Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

קוונפיקציה של פלמיד בתיווך עמידות לאנטיביוטיקה בגישת אבולוציה ניסויית

doi: 10.3791/60749 Published: December 14, 2019
* These authors contributed equally

Summary

הגישה הניסיונית שלנו מספקת אסטרטגיה לעקוב אחר שפע ועמידות לאנטיביוטיקה לאורך זמן באוכלוסיות חיידקית.

Abstract

פלמידים לשחק תפקיד מרכזי באקולוגיה מיקרוביאלית ואבולוציה ככלי רכב של העברה גנטית לרוחב ומאגרים של פונקציות גן אביזר באוכלוסיות מיקרוביאלית. זה במיוחד המקרה בסביבות המשתנה במהירות כגון חשיפה לאנטיביוטיקה תנודות. לאחרונה הראינו כי פלמידים לשמור על הגנים עמידות לאנטיביוטיקה es, coli ללא בחירה חיובית עבור הנוכחות פלביניים. כאן אנו מתארים מערכת ניסיונית המאפשרת בעקבות הגנוטיפ הפלשני והפנוטיפים בניסויים האבולוציה ארוכת טווח. אנו משתמשים בטכניקות מולקולריות כדי לעצב מודל פלבארמיד כי הוא הציג לאחר מכן לגישה ניסוי האבולוציה מערכת אצווה ב -E. coli מארח. אנו לעקוב אחר התדר פלאמצע לאורך זמן על ידי החלת ציפוי משוכפל של אוכלוסיות E. coli תוך כימות ההתמדה עמידות לאנטיביוטיקה. בנוסף, אנו מפקחים על היווצרות של פלמידים בתאי מארח על ידי ניתוח היקף היווצרות הפלסעון על ידי חותך פלמיד ואלקטרופורזה ג'ל הצמח. גישה כזו מאפשרת לנו להמחיש לא רק את גודל הגנום של הפלמידים מתפתחים אלא גם את הקשר הטופולוגי שלהם-גורם חשוב מאוד עבור הירושה פלמיד. המערכת שלנו משלבת אסטרטגיות מולקולריות עם גישות למיקרוביולוגיה מסורתית ומספק הגדרת לעקוב אחר הפלמידים באוכלוסיות חיידקי במשך זמן רב. הגישה המוצגת ניתן ליישם כדי ללמוד מגוון רחב של אלמנטים גנטיים ניידים בעתיד.

Introduction

פלמידים הם רכיבים גנטיים מעגליים, שמשכפלת את עצמם, שנמצאים בכל מקום ב-prokaryotes. הם סוכנים של העברה גנטית לרוחב, כפי שהם יכולים להעביר תכונות בין אוכלוסיות מיקרוביאלית, ולכן נחשבים לשחק תפקיד מרכזי באבולוציה של חיידקים. פלמידים הם נהגים של הסתגלות מהירה לתנאים הגבלת צמיחה במשך זמן קצר (למשל, בנוכחות אנטיביוטיקה או חומרי הדברה1) והם אחראים מעבר ארוך טווח למצבי חיים אחרים (למשל, הופעתה של פתוגניות2). הדוגמאות הבולט ביותר להשפעה של הפלמידים על העברת גנים מתועדים בתחומי האקולוגיות החשופים לרמות של אנטיביוטיקה, כגון מרפאות רפואיות או חוות תעשייתיות3. בשל בחירה חיובית חזקה, פלמידים רבים לקודד גנים התנגדות מיקרוביאלית ולעתים קרובות מוצאים להיוועץ ריבוי עמידות למארח החיידקי שלהם. פלמידים לאפשר הגירה בין אוכלוסיות או מינים חיידקיים, וכתוצאה מכך התפשטות מהירה של התנגדות מיקרוביאלית מרובים. תחת תנאים בלתי סלקטיבית הפלמידים אינם חיוניים לתא והם לעתים קרובות מתייחסים גם אלמנטים טפיליים. עם זאת, פלמידים הם בכל מקום בטבע האבולוציה שלהם הוא מאוד שזורים עם זה של כרומוזומים חיידקיים. התמדה בסביבות טבעיות (לא בררנית) נשארה מובנת בצורה גרועה, אך היא בעלת חשיבות גבוהה להבנת ההתמדה של גנים בעלי עמידות לאנטיביוטיקה בטבע.

