Summary
Aquí describimos métodos que utilizan la microscopía de lapso de tiempo y contraste de fase para crear imágenes de macrófagos peritoneales residentes del ratón en un complemento quimiotáctico gradiente C5a. Los protocolos se pueden extender a otras células inmunitarias.
Abstract
La quimiotaxis es una guía mediada por receptores de las células a lo largo de un gradiente químico, mientras que la quimioquinesis es la estimulación de la motilidad celular aleatoria por un producto químico. La quimioquina y la quimiotaxis son fundamentales para la movilización y el despliegue de células inmunitarias. Por ejemplo, las quimioquinas (citoquinas quimiotácticas) pueden reclutar rápidamente neutrófilos y monocitos circulantes en sitios extravasculares de inflamación. Receptores quimioatraers pertenecen a la gran familia de receptores acoplados a proteínas G. La forma en que la quimioattractant (es decir, el ligando) gradientea la migración celular directa a través de la señalización del receptor acoplado a la proteína G aún no se entiende completamente. En el campo de la inmunología, los neutrófilos son células modelo populares para el estudio de la quimiotaxis in vitro. Aquí describimos un ensayo quimiotaxis bidimensional (2D) en tiempo real adaptado a los macrófagos residentes de ratón, que tradicionalmente han sido más difíciles de estudiar. Los macrófagos se mueven a un ritmo lento de 1 m/min en una superficie 2D y son menos adecuados para ensayos de migración de fuentes puntuales (por ejemplo, migración hacia la punta de una micropipeta llena de quimioatractora) que los neutrófilos o Dictyostelium discoideum,que mueven un orden de magnitud más rápido. Los ensayos Transwell ampliamente utilizados son útiles para estudiar la actividad quimiotáctica de diferentes sustancias, pero no proporcionan información sobre morfología celular, velocidad o navegación quimiotáctica. Aquí describimos un ensayo de quimiotaxis basado en microfófagos basado en microscopía de lapso de tiempo que permite cuantificar la velocidad celular y la eficiencia quimiotáctica y proporciona una plataforma para delinear los transductores, vías de señal y efectores de la quimiotaxis.
Introduction
Las células inmunes suelen migrar por separado en una superficie 2D en una forma amoeboides1,2, que implica ciclos repetidos de protuberancia de la parte delantera, adhesión celular mediada por integrina, y retracción de la parte posterior. Un paso previo es la polarización celular, en la que las células forman los extremos delantero y trasero3. La quimiotaxis comienza con la detección de quimioatractores por los receptores acoplados a proteínas G y una compleja red de señalización mediada por proteínas G heterotriméricas ancladas por membrana y pequeñas proteínas g monoméricas, así como factores de intercambio de nucleótidos de guanina fosfolípidos (GEF)4,,5. La activación de Rho GTPases de las subfamilias Cdc42 y Rac induce ntrusiones en la parte delantera6 y los miembros de la subfamilia Rho, especialmente RhoA, activan la contracción de la parte trasera5,,7. En un entorno tridimensional (3D), los integrines son en gran medida redundantes para la migración de leucocitos y RhoA se vuelve más importante para apretar células a través de pasajes estrechos8,mientras que la activación de Arp2/3 inducida por Cdc42 o Rac sigue siendo importante para la dirección quimiotáctica9,,10.
Las células inmunitarias pueden enfrentarse a diferentes quimioattractantes, especialmente en los entornos de lesión tisular, invasión de patógenos e inflamación. Los quimioatractores endógenos expresados en fagocitos complementan C3a y C5a, se generan rápidamente mediante la activación de la cascada de complemento, y son reconocidos por los receptores C3a y C5a. Del mismo modo, las células necróticas reclutan fagocitos a través de receptores de péptidos formilo, que reconocen los péptidos de formilo derivados de las mitocondrias11. Las células inmunitarias también expresan los receptores acoplados a proteínas G para las quimiolinas, una gran familia de péptidos quimioatractores implicados en la regulación del tráfico de células inmunes durante la homeostasis y la inflamación. Las quimioquinas se clasifican en cuatro grupos dependiendo del espaciado de los dos primeros residuos de cisteína (C): citoquinas C, CC, CXC y CX3C, donde X es un aminoácido. Por lo tanto, las células inmunitarias in vivo necesitan responder adecuadamente a señales espaciales y temporales altamente complejas, haciendo que el estudio de la quimiotaxis sea una tarea desalentadora. A continuación proporcionamos una breve historia de la quimiotaxis, que comenzó con enfoques de imágenes intravitales.
