟的刻痕和线性质粒DNA样本,在4.3 V/cm的1%(w/v)角质凝胶和1°TAE缓冲液中。样品被染色的米多里绿色和凝胶可视化在凝胶成像系统(见材料表)。使用 1 kbp 梯子。

Representative Results

在这里,我们提出了一种通过量化种群中的质粒持久性来研究质粒进化的方法。首先,我们展示如何构建携带大肠杆菌菌株MG1655 pCON的质粒,随后引入进化实验。其次,我们提出了一种直接的方法,以跟踪在不断演变的细菌种群中的质粒丰度。最后,我们展示了如何可视化质粒分子的大小和构象。

在我们以前的工作中我们使用所提出的方法进行了进化实验,研究在缺乏抗生素的情况下大肠杆菌中抗生素耐药性质粒的持续存在(图4)。我们的代表性结果显示,在37°C下,种群的进化和10-4的稀释率。在大量携带质粒的细胞之后,我们观察到携带质粒的宿主细胞的频率随时间而降低(图4)。我们的方法使我们能够发现质粒损失是凝聚质粒基因组结构的结果,该结构导致质粒不稳定,由抗性基因转录和质粒本身复制引起的冲突引起。可视化质粒分子使我们能够发现,这些冲突导致不稳定的质粒构象(即质粒多虫形成,图5)。尽管如此,我们观察到质粒稳定性的进化,没有接触抗生素(图4)。进化的稳定性通过质粒内在复制而传递,它消除了转录-复制冲突,导致稳定遗传质粒的形成。因此,我们的研究结果证明了重组和基因组扩增在遗传元素的适应性进化中的重要性。

Figure 1
图1:pCON的质粒设计。用于构建质粒 pCON 的克隆策略的原理表示。质粒主干(pBBR1)和抗生素耐药性基因(nptII)被异构体融合20扩增和融合。这产生质粒pCON和菌株MG1655pCON。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2:长期进化实验的设计。串行传输实验的原理表示。质粒携带(pCON)种群在选择性介质上镀层。祖先的殖民地是从板块中随机选择的,并引入串行转移系统。转移采用三种不同的稀释方法进行,以模拟不同规模的人口瓶颈。稀释是连续重复的。实验在两种温度机制中进行。通过复制电镀沿实验测量质粒-宿主频率。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3:复制电镀。细菌群的复制电镀中使用的步骤的原理表示。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图 4:一段时间内的代表性 pCON 频率。pCON 持久性显示为进化实验中宿主(代表性复制群体)的比例。对于98次转移,pCON质粒种群在非选择性条件下进化,稀释因子为10-4。所有携带质粒pCON的复制在种群中减少。之后,这些人群接触抗生素进行过夜孵育,并在非选择性条件下再次培养,以测试质粒稳定性进化。此图已由 Wein 等人8中修改,请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图5:质粒构象的代表性分析。模型质粒pCON的可视化。可视化是未经处理的质粒DNA直接提取,线性化质粒DNA,并处理与DN酶,只削减染色体DNA以及酶刻痕的DNA(即,开放圆质粒DNA)。线性化质粒表明,所有质粒的大小相同。去除染色体DNA和刻痕pCON揭示了二聚体和其他多聚体的存在。这个数字已由Wein等人8.8修改。请点击此处查看此图的较大版本。

Discussion

在此协议中,我们提出了一种将分子生物学、实验进化和DNA可视化技术相结合的方法,以研究质粒进化对细菌抗生素耐药性持久性的作用。虽然提出的方法结合了不同研究领域的方法,但所有应用技术都是简单的,可以在标准微生物实验室进行。

该协议中最重要的步骤包括构建模型系统应变,包括携带质粒基因型的基因验证。值得注意的是,许多质粒自然编码抗生素耐药性基因。因此,读取器可以省略协议的步骤 1,然后直接继续执行步骤 2。接下来,进化实验应包括复制种群的随机设计,以便结果不会因复制种群在深井板块中的位置而产生偏差。此外,在进化实验中仔细进行序列转移和稀释步骤尤为重要,因为污染会伪造结果。最后,复制电镀应非常小心。较大的菌落大小可能是一个问题,但可以通过孵育板小于24小时来避免。同样,一个板上的菌落数量可能会偏向复制电镀结果。因此,在电镀和复制之前,需要稀释种群。

我们方法的最大优点之一是无需重型设备即可轻松复制。此外,复制电镀遵循标记基因的另一个优点是,只评估活细胞,与流式细胞学或qPCR相反,其中死细胞可以被评估为活细胞。因此,复制电镀对质粒携带细胞的计数引入的偏差较小。尽管如此,复制电镀的一个限制可能是在一次实验中可以评估的体量(即细胞数)。

利用我们的方法,我们最近已经表明,质粒稳定性进化能增强细菌中抗生素耐药性基因的持久性。因此,我们开发了一种方法,作为跟踪质粒介导的抗药性持久性的工具,这种抗药性对于长期跟踪耐药性非常重要,特别是在没有抗生素的条件下。

Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

我们感谢戈尔·马加良提供创造性的支持和技术援助。这项工作得到了ZMB青年科学家资助2017/2018(授予TW)和DFG重点计划1819(授予No.DA1202/2-1 授予道德)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-deep-well plates Starlab
96-deep-well plates Roth EN07.1 2 ml, square
96-deep-well plates (cryo) Starlab E1702-8400 Micro-Dilution Tube System
Colony counter Stuart SC6+
Cotton velvet drapery shop 100 % cotton required
Electrophoresis chamber BioRad Agarose gel electrophoresis
Electrophoresis power supply BioRad 1645070 Agarose gel electrophoresis
Electroporation cuvettes BioRad 1652089 0.1 cm
Electroporator BioRad 1652660
GeneJet Gel Extraction kit Thermo Fisher Scientific K0832 PCR fragment clean-up
GeneJet Plasmid Miniprep kit Thermo Fisher Scientific K0503 Plasmid extraction kit
Gibson Assembly New England Biolabs E2611S
Incubator Thermo Fisher Scientific 50125852
Incubator (plate shaker) Heidolph 1000
Incubator (shaker) New Brunswick Scientific Innova 44
Inoculating loops Sigma-Aldrich
Multi-channel pippetes Eppendorf 3125000052, 3125000028
Multi-channel pippetes Capp ME8-1250R
NanoDrop 2000/2000c Thermo Fisher Scientific ND2000
Oligonucleotides Eurofines
Petri dishes Sigma-Aldrich
Phusion Polymerase Thermo Fisher Scientific F533S
Pipettes Eppendorf 3123000012, 3123000098, 3123000055, 3123000063,
PlasmidSafe enzyme Epicentre 10059400
Reaction tubes Eppendorf 30125150
Replica block & metal ring VWR 601-3401 PVC cylinder 69 mm; ring 102cm
Resctriction enzymes New England Biolabs
Thermocycler BioRad T100

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References

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Wein, T., Stücker, F. T., Hülter, N. F., Dagan, T. Quantification of Plasmid-Mediated Antibiotic Resistance in an Experimental Evolution Approach. J. Vis. Exp. (154), e60749, doi:10.3791/60749 (2019).More

Wein, T., Stücker, F. T., Hülter, N. F., Dagan, T. Quantification of Plasmid-Mediated Antibiotic Resistance in an Experimental Evolution Approach. J. Vis. Exp. (154), e60749, doi:10.3791/60749 (2019).

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