האבולוציה הניסיונית היא כלי רב-עוצמה לחקר אוכלוסיות מיקרוביאלית4. האבולוציה הניסיונית הוכיחה כי מרשים בחירה חזקה עבור תחזוקה פלמיד מוביל לפיצוי (כלומר, אדפטיבית) האבולוציה של הפלבין או כרומוזום מארח כי מפחית את עלות הכושר פלמיד, בתורו, מקלה פלמיד שפע (כלומר, התמדה פלמיד)5,6,7. לפיכך, בעקבות המגע הפלבין-מארח לאורך זמן, עשוי לחשוף מנגנונים חשובים של הסתגלות של שני האלמנטים. יתר על כן, האבולוציה ניסיוני מאפשר לכמת את השפע של התאים הסוחבים באמצע לאורך זמן בתנאים שונים8,9,10.

התמדה פלסטלינה בניסויים האבולוציה ניתן לפקח על ידי מספר אסטרטגיות כולל הזרימה cy, המופעל על ידי מיון התא מופעל פלורסנט (FACS)11, PCR כמותי (qpcr)11, או בשיטות מבוססות-טיפוח. Cy, הזרמת מחשבים דורשת מכונת FACS והמבוא של גן סמן (פלורסנט) לזיהוי, כגון חלבון פלורסנט ירוק (GFP), על הפלסמיד. עם זאת, ביטוי GFP עשוי לשנות מספר תכונות הסלולר ובנוסף להשפיע על מיקום הפלבמיד בתא12, אשר בתורו עשוי להשפיע על הירושה פלמאלית במהלך חלוקת התא. הגישה qPCR כדי למדוד את השפע פלמיד עשוי להיות מוטה מאוד על ידי מספר העתק פלאמצע, אשר יכול להשתנות מאוד לאורך שלב הצמיחה חיידקים ולאורך זמן13. לבסוף, גישה מבוססת תרבות וציפוי דורש הקדמה של גן סמן לבחירה. זה יכול להיות גן עמידות לאנטיביוטיקה, אשר מקודד לעתים קרובות על פלמידים טבעיים; לכן, אין צורך בתפעול גנטי. עמידות לאנטיביוטיקה עשויה להיות לאחר הגישה המסורתית ציפוי משוכפל. כך, כדי ללמוד דינמיקה הטבעי פלמיד, ציפוי עותק משוכפל הוא מתאים היטב כדי לפקח על העמידות לאנטיביוטיקה המקודדים באמצע14.

כדי להמחיש מולקולות פלסטיות (למשל, כדי להעריך את גודל הפלביניים) ניתן להחיל כמה שיטות. כל הפלסטלינה יכולה להיות מוגברת. באמצעות גישה מבוססת PCR עם זאת, זה דורש עיצוב של התחל הספציפי, אשר עשוי להיות מאתגר במהלך ניסוי האבולוציה, כי הרצף הפלממדי עשוי להשתנות לאורך זמן. בנוסף, קשה להגביר את הקושי הפלסטי בגישה המבוססת על PCR בשל אתרי מחייב מרובים עבור ה-PCR התחל. מולקולות הפלסטיות של מולטימאריק יכול להופיע בעקבות הפסקת השכפול של הפלזמה או באמצעות שילוב מחדש של מולקולות פלאביניים ומכוונות בעיקר מראש אל הזנב15. גישה נוספת של ויזואליזציה פלמיד משלבת את העיכול אנזימטי של מולקולות פלמטיות על ידי ה-DNA end, כי או קליב או ניק הגדיל ה-DNA באמצעות ניתוח אלקטרופורזה ג'ל הג. הפלסטלינה זהה במידות שונות (למשל, ונומרים vs. multimers) תוצאות mobilities ג'ל שונים כי ניתן לצפות בעת המחשה מולקולות פלביניים. גישה זו מאפשרת הדמיה וכימות של הקונמציות הפלסטיות השונות (כלומר, מדינות המולטיפיקציה). היווצרות הפלסטלינה עשוי לשמש מחוון של יציבות פלביניים, כמו לעתים קרובות לאיבוד פלזמה במהלך חלוקת התא16.