El estudio de la quimiotaxis leucocitos se remonta a 188812,cuando el oftalmólogo Theodor Karl Gustav Leber describió claramente la migración dirigida de leucocitos a, y la acumulación en, sitios de inflamación en un modelo de queratitis micótica (fúngica). Leber subrayó que la atracción del exceso de leucocitos por sustancias derivadas de patógenos es importante para la eliminación de microorganismos nocivos a través de la fagocitosis, que había sido descrita por Metchnikoff (también conocido como Metschnikoff) más temprano en la misma década13. Los experimentos in vivo también fueron realizados en la década de 1920 por Clark y Clark14,15, que aprovecharon la transparencia de los renacuajos y mostraron que la inflamación estéril inducida por el aceite de crotón14 u otros irritantes15 causó que los leucocitos se adhierieran a los vasos sanguíneos, seguido de diapedesis (migración transendotelial) y rápida migración a través de los espacios tisulares hacia el irritante. Los experimentos in vitro utilizando el método de microcinematografía desarrollado por Jean Comandon16 mostraron que los leucocitos migraban hacia una fuente quimioattractante de partículas como la bacteria17. En ese momento, se desconocían las identidades moleculares de los factores quimiotácticos. En la década de 1960, Stephen Boyden18 reconoció que faltaban técnicas para estudiar la actividad quimiotáctica de sustancias solubles. Ideó una cámara, posteriormente conocida como la cámara Boyden, con dos compartimentos separados por una membrana de papel filtrante. Se añade una suspensión celular al compartimento superior y la sustancia de ensayo se añade a ambos compartimentos o solo al compartimento inferior. Después de un período de incubación, se elimina la membrana del filtro, y las células se fijan y teñen. Al comparar cuántas células migran a través de la membrana del filtro hacia el pozo inferior con la sustancia de ensayo en ambos compartimentos, en ninguno de los compartimentos, o sólo en el compartimento inferior, se puede determinar la actividad quimiotáctica. Los ensayos transwell siguen siendo populares hoy en día y han sido modificados de varias maneras, incluyendo el uso de diferentes membranas de policarbonato con tamaños y densidades de porodefinidos definidos19,20. Un inconveniente importante de los ensayos de Transwell es que no es práctico visualizar directamente las células que migran y la ruta de migración a través de la membrana normalmente no excede el diámetro de una célula inmune.
Sally H. Zigmond desarrolló una cámara de quimiotaxis21 que permitió la visualización tanto de la formación de gradientes como de la morfología celular utilizando colorantes fluorescentes. La cámara se compone de una corredera de plexiglás (acrílico) con dos pozos lineales paralelos, cada uno con un volumen de 100 l, separados por un puente de 1 mm de ancho de 3-10 m por debajo del plano superior de la diapositiva. Un cubreobjetos sembrado con células se invierte y se coloca en la diapositiva de tal forma que abarque los dos pozos. Después de la adición de un quimioatractor a uno de los pozos, se observa un gradiente quimioattractante pronunciado a través del puente, típicamente dentro de 30-90 min. Leucocitos polimorfonucleares humanos (granulocitos) en la cámara Zigmond se observan orientando hacia el quimioatractor. Se han notificado variaciones de la cámara Zigmond, incluyendo las cámaras Dunn22 e Insall23, que utilizan un cubreobjetos sembrado con células colocadas a través de dos pozos separados por un puente de 1 mm de ancho. La cámara Dunn consta de pozos concéntricos separados por un puente circular, mientras que la cámara Insall está más estrechamente relacionada con la cámara Zigmond, pero proporciona puentes de dos anchuras diferentes, 0,5 mm y 1 mm. Zemgel et al.24describió una nueva cámara de quimiotaxis, denominada Chemotaxis de diapositivas y fabricada por moldeo por inyección de plástico. La cámara de quimiotaxis consta de dos depósitos de 40 ml separados por un canal de 1 mm de ancho con una longitud de 2 mm y una altura de 70 m. La parte inferior de la cámara está formada por una lámina de plástico delgada y permeable al gas con el mismo grosor y propiedades ópticas de un cubreobjetos de vidrio No. 1.524. Aquí describimos un ensayo quimiotaxis utilizando la cámara Quimiotaxis para visualizar la migración de los macrófagos peritoneales residentes de ratón durante hasta 14 horas en un gradiente quimiotáctico (complemento C5a).
Protocol
Los protocolos siguen las pautas de nuestro comité local de ética de la investigación, así como las pautas de cuidado animal.
NOTA: La Figura 1 muestra un flujo de trabajo del ensayo de quimiotaxis.
1. Prellenar diapositivas Chemotaxis
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Rellene los canales de conexión de 1 mm de ancho y 2 mm de largo de una o dos correderas quimiotaxis utilizando el medio modificado RPMI 1640 HEPES, que consiste en un medio RPMI 1640 libre de bicarbonato que contiene 20 mM 4-(2-hidroxietilo)-1-piperazineethanesácidos ácido sulfónico (ácido (20 mM 4-(2-hidroxietilo)-1-piperazineethanesulfonic acid (20 mM 4-(2-hidroxietilo)-1-piperazineethanesulfonic acid (20 mM 4-(2-hidroxietilo)-1-piperazineethanesulfonic acid (20 mM 4-(2-hidroxietilo)-1-piperazineethanesulfonic acid (acido (20 mM 4-(2-hidroxietilo)-1-piperazineethanes HEPES), 10% suero bovino fetal inactivado por calor (FBS), y antibióticos como penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 g/ml), preparados diluyendo 100x penicilina/estreptomicina, y 1 lipopolisacárido (de E. coli),y un ligando del receptor 4 similar al peaje utilizado para activar las celdas.
- Coloque una corredera de quimiotaxis(Figura 2A)en una placa de cultivo celular redonda (10 cm de diámetro), ambas precalentadas a 37 oC, y coloque el plato en un bloque de aluminio calentado (37 oC). Inserte los enchufes en los puertos 1 y 4(figura 2B).
NOTA: Un bloque de aluminio mantenido a 37oC y colocado dentro de la campana de flujo laminar es útil para preparar cámaras de quimiotaxis. Idealmente, el bloque calentado debe proporcionar una zona de trabajo plana y pozos para varios tubos, tales como tubos de 50 ml y tubos de microcentrífuga de 2 ml. - Usando una punta de pipeta de 10–200 l con una punta biselada, deposite 15 ml del medio RPMI 1640 HEPES modificado en el puerto de llenado 3(Figura 2B). A continuación, con el volumen todavía ajustado a 15 l y el botón de control de la pipeta (2-20 l de volumen) deprimida, inserte la punta de la pipeta en el puerto 2 y aspire 15 s a una velocidad moderadamente rápida(Figura 2B). Esto rellenará previamente el canal de conexión de 1 mm x 2 mm (área de observación), así como los dos canales de suministro de flanqueo (entre el área de observación central y los puertos 2 y 3, respectivamente). Cubra los puertos 2 y 3 con tapas.
- Después de rellenar, coloque los portaobjetos de quimiotaxis en un estante mantenido en una cámara de humedad cerrada dentro de una incubadora seca y libre de CO2a 37 oC.
NOTA: Es importante utilizar la punta de pipeta correcta para llenar el tobogán quimiotaxis. Una punta de pipeta biselada se sume en la parte superior del puerto de llenado, mientras que las puntas puntiagudas de uso común se pueden insertar más profundamente en el puerto de llenado y pueden aumentar en gran medida la resistencia al flujo de fluidos.
- Coloque una corredera de quimiotaxis(Figura 2A)en una placa de cultivo celular redonda (10 cm de diámetro), ambas precalentadas a 37 oC, y coloque el plato en un bloque de aluminio calentado (37 oC). Inserte los enchufes en los puertos 1 y 4(figura 2B).
2. Aislamiento de macrófagos peritoneales residentes de ratón
- Sacrificar un ratón de 3-4 meses de edad usando una alta concentración del isoflurano anestésico volátil (>5% en el aire) o dióxido de carbono25,seguido de la luxación cervical. La pérdida del reflejo de enderece en roedores se correlaciona con la pérdida de conciencia en humanos26. Limpie el abdomen del ratón con un 80% de etanol en agua y luego haga una incisión cutánea de línea media de 1-2 cm utilizando tijeras quirúrgicas con puntas contundentes. Pelar hacia atrás la piel para exponer la pared abdominal subyacente.
- Inserte un catéter de plástico de 24 G en la cavidad peritoneal. Usando una jeringa de plástico de 5 ml, lava la cavidad usando 2 x 4.5 ml de solución de sal tamponada (HBSS) de Hank helado de 4,5 ml, sin Ca2+ y Mg2+. Deje alrededor de 0,5 ml de HBSS residual en la jeringa para que el tejido aspirado inadvertidamente en la punta del catéter pueda ser expulsado.
- Transfiera el medio lavado, típicamente de 8 a 8,5 ml en total, a un tubo inferior redondo de polipropileno de 14 ml. Centrifugar el tubo a 300 x g durante 6,5 min a temperatura ambiente.
NOTA: El tubo inferior redondo permite que el sobrenadante sea completamente decantado y reduce el aglutinamiento celular. - Deseche el sobrenadante y resuspenda las células peritoneales (normalmente 4 x 106 celdas por ratón) en 200 l de medio HEPES RPMI 1640 modificado. Diluir una muestra de la suspensión celular 1:20 y utilizar un dispositivo de conteo, como una cámara de conteo mejorada Neubauer, para contar las células. A continuación, diluir la suspensión celular a una concentración final de 10 x 106 células/ml y mantener las células en un tubo de microcentrífuga de polipropileno de 2 ml de fondo redondo a 37 oC utilizando un bloque de aluminio calentado (ver NOTA en el paso 1.1.1).
3. Sembrar células peritoneales en diapositivas de quimiotaxis
- Después de pipetear la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo 5 veces con el volumen de la pipeta ajustado a 100 l (o a la mitad del volumen de la suspensión) para reducir el aglutinamiento, deposite suavemente 10 ml de la suspensión celular en el puerto 3 de una cámara de quimiotaxis(Figura 2C). Coloque la punta de la pipeta en el puerto 2 y extraiga lentamente la suspensión de la célula en el canal de conexión(Figura 2C). Tan pronto como se haya introducido la suspensión celular, retire los tapones en los puertos 1 y 4, lo que ayudará a detener el flujo de la suspensión celular. Coloque las tapas en los cuatro puertos de llenado.
- Repita el paso 3.1 para todas las cámaras de quimiotaxis. Usando un pequeño microscopio invertido y una lente objetivo de contraste de fase 10x, inspeccione las diapositivas de quimiotaxis en busca de burbujas de aire no deseadas.
- Colocar las diapositivas de quimiotaxis sembradas con células peritoneales en una cámara de humedad a 37oC durante 2–3 h.
4. Llenar los embalses y añadir quimioatractor
- Inspeccione el área de observación (canal que conecta los dos depósitos de 40 l) utilizando un microscopio invertido.