בעבודה שנעשתה לאחרונה, עקבנו אחר התמדה בתנאים שאינם סלקטיבית עבור השפע הפלסטי (כלומר, ללא ברירה אנטיביוטית). השוונו את ההתמדה בשני טמפרטורות שונות (20 ° c ו-37 ° c) ושלושה מידות אוכלוסיה (כלומר, שיעורי דילול). החלת שיעורי דילול שונים, או צווארי בקבוק באוכלוסיה, מאפשרת חקירת ההשפעה של גודל האוכלוסיה על אבולוציה חיידקית ופלקטאני. בהתבסס על התוצאות שלנו, אנו מציעים כי פלמידים יכול להיות נייטרלי למארח החיידקי שלהם יכול להתפתח יציבות ללא כל לחץ בחירה8. היציבות התפתחה במרכז הפלזמה מלווה בהפחתת היווצרות פלסעון8.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור כימות של התמדה בדיקה וחקירה של האבולוציה פלביניים בנוגע לתחזוקת גנים עמידות לאנטיביוטיקה. השיטה יש מספר שלבים, כולל החדרת גן עמידות לאנטיביוטיקה על המודל הפלמיד (אשר ניתן להשמיט בעת שימוש בפלסטלינה טבעי ההתנגדות), ואחריו השימוש של האבולוציה ניסיוני כדי להעריך את הפוטנציאל של הפלביניים להתמיד תחת תנאים לא סלקטיבית תוך קביעת הדינמיקה בתדר הפלביניים לאורך זמן באמצעות ציפוי העתק, וניתוח של הגנום פלביניים על ידי הדמיה. הפרוטוקול המתואר כאן נועד לחקור את האבולוציה וההתמדה של הפלמידים, אבל זה יכול להיות גם מיושם על מנת לעקוב אחר האבולוציה של גנים ההתנגדות הרומוזומלית (או גנים סמן אחרים) לאורך זמן.

Protocol

1. בניית פלאמיד דגם הנושא גן עמידות לאנטיביוטיקה

הערה: הנבג מהווה את האורגניזם הMG1655 של ה-K-12 שימש כיצור מודל בכל הניסויים (DSM No. 18039, אוסף גרמני של מיקרואורגניזמים ותרביות תאים, DSMZ). המתח E. coli DH5α17 שימש במהלך בנייה פלביניים.

  1. ה-PCR מגבירים את עמוד השדרה הפלמאני על פי בחירתך ומגבירים את גן ההתנגדות כולל אזור המקדם של ה-PCR (איור 1).
    1. PCR הגבר את עמוד השדרה הפלטמאני באמצעות פולימראז איכותי והאוגמונואודים pBBR1_for (5 '-GCGGCCACCTGGCT-3 ') וpBBR1_rev (5 '-TACCGGCGCGGCAGCGTGACCC-3 ') על התבנית היחידה לpLC (GenBank acc. לא. MH238456)18.
    2. PCR הגבר את גן ההתנגדות Nptii כולל את Tn5 יזם המקורי19 באמצעות פולימראז באיכות גבוהה ו-olig, מNPTII_GIB_FOR (5 '-GCGCCGGTAGATCTGCTCATGTTTGAAGCTTCACGCTGCCGCA-3 ') ו-nptII_gib_rev (5 '-CGGTGGCCGCCAAAAAGGCCATCCGTCAGGTCAGAAGAACTCGT-3 '). הגן Nptii מקודד neomycin פוספוליאז ומעביר התנגדות לקאנאמיצין.
      הערה: לעצב את התחל של גן ההתנגדות עם כ 20 bp של רצף משלים לעמוד השדרה הפלמאני שהוא יהיה מחובר.
  2. נקה את שני שברי ה-PCR באמצעות ערכה לפי בחירתך.
  3. הצטרפות מוצר התנגדות לאנטיביוטיקה מטוהרים המוצר (כולל אזור המקדם שלה) לעמוד השדרה הטהור פלמיד ונתיך האזורים הומולוגיים באמצעות איזותרמי הרכבה20, ב 50 ° c עבור 60 min.
  4. אלקטרופורף את המוצר התמזגו לתוך המתח E. coli DH5α.
    1. הצג 2 μL של המוצר משלב 1.3 לתוך 40 μL של תאים אלקטרומוסמכים ב-2 מ"מ כימיקלים ב 4 ° c ו 2.5 kV. השהה את התאים מחדש ב-1 מ ל של מדיום (LB).
    2. העבר את אמצעי האחסון הכולל לצינור microfuge ו-דגירה 1 h ב 37 ° צ' לרעוד ב 250 rpm ב שייקר מסלולית כדי לאפשר את הביטוי של סמן ההתנגדות על הפלביניים.
    3. צלחת 100 μL של התאים בלוחות LB אגר המכיל את האנטיביוטיקה המתאימה (kanamycin ' 25 μg/mL) כדי לבחור את הגן עמידות לאנטיביוטיקה ובכך לבחור עבור התאים הנושאת פלבאמצע. ספין למטה את השאר, להסיר את supernatant, להשעות מחדש את התאים ב100 μL ליברות ולוחית על צלחת אגר בררני. מודאת לוחיות הרישוי ב-37 ° c עבור 24 שעות.
  5. כדי לאמת שיבוטים, לחלץ את הפלמידים שנבנו באמצעות הליזה אלקליין באמצעות ערכת מיני מסחרי הכנה.
    1. קציר 5 מ ל של תרבות לילה נייח על ידי תפרידו ב 12,000 x g בטמפרטורת החדר. השהה מחדש את התאים בפתרון מחדש, לאחר מכן lyse ונטרל את פתרון התא. צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 12,000 x g.
    2. העבר את supernatant אל העמודה איגוד ה-DNA המסופק בערכה ולשטוף את העמודה פעמיים עם 500 μL תפרידו פתרון כביסה 2x לפני משחרר את קרום הטור עם מאגר משחררי.
    3. בצעו רצף של הפלסמאמצע כדי לוודא שהרצף נכון.
  6. ברגע שתוקף הפלסמה מאומת, אלקטרופורף את הפלמיד (עכשיו pCON) לתוך המתח E. coli MG1655 כפי שמתואר לעיל. זה התשואות מאמץ E. coli MG1655 pcon.