NOTA: En esta etapa, la densidad celular será mayor que después de llenar los reservorios, porque las células débilmente adherentes, predominantemente CD19+ células (células B1), serán lavadas fuera del área de observación durante el procedimiento de llenado(Figura 2C–E). - Coloque los enchufes en los puertos de llenado 1 y 2(Figura 2D). Asegúrese de que el puerto de llenado 3 esté lleno hasta la parte superior con burbujas de aire medianas y libres. Utilice una aguja de jeringa estéril de 27 G para desalojar burbujas de aire no deseadas, si es necesario.
- Usando una pipeta mecánica de volumen de 10–100 l, aspirar a 60 l de medio RPMI 1640 HEPES modificado y colocar la punta de la pipeta en el puerto de llenado 3. Utilice el anillo de ajuste de volumen de la pipeta para inyectar lenta y constantemente el medio en el depósito de modo que el medio alcance la parte superior del puerto de llenado 4 después de 1-2 min(Figura 2D).
- Llene el segundo depósito. Mueva el enchufe del puerto 1 e insértelo lentamente en el puerto 3(Figura 2D). A continuación, aspirar 50 s de medio RPMI 1640 HEPES modificado y colocar la punta de la pipeta en el puerto de llenado 4. Utilice el anillo de ajuste de volumen de la pipeta de volumen de 10-100 ml para inyectar lenta y constantemente el medio en el segundo depósito de modo que el medio alcance la parte superior del puerto de llenado 1 después de 1-2 min(Figura 2D).
- Colocar 495 l de medio HEPES RPMI 1640 modificado en un tubo de microcentrífuga (fondo redondo) de 2 ml y añadir 5 ml de Patente Azul V (solución en stock: 10 mg/ml en solución salina con fosfato [PBS]), un tinte azul utilizado como indicador visual de la formación de gradiente de concentración. Mezclar por breve vórtice. Añadir 5,4 ml de complemento de ratón recombinante C5a (solución de stock: 50 g/ml en PBS con albúmina sérica bovina al0,1%) y mezclar mediante un breve vórtice.
- Depositar 15 sl de azul, complementar el medio que contiene C5a en el puerto de llenado 1(Figura 3A),después de asegurarse de que la depresión poco profunda en la parte superior del puerto es media libre (de lo contrario, la gota puede derramarse).
- Inserte una punta de pipeta de 10–200 l en el puerto de llenado 4 y gire lenta y constantemente el anillo de ajuste de volumen de la pipeta de volumen de 10–100 ml para dibujar la gota de azul, complemente el medio que contiene C5a en el depósito opuesto(Figura 3B). El aire comenzará a entrar en la columna vertical corta del puerto de llenado 1. Extraiga aire hasta que la interfaz fluido-aire esté a mitad de camino en la columna vertical y, a continuación, inserte lentamente un enchufe en el puerto.
- Levante suavemente la pipeta del puerto 4, utilizando la otra mano para asegurarse de que la corredera permanece fija en su lugar. Por último, enchufe lentamente el puerto 4(Figura 3B).
- Inspeccione la corredera de quimiotaxis en un microscopio invertido.
NOTA: Las células adherentes restantes en el área de observación deben ser predominantemente macrófagos. Esto se puede confirmar utilizando anticuerpos anti-F4/80 etiquetados fluorescentemente (F4/80 es un marcador específico para los macrófagos de ratón). Las células B se pueden identificar utilizando anticuerpos anti-CD19 etiquetados fluorescentemente y células F4/80-/CD19- se pueden detectar utilizando una mancha de ácido nucleico fluorescente azul (Figura 4).
5. Migración de macrófagos por imágenes por lapso de tiempo, microscopía de contraste de fase
- Coloque un portaobjetos quimiotaxis en el escenario de un microscopio invertido equipado con una incubadora de etapas. Mantener la temperatura a 37oC.
- Imagen del área de observación de 1 mm x 2 mm utilizando una lente objetivo de contraste de fase de 10x y concéntrese en la lamellipodia de macrófagos: protuberancias de membrana delgadas similares a láminas. Capturar imágenes durante 14 h a una velocidad de 1 fotograma cada 2 min.
6. Análisis de imágenes de lapso de tiempo
- Analice las imágenes de lapso de tiempo y contraste de fase utilizando el software de análisis de imágenes automatizado o el plugin de seguimiento manual, producido por Fabrice P. Cordeliéres, para ImageJ.
NOTA: Los programas de seguimiento automatizados se pueden utilizar para analizar las células que se utilizan mediante microscopía de lapso de tiempo, contraste de fase o fluorescencia. Por ejemplo, el software basado en Java iTrack4U producido por Cordeliéres et al.27 se puede utilizar para el seguimiento y análisis automatizado de células utilizando imágenes de lapso de tiempo, contraste de fase o fluorescencia como entrada. El seguimiento manual consume más tiempo, pero las pistas generadas por el plugin ImageJ Manual Tracking pueden ser importadas directamente y analizadas automáticamente por el plugin ImageJ Chemotaxis and Migration Tool28,29.
Representative Results
En la Figura 2Ase muestra un diagrama esquemático de la diapositiva quimiotaxis utilizada para la microscopía de vídeo de lapso de tiempo de los macrófagos peritoneales del ratón que migran en un gradiente quimiotáctico. El portaobjetos contiene tres cámaras de quimiotaxis, cada una de las cuales tiene cuatro puertos de llenado. Los puertos se pueden cerrar individualmente utilizando los enchufes que se muestran encima de la diapositiva. Alternativamente, una tapa no sellada se puede colocar sobre un puerto desconectado para mantener la esterilidad. Después de enchufar los puertos 1 y 4, el área de observación (1 mm de ancho x 2 mm de largo x 70 ám de alto canal que conecta los dos depósitos) entre los puertos 2 y 3 se puede prellenar con medio colocando una caída de 15 ml en el puerto 3 y aspirando con una pipeta de volumen de 2-20 ml en el puerto 2(Figura 2B). Se sintió una suspensión de las células peritoneales residentes del ratón (10 x 106 células/ml) en el área de observación colocando una caída de suspensión de 10 l en el puerto 3 y aspirando lentamente en el puerto 2(Figura 2C). Una imagen típica de las células sembradas en el área de observación tomada por microscopía de contraste de fase utilizando una lente objetivo 10x se muestra en la Figura 2C. Después de incubar durante 2-3 h, la diapositiva de quimiotaxis se llenó lentamente de medio(Figura 2D). Después de enchufar los puertos 1 y 2, el medio se inyectó lentamente a través del puerto 3 hasta que emergió del puerto 4. A continuación, el enchufe fue conmutado del puerto 1 al puerto 3, y luego el segundo depósito se llenó inyectando lentamente el medio a través del puerto 4 hasta que emergió en el puerto 1. En esta etapa, las células en el área de observación fueron reinspeccionadas usando un microscopio invertido(Figura 2E). Al comparar las imágenes poco antes(Figura 2C)y después(Figura 2E)el llenado de los depósitos, hasta dos tercios de las células se habían lavado fuera del área de observación. Generalmente, las células CD19+ débilmente adherentes (células B1) fueron lavadas y las células restantes fueron predominantemente F4/80+ células (macrófagos). Esto se demostró mediante microscopía de fluorescencia después de etiquetar cada tipo de célula con anticuerpos específicos etiquetados fluorescentemente(Figura 4). En la Figura 4A,las células peritoneales residentes de ratones recién aisladas fueron etiquetadas con anticuerpos anti-F4/80 conjugados con fluoróforo verde y anticuerpos anti-CD19 conjugados por fluoróforo fluorescente rojo, y los núcleos de las células fueron etiquetados con una mancha de ácido nucleico fluorescente azul. F4/80 es un marcador específico para los macrófagos de ratón30,mientras que CD19 es un marcador de celda B. La Figura 4B muestra F4/80+ células imageeadas por microscopía confocal de disco giratorio en el área de observación de una cámara de quimiotaxis. Las células fueron etiquetadas después de un ensayo de quimiotaxis durante la noche registrado por microscopía de lapso de tiempo y contraste de fase.
El complemento C5a (quimioatractor) se introdujo en uno de los dos depósitos colocando una gota de 15 l de medio que contiene 0,54 g/ml (ratón recombinante) y 10 g/ml Patente Azul V en el puerto de llenado 1 (Figura 3A) después de tapar los puertos 2 y 3. El medio quimioatraer fue introducido lentamente en el depósito por aspiración lenta con una pipeta a través del puerto 4. La Figura 3B muestra la difusión del tinte azul después de dibujar la gota de 15 ol en un depósito. Patente Azul V se utilizó como un indicador visual indirecto de difusión quimioattractante. Las moléculas de complemento C5a son considerablemente más grandes que las de Patent Blue V (9,0 kDa frente a 0,57 kDa) y se difunden más lentamente. Después de la difusión del complemento C5a en el depósito, su concentración fue de 0,2 g/ml (15 l/40 l [volumen del depósito] x 0,54 g/ml a 0,2 g/ml, equivalente a 22,5 nM. Una pendiente modestamente pronunciada se formó a través de la zona de observación después de 3 h y continuó aumentando, alcanzando un máximo alrededor de 12 h31. La Figura 3C muestra las pistas de migración de los macrófagos migrando en un gradiente C5a de complemento, entre 6-12 h después de agregar el quimioatraer. La velocidad celular y la eficiencia quimiotáctica, indexadas como y-FMI (índice de migración y-forward; rango: -1 a +1) y x-FMI, de macrófagos individuales se calculó a partir de las gráficas de migración(Figura 3D). La Figura 3D también muestra una gráfica de migración producida después de normalizar el punto inicial de cada pista de migración a X a 0 e Y a 0 debajo de las gráficas de cuadro. El recuadro de la gráfica de migración muestra cómo se calculó el y-FMI para cada pista de migración.