2. ניטור הפלשבאמצע הנושא חיידקים בתנאים שונים לאורך זמן

הערה: הניסוי באבולוציה מתנהל עם זנים בעלי בעיות בתנאים לא סלקטיבית (LB media) בשני טמפרטורות (37 ° c ו-20 ° c) ושלושה גדלים של בקבוק צוואר. העיצוב הניסיוני משמש ללימוד התמדה בפלסמיד בתנאים שונים.

  1. תכנון של ניסוי האבולוציה כדי לעקוב אחר תדירות הפלביניים לאורך זמן (איור 2)
    1. צלחת בנוי פלפריאמצע הנושא את המתח (E. coli MG1655 pcon) על LB אגר צלחות שיושלם עם אנטיביוטיקה (kanamycin ' 25 μg/mL) ו-דגירה לילה ב 37 ° c.
    2. להכין 96 לוחות עמוקים עם 1 מ ל של LB בינונית בכל טוב. כמו האבות החיידקיים, לבחור שמונה מושבות מבודדים אקראית מלוחית אגר בבארות עצמאיות. מודקת את הצלחות ב 37 ° צ' ו 450 rpm על צלחת שייקר עבור 24 h. הכינו מלאי של גליצרול קפוא של שיבוטים אב קדמון.
    3. היום למחרת העבירו את שמונת האוכלוסיות ללוחות היטב החדשים בהתאם לתכנון הניסיוני (איור 2). התרבויות הם מדולל 1:100 (צוואר גדול, L), 1:1000 (צוואר בינוני, M), או 1:10000 (צוואר בקבוק קטן, S) בנפח כולל של 1 mL LB באמצעות PBS עבור דילול. התרבויות מדולל מודולות ב 37 ° c ו 20 ° c.
      הערה: חשוב מאוד לשלוט בזיהום הצולב בצלחת 96-הבאר העמוקה. כך, השתמש בלוח לוח שחמט על-ידי בארות מחוסן מפני העור עם חיידקים מדיום ליברות חינם. השתמש בדפוס הזה. דרך כל ניסוי האבולוציה
    4. התרבויות ב-37 ° c מועברות מדי 12 שעות בעוד שתרבויות ב -20 ° c מועברות כל 24 שעות.
      הערה: במהלך כל אירוע העברה מוחל הטיפול בגודל צוואר הבקבוק וההעברה הטורית חוזרת על סך של 98 העברות. מספר ההעברות יהיה תלוי בעיצוב הניסיוני של הקוראים.
    5. להכין מלאי של גליצרול קפוא של כל האוכלוסיות באופן קבוע, 2x בשבוע.
  2. ניטור תדר פלביניים על ידי ציפוי עותק משוכפל (איור 3)
    הערה: במהלך ניסוי האבולוציה, תדירות הצפיפות של התאים באוכלוסייה באוכלוסיה מוערכת מיחס המארחים. פרוטוקול ציפוי העותקים המשוכפלים מוצג באיור 3.
    1. כדי לקבוע את תדר הפלביניים באוכלוסייה במהלך ניסוי האבולוציה, תרבויות נייחים מדולל באופן סדרתי ומצופה על צלחות LB אגר ליברות. התאימו את הדילול בהתאם לתשואה של 250-500 מושבות לכל צלחת.
      הערה: להכין צלחות ליברות אגר עבה לפני ציפוי (~ 30 מ ל אגר).
    2. האוכלוסיות הציפוי מודשות לצמיחת לילה בהתאם לטמפרטורת הצמיחה שלהם בניסוי.
      הערה: המושבות צריכות להיות קטנות, ובכך להדגירה < 24 שעות ב 37 ° c.
    3. לאחר הצמיחה לילה, לספור את כל המושבות באמצעות מספר ידני או אוטומטי המושבה התחנה ולחשב את גודל האוכלוסיה החיידקית הכולל בתרבויות.
      הערה: המושבות בקצה של הצלחת אגר לא צריך להיכלל בספירת התאים החיידקיים הכולל.
    4. לעקר חתיכות מרובעות (~ 20 x 20 ס מ) של קטיפה כותנה על ידי אוטוקלינג.
      הערה: בד הקטיפה צריך להיות 100% כותנה כדי להיות אוטומטית. חשוב לייבש את הבד לאחר עיקור.
    5. לאחר עיקור של הבד הקטיפתי, הניחו את הבד על בלוק עגול ותקנו אותו בטבעת מתכת. חשוב להימנע מקמטים. מניחים בזהירות את הצלחת עם המושבות מבוגרים (אגר פונה למטה) על משטח בד קטיפה קבוע. ודא שכל המושבות נוגעות במשטח הקטיפה על-ידי הקשה בזהירות על צלחת פטרי באופן מעגלי.
    6. הסר בזהירות את הצלחת ליברות אגר ומקום צלחת סלקטיבית שיושלם עם אנטיביוטיקה (kanamycin ' 25 μg/mL) על הבד קטיפה. ודא כי הצלחת נוגעת בכל הקטיפה על ידי הקשה בקפידה על צלחת פטרי כפי שמתואר לפני. . לאחר מכן, הסר את הצלחת השאירו את הצלחות בטמפרטורת החדר לצמיחת הלילה.
    7. למחרת, הערכה הן את לוחית ליברות אגר ואת הצלחת סלקטיבי. המושבות לצמוח על התקשורת סלקטיבי נספרים כמו פלמיד המארחים (כלומר, עמידות לאנטיביוטיקה), בעוד כתמים ללא מושבה הם מושבות כי היו בחינם ולכן הם לא עמידים לאנטיביוטיקה (כלומר, איבד את הפלמיד). הדבר נעשה על-ידי הצבת הלוחות זה על זה והשוואת הצמיחה (כלומר, לסמן מושבות חסרות) ולספור את מספר המושבה על שתי הצלחות. זה מניב את מספר התאים שאיבדו את הפלסמיד במהלך ניסוי האבולוציה.
    8. חזור על הליך זה לאורך כל ניסוי האבולוציה באופן קבוע (לדוגמה, כל 14 העברות).