Figura 1: El flujo de trabajo del ensayo de quimiotaxis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Manejo de diapositivas quimiotaxis. (A) Una vista 3D de una corredera quimiotaxis con cuatro tapones y cuatro tapas. La corredera contiene tres cámaras de quimiotaxis, cada una de las cuales consta de dos depósitos de 40 l conectados por un canal de 1 mm x 2 mm, que tiene 70 mm de altura, llamado el área de observación. (B) El canal de conexión se extiende en ambos extremos a los puertos de llenado 2 y 3. Después de insertar tapones en los puertos de llenado 1 y 4, el área de observación se llenó previamente con medio (rojo) aplicando una gota de medio al puerto 3 y aspirando en el puerto 2 con una punta de pipeta de 10-200 l. Posteriormente, se aplicaron tapas a los puertos 2 y 3 antes de incubar el portaobjetos a 37oC y preparar la suspensión celular. (C) El área de observación, donde se formó el gradiente quimioatraer, fue sembrada con macrófagos aplicando una gota de 10 l de células peritoneales residentes del ratón en el puerto 3 y aspirando lentamente en el puerto 2. El portaobjetos fue entonces incubado en una cámara de humedad a 37oC durante 2-3 h. La imagen de contraste de fase que se muestra a la derecha, obtenida a través de una lente objetivo 10x, muestra las células peritoneales después de la sembración y la incubación a 37 oC durante 2 h. Barra de escala a 500 m.(D) Las cámaras quimiotaxis se llenaron con medios conectando los puertos 1 y 2 y luego inyectando lentamente el medio a través del puerto 3 hasta que emergió en el puerto 4. El llenado lento y constante se puede lograr girando el anillo de ajuste de volumen de una pipeta de volumen de 20-100 l. Después de llenar el primer depósito, el segundo depósito se puede llenar enchufando los puertos 2 y 3 y luego inyectando lentamente el medio en el puerto 4 hasta que emerge en el puerto 1. (E) Imagen de contraste de fase de la misma área de observación mostrada anteriormente (C) después de llenar los dos depósitos. Barra de escala a 500 m. Elementos gráficos proporcionados por Elias Horn. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Ensayo de Chemotaxis. (A) Chemoattractant se introdujo en uno de los dos reservorios de una cámara de quimiotaxis aplicando una gota de 15 ol de medio que contiene 0,54 g/ml de complemento C5a y 10 g/ml Patente Azul V al puerto de llenado 1, seguido de una aspiración lenta en el puerto 4. (B) Inicialmente después de ser arrastrado al embalse, el medio azul, que contiene quimioattractante, tenía una forma de gota invertida aproximadamente, y luego se difundió lentamente por todo el depósito. (C) Pistas migratorias de macrófagos migrando en un gradiente quimioatractor (complemento C5a) entre 6-12 h después de introducir quimioattractante en uno de los embalses. La dirección del degradado se indica a la derecha. El final de cada pista de migración se indica mediante un círculo relleno. (D) Gráficas Blox de velocidad, x-FMI (índice de migración x-forward) e y-FMI (índice de migración y-forward), un índice de eficiencia quimiotáctica que oscila entre -1 y +1. Los datos se obtuvieron mediante el análisis de 25 pistas de migración de macrófagos. Los macrófagos en la mitad inferior del área de observación y que muestran el desplazamiento de al menos un ancho de celda sobre 6 h fueron seleccionados aleatoriamente para el análisis. A continuación se muestra una gráfica de las pistas de migración después de normalizar el punto inicial a X - 0 e Y - 0. El índice de quimiotaxis (y-FMI) se calculó dividiendo el desplazamiento neto a lo largo del eje Y (d) por la longitud acumulada (l) de la ruta de migración, como se muestra esquemáticamente. Elementos gráficos en los paneles A y B proporcionados por Elias Horn. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Imágenes fluorescentes de células peritoneales residentes de ratón vivo obtenidas mediante microscopía confocal de disco giratorio. (A) Imagen de enfoque extendido (combinación de puntos más brillante de todos los planos Z) de células peritoneales de ratón recién aisladas etiquetadas con anticuerpos anti-F4/80 fluorescentes verdes (marcador de macrófagos), anticuerpos anti-CD19 fluorescentes rojos (marcador de células B) y una mancha de ácido nucleico fluorescente azul. Barra de escala a 10 m. (B) Instantánea (plano Z único) de F4/80+ células (macrófagos) en el área de observación de una cámara de quimiotaxis tomada después de un ensayo de quimiotaxis durante la noche. Las células fueron etiquetadas con anticuerpos anti-F4/80 fluorescentes verdes y una mancha de ácido nucleico fluorescente azul. Los gradientes C5a y Patent Blue V del complemento fueron lavados por el procedimiento de etiquetado celular, lo que explica por qué el depósito superior en el diagrama esquemático de la cámara de quimiotaxis no es azul. Barra de escala a 10 m. Elemento gráfico proporcionado por Elias Horn. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Las imágenes intravitales datan del siglo XIX y proporcionan un medio para estudiar el comportamiento de las células inmunitarias vivas en su entorno natural. Sin embargo, incluso con la microscopía avanzada de hoy en día y las técnicas genéticas es difícil estudiar la respuesta de las células a quimioattractantes específicos in vivo. Para evitar este problema, Boyden18 desarrolló ensayos Transwell en la década de 1960, pero estos ensayos de punto final no proporcionaron visualización de cómo las células realmente migraban hacia quimioattractantes, lo que dificultó distinguir la quimioquina, estimuló la migración aleatoria por una señal química32,y la quimiotaxis, la migración hacia concentraciones más altas de estímulos químicos entre sí33. Este problema se solucionó diseñando varias cámaras abiertas con un puente, normalmente de 1 mm de ancho, situadas entre dos depósitos y accesibles por una lente objetivo21,,22,,23. La aplicación de un resbalón de cubierta invertido, sin semillas con células adherentes, cierra las cámaras y el quimioattractante añadido a uno de los reservorios se difunde a través del puente hasta el depósito opuesto, creando un gradiente de concentración. Aquí describimos un ensayo quimiotaxis utilizando el mismo principio pero usando una cámara cerrada con cuatro puertos de llenado. Utilizando este sistema y la microscopía de lapso de tiempo y contraste de fase, desarrollamos un ensayo para la imagen de macrófagos peritoneales residentes del ratón migrando en un complemento quimiotáctico C5a gradiente31,,34,,35,,36. Este ensayo, combinado con modelos de ratón knockout, resultó fundamental en la investigación de los papeles de varios Rho GTPases y proteínas motoras en morfología de macrófagos, motilidad y quimiotaxis31,,34,,35,,36,,37. También hemos utilizado este enfoque para la imagen de monocitos de sangre periférica humana migrando en una superficie 2D o en una matriz 3D de colágeno tipo I38. Además, el ensayo es adecuado para macrófagos derivados de médula ósea de ratón o macrófagos derivados de células precursoras de mieloides inmortalizadas condicionalmente39,40. Anteriormente hemos utilizado bolsas de politetrafluoroetileno (PTFE) con adaptadores luer para cultivar células de médula ósea y obtener macrófagos34. La ventaja de las bolsas de PTFE es que las células se pueden resuspender fácilmente y listas para su uso después de colocar la bolsa en hielo durante 20-30 min. Tenga en cuenta que rellenamos previamente el área de observación de diapositivas quimiotaxis antes de introducir las células. Este enfoque tiene la ventaja de que las burbujas de aire no deseadas se pueden eliminar posteriormente (con éxito variable) y el área de observación preempapada permite la introducción lenta de una suspensión celular mediante pipeteo. El relleno previo, sin embargo, aumenta la probabilidad de que el medio fluya parcialmente en uno o ambos de los reservorios de flanqueo, lo que promoverá la sembración de células más allá del área de observación. Alternativamente, la suspensión celular se puede pipetear directamente en un área de observación seca, pero las burbujas de aire no deseadas no pueden ser expulsadas posteriormente.
La cavidad peritoneal del ratón contiene dos poblaciones principales de células: F4/80+ macrófagos y células CD19+ B (más pequeñas), en una proporción de aproximadamente 1:2(Figura 4A). Estas dos poblaciones celulares representan más del 95% de las células de la cavidad peritoneal, mientras que las células F4/80-/CD19- restantes se pueden identificar generalmente como CD11c+ células (células dendríticas) o CD3+ células (células T). Las células B débilmente adherentes se lavan fuera del área de observación durante el llenado de los depósitos con el medio(Figura 2). Después de añadir quimioattractante a uno de los dos reservorios, la microscopía de lapso de tiempo y de contraste de fase se puede utilizar para tomar imágenes de las células restantes (macrofagos) que migran en un gradiente quimioatractor en evolución. La formación del gradiente C5a del complemento en el área de observación, a través de la difusión de un depósito al otro, se puede simular utilizando un tinte fluorescente con un peso molecular similar. Un buen sustituto del complemento de ratón recombinante C5a (peso molecular previsto, 9,0 kDa) está etiquetado fluorescentemente dextran (10 kDa)31. Mediante la microscopía confocal, el gradiente de fluorescencia en el canal estrecho (área de observación) que conecta los dos depósitos de la corredera de quimiotaxis se puede medir a intervalos fijos y los perfiles de concentración en los diferentes puntos de tiempo se pueden trazar24,,31. Añadimos rutinariamente un tinte azul no fluorescente (Patent Blue V) al medio quimioatraer para proporcionar un indicador visual conveniente de difusión y formación de gradientes. Dentro de 1 h de introducir 15 l de medio azul que contiene quimioatraers en un depósito, el depósito aparece uniformemente azul y, de acuerdo con las leyes de difusión de Fick, se formará un gradiente a través del estrecho área de observación que conecta los embalses(Figura 3B). Se requieren varios días para que el soluto (tinte azul o quimioatraer) se distribuya uniformemente.