3. ויזואליזציה של פלסמיד באמצעות אלקטרופורזה ג'ל

הערה: הוצאת פלמידים מפלסטיק נמוך מובילה לעתים קרובות לזיהום באמצעות דנ א כרומוזום מארח שצריך להיות מתעכל לפני ההדמיה.

  1. לחלץ את ה-DNA מתוך 5 mL הנייח לילה התרבות התא באמצעות הליזה אלקליין כמתואר בשלב 1.5.
  2. לאחר מכן, לטפל ב-DNA המחולצים עם DNase ATP תלוי כי רק חותך דנ א כרומוזומלית להסיר זיהום DNA כרומוזומלית (ראה טבלת חומרים). מודקון ב 37 ° c עבור 30 דקות. לאחר מכן, נקה את ה-DNA באמצעות ערכת לפי בחירתך.
  3. כדי ליצור מולקולות מעגל פתוח של כל הקונמציות פלביניים (monomers או מומים), דגירה דגימות ה-DNA הפלמיד עם אנזים חותך (Nb. BsrDI) ו דגירה עבור 30 דקות ב 65 ° c.
  4. במקביל, כדי ליצור המולקולות פלביניים ליניארי (כלומר, עבור השוואת גודל פלמיד), להשתמש באנזים הגבלה של הבחירה שלך (למשל, hindiii) כי דבק את הפלמיד פעם.
    הערה: התוצאה היא מונמרים DNA ליניארי. מולקולות מעגל פתוח אינן מנודדות באופן ליניארי.
  5. כדי להמחיש את גודל הפלסטלינה והיווצרות, אלקטרופורזה את בדיקות DNA ליניארי וליניארית עבור 120 דקות ב 4.3 V/cm ב 1% (w/V) agarose ג'ל ו 1 × טאה מאגר. הדגימות מוכתמות בעזרת מידורי גרין והג'ל מדמיין במערכת הדמיה של ג'ל (ראה טבלת חומרים). . השתמש בסולם של 1-bp

Representative Results

כאן, אנו מציגים גישה לחקר האבולוציה הפלביניים על ידי כימות התמדה באוכלוסיה. ראשית, אנו מראים כיצד לבנות את הפלבאמצע לשאת את החיידק הMG1655 pcon כי הוא הציג לאחר מכן לניסוי האבולוציה. שנית, אנו מציגים שיטה ישירה לעקוב אחר השפע הפלסאני באוכלוסיות החיידקי המתפתחת. בסופו של דבר, אנו מראים כיצד להמחיש את גודל המולקולה והמיבנה הפלביניים.