La microscopía de fluorescencia se puede sustituir por la microscopía de contraste de fase, que ofrece ventajas para el seguimiento automatizado de células, ya que las células etiquetadas fluorescentes se pueden distinguir fácilmente del fondo. Otra ventaja es que las poblaciones específicas de células inmunitarias se pueden rastrear selectivamente después de etiquetar marcadores de superficie con anticuerpos fluorescentes. Usamos este enfoque para la imagen de la sangre periférica humana CD14+ células (monocitos) migrando en un gradiente quimiotáctico fMLP (N-formilmetioninina-leucyl-fenilalanina)38. Del mismo modo, los anticuerpos fluorescentes anti-F4/80 podrían utilizarse para crear imágenes de macrófagos de ratón migrando en un gradiente quimiotáctico C5a. La fototoxicidad es una desventaja potencial del uso de imágenes de fluorescencia41. Esto puede ser reducido por varios medios42,incluyendo el uso de fluoróforos excitados con longitudes de onda más largas y la adición de antioxidantes al medio. Alternativamente, las células etiquetadas podrían identificarse inicialmente mediante microscopía de fluorescencia y posteriormente ser imágenes mediante microscopía de contraste de fase de lapso de tiempo. Sin embargo, en la práctica, las células que se mueven a velocidades moderadamente bajas, como por ejemplo 1 m/min (macrofagos) o 4 m/min (monocitos), pueden ser imágenes intermitentes mediante microscopía de fluorescencia a intervalos de minutos, lo que es bien tolerado38. Anteriormente usamos la microscopía de fluorescencia y la corredera de quimiotaxis descrita aquí para los ensayos de quimiotaxis 3D38,43. En este caso, ambos depósitos fueron precargados con medio y el medio que contiene quimioattractant de 15 l fue introducido en uno de los depósitos inmediatamente antes de pipetear lentamente las células etiquetadas fluorescentes mente suspendidas en medio que contiene colágeno tipo I en el área de observación. La parte difícil de este procedimiento es el manejo de colágeno tipo I, que se concentra en solución ácida. El pH de la solución de colágeno debe neutralizarse mediante la adición de solución alcalina antes de mezclar la solución de colágeno helado con la suspensión celular. La transferencia de la mezcla colágeno-célula a una incubadora a 37 oC iniciará la polimerización del colágeno. Durante la incubación, la corredera debe girarse lentamente alrededor de su eje largo para que las células permanezcan distribuidas uniformemente en las direcciones de los ejes X, Y y Z, mientras que el colágeno se polimeriza en un gel. Recientemente se ha descrito una corredera de quimiotaxis cerrada relacionada adecuada para ensayos de quimiotaxis 3D, con seis enchufes en lugar de cuatroenchufes. Este sistema permite introducir la mezcla colágeno-célula en el área de observación antes de llenar independientemente cada uno de los depósitos de flanqueo, ya que cada depósito tiene dos puertos de llenado, en lugar de un solo puerto.
En resumen, describimos un ensayo de quimiotaxis en tiempo real que permite la visualización de células navegando en un gradiente quimiotáctico durante un período de 6 o más horas. Aquí nos centramos en los macrófagos, que desempeñan un papel importante en las enfermedades inflamatorias, pero que han sido subrepresentados en los ensayos de quimiotaxis en tiempo real en comparación con las células móviles más rápidas como los neutrófilos y la amebae de Dictyostelium.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una subvención (HA 3271/3-2) del DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Slide (anodized aluminium) rack | Ibidi, Martinsried, Germany | 80003 | Autoclavable stackable rack for channel slides |
| µ-Slide Chemotaxis 2D (chemotaxis slide) | Ibidi, Martinsried, Germany | 80306 | Slide containing chemotaxis chambers (tissue culture treated) |
| 100x penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
| 10-100 µL pipette with volume control ring | Eppendorf | 3123000047 | Eppendorf Research plus pipette |
| 10-200 µL pipette tips | Greiner Bio-One International | 739261 | Pipette tips with beveled tips (96 pieces per rack: sterile) |
| 14 mL polypropylene round bottom tubes | BD Falcon | 352059 | Used to collect peritoneal cells |
| 14-bit Hamamatsu C9100-50 Electron Multiplying-Charged Couple Device (EM-CCD) peltier-cooled camera | Hamamatsu Photonics Inc., Japan | EM-CCD camera of the spinning disk confocal microscope system | |
| 2-20 µL pipette with volume control ring | Eppendorf | 3123000039 | Eppendorf Research plus pipette |
| 24 G plastic catheter | B Braun Mesungen AG, Germany | 4254503-01 | Used for peritoneal lavage |
| 405 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (405 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
| 488 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (488 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
| 561 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (561 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
| Alexa Fluor 488-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone BM8) anti-mouse F4/80 antibody | Thermo Fisher Scientific | MF48020 | Mouse macrophage marker and plasma membrane label |
| Alexa Fluor 594-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone 6D5) anti-mouse CD19 antibody | BioLegend | 115552 | Mouse B cell marker |
| C-Chip disposable (improved Neubauer) hemocytometer | NanoEnTek (distributed by VWR International) | 631-1098 | Used to count cells |
| CSU-X1 spinning disk scanner | Yokogawa Electric Corporation, Japan | Nipkow spinning disk unit | |
| Hank’s buffered salt solution without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14170120 | Used for peritoneal lavage |
| Heat-inactivated fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
| Hoechst 34580 | Thermo Fisher Scientific | H21486 | Cell permeable, blue fluorescent nucleic acid stain |
| ImageJ (image processing and analysis in Java) | National Institutes of Health (NIH) | Image analysis software | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coliO111:B4 | Sigma-Aldrich | L4391-1MG | Toll-like receptor 4 ligand |
| Nikon Eclipse Ti inverse microscope | Nikon, Japan | Inverted microscope | |
| Patent Blue V, sodium salt | Sigma-Aldrich | 21605-10G | Blue-colored dye used as visual indicator of gradient formation |
| Recombinant mouse complement C5a protein | R&D Systems | 2150-C5-025 | Chemoattractant for mouse macrophages |
| RPMI 1640 medium containing 20 mM Hepes | Sigma-Aldrich | R7388 | Basis medium for assays |
| UltraVIEW Vox 3D live cell imaging system + Volocity software | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Spinning disk confocal microscope system | |
| Zeiss LSM 510 + Axiovision software | Carl Zeiss Microscopy, Oberkochen, Germany | Confocal laser scanning microscope (LSM) adapted for phase-contrast microscopy |
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