בעבודה הקודמת שלנו8 באמצעות גישה הציג ערכנו ניסוי האבולוציה בעקבות ההתמדה של עמידות לאנטיביוטיקה בתוך החיידק ב-E. coli בהעדר אנטיביוטיקה (איור 4). תוצאות הנציג שלנו מציגות את התפתחות האוכלוסיות ב37 ° c ושיעור דילול של 10-4. בעקבות השפע של תאים בעלי מרכז הסינון, הבחנו בירידה בתדר של התאים המארחים לאורך הזמן (איור 4). הגישה שלנו אפשרה לנו לגלות שההפסד הפלסטי היה תוצאה של ארכיטקטורת הגנום המרוכז בפלסטלינה, שהובילה לחוסר יציבות פלמיד שנגרם על-ידי התנגשויות שעתוק של גן ההתנגדות והשכפול של הפלסמיד עצמו. המחשה של מולקולות הפלביניים אפשרה לנו לגלות שקונפליקטים אלה הובילו ליצירת פלסטלינה לא יציבה (כלומר, היווצרות פלסמיד, איור 5). ובכל זאת, הבחנו באבולוציה של יציבות פלביניים ללא חשיפה לאנטיביוטיקה (איור 4). היציבות התפתחה העניקו על ידי שכפול מהותי בפלסטלינה שבטל את התנגשויות שכפול השיעתוק והוביל להיווצרות של פלמידים שעברו בירושה באופן בלתי נשכח. התוצאות שלנו ובכך להדגים את החשיבות של שילוב מחדש והגברה הגנום באבולוציה מסתגלת של אלמנטים גנטיים.

Figure 1
איור 1: עיצוב פלמיד של pCON. ייצוג סכמטי של אסטרטגיית השיבוט המשמשת לבניית pCON הפלמיד. השדרה הפלפריארית (pBBR1) ו גן עמידות לאנטיביוטיקה (Nptii) הם PCR מוגבר והתמזגו על ידי איזותרמי fusion20. זה התשואות pCON הפלמיד ואת זן MG1655 pCON. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: עיצוב ניסוי האבולוציה לטווח ארוך. ייצוג סכימטי של ניסוי ההעברה הטורית. האוכלוסיות בעלי הפלאמצע (pCON) מצופים באמצעי תקשורת סלקטיבית. מושבות של אבות קדמונים נבחרו באופן אקראי מלוחית והציגו למערכת העברה טורית. ההעברות מתבצעות עם שלוש גישות שונות לדילול להדמיית צווארי בקבוק של אוכלוסיה בגדלים שונים. . הדילול חוזר באופן סדרתי הניסוי מתנהל בשני משטרי טמפרטורה. התדר פלמיד-מארח נמדד לאורך הניסוי באמצעות ציפוי משוכפל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ציפוי עותק משוכפל. ייצוג סכמטי של השלבים המשמשים בציפוי משוכפל של אוכלוסיות בקטריאליות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: תדר הנציג pCON לאורך זמן. התמדה pCON מוצגת כחלק מהמארחים (נציג שכפול אוכלוסיות) במהלך ניסוי האבולוציה. עבור 98 העברות, pCON האוכלוסייה התפתחה בתנאים שאינם סלקטיבית עם פקטור דילול של 10-4. כל המשכפלת שנושאות את pCON הפלמיד ירדה באוכלוסייה. לאחר מכן, האוכלוסיות נחשפו לאנטיביוטיקה עבור הדגירה לילה וטיפח שוב תחת תנאים לא סלקטיבי כדי לבדוק את האבולוציה יציבות פלמיד. דמות זו השתנתה מויין ואח '8אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: ניתוח מייצג של המערך הפלייתי. ויזואליזציה של המודל הפלמיד pCON. דמיינו הוא ה-DNA מטופל פלזמה ישירות לאחר חילוץ, דנ א לינבאמצע ה-DNA, וטיפל עם DNase כי רק חותך דנ א כרומוזומלית, כמו גם ה-DNA שפצע אנזימטי (כלומר, פתח מעגל באמצע DNA). מראה שכל הפלמיונים. הם באותו גודל הסרת דנ א כרומוזום וחותך pCON חושף נוכחות של דימרס ושעוני צד אחרים. דמות זו שונתה מויין ואח '8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

בפרוטוקול זה, אנו מציגים גישה המשלבת טכניקות בביולוגיה מולקולרית, האבולוציה ניסיוני, ו-DNA הדמיה כדי לחקור את התפקיד של האבולוציה פלביניים להתמדה של עמידות לאנטיביוטיקה בחיידקים. למרות שהגישה המוצגת משלבת שיטות מתחומי מחקר שונים, כל הטכניקות המוחלות הן ברורות וניתן לבצעו במעבדת מיקרוביולוגיה סטנדרטית.

השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול כוללים את הבנייה של זן מערכת המודל הכולל את האימות הגנטי של הגנוטיפ נושאת הפלבאמצע. בעיקר, פלמידים רבים לקודד באופן טבעי גנים עמידות לאנטיביוטיקה. לפיכך, הקורא עשוי להשמיט את שלב 1 של הפרוטוקול ולהמשיך באופן ישיר עם שלב 2. לאחר מכן, ניסויים האבולוציה צריך לכלול עיצוב אקראי של שכפול אוכלוסיות כך התוצאות אינן מוטה על ידי מיקום של אוכלוסיות שכפול בצלחת עמוק. בנוסף, חשוב במיוחד לנהל בזהירות את ההעברה הטורית ושלבי הדילול בניסוי האבולוציה כאשר הזיהום מזייף את התוצאות. לבסוף, ציפוי עותק משוכפל צריך להתבצע בזהירות רבה. גודל המושבה הגדולה עשויה להיות בעיה, אך ניתן להימנע מהדגירה של הצלחות במשך פחות מ -24 שעות. באופן דומה, מספר המושבות על צלחת אחת עשוי להטיה תוצאות ציפוי משוכפל. לכן, אוכלוסיות צריך להיות מדולל לפני ציפוי ושכפול.

אחד היתרונות הגדולים ביותר של הגישה שלנו הוא שניתן לשכפל בקלות ללא צורך בציוד כבד. בנוסף, יתרון נוסף של ציפוי משוכפל לעקוב אחר גנים סמן הוא רק תאים חיים מוערכים, בניגוד לזרום cy, או qPCR שבו תאים מתים ניתן להעריך כמו בחיים. כך, ציפוי עותק משוכפל מציג פחות הטיה לספירה של תאים הנושאת פלבאמצע. עם זאת, מגבלה אחת של ציפוי העתק עשוי להיות גודל האוכלוסייה (כלומר, מספר התא), כי ניתן להעריך בהפעלה אחת ניסיוני.

באמצעות הגישה שלנו, לאחרונה הראינו כי האבולוציה יציבות פלמיד הפוטנציאל ההתמדה של הגנים עמידות לאנטיביוטיקה בחיידקים. לפיכך, פיתחנו גישה ככלי לעקוב אחר התמדה בתיווך התנגדות ההתנגדות כי הוא בעל חשיבות גבוהה כדי לעקוב אחר התנגדות לאורך זמן במיוחד בתנאים ללא נוכחות של אנטיביוטיקה.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

אנו מודים לגור Margaryan על תמיכה יצירתית וסיוע טכני. עבודה זו נתמכת על ידי המדען הצעיר ZMB גרנט 2017/2018 (הוענק TW) ו DFG מיקוד תוכנית 1819 (גרנט לא. DA1202/2-1 הוענק ל TD).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-deep-well plates Starlab
96-deep-well plates Roth EN07.1 2 ml, square
96-deep-well plates (cryo) Starlab E1702-8400 Micro-Dilution Tube System
Colony counter Stuart SC6+
Cotton velvet drapery shop 100 % cotton required
Electrophoresis chamber BioRad Agarose gel electrophoresis
Electrophoresis power supply BioRad 1645070 Agarose gel electrophoresis
Electroporation cuvettes BioRad 1652089 0.1 cm
Electroporator BioRad 1652660
GeneJet Gel Extraction kit Thermo Fisher Scientific K0832 PCR fragment clean-up
GeneJet Plasmid Miniprep kit Thermo Fisher Scientific K0503 Plasmid extraction kit
Gibson Assembly New England Biolabs E2611S
Incubator Thermo Fisher Scientific 50125852
Incubator (plate shaker) Heidolph 1000
Incubator (shaker) New Brunswick Scientific Innova 44
Inoculating loops Sigma-Aldrich
Multi-channel pippetes Eppendorf 3125000052, 3125000028
Multi-channel pippetes Capp ME8-1250R
NanoDrop 2000/2000c Thermo Fisher Scientific ND2000
Oligonucleotides Eurofines
Petri dishes Sigma-Aldrich
Phusion Polymerase Thermo Fisher Scientific F533S
Pipettes Eppendorf 3123000012, 3123000098, 3123000055, 3123000063,
PlasmidSafe enzyme Epicentre 10059400
Reaction tubes Eppendorf 30125150
Replica block & metal ring VWR 601-3401 PVC cylinder 69 mm; ring 102cm
Resctriction enzymes New England Biolabs
Thermocycler BioRad T100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. San Millan, A. Evolution of plasmid-mediated antibiotic resistance in the clinical context. Trends in Microbiology. 26, (12), 978-985 (2018).
  2. Bruto, M., James, A., et al. Vibrio crassostreae, a benign oyster colonizer turned into a pathogen after plasmid acquisition. The ISME Journal. 11, (4), 1043-1052 (2017).
  3. von Wintersdorff, C. J. H., et al. Dissemination of antimicrobial resistance in microbial ecosystems through horizontal gene transfer. Frontiers in Microbiology. 7, (110), 305-310 (2016).
  4. Lenski, R. E. Experimental evolution and the dynamics of adaptation and genome evolution in microbial populations. ISME Journal. 11, (10), 2181-2194 (2017).
  5. De Gelder, L., Williams, J. J., Ponciano, J. E. M., Sota, M., Top, E. M. Adaptive plasmid evolution results in host-range expansion of a broad-host-range plasmid. Genetics. 178, (4), 2179-2190 (2008).
  6. Harrison, E., Guymer, D., Spiers, A. J., Paterson, S., Brockhurst, M. A. Parallel compensatory evolution stabilizes plasmids across the parasitism-mutualism continuum. Current Biology. 25, (15), 2034-2039 (2015).
  7. Bouma, J. E., Lenski, R. E. Evolution of a bacteria/plasmid association. Nature. 335, (6188), 351-352 (1988).
  8. Wein, T., Hülter, N. F., Mizrahi, I., Dagan, T. Emergence of plasmid stability under nonselective conditions maintains antibiotic resistance. Nature Communications. 10, (1), 2595 (2019).
  9. Loftie-Eaton, W., et al. Compensatory mutations improve general permissiveness to antibiotic resistance plasmids. Nature Ecology & Evolution. 1, (9), 1354-1363 (2017).
  10. Millan, A. S., et al. Positive selection and compensatory adaptation interact to stabilize non-transmissible plasmids. Nature Communications. 5, (1), 1-11 (2014).
  11. Loftie-Eaton, W., Tucker, A., Norton, A., Top, E. M. Flow cytometry and real-time quantitative PCR as tools for assessing plasmid persistence. Applied and Environmental Microbiology. 80, (17), 5439-5446 (2014).
  12. Münch, K. M., et al. Polar fixation of plasmids during recombinant protein production in Bacillus megaterium results in population heterogeneity. Applied and Environmental Microbiology. 81, (17), 5976-5986 (2015).
  13. Jahn, M., Vorpahl, C., Hübschmann, T., Harms, H., Müller, S. Copy number variability of expression plasmids determined by cell sorting and Droplet Digital PCR. Microbial Cell Factories. 15, (1), 211 (2016).
  14. Lederberg, J., Lederberg, M. E. Replica plating and indirect selection of bacterial mutants. Journal of Bacteriology. 63, 399-406 (1952).
  15. Summers, D. K., Sherratt, D. J. Multimerization of high copy number plasmids causes instability: ColE1 encodes a determinant essential for plasmid monomerization and stability. Cell. 36, (4), 1097-1103 (1984).
  16. Summers, D. K., Beton, C. W., Withers, H. L. Multicopy plasmid instability: the dimer catastrophe hypothesis. Molecular Microbiology. 8, (6), 1031-1038 (1993).
  17. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166, (4), 557-580 (1983).
  18. Ilhan, J., et al. Segregational drift and the interplay between plasmid copy number and evolvability. Molecular Biology and Evolution. 36, (3), 472-486 (2019).
  19. Beck, E., Ludwig, G., Auerswald, E. A., Reiss, B., Schaller, H. Nucleotide sequence and exact localization of the neomycin phosphotransferase gene from transposon Tn5. Gene. 19, (3), 327-336 (1982).
  20. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6, (5), 343-345 (2009).
קוונפיקציה של פלמיד בתיווך עמידות לאנטיביוטיקה בגישת אבולוציה ניסויית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wein, T., Stücker, F. T., Hülter, N. F., Dagan, T. Quantification of Plasmid-Mediated Antibiotic Resistance in an Experimental Evolution Approach. J. Vis. Exp. (154), e60749, doi:10.3791/60749 (2019).More

Wein, T., Stücker, F. T., Hülter, N. F., Dagan, T. Quantification of Plasmid-Mediated Antibiotic Resistance in an Experimental Evolution Approach. J. Vis. Exp. (154), e60749, doi:10.3791/60749 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter